CN114371201B - 一种可重复使用的葡萄糖传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可重复使用的葡萄糖传感器及其制备方法和应用，属于生物传感器技术领域。本发明在鲁士蓝模拟物(PBA)纳米立方体的顶点进行控制蚀刻，然后通过原位还原HAuCl4将Au纳米粒子(AuNPs)嵌入蚀刻空腔。独特的AuNP‑PBA纳米镶嵌体具有低的葡萄糖氧化电势、高的电催化活性和快速的氧化还原电子转移速率。将AuNP‑PBA纳米镶嵌体共价固定在细金丝上，形成非酶葡萄糖传感器，具有特别宽的线性检测范围(10μM至16mM)，优异的抗干扰性和快速响应。更重要的是，传感器是可重复使用的，即使在150次检测后，其灵敏度仍然保持良好。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，具体涉及一种可重复使用的葡萄糖传感器及其制备方法和应用。
背景技术
葡萄糖检测在许多应用中都很重要。在卫生保健领域，全球糖尿病患者超过4.63亿，而血糖监测是目前反映患者糖代谢水平的唯一方法，用以管理糖尿病和预防严重的并发症如黄斑变性、糖尿病肾病和心力衰竭等。此外，葡萄糖检测也在环境监测和食品质量控制等领域有广泛应用。
常用的葡萄糖检测方法依赖于电化学的检测试纸。试纸中的葡萄糖脱氢酶(GDH)或葡萄糖氧化酶(GOx)与样品中的葡萄糖反应，产生与葡萄糖浓度相关的电信号。该方法反应迅速，选择性高，灵敏度好，但固定方法、温度、 pH(pH<2或>8时活性损失)等因素显著影响酶活性。由于酶稳定性差，试纸条的储存条件严格，货架期短(通常不到2年)。此外，试纸条是一次性的消耗品。在全球范围内，每年约有260亿不可回收的葡萄糖试纸条被消耗，导致累积成本和垃圾居高不下。
为了避免酶的缺点，无酶葡萄糖传感器越来越受到人们的关注。贵金属，如铂、金和钯，由于其对葡萄糖稳定的氧化催化活性，已被用于无酶葡萄糖传感器的开发。但葡萄糖氧化催化动力学较差，反应时间长，灵敏度低，电解质中的反应中间体和Cl-对贵金属电极具有毒性。此外，葡萄糖氧化的电化学电位通常高到足以催化一些人体自身的生理物质，导致抗干扰能力差。
为了提高灵敏度和选择性，人们研究采用电镀、阳极氧化和气相沉积等表面改性技术对传感电极进行表面改性。这些技术可以增加电极的表面粗糙度，加速电子从葡萄糖到电极的转移，提高传感器的灵敏度。此外，在贵金属电极上，常见的生理干扰物质(如抗坏血酸(AA)和尿酸(UA))的氧化是扩散控制过程，而葡萄糖氧化是由表面反应控制的。表面粗糙度的增加降低了干扰物质的扩散，但不影响葡萄糖的反应速率，从而提高了选择性。虽然在理论上，通过提高电极表面粗糙度来提高传感器的选择性和灵敏度是可能的，但实际上，这种方法对性能的改进是有限的。
纳米材料包括金属、合金、金属氧化物、金属-有机框架(MOFs)、碳材料及其配合物，由于其大的表面积和高的表面自由能，也被开发用于提高非酶葡萄糖传感器的灵敏度和选择性。其中，MOF具有明显的优势，因为它们的合成具有高度多样化的化学成分和可调节的结构。普鲁士蓝类似物(PBAs) 是一种金属离子中心与氰化物配位形成的金属材料。利用具有高氧化还原活性的金属离子，制备的PBAs能实现快速电子转移和高氧化还原能力。高的比表面积和丰富的催化活性位点可以进一步提高PBAs氧化葡萄糖的效率。更重要的是，PBAs能在如此低的电位下催化葡萄糖氧化，普通的生理干扰物质不能被氧化，从而提高了抗干扰能力和葡萄糖检测的准确性。然而， PBAs对葡萄糖检测的主要障碍是其电导率差。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种可重复使用的葡萄糖传感器及其制备方法和应用，以解决现有葡萄糖传感器电导率差的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料，该纳米材料中的金是以金纳米颗粒形态镶嵌在中空的 Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米笼中。
上述Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料的制备方法包括以下步骤：
通过蚀刻工艺将Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米立方体材料制成中空的Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米笼材料，然后将金纳米颗粒镶嵌在中空的Ni-Fe 普鲁士蓝类似物纳米笼材料孔洞中，制得。
本发明的有益效果为：本发明采用普鲁士蓝有机金属框架材料(MOF) 作为基材，孔径均一、比表面积大，可有效限制干扰物质的扩散，从而提升传感器的灵敏度与选择性。通过蚀刻工艺在Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米立方体材料晶体角上蚀刻出纳米孔，得到纳米笼，然后将金纳米颗粒镶嵌在纳米笼中的空洞中，实现金纳米颗粒与普鲁士蓝有机金属框架材料(MOF)的紧密接触，可以显著提高MOF的导电性，提升传感器灵敏度。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步地，将氨水滴加到Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米立方体材料中，制得中空的Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米笼材料。其中，氨水的质量浓度范围为 5-10％，刻蚀时间5-20分钟。
进一步地，Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米立方体材料通过以下方法制得：将K3[Fe(CN)6]溶液滴加到含有Ni(NO3)2和C6H5Na3O7(柠檬酸钠)的溶液中，室温下反应，然后经离心，干燥，制得。
进一步地，K3[Fe(CN)6]、Ni(NO3)2和C6H5Na3O7的摩尔比为 0.03-0.05:0.02-0.05:0.03-0.04，优选K3[Fe(CN)6]、Ni(NO3)2和C6H5Na3O7的摩尔比为0.04:0.03:0.0375。
进一步地，室温下反应20-28h，优选24h。
进一步地，将中空的Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米笼材料和普朗尼克F127 混合，制成含普朗尼克F127的中空的Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米笼材料悬浮液，向悬浮液中加入HAuCl4·3H2O，搅拌20-40min后，再加入抗坏血酸，搅拌40-80min后，离心，洗涤，干燥，制得Au@Ni-Fe PBA纳米笼材料即 Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：利用原位还原技术，将金纳米颗粒镶嵌在蚀刻的纳米笼的孔洞中，金纳米颗粒能够紧密地镶嵌在孔洞中，这样可显著增强电子传导速率，进而大幅提升响应速率。
将上述Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料用于制备可重复使用的葡萄糖传感器，具体过程如下：
S1、将Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料氨基化，制得氨基化的 Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料；
S2、将金丝表面涂覆多孔金涂层，然后浸泡在羧基化溶液中，制得羧基化的金丝；羧基化溶液为巯基丙酸溶液、巯基乙酸或巯基丁酸；
S3、将羧基化的金丝在EDC溶液中浸泡40-80min，然后于NHS溶液中浸泡10-14h；
S4、将S3所得物在氨基化的Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料悬浮液中浸泡3-6h，然后再滴加全氟磺酸，制得可重复使用的葡萄糖传感器。
本发明的有益效果为：羧基化的金丝为金丝表面含有羧基化涂层，在 EDC/NHS试剂条件下，羧基化涂层中的羧基与氨基化的Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料中的羧基进行反应，通过共价键将Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料连接到金丝上，然后再加入全氟磺酸，制得可重复使用的葡萄糖传感器。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，步骤S1具体过程为：将Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料分散在含1-3％(w/w)APTES的乙醇溶液中，于60-80℃条件下搅拌反应1-3h，然后烘干，制得氨基化的Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料。
进一步，步骤S2具体过程为：将金丝在硫酸溶液中活化，将活化后的金丝浸在HAuCl4溶液中，用恒流法在金丝表面涂覆多孔金涂层，之后在 0.8-1.5mM巯基丙酸溶液中浸泡20-40min，制得羧基化的金丝。
进一步，活化过程为：将金丝在1M硫酸溶液中活化和洗涤，在25mV/s 的扫描速度下从-0.2V到1.5V扫描20次，得活化后的金丝。
进一步，步骤S3具体过程为：将羧基化的金丝在pH值为5-6，含4-6mM EDC的PBS溶液中浸泡1h，然后在0.5-1.5mM NHS溶液中浸泡12h。
进一步，步骤S4具体过程为：将S3所得物在10mg/ml氨基化的 Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料悬浮液中浸泡4h，然后再滴加0.5wt％全氟磺酸，制得可重复使用的葡萄糖传感器。
本发明具有以下有益效果：
商业化的酶基葡萄糖检测试纸不能重复使用，同时目前的无酶葡萄糖传感器检测范围窄，葡萄糖氧化动力学缓慢。本发明在鲁士蓝模拟物(PBA)纳米立方体的顶点进行控制蚀刻，然后通过原位还原HAuCl4将Au纳米粒子 (AuNPs)嵌入蚀刻空腔。独特的AuNP-PBA纳米镶嵌体具有低的葡萄糖氧化电势、高的电催化活性和快速的氧化还原电子转移速率。将AuNP-PBA纳米镶嵌体共价固定在细金丝上，形成非酶葡萄糖传感器，具有特别宽的线性检测范围(10μM至16mM)，优异的抗干扰性和快速响应。更重要的是，传感器是可重复使用的，即使在150次检测后，其灵敏度仍然保持良好。
附图说明
图1为可重复使用的葡萄糖传感器的制备流程图。
图2为可重复使用的葡萄糖传感器制备过程中各材料低倍和高倍下的 SEM照片；其中，a,d为Ni-Fe PBA纳米立方体材料、b,e为Ni-Fe PBA纳米笼材料，c,f为Au@Ni-Fe PBA纳米笼材料，a-c为低倍下的SEM照片，d-f 为高倍下的SEM照片。
图3为Ni-Fe PBA纳米立方体材料、Ni-Fe PBA纳米笼材料和Au@Ni-Fe PBA纳米笼材料的XRD图谱。
图4为氨水浓度对刻蚀效果的影响结果。
图5为Au@Ni-Fe PBA/Nafion电极材料的CV曲线图。
图6为Au@Ni-Fe PBA/Nafion电极对葡萄糖的响应能力。图6a为在预定时间内，在不同电位下多次添加1mM葡萄糖时的I-t曲线，图中从上到下的曲线依次为0.23V、0.22V、0.21V、0.20V；图6b为当电位为0.22V时，每次添加葡萄糖后的电流信号图；图6c为在10μM～16mM范围内，峰值电流与葡萄糖浓度的关系；图6d为葡萄糖抗干扰性测试结果图。
图7为Au@Ni-Fe PBA/Nafion电极的可重复使用能力。
具体实施方式
以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
一种可重复使用的葡萄糖传感器，其制备方法包括以下步骤：
S1、将24ml K3[Fe(CN)6]溶液(0.04M)滴加到含有0.03M Ni(NO3)2和 0.0375MC6H5Na3O7的16ml溶液中，在室温下反应24h后以4000r/min的速度离心10分钟，最后于75℃干燥10h，得到Ni-Fe PBA纳米立方体材料。
S2、将10mL氨水(8.5wt％)滴加到5mL Ni-Fe-PBA纳米立方体悬浮液中 (2mg/mL)，室温下搅拌10分钟，制得Ni-Fe-PBA纳米笼。将制备的Ni-Fe-PBA 纳米笼依次用去离子水和乙醇洗涤3次，75℃干燥10h，得到中空的Ni-Fe PBA纳米笼材料。
S3、将1ml HAuCl4·3H2O(10mM)滴加到6ml含有20mg普朗尼克F127 的1mg/mL Ni-Fe PBA纳米笼悬浮液中，搅拌30分钟，然后加入1.4ml的抗坏血酸(10mM)，将AuNP沉积在Ni-Fe PBA纳米笼中。搅拌1h后，悬浮液以8000r/min的速度离心10min，依次用去离子水和乙醇漂洗3次，40℃干燥过夜后得到Au@Ni-Fe PBA纳米笼材料。
S4、将Au@Ni-Fe PBA纳米笼材料用等离子清洁器清洁10分钟，然后以 1mg/mL的浓度分散在2％(w/w)APTES的乙醇溶液中，在70℃连续搅拌2h， 40℃烘干，得到氨基化Au@Ni-Fe PBA纳米笼。
S5、将金丝(
4cm长)在1M H2SO4中活化和洗涤，在25mV s-1的扫描速度下从-0.2V到1.5V扫描20次。活化后的金丝浸在2mM HAuCl4溶液中，在-1V下，用恒流法在金线表面涂覆多孔金涂层，之后在1mM巯基丙酸溶液中室温下浸泡30min。巯基丙酸修饰的金丝在5mM EDC的PBS 溶液(pH 5.5)中浸泡1h，之后在1mM NHS溶液中浸泡12h。随后将金丝在1ml 10mg/ml的氨基化Au@Ni-Fe PBA纳米笼的悬浮液中浸泡4h，再滴加 0.5wt％的全氟磺酸，制备可重复使用的血糖传感器(Au@Ni-Fe PBA/Nafion 电极)。
上述可重复使用的葡萄糖传感器的具体制备流程图见图1。
实验例1：
对实施例1中制得的Ni-Fe PBA纳米立方体材料、中空的Ni-Fe PBA纳米笼材料和Au@Ni-Fe PBA纳米笼材料进行微观形貌测试，测试结果见图2。
由图2a、d可以看出，Ni-Fe PBA纳米晶具有固体立方结构，尺寸均匀，约为140nm。利用氨水的可控刻蚀将固态Ni-Fe PBA纳米立方体刻蚀为具有纺锤形空洞的空心纳米笼(图2b,e)。利用原位还原形成了金纳米颗粒 (40～45nm)，并且金纳米颗粒镶嵌在Ni-FePBA纳米笼中(图2c,f)。
实验例2：
对实施例1中制得的Ni-Fe PBA纳米立方体材料、中空的Ni-Fe PBA纳米笼材料和Au@Ni-Fe PBA纳米笼材料进行晶型测试，结果见图3。
由图3可知，在Ni-Fe PBA纳米立方体、Ni-Fe PBA纳米笼和Au@Ni-Fe PBA纳米笼的XRD谱图中，出现了与Fe4[Fe(CN)6]3(PDF#01-0239)晶面相对应的峰，表明在可控刻蚀和原位金沉积过程中，PBA的晶体结构得到了很好的保持。Au@Ni-Fe PBA纳米笼在38.18°、44.41°、64.51°和77.61°处的衍射峰属于Au(PDF#04-0784)的(111)、(200)、(220)和(311)晶面，表明 Au NPs在Ni-Fe PBA纳米笼中成功偶联。
实验例3：
测试实施例1中制得的Ni-Fe PBA纳米立方体材料、中空的Ni-Fe PBA 纳米笼材料和Au@Ni-Fe PBA纳米笼材料的微观形貌变化，结果见图4。
Ni-Fe PBA纳米立方体的刻蚀是制备Au@Ni-Fe PBA纳米笼的关键步骤。为了实现高效装载Au NPs，需要对刻蚀过程进行优化，以便在得到最大的空腔体积的同时保持立方纳米笼的完整性。Ni-Fe-PBA纳米立方体的刻蚀从八个顶点开始，倾向于沿着空间对角线进行刻蚀，因为这些顶点比立方体的平面具有更高的表面能。由于在PBA形成过程中，外平面经常发生溶解和再结晶过程，反复的溶解与结晶可修复缺陷，一次立方体外平面缺陷密度小于内部的缺陷。缺陷密度越高，刻蚀速率越快，因此立方体内部的蚀刻率高于外部平面，形成笼状结构。如图4所示，刻蚀产生的纳米孔在立方体平面上的投影是椭圆，用椭圆的长轴和短轴分别除以面对角线长度的一半，得到长轴相对长度和短轴相对长度，用于量化蚀刻过程。当氨水质量浓度从 5％上升到8.5％时，长轴相对长度和短轴相对长度都有所增加。然而，当氨水浓度进一步增加到9％时，长轴相对长度和短轴相对长度均不能继续增加，纳米立方体开始坍缩。刻蚀时间也会影响纳米立方体的结构。刻蚀程度随着时间的延长而增加，当刻蚀时间超过12min时，整个立方体发生坍塌。
实验例4：
测试Au@Ni-Fe PBA/Nafion电极材料的CV曲线，集CV曲线研究 Au@Ni-Fe PBA纳米笼是否牢固地固定在多孔金电极上。如图5a所示，多孔金电极的氧化峰和还原峰分别稳定地维持在0.43V和0.1V。相比之下，如果直接将Au@Ni-Fe PBA纳米笼采用沉积在多孔金电极上，Au@Ni-Fe PBA 纳米笼与金丝之间的相互作用是微弱的范德华力。在这种情况下，仅在第一轮CV测试后，氧化峰电流和电位就显著降低(图5b)，表面纳米笼从导线上脱落。然而，当Au@Ni-Fe PBA纳米笼通过共价键固定在金丝表面上时， CV曲线非常稳定(图5c)。这一结果表明了共价键在维持电极稳定性方面的重要作用。与多孔Au电极相比，Au@Ni-Fe PBA电极的氧化峰移动到一个更小的电位(0.3V)，这可能有利于抗干扰性能的葡萄糖传感。
实验例5：
测试实施例1制得的可重复使用的血糖传感器对葡萄糖的响应，具体利用电化学工作站测试了Au@Ni-Fe PBA/Nafion电极对葡萄糖的电流响应。图 6a展示的是在预定时间内，在不同电位下多次添加1mM葡萄糖时的I-t曲线。当电位分别为0.20、0.21、0.22和0.23V时，电极的I-t曲线能很好地保持阶梯状，当电位为0.22V时灵敏度最佳。每次添加葡萄糖后，电流信号很快达到稳定状态(1秒内)(图6b)，表明葡萄糖氧化催化效率很高。如图6c 所示，在10μM～16mM范围内，峰值电流与葡萄糖浓度呈线性关系(R2＝ 0.999)，检出限(LOD)为4.686μM(S/N＝3)，灵敏度为8.037μA mM-1cm-2。 Au@Ni-Fe PBA/Nafion电极的检测范围(ROD)和LOD与有酶葡萄糖传感器相当(ROD 0-20mM，LOD 5μM)。与大多数非酶葡萄糖传感器相比，本发明提供的Au@Ni-Fe PBA/Nafion电极具有更宽的电极棒和更低的氧化电位。
实验例6：
测试实施例1制得的可重复使用的血糖传感器的可重复使用能力，结果如图7所示。
如图7上图所示，Au@Ni-Fe PBA/Nafion电极测得的葡萄糖浓度与实际浓度高度一致。Au@Ni-Fe PBA/Nafion电极也具有良好的重复使用性。如图 7下图所示，即使经过150次测试，电极灵敏度仍保持在70％以上(图7下图中的每个点需要5次测试)。相比之下，当使用商业血糖试纸时，每条试纸只能使用一次，使用同一条试纸进行第二次葡萄糖测试仪器会显示错误。因此，从成本和环境的角度来看，Au@Ni-Fe PBA/Nafion电极比商业条带更适合测试大量的样品。此外，普通存储温度(5～40℃)对传感精度影响不大。 Au@Ni-Fe PBA/Nafion电极极好的稳定性和可重复使用性可能是由于 Au@Ni-Fe PBA纳米笼是通过共价键固定在多孔金电极上的。这一优点使得该电极不仅适用于医院或体检中心的高通量体外血糖检测，也适用于食品和环境应用中的血糖检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种可重复使用的葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料氨基化，制得氨基化的Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料；所述Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料中的金是以金纳米颗粒形态镶嵌在中空的Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米笼中；所述Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料通过以下方法制得：通过蚀刻工艺将Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米立方体材料制成中空的Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米笼材料，然后将金纳米颗粒镶嵌在中空的Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米笼材料孔洞中，制得；
S2、将金丝表面涂覆多孔金涂层，然后浸泡在羧基化溶液中，制得羧基化的金丝；
S3、将羧基化的金丝在EDC溶液中浸泡40-80min，然后于NHS溶液中浸泡10-14h；
S4、将S3所得物在氨基化的Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料悬浮液中浸泡3-6h，然后再滴加全氟磺酸，制得可重复使用的葡萄糖传感器。
2.根据权利要求1所述的可重复使用的葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，步骤S1具体过程为：将Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料分散在含1-3wt％APTES的乙醇溶液中，于60-80℃条件下搅拌反应1-3h，然后烘干，制得氨基化的Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料。
3.根据权利要求1所述的可重复使用的葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，步骤S2具体过程为：将金丝在硫酸溶液中活化，将活化后的金丝浸在HAuCl4溶液中，用恒流法在金丝表面涂覆多孔金涂层，之后在0.8-1.5mM巯基丙酸溶液中浸泡20-40min，制得羧基化的金丝。
4.根据权利要求3所述的可重复使用的葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，活化过程为：将金丝在1M硫酸溶液中活化和洗涤，在25mV/s的扫描速度下从-0.2V到1.5V扫描20次，得活化后的金丝。
5.根据权利要求1所述的可重复使用的葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，步骤S3具体过程为：将羧基化的金丝在pH值为5-6，含4-6mM EDC的PBS溶液中浸泡1h，然后在0.5-1.5mM NHS溶液中浸泡12h。
6.根据权利要求1所述的可重复使用的葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于，步骤S4具体过程为：将S3所得物在10mg/ml氨基化的Au@Ni-Fe普鲁士蓝类似物纳米材料悬浮液中浸泡4h，然后再滴加0.5wt％全氟磺酸，制得可重复使用的葡萄糖传感器。
7.采用权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的可重复使用的葡萄糖传感器。
8.权利要求7所述的可重复使用的葡萄糖传感器在血糖检测方面的应用。
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