CN114369949B - 光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维、细胞装载的光电刺激神经支架及其制备方法 - Google Patents

光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维、细胞装载的光电刺激神经支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了具有生物活性的光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维及其制备方法，该复合取向微纤维由PCL微纤维，以及依次包覆于PCL微纤维表面的胶原蛋白和亲水性P3HT纳米颗粒构成。所述亲水性P3HT纳米颗粒由半导体聚合物P3HT经十二烷基硫酸钠(SDS)和正丙醇进行表面改性得到。本发明在不改变微纤维微观结构的同时，赋予微纤维生物活性和光电响应性。本发明进一步公开了细胞装载的光电刺激神经支架，将细胞接种于成型的光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维材料表面得到，其具有高度取向性，取向结构可诱导神经细胞取向生长，模拟天然神经细胞中神经元沿神经纤维方向排列。

Description

光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维、细胞装载的光电刺激 神经支架及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学材料和生物医学工程技术领域，涉及具有生物活性的光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维及用于可光电刺激的取向神经支架及其制备。
背景技术
天然神经组织具有多级定向结构，它由取向排列的神经束组成，而神经束又由具有微米尺度的神经纤维组成，在神经纤维中，雪旺细胞定向排列生长形成髓鞘，而神经元的轴突沿髓鞘定向生长。
在神经组织中，电信号作为神经细胞之间交流的主要介质，因此其对神经细胞的生长、分化和功能表达起到至关重要的作用。神经组织在受损后自我恢复能力极其有限，近年来，大量文献报道通过电活性生物材料(如金属纳米粒子、碳基纳米材料、以及导电聚合物等)制备导电的神经支架，辅以外部的电刺激，可以促进干细胞的神经分化及神经细胞的粘附、轴突的生长，在体内神经损伤模型中，导电支架及其介导的电刺激可以促进受损组织的修复以及功能的恢复。然而，外加电场刺激需要使用外部电源以及复杂的电线系统从而对细胞或组织进行有效的电刺激。此外，在体内实验及实际临床模型中，电源通过电极和电线与身体相连，这样的装置不方便且安全性亟待提高。因此，迫切需要开发便携、安全的持久自供电的新型神经支架电刺激系统。与传统电刺激相比，可将光信号转化成电信号的光电刺激为神经界面提供了无线远程刺激的新思路。无机半导体材料(如硅基材料)在临床中有一定的应用，但是其应用受限于低的光吸收效率、远远高于天然神经组织的力学强度以及较差的生物相容性。相比之下，半导体聚合物材料具有较高的光吸收效率，可调的光电性质，在太阳能电池等领域已有广泛的应用。另一方面，有机半导体材料的力学性能与天然软组织相匹配，并且生物相容性较好，易与其他生物活性材料结合，从而制备适宜的光电刺激神经支架。在这其中，太阳能电池和光传感器的代表性光敏聚合物聚(3-己基噻吩)(P3HT)因其良好的生物相容性、较宽的可见光吸收(主要为绿光)、高的光电转换效率受到了许多研究者的青睐。
Kisuk Yang等人报道了一项制备光电活性的P3HT制备的纳米网络基质材料用于促进人的神经干细胞(hNSCs)的神经发生的研究，通过冷却-加热循环与旋转喷涂技术分别制备了P3HT纳米棒和纳米纤维。相比于在普通培养板、P3HT纳米棒基底和P3HT平板基底，培养在P3HT纳米纤维基底表面的hNSCs细胞在定期的539nm绿光照射后向神经元方向分化更明显，培养7天后表现出成熟神经元的电生理行为(Yang,Kisuk,et al."Photoactive poly(3-hexylthiophene)nanoweb for optoelectrical stimulation to enhanceneurogenesis of human stem cells."Theranostics 7.18(2017):4591.)。然而，这种制备P3HT纳米网络的方法较为繁琐，只涉及了P3HT一种材料的使用，制备的支架的生物相容性不够理想，并且其中纳米结构随机排列，与取向的天然神经组织相去甚远。Yingjie Wu等人报道了一项利用聚己内酯(PCL)与P3HT制备支架材料用于类神经细胞无线刺激的研究，通过静电纺丝技术共纺制备PCL与P3HT的混合微米纤维，调节静电纺丝参数可以获得不同取向排列度和直径的微纤维。相比于随机排列的微纤维，定向排列的混合纳米纤维上培养的类神经细胞定向生长更好，伸出的轴突更长，此外，在定期绿光LED灯的照射下的细胞的轴突也比无照射组的更长(Wu,Yingjie,et al."Photoconductive micro/nano-scaleinterfaces of a semiconducting polymer for wireless stimulation of neuron-like cells."ACS Applied Materials&Interfaces(2019).)。虽然这种制备光电刺激神经支架的方法实现了取向拓扑结构的构建，促进了细胞的取向生长，但是由于P3HT和PCL的细胞相容性有限，P3HT极疏水，且其细胞粘附位点有限，不利于细胞生长。此外，P3HT原料价格昂贵，而静电纺丝技术需要大量原料，因此其在神经支架材料中的应用有限。
综上所述，目前报道的光电刺激神经支架由于生物相容性较差、材料制备工艺较为复杂、制备成本高或者缺少取向的微结构等缺陷，从而导致其难以适用于神经再生研究。研究一种具有取向微结构、优异生物相容性、成本较低的可光电刺激神经支架，对研究神经再生具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的旨在针对上述现有技术中的不足，提供一种具有生物活性的光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维及其制备方法，得到具有取向的微结构、理化性质稳定，光电转化效率优异、生物活性好的微纤维，可以实现神经细胞的无线刺激，并降低制备工艺难度、成本，提高制备效率。
本发明的另一目的在于提供一种高取向神经支架及其制备方法，所制备的神经支架可模拟神经组织中的定向结构，且具有光电响应型，在光照射条件下产生电流，促进支架表面神经细胞生长。
本发明提供的具有生物活性的光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维，其由PCL微纤维，以及依次包覆于PCL微纤维表面的胶原蛋白和亲水性P3HT纳米颗粒构成。所述亲水性P3HT纳米颗粒由半导体聚合物P3HT经十二烷基硫酸钠(SDS)和正丙醇进行表面改性得到。在不改变微纤维微观结构的同时，赋予微纤维生物活性和光电响应性。在优选实现方式中，所述PCL微纤维直径约为5μm；进一步胶原蛋白浓度为30-120μg/cm2；P3HT纳米颗粒浓度为25-50μg/cm2。
本发明进一步提供了一种光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制备亲水性P3HT纳米颗粒
室温下，将半导体聚合物P3HT溶于第一有机溶剂，形成P3HT浓度为1-10mg/mL的第一溶液；将阴离子表面活性剂溶于去离子水形成浓度为1-10mmol/L的第二溶液，以体积比1:(50-100)的比例向第二溶液中加入助表面活性剂形成第三溶液；将第一溶液与第三溶液等体积混合，经超声反应形成微乳液，然后在搅拌条件下蒸发第一有机溶剂形成P3HT纳米颗粒水分散液；
(2)制备取向PCL微纤维
将PCL溶于第二有机溶剂得到质量分数10％-20％的PCL溶液，以PCL溶液为原料，采用静电纺丝方法制备得到PCL微纤维；
(3)微纤维上静电喷涂胶原蛋白
将胶原蛋白溶于去离子水，形成浓度为0.5-2mg/mL的胶原蛋白溶液；采用静电喷涂方法使胶原蛋白溶液均匀喷涂至步骤(2)制备的PCL微纤维表面，得到胶原-PCL微纤维；
(4)微纤维上静电喷涂P3HT纳米颗粒
采用静电喷涂方法，将步骤(1)制备的P3HT纳米颗粒水分散液均匀喷涂至胶原-PCL微纤维表面，得到P3HT纳米颗粒-胶原-PCL微纤维，即光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维。
上述步骤(1)中，半导体聚合物P3HT溶于第一有机溶剂形成均相溶液，其为油相；第一有机溶剂可以为氯苯、甲苯、二甲苯、氯仿或吡啶等，优选为氯仿，因氯仿沸点低于水，容易去除。所述阴离子表面活性剂可以为十二烷基硫酸钠(SDS)。所述助表面活性剂可以为正丙醇。第三溶液为水相，溶有P3HT的第一溶液与溶有阴离子表面活性剂的第三溶液混合后，两相互不相容将会分层。当在油水界面处施加超声波时，在助表面活性剂作用下，油水两相混合形成微乳液。超声强度和时间可以控制形成的微乳液的大小从而调节产物粒径。本发明中在100-150W功率下超声10-30min，之后在搅拌条件下蒸发去除溶剂，在优选实现方式中，于65-80℃下蒸发即可；对于氯仿等易于蒸发去除的有机溶剂，可以在65-80℃搅拌约10-15min即可。第一有机溶剂将被充分蒸发，形成表面带有阴离子表面活性剂的P3HT纳米颗粒的水分散液，阴离子表面活性剂的存在大大改善了P3HT的亲水性，方便了之后的应用。为了确定P3HT纳米颗粒浓度，将所得P3HT纳米颗粒分散液冻干称重确定产物亲水性P3HT纳米颗粒质量，再向冻干产物中加入去离子水使亲水性P3HT纳米颗粒分散均匀重新得到P3HT纳米颗粒水分散液；重新得到的P3HT纳米颗粒水分散液中，P3HT纳米颗粒浓度为0.25-0.5mg/mL。
上述步骤(2)中，PCL溶于第二有机溶剂形成均相溶液，第二有机溶剂可以为氯仿、二氯甲烷、二甲基甲酰胺或四氢呋喃等，优选为氯仿。本发明中使用的静电纺丝技术原理为，在足够高的电压下，一定速率的射流被拉伸，第二有机溶剂迅速蒸发，从而在接收端的旋转接收器上形成纤维，控制旋转接收器的旋转速率可以控制形成纤维的取向度。在具体实现方式中，使用静电纺丝仪，设置纺丝液流速为5-7.5mL/h，滑台速率0.1-0.2mm/s，静电发生器电压设为8-12kV，滚轴接收器转速为500-1000rpm。
上述步骤(3)中，使用具有优异生物相容性的胶原蛋白与PCL复合赋予步骤(2)中得到的取向微纤维以生物相容性。经研究发现，可以通过静电喷涂的方法将胶原蛋白喷涂至PCL表面，静电喷涂方法原理与静电纺丝法类似，在高压电场作用下，胶原蛋白可以被均匀喷涂到PCL表面而不改变原有的纺丝纤维结构，PCL微纤维表面胶原蛋白浓度为30-120μg/cm2。利用静电纺丝仪控制步骤(2)制备的PCL微纤维旋转的同时控制装有胶原蛋白溶液的容器沿垂直于PCL微纤维移动，控制电压和流速将胶原蛋白溶液喷涂至PCL微纤维上。具体实现方式中，使用静电纺丝仪，控制胶原溶液挤出速率为3-5mL/h，滑台移动速率0.1-0.2mm/s，电压设为8-12kV，保持步骤(2)中得到的PCL微纤维在滚轴上继续以转速100-200rpm进行旋转，将胶原蛋白均匀喷涂至PCL微纤维表面，得到胶原-PCL微纤维。
上述步骤(4)中，再次通过静电喷涂进一步将步骤(1)获得的P3HT纳米颗粒水分散液均匀地喷涂到步骤(3)中得到的复合微纤维表面，得到P3HT纳米颗粒浓度为25-50μg/cm2的光电响应纳米颗粒复合静电纺丝微纤维，亲水性大大改善了P3HT纳米颗粒均匀铺在微纤维表面，P3HT在绿光照射下能产生一定的光电流，从而赋予了微纤维光电响应特性，为远程无线电刺激奠定了基础。在具体实现方式中，使用静电纺丝仪，P3HT纳米颗粒水分散液挤出速率为3-5mL/h，滑台移动速率0.1-0.2mm/s，电压设为8-12kV，保持步骤(3)中得到的胶原-PCL微纤维在滚轴上继续以转速100-200rpm进行旋转，将P3HT纳米颗粒喷涂至胶原-PCL微纤维表面。
本发明进一步提供了光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维在光电刺激神经支架材料制备中的应用。
本发明进一步提供了一种简单高效的细胞装载的光电刺激神经支架，可模拟神经组织中的定向结构，支架材料中复合的光电纳米颗粒在绿光照射下产生电流，促进了支架材料表面的神经细胞的生长。该神经支架是将细胞接种于成型的光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维材料表面得到；接种细胞密度为0.8-2×104个/cm2。
上述细胞装载的光电刺激神经支架制备方法包括以下步骤：
步骤一，将上述光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维按照设计形状成型并灭菌；
步骤二，将细胞接种至步骤一成型后的材料表面得到光电刺激神经支架材料，接种细胞密度为0.8-2×104个/cm2。
对步骤二制备的光电刺激神经支架材料按照设定的时间间隔进行光电刺激，其余时间在无光照条件下进行培养。光电刺激采用绿光脉冲进行30-60min。
上述细胞装载的光电刺激神经支架材料制备方法，是在前面给出的具有生物活性的光电响应纳米颗粒复合取向微纤维的制备方法的基础上，将细胞接种至微纤维表面，细胞可以为神经元细胞或神经干细胞。通过该方法制备的可光电刺激神经支架材料可以诱导神经细胞沿微纤维方向取向生长，模拟天然神经组织中取向生长的神经元。另外，具有光电响应性的P3HT纳米颗粒的加入赋予了支架材料光电特性，在绿光的照射下产生光电流，实现对材料表面神经元的无线远程刺激，促进其轴突伸长及功能表达，显示出良好的神经组织工程应用前景。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明以具有优异生物相容性的胶原蛋白和良好水分散性的P3HT纳米颗粒为原料，依次包覆于PCL微纤维表面构成光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维，赋予微纤维生物活性和光电响应性并且不改变微纤维的微观结构。
(2)本发明所提供的光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维的制备方法，首先通过静电纺丝制备PCL微纤维，然后再通过静电喷涂将明胶和亲水性P3HT纳米颗粒依次喷涂于PCL微纤维表面，制备方法简单高效、且降低了原料使用量和生产成本。
(3)本发明所制备的P3HT纳米颗粒，粒径分布均匀，在水中能够均匀分散。
(4)本发明所提供的细胞装载的光电刺激神经支架材料，具有高度取向性，取向结构可诱导神经细胞取向生长，模拟天然神经细胞中神经元沿神经纤维方向排列。
(5)本发明所提供的细胞装载的光电刺激神经支架材料，在光电响应神经支架材料上生长的神经细胞在受到定期的绿光照射后轴突生长和功能表达得到大大提高，该神经支架材料显示出良好的神经组织工程应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的P3HT纳米颗粒结构性能表征示意图，其中a为扫描电镜图谱，b为粒径分布直方图，c为紫外-可见光光谱图。
图2为本发明实施例1、实施例3和对比例1制备的微纤维扫描电镜图谱，a图中APCP25表示取向的P3HT-胶原-PCL微纤维中P3HT的浓度为25μg/cm2，即实施例3制备的；b图中APCP50表示取向的P3HT-胶原-PCL微纤维中P3HT的浓度为50μg/cm2，即实施例1制备的；c图中APCP0表示取向的P3HT-胶原-PCL微纤维中P3HT的浓度为0，即对比例1制备的；d图为3种微纤维的直径统计图。
图3为本发明实施例1和对比例1制备的两种微纤维的光电流测试结果，其中APCP50和APCP0含义同上。
图4为细胞装载神经支架材料分别在培养3、5天后的FDA/PI染色激光共聚焦图谱；其中，(a)、(b)、(c)分别对应对比例3、对比例5、对比例4制备的细胞装载神经支架材料培养3天后的FDA/PI染色激光共聚焦图谱，(d)、(e)、(f)分别对应对比例2、实施例8、实施例9制备的细胞装载神经支架材料培养3天后的FDA/PI染色激光共聚焦图谱，(h)、(i)、(j)分别对应对比例3、对比例5、对比例4制备的细胞装载神经支架材料培养5天后的FDA/PI染色激光共聚焦图谱，(k)、(l)、(m)分别对应对比例2、实施例8、实施例9制备的细胞装载神经支架材料培养5天后的FDA/PI染色激光共聚焦图谱，APCP50，APCP25和APCP0含义同上。
图5为细胞装载神经支架材料分别在培养3、5天后的FDA/PI染色激光共聚焦图谱(A)和细胞长度统计图(B)；其中，A中(a)、(b)、(c)分别对应对比例3、对比例5、对比例4制备的细胞装载神经支架材料培养3天后的F-Actin/DAPI染色激光共聚焦图谱，(d)、(e)、(f)分别对应对比例2、实施例8、实施例9制备的细胞装载神经支架材料培养3天后的F-Actin/DAPI染色激光共聚焦图谱，(h)、(i)、(j)分别对应对比例3、对比例5、对比例4制备的细胞装载神经支架材料培养5天后的F-Actin/DAPI染色激光共聚焦图谱，(k)、(l)、(m)分别对应对比例2、实施例8、实施例9制备的细胞装载神经支架材料培养5天后的F-Actin/DAPI染色激光共聚焦图谱，APCP50，APCP25和APCP0含义同上。
图6为对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、实施例8和实施例9制备的细胞装载神经支架材料分别在培养10天后细胞的神经发生相关基因TuJ1和Ina的表达统计图，APCP50，APCP25和APCP0含义同上。
具体实施方式
拟结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明。
实施例1
本实施例制备具有生物活性的光电响应纳米颗粒复合取向微纤维的步骤如下：
(1)制备亲水性P3HT纳米颗粒
室温下，将P3HT溶于氯仿，形成P3HT浓度为5mg/mL的第一溶液；将SDS溶于去离子水形成浓度为5mmol/L的第二溶液，向第二溶液中加入助表面活性剂正丙醇形成第三溶液(助表面活性剂与第二溶液体积比1:100)；各取第一溶液与第三溶液1mL混合，在125W功率下超声分散20min，然后在65℃，搅拌10min蒸发氯仿形成P3HT纳米颗粒水分散液，将所得溶液冻干称重确定产物浓度，并加一定量的去离子水使纳米颗粒浓度为0.25mg/mL，得到P3HT纳米颗粒水分散液；
(2)制备取向PCL微纤维
将PCL溶于氯仿得到质量分数15％的PCL溶液，将PCL溶液置于注射器，注射器接上可注射钝针装入静电纺丝仪；设置纺丝液流速为7.5mL/h,滑台速率0.1mm/s,静电发生器电压设为10kV，针头距接收器的距离为12cm；采用直径4cm、长15cm的金属滚轴接收器，滚轴接收器转速为1000rpm，旋转收集得到PCL微纤维；
(3)微纤维上静电喷涂胶原蛋白
将胶原蛋白溶于去离子水，形成浓度为0.5mg/mL的胶原蛋白溶液，使用注射器吸取胶原蛋白溶液22.6mL，注射器连接钝针并装入静电纺丝仪；设置溶液挤出速率为3mL/h，滑台移动速率0.2mm/s，电压设为10kV，针头距接收器的距离为12cm，保持步骤(2)中得到的PCL微纤维在滚轴上继续以转速100rpm进行旋转，通过高压将胶原蛋白均匀喷涂至PCL微纤维表面，得到胶原-PCL微纤维；纤维上胶原蛋白浓度为30μg/cm2；
(4)微纤维上静电喷涂P3HT纳米颗粒
用注射器吸取步骤(1)中得到的P3HT纳米颗粒水分散液37.68mL，注射器连接钝针并装入静电纺丝仪；设置溶液挤出速率为3mL/h，滑台移动速率0.2mm/s，电压设为10kV，针头距接收器的距离为12cm，保持步骤(3)中得到的胶原-PCL微纤维在滚轴上继续以转速100rpm进行旋转，将P3HT纳米颗粒喷涂至胶原-PCL微纤维表面，得到P3HT-胶原-PCL复合微纤维，纤维上的P3HT浓度为50μg/cm2 .。
实施例2
本实施例制备具有生物活性的光电响应纳米颗粒复合取向微纤维的步骤如下：
(1)制备亲水性P3HT纳米颗粒
室温下，将P3HT溶于氯仿，形成P3HT浓度为10mg/mL的第一溶液；将SDS溶于去离子水形成浓度为10mmol/L的第二溶液，向第二溶液中加入助表面活性剂正丙醇形成第三溶液(助表面活性剂与第二溶液体积比1:100)；各取第一溶液与第三溶液1mL混合，在125W功率下超声分散30min，然后在65℃，搅拌15min蒸发氯仿形成P3HT纳米颗粒水分散液，将所得溶液冻干称重确定产物浓度，并加一定量的去离子水使纳米颗粒浓度为0.25mg/mL，得到P3HT纳米颗粒水分散液；
(2)制备取向PCL微纤维
将PCL溶于氯仿得到质量分数15％的PCL溶液，将PCL溶液置于注射器，注射器接上可注射针头装入静电纺丝仪；设置纺丝液流速为5mL/h,滑台速率0.1mm/s,静电发生器电压设为8kV，针头距接收器的距离为12cm；采用直径4cm、长15cm的金属滚轴接收器，滚轴接收器转速为1000rpm，旋转收集得到PCL微纤维；
(3)微纤维上静电喷涂胶原蛋白
将胶原蛋白溶于去离子水，形成浓度为2mg/mL的胶原蛋白溶液，使用注射器吸取胶原蛋白溶液22.6mL，注射器连接钝针并装入静电纺丝仪；设置溶液挤出速率为5mL/h，滑台移动速率0.2mm/s，电压设为8kV，针头距接收器的距离为12cm，保持步骤(2)中得到的PCL微纤维在滚轴上继续以转速100rpm进行旋转，通过高压将胶原蛋白均匀喷涂至PCL微纤维表面，得到胶原-PCL微纤维；纤维上胶原蛋白浓度为120μg/cm2；
(4)微纤维上静电喷涂P3HT纳米颗粒
用注射器多次吸取步骤(1)中得到的P3HT纳米颗粒水分散液18.84mL，注射器连接钝针并装入静电纺丝仪；设置溶液挤出速率为5mL/h，滑台移动速率0.2mm/s，电压设为8kV，针头距接收器的距离为12cm，保持步骤(3)中得到的胶原-PCL微纤维在滚轴上继续以转速100rpm进行旋转，将P3HT纳米颗粒喷涂至胶原-PCL微纤维表面，得到P3HT-胶原-PCL复合微纤维，纤维上的P3HT浓度为25μg/cm2。
实施例3
本实施例制备具有生物活性的光电响应纳米颗粒复合取向微纤维的步骤如下：
(1)制备亲水性P3HT纳米颗粒
室温下，将P3HT溶于氯仿，形成P3HT浓度为5mg/mL的第一溶液；将SDS溶于去离子水形成浓度为5mmol/L的第二溶液，向第二溶液中加入助表面活性剂正丙醇形成第三溶液(助表面活性剂与第二溶液体积比1:100)；各取第一溶液与第三溶液1mL混合，在125W功率下超声分散20min，然后在65℃，搅拌10min蒸发氯仿形成P3HT纳米颗粒水分散液，将所得溶液冻干称重确定产物浓度，并加一定量的去离子水使纳米颗粒浓度为0.25mg/mL，得到P3HT纳米颗粒水分散液；
(2)制备取向PCL微纤维
将PCL溶于氯仿得到质量分数15％的PCL溶液，将PCL溶液置于注射器，注射器接上可注射钝针装入静电纺丝仪；设置纺丝液流速为7.5mL/h,滑台速率0.1mm/s,静电发生器电压设为10kV，针头距接收器的距离为12cm；采用直径4cm、长15cm的金属滚轴接收器，滚轴接收器转速为1000rpm，旋转收集得到PCL微纤维；
(3)微纤维上静电喷涂胶原蛋白
将胶原蛋白溶于去离子水，形成浓度为0.5mg/mL的胶原蛋白溶液，使用注射器吸取胶原蛋白溶液22.6mL，注射器连接钝针并装入静电纺丝仪；设置溶液挤出速率为3mL/h，滑台移动速率0.2mm/s，电压设为10kV，针头距接收器的距离为12cm，保持步骤(2)中得到的PCL微纤维在滚轴上继续以转速100rpm进行旋转，通过高压将胶原蛋白均匀喷涂至PCL微纤维表面，得到胶原-PCL微纤维；纤维上胶原蛋白浓度为30μg/cm2；
(4)微纤维上静电喷涂P3HT纳米颗粒
用注射器吸取步骤(1)中得到的P3HT纳米颗粒水分散液18.84mL，注射器连接钝针并装入静电纺丝仪；设置溶液挤出速率为3mL/h，滑台移动速率0.2mm/s，电压设为10kV，针头距接收器的距离为12cm，保持步骤(3)中得到的胶原-PCL微纤维在滚轴上继续以转速100rpm进行旋转，将P3HT纳米颗粒喷涂至胶原-PCL微纤维表面，得到P3HT-胶原-PCL复合微纤维，纤维上的P3HT浓度为25μg/cm2。
实施例4
本实施例制备具有生物活性的光电响应纳米颗粒复合取向微纤维的步骤如下：
(1)制备亲水性P3HT纳米颗粒
室温下，将P3HT溶于氯仿，形成P3HT浓度为10mg/mL的第一溶液；将SDS溶于去离子水形成浓度为5mmol/L的第二溶液，向第二溶液中加入助表面活性剂正丙醇形成第三溶液(助表面活性剂与第二溶液体积比1:50)；各取第一溶液与第三溶液1mL混合，在150W功率下超声分散30min，然后在80℃，搅拌10min蒸发氯仿形成P3HT纳米颗粒水分散液，将所得溶液冻干称重确定产物浓度，并加一定量的去离子水使纳米颗粒浓度为0.25mg/mL，得到P3HT纳米颗粒水分散液；
(2)制备取向PCL微纤维
将PCL溶于氯仿得到质量分数20％的PCL溶液，将PCL溶液置于注射器，注射器接上可注射钝针装入静电纺丝仪；设置纺丝液流速为5mL/h,滑台速率0.1mm/s,静电发生器电压设为10kV，针头距接收器的距离为12cm；采用直径4cm、长15cm的金属滚轴接收器，滚轴接收器转速为500rpm，旋转收集得到PCL微纤维；
(3)微纤维上静电喷涂胶原蛋白
将胶原蛋白溶于去离子水，形成浓度为1mg/mL的胶原蛋白溶液，使用注射器吸取胶原蛋白溶液22.6mL，注射器连接钝针并装入静电纺丝仪；设置溶液挤出速率为3mL/h，滑台移动速率0.2mm/s，电压设为10kV，针头距接收器的距离为12cm，保持步骤(2)中得到的PCL微纤维在滚轴上继续以转速100rpm进行旋转，通过高压将胶原蛋白均匀喷涂至PCL微纤维表面，得到胶原-PCL微纤维；纤维上胶原蛋白浓度为60μg/cm2；
(4)微纤维上静电喷涂P3HT纳米颗粒
用注射器吸取步骤(1)中得到的P3HT纳米颗粒水分散液28.26mL，注射器连接钝针并装入静电纺丝仪；设置溶液挤出速率为3mL/h，滑台移动速率0.2mm/s，电压设为10kV，针头距接收器的距离为12cm，保持步骤(3)中得到的胶原-PCL微纤维在滚轴上继续以转速100rpm进行旋转，将P3HT纳米颗粒喷涂至胶原-PCL微纤维表面，得到P3HT-胶原-PCL复合微纤维，纤维上的P3HT浓度为37.5μg/cm2。
实施例5
本实施例制备具有生物活性的光电响应纳米颗粒复合取向微纤维的步骤如下：
(1)制备亲水性P3HT纳米颗粒
室温下，将P3HT溶于氯仿，形成P3HT浓度为5mg/mL的第一溶液；将SDS溶于去离子水形成浓度为5mmol/L的第二溶液，向第二溶液中加入助表面活性剂正丙醇形成第三溶液(助表面活性剂与第二溶液体积比1:100)；各取第一溶液与第三溶液1mL混合，在150W功率下超声分散20min，然后在65℃，搅拌10min蒸发氯仿形成P3HT纳米颗粒水分散液，将所得溶液冻干称重确定产物浓度，并加一定量的去离子水使纳米颗粒浓度为0.5mg/mL，得到P3HT纳米颗粒水分散液；
(2)制备取向PCL微纤维
将PCL溶于氯仿得到质量分数15％的PCL溶液，将PCL溶液置于注射器，注射器接上可注射钝针装入静电纺丝仪；设置纺丝液流速为5mL/h,滑台速率0.2mm/s,静电发生器电压设为12kV，针头距接收器的距离为12cm；采用直径4cm、长15cm的金属滚轴接收器，滚轴接收器转速为500rpm，旋转收集得到PCL微纤维；
(3)微纤维上静电喷涂胶原蛋白
将胶原蛋白溶于去离子水，形成浓度为0.5mg/mL的胶原蛋白溶液，使用注射器吸取胶原蛋白溶液22.6mL，注射器连接钝针并装入静电纺丝仪；设置溶液挤出速率为3mL/h，滑台移动速率0.1mm/s，电压设为12kV，针头距接收器的距离为12cm，保持步骤(2)中得到的PCL微纤维在滚轴上继续以转速200rpm进行旋转，通过高压将胶原蛋白均匀喷涂至PCL微纤维表面，得到胶原-PCL微纤维；纤维上胶原蛋白浓度为30μg/cm2；
(4)微纤维上静电喷涂P3HT纳米颗粒
用注射器吸取步骤(1)中得到的P3HT纳米颗粒水分散液14.13mL，注射器连接的钝针并装入静电纺丝仪；设置溶液挤出速率为3mL/h，滑台移动速率0.1mm/s，电压设为12kV，针头距接收器的距离为12cm，保持步骤(3)中得到的胶原-PCL微纤维在滚轴上继续以转速200rpm进行旋转，将P3HT纳米颗粒喷涂至胶原-PCL微纤维表面，得到P3HT-胶原-PCL复合微纤维，纤维上的P3HT浓度为37.5μg/cm2。
实施例6
本实施例制备具有生物活性的光电响应纳米颗粒复合取向微纤维的步骤如下：
(1)制备亲水性P3HT纳米颗粒
室温下，将P3HT溶于氯仿，形成P3HT浓度为10mg/mL的第一溶液；将SDS溶于去离子水形成浓度为5mmol/L的第二溶液，向第二溶液中加入助表面活性剂正丙醇形成第三溶液(助表面活性剂与第二溶液体积比1:50)；各取第一溶液与第三溶液1mL混合，在150W功率下超声分散30min，然后在65℃，搅拌10min蒸发氯仿形成P3HT纳米颗粒水分散液，将所得溶液冻干称重确定产物浓度，并加一定量的去离子水使纳米颗粒浓度为0.5mg/mL，得到P3HT纳米颗粒水分散液；
(2)制备取向PCL微纤维
将PCL溶于氯仿得到质量分数15％的PCL溶液，将PCL溶液置于注射器，注射器接上的可注射钝针装入静电纺丝仪；设置纺丝液流速为7.5mL/h,滑台速率0.1mm/s,静电发生器电压设为10kV，针头距接收器的距离为12cm；采用直径4cm、长15cm的金属滚轴接收器，滚轴接收器转速为500rpm，旋转收集得到PCL微纤维；
(3)微纤维上静电喷涂胶原蛋白
将胶原蛋白溶于去离子水，形成浓度为0.5mg/mL的胶原蛋白溶液，使用注射器吸取胶原蛋白溶液22.6mL，注射器连接钝针并装入静电纺丝仪；设置溶液挤出速率为3mL/h，滑台移动速率0.2mm/s，电压设为10kV，针头距接收器的距离为12cm，保持步骤(2)中得到的PCL微纤维在滚轴上继续以转速200rpm进行旋转，通过高压将胶原蛋白均匀喷涂至PCL微纤维表面，得到胶原-PCL微纤维；纤维上胶原蛋白浓度为30μg/cm2；
(4)微纤维上静电喷涂P3HT纳米颗粒
用注射器吸取步骤(1)中得到的P3HT纳米颗粒水分散液18.84mL，注射器连接钝针并装入静电纺丝仪；设置溶液挤出速率为3mL/h，滑台移动速率0.2mm/s，电压设为10kV，针头距接收器的距离为12cm，保持步骤(3)中得到的胶原-PCL微纤维在滚轴上继续以转速200rpm进行旋转，将P3HT纳米颗粒喷涂至胶原-PCL微纤维表面，得到P3HT-胶原-PCL复合微纤维，纤维上的P3HT浓度为50μg/cm2 .。
实施例7
本实施例制备具有生物活性的光电响应纳米颗粒复合取向微纤维的步骤如下：
(1)制备亲水性P3HT纳米颗粒
室温下，将P3HT溶于氯仿，形成P3HT浓度为1mg/mL的第一溶液；将SDS溶于去离子水形成浓度为1mmol/L的第二溶液，向第二溶液中加入助表面活性剂正丙醇形成第三溶液(助表面活性剂与第二溶液体积比1:100)；各取第一溶液与第三溶液1mL混合，在100W功率下超声分散20min，然后在65℃，搅拌10min蒸发氯仿形成P3HT纳米颗粒水分散液，将所得溶液冻干称重确定产物浓度，并加一定量的去离子水使纳米颗粒浓度为0.25mg/mL，得到P3HT纳米颗粒水分散液；
(2)制备取向PCL微纤维
将PCL溶于氯仿得到质量分数20％的PCL溶液，将PCL溶液置于注射器，注射器接上可注射钝针装入静电纺丝仪；设置纺丝液流速为5mL/h,滑台速率0.1mm/s,静电发生器电压设为10kV，针头距接收器的距离为12cm；采用直径4cm、长15cm的金属滚轴接收器，滚轴接收器转速为500rpm，旋转收集得到PCL微纤维；
(3)微纤维上静电喷涂胶原蛋白
将胶原蛋白溶于去离子水，形成浓度为0.5mg/mL的胶原蛋白溶液，使用注射器吸取胶原蛋白溶液22.6mL，注射器连接钝针并装入静电纺丝仪；设置溶液挤出速率为3mL/h，滑台移动速率0.2mm/s，电压设为10kV，针头距接收器的距离为12cm，保持步骤(2)中得到的PCL微纤维在滚轴上继续以转速100rpm进行旋转，通过高压将胶原蛋白均匀喷涂至PCL微纤维表面，得到胶原-PCL微纤维；纤维上胶原蛋白浓度为30μg/cm2；
(4)微纤维上静电喷涂P3HT纳米颗粒
用注射器吸取步骤(1)中得到的P3HT纳米颗粒水分散液37.68mL，注射器连接钝针并装入静电纺丝仪；设置溶液挤出速率为3mL/h，滑台移动速率0.2mm/s，电压设为10kV，针头距接收器的距离为12cm，保持步骤(3)中得到的胶原-PCL微纤维在滚轴上继续以转速100rpm进行旋转，将P3HT纳米颗粒喷涂至胶原-PCL微纤维表面，得到P3HT-胶原-PCL复合微纤维，纤维上的P3HT浓度为50μg/cm2 .。
对比例1
本对比例制备的取向胶原-PCL微纤维的步骤如下：
(1)制备取向PCL微纤维
将PCL溶于氯仿得到质量分数15％的PCL溶液，将PCL溶液置于注射器，注射器接上可注射钝针装入静电纺丝仪；设置纺丝液流速为7.5mL/h,滑台速率0.1mm/s,静电发生器电压设为10kV，针头距接收器的距离为12cm；采用直径4cm、长15cm的金属滚轴接收器，滚轴接收器转速为1000rpm，旋转收集得到PCL微纤维；
(2)微纤维上静电喷涂胶原蛋白
将胶原蛋白溶于去离子水，形成浓度为0.5mg/mL的胶原蛋白溶液，使用注射器吸取胶原蛋白溶液22.6mL，注射器连接钝针并装入静电纺丝仪；设置溶液挤出速率为3mL/h，滑台移动速率0.2mm/s，电压设为10kV，针头距接收器的距离为12cm，保持步骤(2)中得到的PCL微纤维在滚轴上继续以转速100rpm进行旋转，通过高压将胶原蛋白均匀喷涂至PCL微纤维表面，得到胶原-PCL微纤维；纤维上胶原蛋白浓度为30μg/cm2。
对上述部分实施例制备的具有生物活性的光电响应纳米颗粒复合取向微纤维样品进行结构、性能表征如下：
对实施例1制备的P3HT纳米颗粒进行扫描电子显微镜、粒径以及紫外-可见分光光谱表征，表征结果如图1所示，从图1a、b中可看出，所制备的P3HT纳米颗粒粒径在100-200nm左右，其分散性良好，从图1c中的紫外-可见光分光光谱可看出，所制备的P3HT纳米颗粒水分散液在450-620nm波长范围内有一个较宽的吸收峰，吸收峰值出现在510-530nm处的绿光区域。
对实施例1制备的具有生物活性的光电响应纳米颗粒复合取向微纤维(命名为APCP50)、实施例3制备的具有生物活性的光电响应纳米颗粒复合取向微纤维(命名为APCP25)、对比例1制备的取向PCL-胶原纤维(命名为APCP0)进行扫描电子显微镜表征，表征结果如图2所示。从图2中可以看出，制备出的三组纤维都具有定向结构，三组直径分别为5.25±0.27、5.27±0.31、5.27±0.28μm，表明其微观结构没有受到P3HT喷涂的影响；且P3HT纳米颗粒在微纤维表面均匀分布。如图2a和2b的内嵌图所示，随着喷涂量的增加，P3HT纳米颗粒的密度也增加。而P3HT的喷涂不会改变微纤维的尺寸和形状，如图2d的直径统计结果所示。
对实施例1制备的具有生物活性的光电响应纳米颗粒复合取向微纤维APCP50和对比例1制备的取向PCL-胶原纤维进行光电流表征，表征结果如图3所示，使用530nm的LED灯用6mW/cm2的绿光脉冲照射P3HT浓度为50μg/cm2的微纤维时，材料将产生约75pA的随脉冲光照效应的周期性稳定光电流，而对比例1制备的不含P3HT的微纤维将不会产生光电流的响应。
实施例8
本实施例制备细胞装载的光电刺激神经支架及细胞培养的步骤如下：
步骤一，使用打孔器将实施例3中得到的P3HT-胶原-PCL复合微纤维制成直径约1.5cm的圆片，然后暴露在紫外灯下照射1小时进行灭菌；
步骤二，将经神经营养因子诱导分化的大鼠嗜铬细胞瘤(PC12细胞，广泛用作类神经细胞)接种至圆片状材料表面，得到细胞装载的光电刺激神经支架材料，接种密度为1×104个/cm2；
步骤三，步骤二中细胞接种1天后每天对细胞进行30分钟绿光脉冲刺激(1Hz,6mW/cm2)，其余时间在无光照条件(这里是黑暗条件)下进行培养。
实施例9
本实施例制备细胞装载的光电刺激神经支架及细胞培养的步骤如下：
步骤一，使用打孔器将实施例1中得到的P3HT-胶原-PCL复合微纤维制成直径约1.5cm的圆片，然后暴露在紫外灯下照射1小时进行灭菌；
步骤二，将PC12细胞接种至圆片状材料表面，得到细胞装载的光电刺激神经支架材料，接种密度为1×104个/cm2；
步骤三，步骤二中细胞接种1天后每天对细胞进行30分钟绿光脉冲刺激(1Hz,6mW/cm2)，其余时间在无光照条件(这里是黑暗条件)下进行培养。
实施例10
本实施例制备细胞装载的光电刺激神经支架及细胞培养的步骤如下：
步骤一，使用打孔器将实施例5中得到的P3HT-胶原-PCL复合微纤维制成直径约1.5cm的圆片，然后暴露在紫外灯下照射1小时进行灭菌；
步骤二，将PC12细胞接种至圆片状材料表面，得到细胞装载的光电刺激神经支架材料，接种密度为1×104个/cm2；
步骤三，步骤二中细胞接种1天后每天对细胞进行45分钟绿光脉冲刺激(1Hz,4mW/cm2)，其余时间在无光照条件(这里是黑暗条件)下进行培养。
实施例11
本实施例制备细胞装载的光电刺激神经支架及细胞培养的步骤如下：
步骤一，使用打孔器将实施例6中得到的P3HT-胶原-PCL复合微纤维制成直径约1.5cm的圆片，然后暴露在紫外灯下照射1小时进行灭菌；
步骤二，将PC12细胞接种至圆片状材料表面，得到细胞装载的光电刺激神经支架材料，接种密度为2×104个/cm2；
步骤三，步骤二中细胞接种1天后每天对细胞进行30分钟绿光脉冲刺激(1Hz,8mW/cm2)，其余时间在无光照条件(这里是黑暗条件)下进行培养。
实施例12
本实施例制备细胞装载的光电刺激神经支架及细胞培养的步骤如下：
步骤一，使用打孔器将实施例7中得到的P3HT-胶原-PCL复合微纤维制成直径约1.5cm的圆片，然后暴露在紫外灯下照射1小时进行灭菌；
步骤二，将PC12细胞接种至圆片状材料表面，得到细胞装载的光电刺激神经支架材料，接种密度为2×104个/cm2；
步骤三，步骤二中细胞接种1天后每天对细胞进行60分钟绿光脉冲刺激(1Hz,4mW/cm2)，其余时间在无光照条件(这里是黑暗条件)下进行培养。
对比例2
本对比例制备的取向神经支架及细胞培养的步骤如下：
步骤一，使用打孔器将对比例1中得到的胶原-PCL复合微纤维制成直径约1.5cm的圆片，然后暴露在紫外灯下照射1小时进行灭菌；
步骤二，将PC12细胞接种至圆片状材料表面，接种密度为1×104个/cm2；
步骤三，步骤二中细胞接种1天后每天对细胞进行60分钟绿光脉冲刺激(1Hz,6mW/cm2)，其余时间在无光照条件(这里是黑暗条件)下进行培养。
对比例3
本对比例制备的取向神经支架及细胞培养的步骤如下：
步骤一，使用打孔器将对比例1中得到的胶原-PCL复合微纤维制成直径约1.5cm的圆片，然后暴露在紫外灯下照射1小时进行灭菌；
步骤二，将PC12细胞接种至圆片状材料表面，接种密度为1×104个/cm2；
步骤三，步骤二中细胞接种后一直在无光照条件下培养(即黑暗处理)。
对比例4
本实施例制备细胞装载的光电刺激神经支架材料及细胞培养的步骤如下：
步骤一，使用打孔器将实施例1中得到的P3HT-胶原-PCL复合微纤维制成直径约1.5cm的圆片，然后暴露在紫外灯下照射1小时进行灭菌；
步骤二，将PC12细胞接种至圆片状材料表面，接种密度为1×104个/cm2；
步骤三，步骤二中细胞接种后一直在无光照条件下培养(即黑暗处理)。
对比例5
本实施例制备细胞装载的光电刺激神经支架材料及细胞培养的步骤如下：
步骤一，使用打孔器将实施例3中得到的P3HT-胶原-PCL复合微纤维制成直径约1.5cm的圆片，然后暴露在紫外灯下照射1小时进行灭菌；
步骤二，将PC12细胞接种至圆片状材料表面，接种密度为1×104个/cm2；
步骤三，步骤二中细胞接种后一直在无光照条件下培养(即黑暗处理)。
本发明中所制备的细胞装载的光电刺激神经支架材料需要每天进行30分钟的绿光脉冲刺激，以促使材料产生光电流，无线远程刺激支架材料上培养的神经细胞，促进轴突伸长和功能表达。
将对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、实施例8和实施例9制备的细胞装载神经支架材料在装载3、5天后分别对材料上装载的PC12细胞进行FDA/PI染色，然后对染色的支架材料进行激光共聚焦显微镜分析，结果如图4所示。从图中可以看出，PC12细胞在各组支架中均具有良好的活性，表明了通过本发明制备光电刺激神经支架材料优异的生物相容性，并且定期适宜强度绿光照射不会引起细胞死亡。
将对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、实施例8和实施例9制备的细胞装载神经支架材料在装载3、5天后分别对材料上装载的PC12细胞进行细胞骨架与细胞核(F-actin/DAPI)染色，然后对染色的支架材料进行激光共聚焦显微镜分析，结果如图5A。从图5A中可以看出，PC12细胞在材料上沿着微纤维方向上生长。将染色得到的对应细胞装载3、5天的显微镜照片中细胞长度进行统计，结果如图5B所示。从图5B可以看出，相比于其他组，高浓度(50μg/cm2)P3HT的APCP50组上的细胞在定期的绿光照射后细胞的铺展最快，轴突生长最长。
将对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、实施例8和实施例9制备的细胞装载神经支架材料在装载10天后对材料上装载的PC12细胞进行神经发生相关基因TuJ1和Ina的PCR技术分析，分析结果如图6所示。从图6可以看出，相比于其他组，定期绿光照射的APCP50组材料上的细胞的神经发生相关基因TuJ1和Ina的表达量最高。
从上述分析中可以看出，通过本发明制备方法得到的光电刺激神经支架材料，取向的微纤维诱导神经元轴突沿纤维方向生长。由于其中的P3HT纳米颗粒赋予了材料以光电响应特性，在一定强度的绿光照射下能产生稳定的光电流，刺激材料上的细胞，从而能够促进神经元轴突的伸长及神经相关功能的表达，相比于需要电源和复杂的电线系统的电刺激来说，光电刺激不需要连接复杂的线路就可以远程对细胞进行无线刺激，这在组织工程领域显示出了良好的应用前景。
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维，其特征在于，由PCL微纤维，以及依次包覆于PCL微纤维表面的胶原蛋白和亲水性P3HT纳米颗粒构成；所述亲水性P3HT纳米颗粒由半导体聚合物P3HT经十二烷基硫酸钠和正丙醇进行表面改性得到；所述胶原蛋白浓度为30-120μg/cm2；P3HT纳米颗粒浓度为25-50μg/cm2。
2.权利要求1所述的光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备亲水性P3HT纳米颗粒
室温下，将半导体聚合物P3HT溶于第一有机溶剂，形成P3HT浓度为1-10mg/mL的第一溶液；将阴离子表面活性剂溶于去离子水形成浓度为1-10mmol/L的第二溶液，以体积比1:（50-100）的比例向第二溶液中加入助表面活性剂形成第三溶液；将第一溶液与第三溶液等体积混合，经超声反应形成微乳液，然后在搅拌条件下蒸发第一有机溶剂形成P3HT纳米颗粒水分散液；所述第一有机溶剂可以为氯苯、甲苯、二甲苯、氯仿或吡啶；所述阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠；所述助表面活性剂为正丙醇；
（2）制备取向PCL微纤维
将PCL溶于第二有机溶剂得到质量分数10%-20%的PCL溶液，以PCL溶液为原料，采用静电纺丝方法制备得到PCL微纤维；所述第二有机溶剂可以为氯仿、二氯甲烷、二甲基甲酰胺或四氢呋喃；
（3）微纤维上静电喷涂胶原蛋白
将胶原蛋白溶于去离子水，形成浓度为0.5-2mg/mL的胶原蛋白溶液；采用静电喷涂方法使胶原蛋白溶液均匀喷涂至步骤（2）制备的PCL微纤维表面，得到胶原-PCL微纤维；
（4）微纤维上静电喷涂亲水性P3HT纳米颗粒
采用静电喷涂方法，将步骤（1）制备的P3HT纳米颗粒水分散液均匀喷涂至胶原-PCL微纤维表面，得到P3HT纳米颗粒-胶原-PCL微纤维，即光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维。
3.根据权利要求2所述的光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，使用静电纺丝仪进行静电纺丝，设置纺丝液流速为5-7.5 mL/h，滑台速率0.1-0.2mm/s，静电发生器电压设为8-12 kV，滚轴接收器转速为500-1000rpm。
4.权利要求1所述的光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维在光电刺激神经支架材料制备中的应用。
5.一种细胞装载的光电刺激神经支架，其特征在于，将细胞接种于成型的权利要求1所述的光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维材料表面得到；接种细胞密度为0.8-2×104个/cm2。
6.权利要求5所述的细胞装载的光电刺激神经支架制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，将所述光电响应型纳米颗粒复合取向微纤维按照设计形状成型并灭菌；
步骤二，将细胞接种至步骤一成型后的材料表面得到光电刺激神经支架材料，接种细胞密度为0.8-2×104个/cm2。
7.根据权利要求6所述的细胞装载的光电刺激神经支架制备方法，其特征在于，对步骤二制备的光电刺激神经支架材料按照设定的时间间隔进行光电刺激，其余时间在无光照条件下进行培养。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008000045A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-03 University Of Wollongong Nanostructured composites
CN110124113A (zh) * 2019-05-29 2019-08-16 四川大学 取向导电胶原水凝胶、仿生导电神经支架材料及其制备方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10629814B2 (en) * 2017-02-07 2020-04-21 University Of South Florida Coaxial semiconductive organic nanofibers and electrospinning fabrication thereof
US20210246575A1 (en) * 2020-02-07 2021-08-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods and devices for making nanofibers and nanofiber scaffolds

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008000045A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-03 University Of Wollongong Nanostructured composites
CN110124113A (zh) * 2019-05-29 2019-08-16 四川大学 取向导电胶原水凝胶、仿生导电神经支架材料及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Electrospun photosensitive nanofibers: potential for photocurrent therapy in skin regeneration";Guorui Jin，etc.;《Photochemical & Photobiological Sciences》;20120629(第12期);第124-134页 *
PLGA-丝素-胶原纳米三维多孔支架材料的制备及细胞相容性研究;吴刚等;《中国修复重建外科杂志》;20090815(第08期);第1007-1011页 *

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