CN102000363B - 具有良好生物相容性CA/CS/CNTs复合纳米纤维的制备方法 - Google Patents
具有良好生物相容性CA/CS/CNTs复合纳米纤维的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种具有良好生物相容性CA/CS/CNTs复合纳米纤维的制备方法，包括：配制醋酸纤维素溶液，通过静电纺丝工艺制备纳米纤维膜；(2)将上述制备的纳米纤维膜真空干燥；(3)配制壳聚糖与碳纳米管组装液；(4)进行组装；(5)将组装好的复合膜材料于80℃真空干燥12小时备用。本发明制备的纳米纤维具有孔隙率高，生物相容性好，加入多壁碳纳米管后促进细胞的增殖及对蛋白的吸附，且材料的制备过程简单易操作，在组织工程方面应用广阔。
Description
技术领域
本发明属于组织工程人工皮肤材料的制备领域，特别涉及一种具有良好生物相容性CA/CS/CNTs复合纳米纤维的制备方法。
背景技术
目前常用的皮肤修复途径有：自体移植、同种移植、异种移植。但是由于供皮区不足、免疫排斥反应、细菌感染及传播疾病等缺点，寻找一种理想的皮肤替代物或者修复途径一直是临床亟需解决的难题。然而，这一现象不仅仅存在于皮肤损伤修复领域，在其他器官和组织的损伤修复方面也亟需解决。
组织工程的宗旨就在于寻求一种科学的方法，解决器官移植供求不平衡之间的矛盾以及损伤修复困难。构建或预制皮肤组织是解决大面积烧伤患者皮源缺乏的有效方法和根本途径。理想的组织工程化皮肤应能够阻止细菌入侵、能够及时提供、能存放较长时间、能防止体液丢失、在创面长期存活、无抗原性、容易获得且价格适中、应用方便。鉴于这样的背景下，本课题的研究方向与皮肤损伤修复这一发展趋势高度一致，不仅对皮肤替代材料的开发具有重要的参考价值，而且对临床医学界攻克皮肤替代物或者修复途径，甚至于其他器官和组织的损伤修复疑难的解决提供了借鉴和可行的思路。
近年来，纳米技术在许多科学领域中都引起了广泛的重视，纳米材料在电子学、光学、微机械、药物释放、生物材料和催化等领域展现出广阔的应用前景。由于纳米材料的独特性质，在骨、皮肤、血管、神经导管等人工材料的制备方面都具有广阔的应用。静电纺纳米纤维直径在100nm-1000nm范围内，这和细胞外基质的主要成分I型胶原蛋白直径大小极为相近，因此，细胞的黏附和增殖能力都有显著提高。上世纪末至本世纪初，静电纺丝技术得到长足的发展，在组织工程领域也得以广泛的应用。许多科学工作者以天然高分子或者人工合成高分子为原料，利用静电纺丝技术制备出极细的纳米纤维，并且在制备好的纤维膜或者纤维毡上通过层层自组装的方法修饰或改性材料，以提高材料的生物相容性。其中层层自组装技术简单，无需特定的设备，易操作以及重现性好等优点而得到了广泛的研究。例如，丁彬等人以醋酸纤维素为基底，在经静电纺丝得到的纳米纤维上组装上聚电解质壳聚糖和海藻酸钠(ALG)，并探究了在细胞的粘附和增殖方面的影响。然而要获得尺寸均匀、机械性能完好、能够诱导细胞生长的静电纺纳米纤维膜材料，仍然面临巨大的挑战。
碳纳米管(Carbon Nanotubes，CNTs)由于其独特的机械、物理和化学性质，因而在组织工程领域得到了许多潜在的应用。例如，Mattson和Hu等人报道了利用CNTs作为基底促进神经生长，而且神经生长可以通过改变CNTs的表面电荷进行控制。Lovat等人证实了CNTs可以作为基底促进神经信号传导，并支持神经元伸长和细胞黏附。这些研究证实CNTs可以作为一种最有潜力的纳米纤维仿生模拟细胞外基质。进一步的文献检索发现，CNTs展示了可以模拟胶原蛋白并作为支架促进羟基磷灰石的生长，并促进骨组织的生长。在最近的一项研究中，Meng等人研究了含多壁碳纳米管(MWCNTs)的聚氨酯纳米纤维膜对成纤维细胞的生长影响。发现，MWCNTs的介入可以促进细胞的黏附、生长、分化和迁移。我们最近的研究工作也显示了我们能够将MWCNTs和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)共聚物电纺形成纳米纤维，用于提高纤维的机械强力。我们预计将CNTs通过组装或者直接和生物相容性聚合物电纺引入纳米纤维膜材料中，得到的含CNTs的膜材料不仅能够提高纤维机械性能，更为重要的是可以提高细胞的响应，促进细胞的黏附、增殖和分化，为组织工程人工皮肤材料的研制提供新思路。
壳聚糖(Chitosan)是甲壳素的脱乙酰衍生物，是天然多糖中惟一的碱性多糖，可以从虾壳、蟹壳还有一些细菌的细胞壁中大量提取。壳聚糖表面存在大量游离的氨基和羟基，因此可以参加很多化学反应，壳聚糖还有一个特性是它能打开上皮细胞的紧密结合处，因此能很好地将大分子穿过紧密的上皮层。壳聚糖还能黏附于黏膜表面，这又提供了它作为一个黏膜给药体系的可能。作为无毒、来源丰富、具有良好生物相容性及生物可降解性且具有抗菌止血的天然物质，壳聚糖成为应用广泛的生物材料之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有良好生物相容性CA/CS/CNTs复合纳米纤维的制备方法，该方法制备的纳米纤维具有孔隙率高，生物相容性好，加入多壁碳纳米管后促进细胞的增殖及对蛋白的吸附，且材料的制备过程简单易操作，在组织工程方面应用广阔。
本发明的一种具有良好生物相容性CA/CS/CNTs复合纳米纤维的制备方法，包括：
(1)将醋酸纤维素加入到体积比为2∶1的丙酮和二甲基甲酰胺为溶剂，配制成浓度为12.5wt％醋酸纤维素溶液，通过静电纺丝工艺制备纳米纤维膜；
(2)将上述制备的纳米纤维膜真空干燥；
(3)将壳聚糖溶解到醋酸溶液中，加入NaCl，制成浓度为1mg/mL的壳聚糖组装液；将碳纳米管超声溶解到超纯水中，制成浓度为1mg/mL的碳纳米管组装液；
(4)将干燥后的膜浸泡在配制好的壳聚糖与碳纳米管组装液中，组装工艺为：
I.将膜浸泡在带正电荷的壳聚糖溶液中5分钟，超纯水洗膜3次，每次2分钟；
II.再将水洗后的膜浸泡在带负电荷的碳纳米管溶液中5分钟，然后水洗膜3次，每次2分钟；经上述I和II步骤后，组装好一个双层，重复上述I和II步骤；
(5)将组装好的复合膜材料真空干燥。
所述步骤(1)醋酸纤维素的浓度配置在12.5％，浓度过高，纺丝困难，制备不出形貌和直径分布均匀的纳米纤维膜。
所述步骤(1)丙酮和二甲基甲酰胺的体积比为2∶1，并且电压保持在20KV。
所述步骤(1)中静电纺丝工艺参数为：纺丝电压20KV，接收距离20cm，温度25℃，湿度4050％。
所述步骤(2)或(5)干燥的温度为80℃，时间为12h以上。
所述步骤(2)制备好的纳米纤维薄膜放置在真空干燥箱中，80℃干燥12小时以上，使残留的有机溶剂彻底去除。
所述步骤(4)在浸泡自组装过程时，轻轻地搅拌，使纳米纤维膜在组装溶液中充分伸展，接触面积均匀。
将经组装好的复合膜材料经消毒杀菌处理后(消毒杀菌一定要严格按照无菌操作，防止染菌导致实验失败)，用于小鼠成纤维细胞L929的培养以测试其生物相容性，细胞黏附实验时，种植密度为1.0×104，细胞增殖实验时接种密度为1.5×104，用于拍扫描电镜观察细胞在材料上的形态时的种植密度为2.0×104。在细胞培养3天后拍电镜，培养3天的细胞在纤维上充分伸展，形态良好。
使用SEM(扫描电镜)、红外光谱法(ATR-FTIR)、TGA、MTT Assay等方法表征本发明获得的含有多壁碳纳米管的复合纳米纤维膜结果如下：
(1)SEM的测试结果
SEM的测试结果表明：利用静电纺丝制备得到醋酸纤维素纳米纤维膜形貌优良，具有较大的空隙率，纤维平均直径为305nm，主要集中在200-300nm范围内。参见说明书附图一。经层层自组装上壳聚糖和碳纳米管后的纤维材料仍然保持着原有的三维结构，原本光滑的纤维表面变得粗糙，明显在纳米纤维表面沉积了壳聚糖和碳纳米管，见说明书附图二。
(2)ATR-FTIR、TGA测试结果
为了进一步表征纤维膜表面碳纳米管的成功组装，本实验综合红外光谱、TGA测试方法，其结果表明，我们成功地将壳聚糖和碳纳米管组装到醋酸纤维素纳米纤维上，从TGA图谱中看出，随着组装层数增加，组装到纳米纤维膜上的碳纳米管的量逐渐增加，见说明书附图三、图四。
(3)MTT Assay测试结果
MTT Assay测试结果表明，不管是黏附试验还是增殖试验，组装上碳纳米管的复合材料上，细胞的黏附和增殖能力都明显优于不含碳纳米管的材料，随着培养时间的增加，两种材料上细胞的增殖能力差异越来越显著，从第三天开始，组装有碳纳米管的复合材料细胞的增殖分化能力显著优于不含碳纳米管的复合材料，由此说明，加入的碳纳米管能加强细胞在纳米纤维材料上的吸附，细胞在含碳纳米管复合材料上保持良好的形态，并促进细胞增殖、分化，参见附图五。
本发明涉及了两个基本原理：
(1)利用静电纺丝的原理使聚电解质溶液在高压的作用下带电并形成锥形射流，带电的射流在电场力的作用下受到牵伸细化形成纳米纤维，最终以纤维毡的形式沉积在接收板上；
(2)利用带电基板在带相反电荷中的交替沉积制备聚电解质自组装多层膜。
有益效果
本发明制备的纳米纤维具有孔隙率高，生物相容性好，加入多壁碳纳米管后促进细胞的增殖及对蛋白的吸附，改善了醋酸纤维素的生物相容性，且材料的制备过程简单易操作，在组织工程方面应用广阔。
附图说明
图1为本发明利用静电纺丝技术制备好的纳米纤维SEM图；
图2为本发明制备的经静电层层自组装后得到的纤维膜SEM图；
图3为本发明制备的含碳纳米管具有良好生物相容性的复合纳米纤维的FTIR图；
图4为本发明制备的含碳纳米管具有良好生物相容性的复合纳米纤维TGA图；
图5为本发明制备的含碳纳米管具有良好生物相容性的复合纳米纤维小鼠成纤维细胞L929黏附实验时测定细胞活力的MTT图；
图6为本发明制备的含碳纳米管具有良好生物相容性的复合纳米纤维小鼠成纤维细胞L929增殖时测定细胞活力的MTT图；
图7为本发明制备的含碳纳米管具有良好生物相容性的复合纳米纤维上生长的小鼠成纤维细胞L929的SEM图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)配制浓度为12.5wt％的醋酸纤维素，用电子天平称取1.8克醋酸纤维素溶解在15毫升的丙酮/二甲基甲酰胺体积比2∶1的混合溶剂中，配制成浓度为12.5wt％的醋酸纤维素纺丝溶液，用玻璃棒搅拌3分钟左右，再超声30分钟后，磁力搅拌12小时后，得到均匀的醋酸纤维素溶液，备用；
(2)将配制好的12.5wt％的醋酸纤维素溶液超声15分钟，然后将连接有硅胶管的10毫升的注射器，吸取大约7毫升的溶液，固定在注射泵上，并调节流速为1ml/h。纺丝条件设置：接收距离为20cm，电压为20kV，流速为1mL/h，外界环境的温度在25℃，湿度保持在40-50％。制备的纳米纤维收集到铝箔上。先将纳米纤维于空气中自然干燥1天后，再放入真空干燥器中干燥24小时；
将干燥好的纳米纤维膜在扫描电镜下观察，SEM的测试结果表明：有连续的纳米纤维形成，并且纤维上几乎不存在串珠结构，纤维的空隙均匀，纤维形貌较好；
(3)配制静电层层自组装溶液：配制1mg/ml的壳聚糖溶液，称取壳聚糖100mg，溶解在100mL的浓度为1％的醋酸溶液里，加入0.5M的NaCl增强离子强度(加入NaCl的量为2.92克)。配制1mg/mL的海藻酸钠(ALG)溶液，称取ALG100mg，溶解在100毫升的超纯水里，加入0.5M的NaCl增强离子强度(加入NaCl的量为2.92克)。配制1mg/mL的碳纳米管分散液，将研磨均匀的多壁碳纳米管，准确称取100mg，加入100mL超纯水中，超声1小时使碳纳米管在超纯水中分散均匀，配制溶液时所用水均为电阻率18.2MΩ.cm的超纯水。
(4)将静电纺丝得到的醋酸纤维素纳米纤维膜(带负电荷)，在壳聚糖(带正电荷)和碳纳米管(带负电荷)/ALG组装溶液中交替浸泡，自组装工艺为：I、将膜浸泡在带正电荷的壳聚糖中5min，水洗膜3次，每次2min，II、再将水洗后的膜浸泡在带负电荷的碳纳米管/ALG溶液中5分钟，然后水洗膜3次，每次2分钟。经上述I和II步骤后，组装好一个双层，重复上述I和II步骤以达到设计的双层数目。将组装好的多层膜用滤纸先将水吸干，然后置于密封袋中，80℃干燥12小时。得到的CA/CS/CNTs材料为我们的实验材料，得到的CA/CS/ALG为对照材料。
实施例2
在接种小鼠成纤维细胞L929前先将膜放入到24孔板中用钢环压好，75％的酒精处理消毒12小时以上，然后用PBS缓冲液洗三次，第一次加入后随即吸出，第二、第三次加入后20分钟后吸出，使残留的酒精完全洗脱。
在消毒后的每孔加入300μl的培养基，完全浸润材料。用于细胞增殖实验的接种细胞数目为1×104/孔。培养时间梯度为1，3，5，7天。达到培养时间后取出24孔板，移去培养基后加入360μL的纯DMEM培养基和40μL的MTT溶液，放入培养箱中孵育4小时后，取出培养板并吸去上清液，然后加入400μL的DMSO溶解晶体，20分钟后用移液枪吸取其中的100μL紫色溶液于96孔板中(吸取时每一孔换一次枪头)，随即用酶标仪测定吸光值。
Claims (3)
1.一种具有良好生物相容性CA/CS/CNTs复合纳米纤维的制备方法，包括：
（1）将醋酸纤维素加入到体积比为2:1的丙酮和二甲基甲酰胺溶剂中，配制成浓度为12.5wt%醋酸纤维素溶液，通过静电纺丝工艺制备纳米纤维膜；
（2）将上述制备的纳米纤维膜真空干燥；
（3）将壳聚糖溶解到醋酸溶液中，加入NaCl，制成浓度为1mg/mL的壳聚糖组装液；将碳纳米管超声溶解到超纯水中，制成浓度为1mg/mL的碳纳米管组装液；
（4）将干燥后的膜浸泡在配制好的壳聚糖与碳纳米管组装液中，组装工艺为：
Ⅰ.将膜浸泡在带正电荷的壳聚糖组装液中5分钟,超纯水洗膜；
Ⅱ.再将水洗后的膜浸泡在带负电荷的碳纳米管组装液中5分钟，然后水洗膜；
经上述Ⅰ和Ⅱ步骤后，组装好一个双层，重复上述Ⅰ和Ⅱ步骤；
（5）将组装好的复合膜材料真空干燥。
2.根据权利要求1所述的一种具有良好生物相容性CA/CS/CNTs复合纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中静电纺丝工艺参数为：纺丝电压20KV，接收距离20cm，温度25℃，湿度40-50%。
3.根据权利要求1所述的一种具有良好生物相容性CA/CS/CNTs复合纳米纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）或（5）干燥的温度为80℃，时间为12h-24h。
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