CN114369130A - 修饰的硫代寡核苷酸及其应用 - Google Patents

修饰的硫代寡核苷酸及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114369130A
CN114369130A CN202111627283.9A CN202111627283A CN114369130A CN 114369130 A CN114369130 A CN 114369130A CN 202111627283 A CN202111627283 A CN 202111627283A CN 114369130 A CN114369130 A CN 114369130A
Authority
CN
China
Prior art keywords
moe
lna
modified
thiooligonucleotide
ome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111627283.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114369130B (zh
Inventor
宋更申
张宏雷
王环宇
陈玺朝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HANGZHOU TIANLONG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Original Assignee
HANGZHOU TIANLONG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HANGZHOU TIANLONG PHARMACEUTICAL CO Ltd filed Critical HANGZHOU TIANLONG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority to CN202111627283.9A priority Critical patent/CN114369130B/zh
Publication of CN114369130A publication Critical patent/CN114369130A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114369130B publication Critical patent/CN114369130B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供一种修饰的硫代寡核苷酸及其应用。所述修饰的硫代寡核苷酸为硫代寡核苷酸YK102的5′末端的最后2～5个核苷酸和3′末端的最后2～5个核苷酸经过gapmer修饰而成的寡核苷酸。本发明采用gapmer策略对硫代寡核苷酸YK102的序列侧翼进行行化学修饰，从而大大提高了硫代寡核苷酸的稳定性和生物学活性，降低了细胞毒性，可用于治疗肿瘤。

Description

修饰的硫代寡核苷酸及其应用
技术领域
本发明涉及核酸修饰技术领域，具体地说，涉及一种修饰的硫代寡核苷酸及其应用。
背景技术
寡核苷酸，是一类30个以下碱基的短链核苷酸的总称(包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，反义寡核苷酸用于抑制RNA片段，防止其翻译成蛋白，在治疗癌症等疾病过程中具有积极作用。
反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides，ASO)是靶向调节IGF1R信号通路的方法之一，其可与靶mRNA的特定序列碱基配对形成双链，从而激活RNase H降解mRNA或防止RNA翻译蛋白，从而抑制目标基因表达。迄今为止，国际上已有多个反义核酸类药物批准上市(Vitravene、Kynamro、Spinraza、Exondys 51、Defitelio、Macugen、Amondys 45、Tegsedi、Waylivra、Vyondys 53和NS-065等)。
由于反义寡核苷酸的稳定性较差，在体内容易被核酸酶降解，因此通过对合成的反义寡核苷酸进行化学修饰，以增加反义寡核苷酸的血清稳定性，从而有效地抑制目的基因的表达。
目前，人们对反义寡核苷酸在血清中的降解过程和机制缺乏足够的认识，依靠经验随机地利用修饰核苷酸取代反义寡核苷酸分子中的多个核苷酸，有时能很好地提高反义寡核苷酸分子的血清稳定性。但是，反义寡核苷酸分子的血清稳定性、生物学活性和细胞毒性之间并不存在着直接相关的关系。
在反义寡核苷酸分子中引入了过量的修饰，可能会增加修饰后的反义寡核苷酸的细胞毒性，并在很多情况下降低了反义寡核苷酸的生物学活性(CN111849988A、CN103184222B、CN113330118A)。通过修饰来提高反义寡核苷酸分子的血清稳定性和生物学活性，同时降低细胞毒性是很非常困难的，且无规律可循。
发明内容
本发明的目的是通过设计反义寡核苷酸的修饰物，来提高反义寡核苷酸分子的血清稳定性和生物学活性，同时降低细胞毒性，从而提供一种修饰的硫代寡核苷酸及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种修饰的硫代寡核苷酸，其为硫代寡核苷酸YK102的5′末端的最后2～5个核苷酸和3′末端的最后2～5个核苷酸经过gapmer修饰而成的寡核苷酸。
所述寡核苷酸为YK102，序列如SEQ ID NO:1所示。
硫代寡核苷酸YK102是指SEQ ID NO:1所示序列中核苷酸单体之间通过3′,5′-硫代磷酸二酯键连接。
修饰的核苷酸可选自2′F-RNA、2′-O-Me、2′-O-MOE、LNA等中的任一种：
Figure BDA0003439983340000021
其中，Base表示碱基，选自以下碱基中的任一种：腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶，5-甲基胞嘧啶；
Me为甲基。
进一步地，修饰的核苷酸单体之间通过磷酸基团、硫代磷酸酯基团或二硫代磷酸酯基团连接。
优选地，所述修饰的硫代寡核苷酸为YK102-1～YK102-9中的任一种：
YK102-1：5′-T(OMe)C(OMe)C(OMe)T(OMe)CCGGAGCCAGACT(OMe)T(OMe)C(OMe)A(OMe)-3′
YK102-2：5′-T(MOE)C(MOE)C(MOE)T(MOE)CCGGAGCCAGACT(MOE)T(MOE)C(MOE)A(MOE)-3′
YK102-3：5′-T(MOE)C(MOE)C(MOE)TCCGGAGCCAGAC(MOE)T(MOE)T(MOE)C(MOE)A(MOE)-3′
YK102-4：5′-T(LNA)C(LNA)C(LNA)TCCGGAGCCAGACTT(LNA)C(LNA)A(LNA)-3′
YK102-5：5′-T(MOE)C(MOE)C(F)T(F)CCGGAGCCAGACT(F)T(F)C(MOE)A(MOE)-3′
YK102-6：5′-T(MOE)C(MOE)C(MOE)T(F)C(OME)C(F)GGAGCCAGACT(F)T(MOE)C(MOE)A(MOE)-3′
YK102-7：5′-T(LNA)C(LNA)C(LNA)T(F)CCGGAGCCAGACT(F)T(LNA)C(LNA)A(LNA)-3′
YK102-8：5′-T(LNA)C(LNA)C(LNA)T(F)C(F)CGGAGCCAGAC(F)T(F)T(LNA)C(LNA)A(LNA)-3′
YK102-9：5′-T(LNA)C(LNA)C(LNA)T(OMe)CCGGAGCCAGACT(OMe)T(LNA)C(LNA)A(LNA)-3′
更优选YK102-3或YK102-4，最优选YK102-3。
第二方面，本发明提供一种药物组合物，包括所述修饰的硫代寡核苷酸和药学上可接受的载体。
第三方面，本发明提供所述修饰的硫代寡核苷酸在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述肿瘤包括但不限于肝癌。
第四方面，本发明提供IGF1R基因或IGF1R信号通路抑制剂，有效成分为所述修饰的硫代寡核苷酸。
第五方面，本发明提供所述修饰的硫代寡核苷酸在抗肿瘤(如治疗肝癌)方面的用途。
第六方面，本发明提供所述修饰的硫代寡核苷酸在靶向抑制IGF1R基因或IGF1R信号通路方面的用途。
具体地，本发明提供一种反义寡核苷酸YK102，核苷酸序列为：5’-TCCTCCGGAGCCAGACTTCA-3’(SEQ ID NO:1)，其是经硫代修饰的寡核苷酸。以肿瘤相关基因细胞增殖受体IGF1R基因为靶标设计一种寡核苷酸，采用PE公司产391A型DNA合成仪合成，经Micro PureH反向柱(Solid Phase Science)纯化后，得到该反义寡核苷酸，寡核苷酸链中磷酸上带双键的氧原子被硫原子取代的衍生物，分子式为C192H245O99N72S19P19，化学名为：胸腺嘧啶核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-2′-脱氧胞嘧啶核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-2′-脱氧胞嘧啶核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-胸腺嘧啶核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-2′-脱氧胞嘧啶核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-2′-脱氧胞嘧啶核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-2′-脱氧鸟嘌呤核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-2′-脱氧鸟嘌呤核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-2′-脱氧腺嘌呤核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-2′-脱氧鸟嘌呤核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-2′-脱氧胞嘧啶核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-2′-脱氧胞嘧啶核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-2′-脱氧腺嘌呤核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-2′-脱氧鸟嘌呤核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-2′-脱氧腺嘌呤核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-2′-脱氧胞嘧啶核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-胸腺嘧啶核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-胸腺嘧啶核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-2′-脱氧胞嘧啶核苷基-(3′→5′O,O-硫代磷酸基)-2′-脱氧腺嘌呤核苷(命名为YK102)。结构式如下：
Figure BDA0003439983340000031
由于反义寡核苷酸的稳定性较差，且没有组织靶向性，因此在体内容易被核酸酶降解。
YK102是以IGF1R为靶点开发的一个具有显著抑制肿瘤增殖作用的反义核酸药物，与目前用于肝癌治疗的分子靶向药物不同，作为一类全新的基因靶向治疗药物，其特点是作用靶点明确、易于设计且能从根本上对疾病进行治疗。与传统的细胞毒化疗药物相比，靶向治疗药物特异性强，不良反应小，疗效更确切。
前期设计了大量不同的gamer修饰，筛选后发现表1中所示的序列，如YK102-2、YK102-3和YK102-4具有良好效果：提高了反义寡核苷酸分子的血清稳定性和生物学活性(抑制肿瘤相关基因细胞增殖受体IGFlR基因的表达)，同时降低了细胞毒性，可用于治疗肿瘤。
表1本发明设计的反义寡核苷酸及其修饰物
编号 序列
YK102 5′-TCCTCCGGAGCCAGACTTCA-3′(SEQ ID NO:1)
YK102-1 5′-T(OMe)C(OMe)C(OMe)T(OMe)CCGGAGCCAGACT(OMe)T(OMe)C(OMe)A(OMe)-3′
YK102-2 5′-T(MOE)C(MOE)C(MOE)T(MOE)CCGGAGCCAGACT(MOE)T(MOE)C(MOE)A(MOE)-3′
YK102-3 5′-T(MOE)C(MOE)C(MOE)TCCGGAGCCAGAC(MOE)T(MOE)T(MOE)C(MOE)A(MOE)-3′
YK102-4 5′-T(LNA)C(LNA)C(LNA)TCCGGAGCCAGACTT(LNA)C(LNA)A(LNA)-3′
YK102-5 5′-T(MOE)C(MOE)C(F)T(F)CCGGAGCCAGACT(F)T(F)C(MOE)A(MOE)-3′
YK102-6 5′-T(MOE)C(MOE)C(MOE)T(F)C(OME)C(F)GGAGCCAGACT(F)T(MOE)C(MOE)A(MOE)-3′
YK102-7 5′-T(LNA)C(LNA)C(LNA)T(F)CCGGAGCCAGACT(F)T(LNA)C(LNA)A(LNA)-3′
YK102-8 5′-T(LNA)C(LNA)C(LNA)T(F)C(F)CGGAGCCAGAC(F)T(F)T(LNA)C(LNA)A(LNA)-3′
YK102-9 5′-T(LNA)C(LNA)C(LNA)T(OMe)CCGGAGCCAGACT(OMe)T(LNA)C(LNA)A(LNA)-3′
其中，YK102-3和YK102-4，尤其是YK102-3，相比于其他的修饰，大大提高了反义寡核苷酸分子的血清稳定性和生物学活性(抑制肿瘤相关基因细胞增殖受体IGFlR基因的表达)，同时降低了细胞毒性，可以作为药物优化的方向。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明采用gapmer策略对硫代寡核苷酸YK102的序列侧翼进行行化学修饰，从而大大提高了硫代寡核苷酸的稳定性和生物学活性，降低了细胞毒性，可用于治疗肿瘤。
具体实施方式
本发明提供一种修饰的硫代寡核苷酸，采用gapmer修饰对硫代寡核苷酸YK102进行化学修饰，所述硫代寡核苷酸的序列长度为20个碱基，碱基序列为5′-TCCTCCGGAGCCAGACTTCA-3′，所述gapmer修饰为在所述硫代寡核苷酸的5′末端的最后2～5个核苷酸和3′末端的最后2～5个核苷酸进行修饰。
在本发明的一个具体实施方式中，所述修饰的硫代寡核苷酸中，修饰核苷酸被替换为以下的任一种：
Figure BDA0003439983340000051
其中，Base表示碱基，选自以下碱基中的任一种：腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶，5-甲基胞嘧啶；
Me为甲基。
在本发明的一个具体实施方式中，所述修饰的硫代寡核苷酸具有以下gapmer结构之一：3-14-3,4-14-2,2-14-4,3-13-4,4-13-3,2-13-5,5-13-2,4-12-4,3-12-5,5-12-3,5-10-5。
在本发明的一个具体实施方式中，所述修饰的硫代寡核苷酸中，修饰核苷酸之间通过磷酸基团、硫代磷酸酯基团或二硫代磷酸酯基团连接。
在本发明的一个具体实施方式中，所述修饰的硫代寡核苷酸的序列选自表1中YK102-1～YK102-9中的任一种。
本发明还提供一种组合物，其包括所述修饰的硫代寡核苷酸和药学上可接受的载体。
本发明还提供所述修饰硫代寡核苷酸或组合物在制备治疗肝癌的药物中的用途。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1修饰的硫代寡核苷酸的合成
1、硫代寡核苷酸YK102的合成
YK102的序列为：5′-TCCTCCGGAGCCAGACTTCA-3′(SEQ ID NO:1)。
仪器和试剂：美国GE公司OligoPilot 400合成仪，其固相载体为交联聚苯乙烯珠(cross-linked polystyrene bead)，交联聚苯乙烯珠连接有碱基为修饰核苷单体A，且C5′-羟基被DMT保护的初始核苷酸。
制备方法如下：
依照单体浓度为1g:30mL，用乙腈分别配制以下核苷酸单体溶液：DMT-dA(bz)亚磷酰胺单体(式1)、DMT-dC(bz)亚磷酰胺单体(式2)、DMT-dG(ibu)亚磷酰胺单体(式3)和DMT-dT亚磷酰胺单体(式4)。
Figure BDA0003439983340000061
采用如下步骤制备：
(1)脱保护
使用3％的二氯乙酸的甲苯溶液作为脱保护试剂，脱掉DMT保护基，之后使用乙腈进行清洗。
(2)偶联
使用0.25M的5-乙硫基四氮唑作为活化剂，对每个核苷酸单体的乙腈溶液进行偶联，之后使用乙腈进行冲洗。
(3)氧化
使用3％的氢化黄原素的吡啶溶剂作为氧化剂，进行氧化，之后使用乙腈进行冲洗。
(4)羟基保护
使用10％的乙酸酐为羟基保护试剂，进行羟基保护，之后使用乙腈进行冲洗。
重复以上操作，按照设定的序列循环进行，得到全保护的产物。
(5)使用3％的二氯乙酸的甲苯溶液为脱保护试剂，脱掉最后一个核苷酸的DMT保护基，之后使用乙腈进行清洗。
(6)氨解及纯化
将固相载体转移至反应器中，加入浓氨水(25-28％)，在70℃保持氨解18h后，体系降至室温，并将混合物转移至压滤罐中，用纯化水与乙醇的混合溶液进行淋洗，合并滤液，过层析柱，浓缩，冻干，得产品，含量为93.4％。
2、硫代寡核苷酸YK102-3的合成
YK102-3的核苷酸序列为：5′-T(MOE)C(MOE)C(MOE)TCCGGAGCCAGAC(MOE)T(MOE)T(MOE)C(MOE)A(MOE)-3′。
制备方法如下：
依照单体浓度为1g:30mL，用乙腈分别配制以下核苷酸单体溶液：DMT-dA(bz)亚磷酰胺单体(式1)、DMT-dC(bz)亚磷酰胺单体(式2)、DMT-dG(ibu)亚磷酰胺单体(式3)、DMT-dT亚磷酰胺单体(式4)、DMT-dT-MOE亚磷酰胺单体(式5)、DMT-dC-MOE亚磷酰胺单体(式6)和DMT-dA-MOE亚磷酰胺单体(式7)。
Figure BDA0003439983340000071
采用如下步骤制备：
(1)脱保护
使用3％的二氯乙酸的甲苯溶液作为脱保护试剂，脱掉DMT保护基，之后使用乙腈进行清洗。
(2)偶联
使用0.25M的5-乙硫基四氮唑作为活化剂，对每个核苷酸单体的乙腈溶液进行偶联，之后使用乙腈进行冲洗。
(3)氧化
使用3％的氢化黄原素的吡啶溶剂作为氧化剂，进行氧化，之后使用乙腈进行冲洗。
(4)羟基保护
使用10％的乙酸酐为羟基保护试剂，进行羟基保护，之后使用乙腈进行冲洗。
重复以上操作，按照设定的序列循环进行，得到全保护的产物。
(5)使用3％的二氯乙酸的甲苯溶液为脱保护试剂，脱掉最后一个核苷酸的DMT保护基，之后使用乙腈进行清洗。
(6)氨解及纯化
将固相载体转移至反应器中，加入浓氨水(25-28％)，在70℃保持氨解18h后，体系降至室温，并将混合物转移至压滤罐中，用纯化水与乙醇的混合溶液进行淋洗，合并滤液，过层析柱，浓缩，冻干，得产品。经HPLC检测滤液中YK102-3的含量为93.2％。
3、硫代寡核苷酸YK102-4的合成
YK102-4的核苷酸序列为：5′-T(LNA)C(LNA)C(LNA)TCCGGAGCCAGACTT(LNA)C(LNA)A(LNA)-3′。
使用的锁核酸单体为：DMT-dT-LNA亚磷酰胺单体(式8)、DMT-dC-LNA亚磷酰胺单体(式9)和DMT-dA-LNA亚磷酰胺单体(式10)。
Figure BDA0003439983340000081
制备方法同硫代寡核苷酸YK102-3的合成，最终制得产品的含量为92.5％。
其他硫代寡核苷酸的合成方法同硫代寡核苷酸YK102-3的合成，YK102-1、YK102-2、YK102-5、YK102-6、YK102-7、YK102-8、YK102-9含量分别为92.3％、92.8％、92.1％、92.7％、92.4％、92.6％、92.3％。
实施例2修饰的硫代寡核苷酸的稳定性检测
采用以下方法对表1中的硫代寡核苷酸及其修饰物进行血清稳定性检测：
将4μL浓度为20μM的未修饰的和不同化学修饰硫代寡核苷酸加入到含有4μL胎牛血清和32μL 1×PBS溶液中，血清的终浓度为10％；在37℃条件下将反应体系孵育一定的时间后取样，一般为0、3和6小时；每次取10μL样本并进行液氮速冻，以立即中止血清核酸酶对siRNA的作用，然后将样本保存于-80℃条件下备用。
配置20％的聚丙烯酰胺凝胶，将3μL的上样缓冲液(30mM EDTA，36％甘油，0.06％溴酚蓝)与siRNA的降解样本进行混合，然后上样，在80mA的恒流条件下电泳。电泳结束后，用1×Sybr Gold染料(Invitrogen，Cat.11494)进行10分钟的染色后照相，结果如表2所示。
实施例3修饰的硫代寡核苷酸的活性测定
采用以下方法分别对表1中的硫代寡核苷酸及其修饰物进行细胞增殖抑制活性测定：
人肝癌(HepG2)细胞株由军事医学科学院提供。将其用含10％小牛血清及100U/ml青霉素，100μg/ml链磁素的DMEM培养液，置37℃,5％CO2孵箱培养。在96孔细胞培养板中，每孔接种5×103细胞/0.2ml。待50-60％细胞融合后，在无血清状态下，采用lipofectin(GIBCO,1mg/ml)试剂并参照说明书操作进行未修饰和修饰硫代反义寡核苷酸转染。每条未修饰或修饰硫代反义寡核苷酸设置3个浓度，分别为0.2μmol/L、0.4μmol/L和0.8μmol/L。每个浓度3孔，每孔总体积为100μ1，并设置细胞和脂质体对照。转染5小时后，换含10％小牛血清的DMEM培养基培养19小时，于培养48小时后，每孔加20μL MTS(Promega)，并继续培养90分钟，于492nm测定光吸收，计算抑制率结果如表2所示。
实施例4修饰的硫代寡核苷酸的细胞毒性检测
采用以下方法分别对表1中的硫代寡核苷酸及其修饰物进行细胞毒性检测：
将在DMEM培养基(10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100个单位/毫升的青霉素和100μg/ml的链霉素)中培养的人胚胎肾细胞(HEK293)接种到24孔板中(1×105细胞/孔)；待细胞生长24小时后，细胞的融合度为50％左右时，将培养基换为Opti-MEM培养基(Gibco公司)；然后将化学合成的修饰硫代反义寡核苷酸通过Lipofectamine2000(Invitrogen公司，美国)进行细胞转染，修饰硫代反义寡核苷酸的终浓度为13nM，每种硫代反义寡核苷酸平行转染三个复孔，未修饰硫代反义寡核苷酸和无硫代反义寡核苷酸的三个转染复孔分别作为对照；4小时后再将转染介质换成1ml DMEM培养基(10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100个单位/毫升的青霉素和100μg/ml的链霉素)；24小时后吸去培养液，用PBS洗涤一次，每孔加1ml PBS和10μl MTT(噻唑蓝)染液，在37℃5％CO2的二氧化碳培养箱中培养4-6小时；每孔加0.1ml酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解；酶联免疫检测仪测定570nm处各孔A值，并按照以下公式计算细胞生长抑制率，结果如表2所示。
细胞生长抑制率(％)＝(对照组平均A值-实验组平均A值)/对照组平均A值×100％
表2未修饰和修饰硫代反义寡核苷酸的位点稳定性、表达抑制率和生长抑制率
Figure BDA0003439983340000091
Figure BDA0003439983340000101
注：“+”表示经血清孵育后，反义寡核苷酸主带完全消失，可见明显的降解条带；
“++”表示经血清孵育后，反义寡核苷酸主带虽有降解但仍清晰可见，可见明显的降解条带；
“+++”表示经血清孵育后，反义寡核苷酸主带清晰未见降解，未见明显的降解条带。
由表2可知，不同的gamer修饰均能提高硫代反义寡核苷酸的位点稳定性。
然而，与未修饰的硫代反义寡核苷酸YK102相比，YK102-1、YK102-2、YK102-5、YK102-6、YK102-7、YK102-8、YK102-9均降低了生物活性(抑制肿瘤相关基因细胞增殖受体IGFlR基因的表达)。生物活性降低了20％-30％，不适合作为药物优化的候选物。
同时，与未修饰的硫代反义寡核苷酸YK102相比，YK102-7、YK102-8、YK102-9均增加了对细胞的毒性，对细胞的毒性增加了10％左右，不适合作为药物优化的候选物。
另外，YK102-1、K102-2和YK102-3显著降低了细胞的毒性，YK102-4、YK102-5和YK102-6的细胞毒性和未修饰的硫代反义寡核苷酸YK102相当。
综上，考虑血清稳定性、生物学活性和细胞毒性，认为YK102-3和YK102-4，尤其是YK102-3，相较其他的修饰，大大提高了反义寡核苷酸分子的血清稳定性和生物学活性(抑制肿瘤相关基因细胞增殖受体IGFlR基因的表达)，同时降低了细胞毒性(或与未修饰的活性相当)，可以作为药物优化的方向。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 杭州天龙药业有限公司
<120> 修饰的硫代寡核苷酸及其应用
<130> KHP211125987.6
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcctccggag ccagacttca 20

Claims (10)

1.一种修饰的硫代寡核苷酸，其特征在于，其为硫代寡核苷酸YK102的5′末端的最后2～5个核苷酸和3′末端的最后2～5个核苷酸经过gapmer修饰而成的寡核苷酸；
所述寡核苷酸为YK102，序列如SEQ ID NO:1所示；
硫代寡核苷酸YK102是指SEQ ID NO:1所示序列中核苷酸单体之间通过3′,5′-硫代磷酸二酯键连接。
2.根据权利要求1所述修饰的硫代寡核苷酸，其特征在于，修饰的核苷酸选自2′F-RNA、2′-O-Me、2′-O-MOE、LNA中的任一种：
Figure FDA0003439983330000011
其中，Base表示碱基，选自以下碱基中的任一种：腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶，5-甲基胞嘧啶；
Me为甲基。
3.根据权利要求1所述修饰的硫代寡核苷酸，其特征在于，修饰的核苷酸单体之间通过磷酸基团、硫代磷酸酯基团或二硫代磷酸酯基团连接。
4.根据权利要求1-3任一项所述修饰的硫代寡核苷酸，其特征在于，其为YK102-1～YK102-9中的任一种：
YK102-1：5′-T(OMe)C(OMe)C(OMe)T(OMe)CCGGAGCCAGACT(OMe)T(OMe)C(OMe)A(OMe)-3′
YK102-2：5′-T(MOE)C(MOE)C(MOE)T(MOE)CCGGAGCCAGACT(MOE)T(MOE)C(MOE)A(MOE)-3′
YK102-3：5′-T(MOE)C(MOE)C(MOE)TCCGGAGCCAGAC(MOE)T(MOE)T(MOE)C(MOE)A(MOE)-3′
YK102-4：5′-T(LNA)C(LNA)C(LNA)TCCGGAGCCAGACTT(LNA)C(LNA)A(LNA)-3′
YK102-5：5′-T(MOE)C(MOE)C(F)T(F)CCGGAGCCAGACT(F)T(F)C(MOE)A(MOE)-3′
YK102-6：5′-T(MOE)C(MOE)C(MOE)T(F)C(OME)C(F)GGAGCCAGACT(F)T(MOE)C(MOE)A(MOE)-3′
YK102-7：5′-T(LNA)C(LNA)C(LNA)T(F)CCGGAGCCAGACT(F)T(LNA)C(LNA)A(LNA)-3′
YK102-8：5′-T(LNA)C(LNA)C(LNA)T(F)C(F)CGGAGCCAGAC(F)T(F)T(LNA)C(LNA)A(LNA)-3′
YK102-9：5′-T(LNA)C(LNA)C(LNA)T(OMe)CCGGAGCCAGACT(OMe)T(LNA)C(LNA)A(LNA)-3′。
5.根据权利要求4所述修饰的硫代寡核苷酸，其特征在于，其为YK102-3或YK102-4。
6.根据权利要求5所述修饰的硫代寡核苷酸，其特征在于，其为YK102-3。
7.药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-6任一项所述修饰的硫代寡核苷酸和药学上可接受的载体。
8.权利要求1-6任一项所述修饰的硫代寡核苷酸在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肝癌。
10.IGF1R基因或IGF1R信号通路抑制剂，其特征在于，有效成分为权利要求1-6任一项所述修饰的硫代寡核苷酸。
CN202111627283.9A 2021-12-28 2021-12-28 修饰的硫代寡核苷酸及其应用 Active CN114369130B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111627283.9A CN114369130B (zh) 2021-12-28 2021-12-28 修饰的硫代寡核苷酸及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111627283.9A CN114369130B (zh) 2021-12-28 2021-12-28 修饰的硫代寡核苷酸及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114369130A true CN114369130A (zh) 2022-04-19
CN114369130B CN114369130B (zh) 2023-10-03

Family

ID=81142143

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111627283.9A Active CN114369130B (zh) 2021-12-28 2021-12-28 修饰的硫代寡核苷酸及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114369130B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115944597A (zh) * 2022-09-28 2023-04-11 北京悦康科创医药科技股份有限公司 硫代寡核苷酸注射剂及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1358859A (zh) * 2000-12-11 2002-07-17 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 细胞增殖受体igfir基因靶标的反义寡核苷酸结构和用途
CN102125696A (zh) * 2011-01-11 2011-07-20 清华大学深圳研究生院 抑制肿瘤生长及血管生成的寡聚核酸组合物及其应用
CA2942394A1 (en) * 2014-04-01 2015-10-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating sod-1 expression
CN110650727A (zh) * 2017-04-19 2020-01-03 拜奥-帕斯控股股份有限公司 用于igf-1r抑制的p-乙氧基核酸

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1358859A (zh) * 2000-12-11 2002-07-17 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 细胞增殖受体igfir基因靶标的反义寡核苷酸结构和用途
CN102125696A (zh) * 2011-01-11 2011-07-20 清华大学深圳研究生院 抑制肿瘤生长及血管生成的寡聚核酸组合物及其应用
CA2942394A1 (en) * 2014-04-01 2015-10-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating sod-1 expression
CN110650727A (zh) * 2017-04-19 2020-01-03 拜奥-帕斯控股股份有限公司 用于igf-1r抑制的p-乙氧基核酸

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAN-DAN LU, ET AL.: "Sequence conWrmation of synthetic phosphorothioate oligodeoxynucleotides using Sanger sequencing reactions in combination with mass spectrometry", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》, pages 81 - 89 *
JIE FU, ET AL.: "Enzyme-Linked Bridging Assay Method for the Quantification of Oligonucleotide-Based Drugs in Biological Matrices", 《NUCLEIC ACID THERAPEUTICS》, vol. 21, no. 6, pages 403 - 413 *
冯指泉等: "离子交换色谱法测定反义寡核苷酸药物CT102 的含量", 《国际药学研究杂志》, vol. 40, no. 4, pages 485 - 490 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115944597A (zh) * 2022-09-28 2023-04-11 北京悦康科创医药科技股份有限公司 硫代寡核苷酸注射剂及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114369130B (zh) 2023-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5763539B2 (ja) ５’及び２’ビス置換ヌクレオシド及びそれから製造されるオリゴマー化合物
EP2895200B1 (en) Multimeric oligonucleotide compounds
JP5572090B2 (ja) テトラヒドロピラン核酸類似体
EP2176280B1 (en) 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
AU2009322290B2 (en) Una oligomer structures for therapeutic agents
JP6005628B2 (ja) 修飾ヌクレオシド、その類似体、およびこれらから調製されるオリゴマー化合物
ES2386492T3 (es) Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos carbocíclicos
US9428750B2 (en) Oligomeric compounds comprising tricyclic nucleosides and methods for their use
JP2007505138A (ja) 末端に連結された二環糖部分を有する、ギャップ化オリゴマー化合物
EP2125852A1 (en) 5&#39;-substituted-2&#39;-f modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EA009670B1 (ru) МОДУЛИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ eIF4E
JP2008501694A (ja) 遺伝子調節の使用のために個別に修飾された鎖を有する二本鎖組成物
US7713944B2 (en) Oligomers comprising activated disulfides which bind to plasma proteins and their use for delivery to cells
CN110760516B (zh) 核酸适配体衍生物和氨基化的核酸适配体衍生物以及它们的应用和药物偶合物
WO2020027227A1 (ja) オリゴヌクレオチドを含有する小細胞肺癌治療薬
CN114369130B (zh) 修饰的硫代寡核苷酸及其应用
Koch et al. Locked nucleic acid
RU2112766C1 (ru) Олигонуклеотиды, фармацевтическая композиция
CN107709561B (zh) 修饰的siRNA及含有该修饰的siRNA的药物组合物
WO2006034321A2 (en) Oligomeric compounds effecting drosha-mediated cleavage
JPWO2016093229A1 (ja) ハイブリダイゼーション安定化用核酸複合体、核酸ハイブリダイゼーションの安定化方法、医薬組成物、核酸検出用プローブ、アンチセンス核酸医薬品、ｍｉｃｒｏＲＮＡ抑制剤及び核酸複合体
JP2022120380A (ja) ｍｉＲＮＡ１３３－ｂ誘導体及びその利用
WO2024137545A1 (en) Arnatar compounds and methods for enhanced cellular uptake

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant