CN114364308A - 通过图像处理和人工智能增强的生物材料的快速染色 - Google Patents

通过图像处理和人工智能增强的生物材料的快速染色 Download PDF

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Abstract

本发明尤其提供了简单(例如，一步)且快速地(例如，<60秒)对样品进行染色，在不洗涤的情况下对其成像，并且通过机器学习算法生成与使用洗涤的标准染色相似的最终图像的装置和方法。

Description

通过图像处理和人工智能增强的生物材料的快速染色
交叉引用
本申请要求于2019年6月2日提交的美国临时申请第62/856,140号的权益，将其全部内容出于所有目的并入本文。
技术领域
本发明尤其涉及用于进行细胞和/或组织染色和成像的装置和方法。
背景技术
在生物和化学测定(例如诊断测试)中，通常需要快速、简单且低成本地染色可视化和分析生物样品。本发明提供了用于实现这些目的的装置和方法。特别地，本发明尤其提供了简单(例如，一步)且快速地(例如，<60秒)对样品进行染色，在不洗涤的情况下对其进行成像，并且通过机器学习算法生成与使用洗涤的标准染色相似的最终图像的装置和方法。
发明内容
本发明的一个方面是在不洗涤的情况下进行快速病理学和细胞学。特别地，本发明涉及简单且快速地在不洗涤的情况下对准备用于成像的样品进行染色且孵育时间短(少于几分钟，或60秒或以下)的装置和方法。
本发明的另一方面是使用机器学习算法从拍摄自未经洗涤的被染色的样品的图像生成目标图像，其中，目标图像具有与经洗涤的被染色的样品相似的质量。
本发明的另一方面是使用训练数据集来训练机器学习算法，训练数据集包含未经洗涤的被染色的样品的至少一张图像和经洗涤的被染色的样品的至少一张图像。
本发明的另一方面是一种用于在不洗涤的情况下对样品进行染色的试剂盒，包含：(a)第一板和第二板，第一板和第二板面向彼此并且由间隔分开；以及(b)具有一定浓度的染色试剂，染色试剂对样品进行染色以用于分析；其中，选择间隔和浓度使得当样品和染色试剂被夹在第一板与第二板之间并且在不洗涤的情况下进行成像时，样品的染色是可见的。
本发明的另一方面是选择两个板之间的间隔使得染色试剂可以快速地扩散到样品上，并且染色快速达到饱和(例如，30秒或以下或60秒或以下)。
本发明不是虚拟染色，而是图像增强，其通过机器学习，从使用低浓度试剂进行染色或采用短得多的染色时间进行染色的图像(在这些情况下图像具有非常低的对比度和高噪声水平或两者)生成高质量染色图像。
在一些实施例中，一种用于在不洗涤的情况下对样品进行染色和成像的方法，包含：
(a)提供第一板和第二板；
(b)将样品和染色试剂夹在第一板与第二板之间，其中，染色试剂对样品进行染色；
(c)在不洗涤的情况下捕获被染色的样品的第一图像，其中，洗涤除去染色试剂的至少一部分；以及
(d)使用机器学习算法从第一图像生成被染色的样品的目标图像；
其中，使用训练数据集来训练所述机器学习算法，训练数据集包含未经洗涤的被染色的样品的至少一张图像和经洗涤的被染色的样品的至少一张图像。
在一些实施例中，一种用于在不洗涤的情况下对样品进行染色的试剂盒，包含：
(a)第一板和第二板，第一板和第二板面向彼此并且由间隔分开；
(b)具有一定浓度的染色试剂，染色试剂对样品进行染色以用于分析；
其中，选择间隔和浓度使得当样品和染色试剂被夹在第一板与第二板之间并且在不洗涤的情况下进行成像时，样品的染色是可见的。
在一些实施例中，一种用于对样品进行染色和成像的系统，包含：
(a)如先前实施例所述的试剂盒；
(b)成像器，成像器用于捕获位于第一板与第二板之间的被染色的样品的图像；
(c)非瞬态存储介质，非瞬态存储介质存储机器学习算法，机器学习算法从被染色的样品的图像生成目标图像。
其中，使用训练数据集来训练所述机器学习算法，训练数据集包含未经洗涤的被染色的样品的至少一张图像和经洗涤的被染色的样品的至少一张图像。
在一些实施例中，一种用于对样品进行染色和成像的方法，包含：
(a)提供第一板和第二板，其中，两个板中的一个或两个包含至少三个位置标记，其中，至少三个位置标记中的每一对之间具有预定距离；
(b)将样品和染色试剂夹在第一板与第二板之间，其中，染色试剂对样品进行染色；
(c)捕获被染色的样品和至少三个位置标记的第一图像；以及
(d)使用机器学习算法从第一图像生成被染色的样品的目标图像；
其中，使用训练数据集来训练机器学习算法，训练数据集包含至少三个位置标记和在第一组条件下染色的被染色的样品的至少一张图像，以及在第二组条件下染色的被染色的样品的至少一张图像。
在一些实施例中，一种用于对样品进行染色的试剂盒，包含：
(a)第一板和第二板，第一板和第二板面向彼此并且由间隔分开，其中，两个板中的一个或两个包含至少三个位置，其中，至少三个位置标记中的每一对之间具有预定距离；以及
(b)具有一定浓度的染色试剂，染色试剂对样品进行染色以用于分析；
其中，选择间隔和浓度使得当样品和染色试剂被夹在第一板与第二板之间并且在不洗涤的情况下进行成像时，样品的染色是可见的。
在一些实施例中，一种用于对样品进行染色和成像的系统，包含：
(a)如先前实施例所述的试剂盒；
(b)成像器，成像器用于捕获位于第一板与第二板之间的被染色的样品的图像；
(c)非瞬态存储介质，非瞬态存储介质存储机器学习算法，机器学习算法从被染色的样品的图像生成目标图像。
(d)其中，使用训练数据集来训练所述机器学习算法，所述训练数据集包含所述至少三个位置标记和在第一组条件下染色的所述被染色的样品的至少一张图像，以及在第二组条件下染色的所述被染色的样品的至少一张图像。
根据任一先前实施例所述的装置、试剂盒、系统和方法，还包含间隔件，间隔件调节第一板与第二板之间的距离。
在一些实施例中，两个板之间的间隔或间隔件的高度在0.5um至30um之间选择。
在一些实施例中，所述两个板之间的间隔或所述间隔件的高度为10um。
在一些实施例中，两个板能够相对于彼此移动。
在一些实施例中，选择两个板之间的间隔或间隔件的高度以使染色饱和时间为5秒、10秒、20秒、30秒、60秒或在这些值中任意两者之间的范围内。
在一些实施例中，还包含间隔件，间隔件调节第一板与第二板之间的距离。
在一些实施例中，样品是组织。
在一些实施例中，机器学习算法采用CycleGAN。
在一些实施例中，机器学习算法采用基于GAN的像素到像素变换。
在一些实施例中，使用训练数据集来训练机器学习算法，训练数据集包含至少三个位置标记和在第一组条件下染色的被染色的样品的至少一张图像，以及在第二组条件下染色的被染色的样品的至少一张图像。
在一些实施例中，机器学习算法至少采用四个位置标记。
在一些实施例中，所述机器学习算法采用位置标记，所述位置标记在x方向上的几何形状和/或所述位置标记之间的间距不同于在与所述x方向正交的y方向上的几何形状和/或间距。
在一些实施例中，样品包含体液，体液选自由以下组成的群组，羊水、房水、玻璃体液、血液、母乳、脑脊髓液(CSF)、耳垢(耳屎)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、粪便、呼吸、胃酸、胃液、淋巴、粘液、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、风湿液、唾液、呼出的冷凝物、皮脂、精液、痰液、汗液、滑液、泪液、呕吐物、尿液，以及它们的任何组合。
在一些实施例中，染色是H&E染色、免疫组织化学染色、免疫荧光染色和原位杂交染色，或它们的任何组合。
在一些实施例中，染色试剂是涂覆在至少一个板的表面上的干染色试剂。
根据任一先前实施例所述的装置、试剂盒和方法，其中，染色试剂是涂覆在板中的至少一个的表面上的干染色试剂，并且其中，染色溶液是将干染色剂转移到样品中的转移液体。
在一些实施例中，间隔件是位置标记。
在一些实施例中，相邻间隔件之间或相邻位置标记之间的间距在50μm至120μm的范围内。
在一些实施例中，间隔件间距(ISD)的四次方除以柔性板的厚度(h)和柔性板的杨氏模量(E)，ISD4/(hE)，等于或小于106um3/GPa。
在一些实施例中，间隔件的高度在1.8至50μm的范围内选择，IDS为100um或以下。间隔件间距(IDS)的四次方除以柔性板的厚度(h)和柔性板的杨氏模量(E)(ISD4/(hE))为5×105um3/GPa或以下；柔性板的厚度乘以柔性板的杨氏模量在60至750GPa-um的范围内。
在一些实施例中，两个板之间的间隔由间隔件调节。在一些实施例中，两个板能够相对于彼此移动成不同的构造，包括开放构造和闭合构造。
附图说明
本领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明的目的。附图不旨在以任何方式限制本发明的范围。附图没有完全按比例绘制。在给出实验数据点的图中，连接数据点的线仅用于引导观察数据，而没有其他意义。
图1一个用于使用机器学习，从通过在不洗涤的情况下以低染色试剂浓度进行快速染色而制备的样品的图像，实现高质量图像的实施例。
图2一个用于实现在不洗涤的情况下进行快速染色的实施例(间隔件是可选的)
图3生成用于机器学习算法的针对不洗涤的1分钟H&E染色的训练数据集的图。在具有小间隔的两个板之间以低染色浓度进行短时间(例如60秒)染色的组织的第一组图像。然后，移除第二板并再次对相同的组织进行染色，但使用带有洗涤的标准染色程序。在标准染色后拍摄的第二组图像。
图4训练机器学习算法以进行基于高分辨率机器学习的预测染色的图示。
图5将机器学习算法用于基于高分辨率机器学习的预测染色的图示。
具体实施方式
以下详细描述通过示例而非限制的方式示出了本发明的一些实施例。本文使用的章节标题和任何副标题仅用于组织目的，而不应被解释为以任何方式限制所描述的主题。章节标题和/或副标题下的内容不限于章节标题和/或副标题，而是适用于本公开的整个描述。
任何出版物的引用是为了在申请日之前公开，并且不应被解释为承认本权利要求无权凭借在先发明而先于此类出版物。此外，所提供的公开日期可以不同于实际的公开日期，其可能需要单独确认。
术语“本公开”和“本发明”可以互换。
术语“FAST”(全部以大写字母表示)是指本发明的“快速染色”，其包括但不限于本发明所述的所有快速染色装置和/或方法。
术语“使用Q卡在不使用洗涤的情况下进行测定(包括病理学中的染色)”和“使用Q卡在无洗涤的情况下进行测定(包括病理学中的染色)”可以互换。
术语“洗涤”是指使用溶液除去用于对样品进行染色的染色试剂的至少一部分。
用于Q卡的板的术语“在闭合构造中”和“处于闭合构造”可以互换。
术语“分析物”和“生物标记”可以互换。
术语“样品”包括但不限于生物材料。
使用两个板和机器学习的不洗涤的快速染色
在当今的病理学和细胞学中，在对样品进行成像以进行分析之前，对样品进行染色通常需要多个步骤和至少一个洗涤步骤。
根据本发明的一个方面，如图1和2所示，(i)将样品和染色试剂(或含有染色试剂的染色溶液)置于两个板之间，然后在不洗去染色试剂的情况下对样品进行成像以用于分析；以及(i i)使用机器学习算法来处理所述第一组图像以生成目标图像，其中，使用训练数据集来训练机器学习算法，训练数据集包含未经洗涤的被染色的样品的至少一张图像和经洗涤的被染色的样品的至少一张图像。
在进行不洗涤的染色的第一步骤中，选择两个板之间的间隔(因此样品和染色试剂层薄)和染色试剂的浓度，使得当样品和染色试剂被夹在第一板与第二板之间并且在不洗涤的情况下进行成像时，样品的染色是可见的。
在一些实施例中，染色试剂的浓度和较短染色时间被配置成用于不洗涤的快速染色和成像，其中，图像不具有如同使用洗涤的正常多步染色的高对比度，而是应用机器学习算法以从低染色浓度、较短染色时间和未洗涤样品的低对比度图像构建最终图像。
本发明不是虚拟染色，而是图像增强，其通过机器学习，从使用低浓度试剂进行染色或采用短得多的染色时间进行染色的图像(在这些情况下图像具有非常低的对比度和高噪声水平或两者)生成高质量染色图像。
两个板间的间隔小以用于减少孵育时间和背景噪声
根据本发明，出于几个原因，在两个板之间使用小的间隔。
(1)两个板之间的间隔小使得染色溶液的厚度变薄，这减小了染色剂在染色溶液中穿过该厚度到达样品的扩散距离，因此减小了扩散时间和饱和染色时间。这使得孵育时间较短。这也可以节省染色剂用量，从而降低成本。
(2)两个板之间的间隔小还减少了由染色溶液中的未消耗的染色剂产生的成像中的背景噪声。我们通过实验发现，对于给定的样品和具有一定浓度的染色溶液，两个板之间的间隔越小(即，薄层厚度越薄)，成像中的背景噪声越小，被染色的样品的图像越清晰。
染色溶液中染色剂的浓度和间隔
根据本发明，选择染色溶液中染色剂的浓度，使得对于两个板之间的给定间隔小(这使得样品和染色溶液层的厚度较薄)并且在孵育结束时，染色溶液中的大部分染色剂被消耗用于染色目标组织或细胞，而很少留在染色溶液中。这可以大大降低成像中的背景噪声并且可以节省用于染色剂的成本。这也可以避免使样品过度染色。
样品接收的染色试剂总量取决于两个板之间的间隔和染色试剂的浓度。在一些实施例中，选择间隔和浓度使得当样品和染色试剂被夹在第一板与第二板之间并且在不洗涤的情况下进行成像时，样品的染色是可见的。
在一些实施例中，当使用选定的间隔和浓度时，为了使样品的染色在不洗涤的情况下是可见的，样品被轻微染色并且对比度低。根据本发明，使用机器学习算法从轻度染色且未洗涤的低对比度图像生成类似于良好染色且经洗涤的样品的高对比度图像。
根据本发明，在使用Q卡进行测定(包括染色)的一些实施例中，两个板之间的间隔被配置成使测定的染色饱和时间为5秒、10秒、20秒、30秒、60秒、90秒、120秒、180秒、300秒、600秒，或在这些值中任两者之间的范围内。在一些实施例中，两个板之间的间隔为0.5um、1um、2um、5um、10um、20um、30um、40um、50um，或在这些值中任两者之间的范围内。在一些实施例中，两个板之间的间隔由位于两个板之间的间隔件的高度调节。间隔件的高度为0.5um、1um、2um、5um、10um、20um、30um、40um、50um，或在这些值中任两者之间的范围内。
在一些优选实施例中，染色饱和时间为5秒、10秒、20秒、30秒、60秒，或在这些值中任两者之间的范围内。在一些优选实施例中，两个板之间的间隔为0.5um、1um、2um、5um、10um、20um，或在这些值中任两者之间的范围内。在一些实施例中，两块板之间的间隔为10um。在一些优选实施例中，间隔件的高度为0.5um、1um、2um、5um、10um、20um，或在这些值中任两者之间的范围内。在一些实施例中，间隔件的高度为10um。
训练用于对不经洗涤快速染色的样品进行成像的机器学习算法的示例
图3示出了生成用于机器学习算法的对不经洗涤的1分钟H&E染色进行成像的训练数据集的实施例。该训练包含：1.将组织切片放置在第一板上；2.将组织和染色溶液(H&E染色试剂)夹在第一板与第二板之间，使用低染色试剂浓度染色1分钟，不洗涤；3.在显微镜下拍摄被染色的组织的第一组图像；4.移除第二板；5.使用带有洗涤的标准染色再次对经轻度染色的组织进行染色；6.在显微镜下拍摄再次染色的样品的第二组图像；7.使用第一组图像和第二组图像来训练机器学习算法。
训练用于生物材料的快速染色的机器学习算法的另一示例
图4示出了本发明中用于训练基于高分辨率机器学习的预测染色模型的过程300的框图。在过程300的各种实现方式中，一些动作可以被移除、组合或分解成子动作。训练过程在动作模块303处开始，动作模块303为建立变换模型准备快速染色但未洗涤的图像。在一些实施例中，动作模块303包含以下(训练数据准备，用于域A－快速染色但未洗涤的样品的图像，以及域B－良好染色且经洗涤的样品的图像)：
a.将生物材料放置在样品保持Q卡上，其中，染色试剂以下列方式中的一种或组合添加到生物材料中：
i.将染色试剂打印到Q卡的第二板上，如图2所示，并且闭合第二板，使生物材料与染色试剂接触，如图2所示；
i i.当卡开放时，将染色试剂直接添加到图2中的第一板上的样品保持Q卡上的生物材料中，然后如图2所示，闭合卡以使染色试剂与生物材料接触；和/或
i i i.将染色试剂印刷在第二板上，在第二板与样品之间提供转移介质，并将转移介质和第二板夹在第一板与第二板之间，其中，染色试剂可以溶解在转移介质中并扩散到样品中。
b.如图2所示，在快速染色时间间隔(例如在一些实施例中为60秒)拍摄闭合的样品保持Q卡中的生物材料的图像(即，样品和染色试剂被夹在第一板与第二板之间)，并拍摄用于训练数据库DB1的图像；
c.打开第二板，同时将生物材料保持在第一板上，如图2所示，向Q卡上的生物材料中加入更多的染色试剂并孵育；进行洗涤以去除未用于生物材料染色的染色试剂；以及，拍摄处于闭合构造的Q卡中的被染色的生物材料的图像，并将其保存到训练数据库DB2中。
因此，构建的图像数据库DB1包含来自域A的图像－快速染色但未洗涤的生物材料的图像，DB2包含来自域B的图像－良好染色且经洗涤的生物材料的图像。然后，使用DB1和DB2来训练机器学习算法。
在一些实施例中，DB1和DB2中的图像来自相同的生物样品。在一些实施例中，DB1和DB2中的图像来自相同的生物样品和样品的相同区域。在一些实施例中，DB1和DB2中的图像来自不同的生物样品，不形成匹配对。
在本发明中，根据图2中的板上的柱，DB1和DB2中的图像被进一步分割成图像片。并且机器学习模型(即算法)训练是为了建立变换模型，该变换模型将快速染色但未洗涤的生物材料的图像变换成其充分洗涤且被染色的对应部分，以来自DB2的图像作为指导。在一些实施例中，通过图像分割的训练包含以下动作：
a.从DB1中取图像，根据图像中Q卡的柱，将每个图像分割成片，其中，每个图像片具有由第二板(也称为“x板”)上的四个柱限定的四个角。其中，每一对柱之间的距离在卡(即，板)制造期间是预先确定的(即，已知的)，并且在DB-A中保存从每个图像切割的片(在一些实施例中，使用至少三个柱(称为“位置标记”)，每对柱之间具有预定距离)；
b.从DB2中取图像，根据图像中Q卡的柱将每个图像分割成片，其中，每个图像片具有四个角，对应于Q卡的四个柱，四个柱通过卡的制造具有已知轮廓，并在DB-B中保存从每个图像中切割的片；以及
c.将取自DB-A的图像片作为输入A，如图4中的组件303所示，将取自DB-B的图像片作为输入B，如图4中的组件312所示；
d.执行循环机器学习训练，该训练将DB-A中的快速染色但未洗涤的样品的图像片的图像变换到由DB-B中的充分洗涤的样品的图像片为范例的充分洗涤的染色样品的图像对应物的域，并将DB-B中的图像变换到以DB-A的图像为范例的快速染色但未洗涤的样品的图像的域，采用循环一致性以及附加约束，即图像片的已知边缘轮廓是对准的。
在一些实施例中，使用循环机器学习，例如CycleGAN，是为了绕过对来自两个不同图像域的完全对齐的匹配图像对的要求，这可能难以获得。循环机器学习，例如CycleGAN，基于循环变换F的框架：域A至域B和G：域B到域A，采用循环一致性约束，使得G(F(x))～x并且F(G(y))～y，其中x∈domain A并且y∈domain B。
循环一致性，例如在CycleGAN机器学习中使用的那些，使得许多应用成为可能，但是它需要被增强以获得较高的变换保真度。在本发明中，使用Q卡柱结构来将图像分割成片，增加了对图像变换的附加结构约束。这样，即使图像片不成对，也可以使用由第二板上的四个柱限定的四个角来匹配图像，其中，在卡(即，板)制造期间，每一对柱之间的距离是先预确定的(即，已知的)(在许多情况下，由于柱的制造精度高，例如，使用纳米压印的高精度制造工艺，匹配也具有较高精度)。本发明中的这种独特的结构约束增强了图像变换中的循环一致性并提高了变换图像中的保真度。
在一些实施例中，可以得到来自两个域的完全对齐的匹配对，训练使用基于匹配对的图像到图像变换，将快速染色但未洗涤的样品的图像变换为其最终染色且经洗涤的样品的图像，以用于测定。
用于生物材料的快速染色的机器学习的另一示例
图5示出了过程200的框图，该过程使用经训练的机器学习算法执行用于快速染色且未洗涤的样品的基于机器学习的预测染色，如图4中所讨论的。基于机器学习的预测染色包含：
a.拍摄图2所示的样品保持Q卡中的生物材料的第一图像，并以较短染色时间间隔，例如60秒，对样品进行孵育；
b.如图5的动作模块201和203所示，根据样品保持Q卡的柱的结构(例如，在第二板上)将第一图像分割成片，其四个角对应于Q卡中的四个柱；
c.基于来自图5的过程300的模型—快速染色机器学习模型(即算法)，执行基于机器学习的预测染色，以将每个图像片从快速染色但未洗涤的样品的图像变换为新图像，该新图像与图5的动作模块203所示的良好染色且经洗涤的高分辨率对应图像片相似；以及
d.如图5的动作模块204和205所示，将变换后的图像片粘贴到最终的快速洗涤图像中，以用于分析。
在一些实施例中，在训练中收集的快速染色图像在对应于快速染色图像拍摄时刻的多个时刻拍摄，例如30秒、60秒、90秒、120秒等。在一些实施例中，一个机器学习模型将在多个时刻拍摄的快速染色图像变换为一个良好染色且经洗涤的高分辨率图像。在一些实施例中，为每个选定时刻建立单独的机器学习模型，以将该时刻上的快速轻度染色的图像变换为良好染色且经洗涤的高分辨率对应图像。
在一些实施例中，在用于快速染色的图像变换中添加关于取向的附加结构约束，其中，柱被制造成矩形形状，其较长边平行于y轴，其较短边平行于x轴。这样，柱和柱所包围的图像片的取向可以进一步增强图像变换中的结构约束，以获得较高的保真度。在一些实施例中，柱在x方向上的周期不同于在y方向上的周期。
在一些实施例中，来自快速染色的训练图像片数据库DB-A沿着图像的原始方向定向。这是通过这样的方式来实现的，根据被柱围绕的图像片的四个角的柱的取向来检测该图像片的取向，并且如果需要使图像片竖直，即四个角的柱的长边平行于y轴，则旋转图像片。在数据库DB-B中的训练图像片上进行同样的操作，数据库DB-B是从充分洗涤且被染色的图像获得的。DB-A和DB-B中的特定取向的图像数据被用在如图4所示的机器学习模型训练过程300中。在快速染色中，图像被分割成由柱包围的片，保持原始取向，即它们的角柱的长边平行于y轴，执行图5的过程200以将快速染色但未洗涤的生物材料变换为其充分洗涤且被染色的对应物，以用于分析。
训练用于对不经洗涤快速染色(H&E染色)的样品进行成像的机器学习算法的另一示例
石蜡包埋的组织切片(Zyagen,CA)，10um柱高PMMA膜，苏木精和伊红染色试剂盒(Vector lab,CA)。
实验步骤：
1.使用2次Histoclear对组织切片进行脱蜡，并将切片从100％乙醇与蒸馏水水合。
2.用于第一组图像的轻度染色和成像：
a.在微量离心管中混合来自苏木精和伊红染色试剂盒(Vector lab)的5ul苏木精溶液和5ul的伊红溶液；
b.将10ul H&E染色溶液滴在组织切片上，用10um柱高PMMA膜覆盖，室温孵育1分钟；
c.在显微镜下对组织切片进行成像。
3.成像后，轻轻取出10um柱高PMMA膜，用蒸馏水洗涤载玻片，继续对相同的组织切片进行标准H&E染色和成像。
4.用于第二组图像的标准H&E染色和成像：
a.施加足量的苏木精以完全覆盖组织切片，并孵育5分钟。
b.用2次更换蒸馏水冲洗载玻片(每次15秒)，以去除多余的染色。
c.施加足量的上蓝试剂以完全覆盖组织切片，并孵育10至15秒。
d.用2次更换蒸馏水冲洗载玻片(每次15秒)。
e.将载玻片浸入100％乙醇中(10秒)，并吸干过量。
f.施加足量的伊红Y溶液以完全覆盖组织切片，并孵育2至3分钟。
g.使用100％乙醇冲洗载玻片(10秒)。
h.用3次更换100％乙醇对载玻片进行脱水(每次1至2分钟)。
i.Hi stoclear和盖玻片。
j.在显微镜下拍摄标准染色组织切片的第二组图像。
5.使用两组图像训练机器学习算法。
在一些实施例中，成像是顺序地拍摄多个图像的过程。在分析中，将对多幅图像进行分析和处理，然后根据某种算法(包括信号处理和机器学习)用于构建染色的最终图像。
在一些实施例中，两个连续图像之间的时间间隔为1秒或以下、10秒或以下、30秒或以下、60秒或以下、90秒或以下、120秒或以下、150秒或以下、240秒或以下、300秒或以下，或者任两个之间的间隔。
在一些实施例中，重建算法使用机器学习算法，其根据已知的最终结果训练重建。
在一些实施例中，重建算法使用信号处理，其选择每个图像的特征用于重建，其中信号处理算法由已知的最终结果的范例确定。
在一些实施例中，与一般的多重染色相比，染色试剂的浓度大大降低。
在本发明的一些实施例中，其还包含确定受试者的疾病和/或病症的步骤。
在本发明的一些实施例中，其包含以下特征，它们可单独或以任何组合使用：
1.两个板是QMAX卡中的两个板，其中Q-MAX卡在本发明说明书的其余部分中进行揭示。
2.在成像步骤期间，体积A和B，每个体积具有与两个板之一接触的体积的一个表面和与另一个板接触的体积的另一个表面。
3.探针包含与分析物特异性结合的探针。
4.在成像步骤之前，该方法还包含透化细胞的步骤。
5.在一些实施例中，细胞透化通过将干燥的透化剂涂覆在其中一个板上进行。
6.在上述步骤(将样品和探针夹住)中，探针包含形成探针的染色液体，其中，染色溶液和样品被夹在两个板之间。
7.在被成像的样品区域中，两个板之间的间隔(即，两个板的内表面之间的距离，其中内表面是面向样品的表面)为0.5um、1um、2um、3um、5um、10um、15um、20um、30um、50um，或在这些值中的任两者之间的范围内。
在一些优选实施例中，两个板之间的间隔(即，两个板的内表面之间的距离，其中内表面是面向样品的表面)为0.5um、1um、2um、3um、5um、10um、15um，或在这些值中的任两者之间的范围内。
8.Q卡上的间隔件的高度为0.5um、1um、2um、3um、5um、10um、15um、20um、30um、50um，或在这些值中任两者之间的范围内。在一些优选实施例中，Q卡上的间隔件的高度为0.5um、1um、2um、3um、5um、10um、15um，或在这些值中任两者之间的范围内。
9.在被成像的样品区域中，两个板之间的间隔被配置为使得分析物与探针之间的结合的饱和时间变为10秒或以下、20秒或以下、30秒或以下、60秒或以下、90秒或以下、120秒或以下、240秒或以下、300秒或以下、500秒或以下，或在任两者之间的范围内。
在优选实施例中，两个板之间的间隔被配置成使分析物和探针之间的结合的饱和时间变为10秒或以下、20秒或以下、30秒或以下、60秒或以下、90秒或以下、或120秒或以下。
提供另外的描述和实施例以说明在本公开的其余部分中描述的方法，例如待测定的分析物、用于快速染色的标签和样品、用于在染色中拍摄样品的图像的适配器、成像装置(例如，显微镜或智能电话)、执行快速染色的系统、测定中的细胞类型例如真核生物或原核生物，以及与本发明的快速测定相关的疾病和病症。在快速染色过程中，细胞可以在形成之前或之后透化。细胞可以与样品保持装置(例如Q卡)中的柱形成单层，作为用探针使测定信号成像的参考。
快速染色可以是多重的，并且在一些实施例中，使用多种探针(即不同种类的探针)。
术语“透化”细胞是指使细胞允许大分子如抗体和/或核酸进入细胞内部。
并且在一些实施例中，样品是没有任何液体稀释的全血。
更多示例
A1.在一些实施例中，一种用于在不洗涤的情况下对生物材料进行快速染色的方法，包含：
a)将生物材料沉积在样品保持器的平坦载玻片上，其中，样品保持器具有两个能够打开和闭合的接触板，以在它们之间的间隙中保持生物材料样品，其中，多个监测结构柱置于接触表面上，其中，多个柱按照图案放置，并且接触板接触在生物材料中含有多种分析物的样品；
b)通过将染色试剂印刷在接触表面上或在样品保持器打开时将染色试剂直接沉积在样品上，或通过二者的组合对生物材料进行染色；
c)闭合样品保持器的接触板，使样品与染色试剂接触，在不洗涤的情况下以短的时间间隔拍摄闭合的样品保持器中的样品的图像；
d)将来自(c)的样品的快速染色且未洗涤的图像分割成不相交的片，其中，每个图像片由位于其四个角处的柱包围；
e)将来自(d)的图像片馈送到图像变换模块，图像变换模块将快速染色且未洗涤的图像片变换为良好染色且经洗涤的样品的图像，其中，图像变换基于经过训练的机器学习模型，具有以下约束，柱(通过卡的制造形成，位于图像片的顶点)的已知边缘轮廓(即，位置标记)或柱之间的间距的约束在变换中对准；以及
f)将来自(e)的变换的图像片收集并缝合成高分辨率染色图像，以用于测定。
A2.在一些实施例中，根据A1所述的方法，还包含训练图像变换模型，图像变换模型在测定中将生物材料的快速染色且未洗涤的图像变换为其高分辨率被染色且充分洗涤的对应物，训练图像变换模型包含：
a)在DB1中收集快速染色且未洗涤的生物材料的多个图像，其中样品保持板闭合，并且在预定的时刻拍摄图像，例如60秒；
b)将DB1中的每幅图像分割成在其四个角处具有柱的被柱围绕的图像片，并保存在DB-A中；
c)在DB2中收集充分洗涤且被染色的图像的多个图像，其中样品保持板闭合；
d)将DB2中的每幅图像分割成在其四个角处具有柱的被柱围绕的图像片，并保存在DB-B中；
e)将DB-A中的图像片作为域1的输入，将DB-B中的图像片作为域2的输入，进行循环机器学习模型训练，例如如CycleGAN，附加约束为位于图像片顶点处的柱的已知边缘轮廓对准；以及
f)保存正向变换模型，正向变换模型将快速染色且未清洗的图像片变换为其高分辨率、被染色且充分洗涤的图像，以用于生物材料的快速染色。
A3：在一些实施例中，根据A2所述的方法，其中，DB1和DB2中的图像片是成对且对准的，还包含：
a)将DB-A中的图像片与DB-B中的与其匹配的图像片配对以形成配对图像对，其中，图像片由位于其四个角处的柱分割；
b)训练基于图像到图像变换(例如，基于GAN的像素到像素变换)的机器学习模型，将来自(a)的配对图像对作为输入，附加约束为位于图像片的顶点处的柱的已知边缘轮廓对准；以及
c)保存变换模型，该变换模型将快速染色且未洗涤的图像变换为其高分辨率、被染色且充分洗涤的对应物。
A4：在一些实施例中，根据A1、A2和A3所述的方法，还包含：
a.利用四个角的柱的长边平行于y轴的矩形柱，使A1、A2、A3中的图像片朝向图像的原始方向；
b.根据A2和A3的DB-A和DB-B中的被柱围绕的图像片的四个角的柱的取向来检测该图像片的取向，并且如果需要使图像片与其原始方向对准，则旋转图像片；
c.在图像变换模型的训练中应用方向定向的图像片，在快速染色且无洗涤的图像片的变换中将图像片定向到其原始方向；以及
d.缝合变换的图像片以形成高分辨率、被染色且充分洗涤的图像，以用于测定。
A5：在一些实施例中，根据A1、A2和A3所述的方法，其中，快速染色且未洗涤在多个时刻成像，还包含：
a)在A2和A3之后，在多个时刻将快速染色且未洗涤的所有图像片收集到一个数据库中并且训练一个机器学习变换模型；或
b)对于每个采样时刻，例如30s、60s和90s，在A2和A3之后的该时刻训练单独的机器学习变换模型，以将在该时刻拍摄的快速染色且未洗涤图像变换为其高质量、被染色且充分洗涤的对应物。
A6：在一些实施例中，一种快速染色且不洗涤的方法，其在不洗涤或等待整个方案/程序完成的情况下从初始染色步骤生成生物材料的高分辨率、被染色且充分洗涤的图像，包含：
a)将生物材料沉积在样品保持器中，其中，根据已知图案和形状放置多个柱；
b)将染色试剂沉积到样品保持器中的生物材料上；
c)在预先指定的时刻(例如60秒)拍摄样品保持器中的快速染色且未清洗的生物材料的图像；
d)将快速染色且洗涤的图像分割成在四个角具有柱的被柱围绕的片；
e)使用机器学习模型将每个图像片变换为其高分辨率、被染色且充分洗涤的对应物，附加约束为在变换中位于图像片的顶点处的柱的已知轮廓对准；以及
f)缝合变换的图像片以形成生物材料的高分辨率、被染色且充分洗涤的图像，以用于测定。
按压后活检样品以上的间隔件的高度
在一些实施例中，按压后活检样品以上的间隔件的平均高度为0.1um、0.2um、0.5um、1um、5um、10um、30um、50um，或在这些值中任两者之间的范围内。
在一些实施例中，按压后活检样品以上的间隔件的优选平均高度为1um、2um、3um、5um、10um，或在这些值中任两者之间的范围内。
按压后活检样品内部的间隔件的高度
在一些实施例中，按压后活检样品内部的间隔件的平均高度为0.1um、0.2um、0.5um、1um、5um、10um、30um、50um，或在这些值中任两者之间的范围内。
在一些实施例中，按压后活检样品内部的间隔件的优选平均高度为1um、2um、3um、5um、10um，或在这些值中任两者之间的范围内。
按压前试剂溶液的体积：
在一些实施例中，装置中未添加液体试剂。
在一些实施例中，将染色试剂印刷到装置的其中一个板上。
在一些实施例中，在按压前将液体试剂添加到第一板或活检样品或第二板上。
在一些实施例中，添加到装置中的液体试剂的体积为0uL、1uL、2uL、3uL、5uL、10uL、20uL、30uL、50uL，或在这些值中任两者之间的范围内。
柔性板的厚度乘以杨氏模量(hE)
在一些实施例中，板中的至少一个是柔性板，并且柔性板的厚度乘以柔性板的杨氏模量在1Gpaμm至1000Gpaμm的范围内。
在一些实施例中，板中的至少一个是柔性板，并且柔性板的厚度乘以柔性板的杨氏模量在10Gpaμm至500Gpaμm的范围内。
在一些实施例中，板中的至少一个是柔性板，并且柔性板的厚度乘以柔性板的杨氏模量优选在20Gpaμm至150Gpaμm的范围内。
在一些实施例中，板中的至少一个是柔性板，并且柔性板的厚度乘以柔性板的杨氏模量优选在1Gpaμm至20Gpaμm的范围内。
间隔件间距(ISD)的四次方除以柔性板的厚度(h)和柔性板的杨氏模量(E)：
在一些实施例中，间隔件间距(IDS)的四次方除以柔性板的厚度(h)和杨氏模量(E)(ISD4/(hE))为5×106um3/GPa或以下。
在一些实施例中，间隔件间距(IDS)的四次方除以柔性板的厚度(h)和杨氏模量(E)(ISD4/(hE))为1×106um3/GPa或以下。
在一些实施例中，间隔件间距(IDS)的四次方除以柔性板的厚度(h)和杨氏模量(E)(ISD4/(hE))为5×105um3/GPa或以下。
柔性板的厚度(h)：
在一些实施例中，板是柔性板，并且柔性板的厚度为1um至500um。
在一些实施例中，板是柔性板，并且柔性板的优选厚度为3um至175um。
在一些实施例中，板是柔性板，并且柔性板的优选厚度为5um至50um。
杨氏模量(E)：
在一些实施例中，板中的至少一个是柔性板，并且柔性板的杨氏模量为0.01GPa至100GPa。
在一些实施例中，板中的至少一个是柔性板，并且柔性板的杨氏模量为0.1GPa至50GPa。
在一些实施例中，板中的至少一个是柔性板，并且柔性板的优选杨氏模量为1GPa至5GPa。
在一些实施例中，板中的至少一个是柔性板，并且柔性板的优选杨氏模量为0.01GPa至1GPa。
染色时间：
在一些实施例中，卡闭合后的染色时间优选为10秒、20秒、30秒、60秒、90秒、120秒，或在这些值中任两者之间的范围内。
成像系统：
在一些实施例中，成像系统检测来自样品的信号包括但不限于光致发光、电致发光和电化学发光、光吸收、反射、透射、衍射、散射或扩散、表面拉曼散射、选自电阻、电容和电感的电阻抗、磁相关性，以及它们的组合。
在一些实施例中，成像系统是显微镜、明场显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜、复合光学显微镜、立体显微镜、数字显微镜、声学显微镜、电话显微镜。
分析系统：
在一些实施例中，分析系统包括但不限于机器学习、监督机器学习、无监督机器学习和强化学习。
在一些实施例中，分析系统将软件分析和人类分析相结合。
本发明的一个方面是提供用于容易且快速的组织染色的装置和方法，其通过利用能够彼此移动的一对板来操纵组织样品和/或小体积的染色液体，从而减小样品/染色液体的厚度、在样品与染色试剂之间形成接触等，它们都对组织染色具有有益的效果(简化和加速染色、免洗涤，以及保存试剂)。
本发明的另一方面是通过在板中的一个或两个上涂覆染色试剂来实现容易且快速的组织染色，染色试剂在接触液体样品和/或染色液体时在样品和/或染色液体中溶解和扩散，从而无需专业训练就可容易地处理染色试剂。
本发明的另一方面是通过利用板和具有均匀高度的多个间隔件以迫使样品和/或染色液体形成均匀厚度的薄膜来确保样品与染色试剂的均匀接触，从而使得染色试剂在样品上的较大横向区域上具有相同的扩散距离。
本发明的另一方面是通过将用于染色的一对板与适于采集和分析由板染色的组织样品的图像的移动通信装置相结合，来提供用于容易且快速的组织染色和成像的系统。可选地，移动通信被配置为将成像数据和/或分析结果发送到远程位置，以用于存储和/或由专业人员或软件进一步分析和解释。
本发明的另一方面是提供用于免疫组织化学的装置、系统和方法。
本发明的另一方面是提供用于H&E染色、特殊染色和/或细胞活力染色的装置、系统和方法。
本发明的另一方面是提供用于原位杂交的装置、系统和方法。
本发明的另一方面是提供用于在不洗涤的情况下对生物材料进行染色(例如用于细胞或组织的染色、核酸染色、H&E染色、特殊染色和/或细胞活力染色)的装置、系统和方法。
在细胞学/细胞病理学筛选和诊断中使用CROF卡
本发明的一些实施例涉及使用细胞学快速且简单地收集和分析样品。
根据本发明，一种用于使用细胞学收集和分析样品的方法，包含：
a.样品保持CROF(压缩调节开放流动)卡，其包含两个板，其中，第二板能够相对于彼此移动；
b.从受试者(例如人或动物)收集生物样品(即活检)，并将部分或全部样品沉积在卡的第一板的内表面上；
c.将染色溶液沉积在(i)第一板的表面上和/或样品的顶部上，(ii)第二板的内表面上，或(iii)两者上，
d.将两个板合在一起形成闭合构造，其中，第一板和第二板的两个内表面彼此面对，并且板之间的间隔由板之间的间隔件调节，并且至少一部分染色溶液位于样品与第二板的内表面之间；
e.具有成像器，并对样品保持卡中的样品进行成像，以用于分析；以及
f.具有分析模块，分析模块分析样品的图像，并生成测定结果。
在一些实施例中，成像分析是细胞分析。
在一些实施例中，间隔件固定在一个或两个板上，在一些实施例中，间隔件位于染色溶液的内部。
在一些实施例中，将样品与染色溶液混合，然后滴在板上。
在一些实施例中，染色溶液包含溶液中的染色剂(将细胞/组织染色的物质)。在一些实施例中，染色被配置为将涂覆在其中一个板上的染色剂输送到细胞/组织中。在一些实施例中，染色溶液包含溶液中的染色剂(将细胞/组织染色的物质)，并且被配置为将涂覆在其中一个板上的染色剂输送到细胞/组织中。
在一些实施例中，间隔件的高度被配置为使得染色的细胞和/或组织通过成像装置可见，而不洗掉第二板与样品之间的染色溶液。
在一些实施例中，间隔件的高度被配置为使得染色的细胞和/或组织在板达到闭合构造之后在不打开板的情况下通过成像装置可见。
在一些实施例中，样品被染色而不洗掉第二板与样品之间的染色溶液，并且在将板闭合成闭合构造之后，在30秒或以下、60秒或以下、120秒或以下、300秒或以下、600秒或以下，或在任两个值之间的范围内由成像器成像。
在一些优选实施例中，样品被染色而不洗掉第二板与样品之间的染色溶液，并且在将板闭合成闭合构造之后，在30秒或以下、60秒或以下、120秒或以下，或在任两个值之间的范围内由成像器成像。
在一些优选实施例中，样品被染色而不洗掉第二板与样品之间的染色溶液，并且在将板闭合成闭合构造之后，在30秒或以下、60秒或以下，或任两个值之间的范围内由成像器成像。
在一些实施例中，间隔件的高度为0.2um(微米)或以下、0.5um或以下、1um或以下、3um或以下、5um或以下、10um或以下、20um或以下、30um或以下、40um或以下、50um或以下，或在任两个值之间的范围内。
在一些优选实施例中，间隔件的高度为3um或以下。在一些优选实施例中，10um或以下。在一些优选实施例中，20um或以下。在一些优选实施例中，30um或以下。
在一些优选实施例中，在板处于闭合构造之后，染色溶液的厚度等于或小于亚噪音厚度。
术语“亚噪声厚度”(SNT)是指样品或染色溶液的厚度，其比光学标签从样品或染色溶液中的噪声对成像器可见的厚度薄。使染色溶液小于SNT，则不需要洗去未结合的光学标签。
口腔癌诊断的示例。根据本发明，样品是通过拭子从受试者口中脱落的上皮细胞。口腔癌诊断可以通过测量上皮细胞及其细胞核的尺寸和/或面积，和/或通过测量它们的尺寸比和/或他们的比例来进行。例如，癌症上皮细胞的上皮细胞及其细胞核面积之比通常大于正常上皮细胞之比。
从非吸烟者中筛选吸烟者的示例。根据本发明，样品是通过拭子从受试者口中脱落的上皮细胞。吸烟者与非吸烟者相比具有不同的上皮细胞及其细胞核面积比。
本发明的一个应用是在细胞病理学中。细胞病理学通常用于使用从广泛身体部位取出的游离细胞或组织碎片来在细胞水平上研究疾病。它已经成为用于筛选和诊断癌症和一些感染性疾病或其他炎性病症的主要工具。例如，细胞病理学的常见应用是巴氏涂片，一种用于检测可能导致宫颈癌的癌前宫颈病变的筛选工具。
对于一些实施例，QMAX装置用于将活检材料加工(按压)成单层。在一些实施例中，通过使用以下方法中的一种或组合从身体取出活检样品：针吸、内窥镜检查和切除或切口手术。
a.皮肤病变、淋巴结、甲状腺、乳腺、肺和体腔的针吸活检
b.口腔刷材料、宫颈(子宫颈涂片)、体液(尿、痰(粘痰)、脊髓液、胸膜液、心包液、腹水)的组织涂片：
c.以下的内窥镜活检
i.胃肠道：食管、胃和十二指肠(食管、胃、十二指肠镜)、小肠(肠镜)、大肠/结肠(结肠镜、乙状结肠镜)、胆管、直肠(直肠镜)和肛门(肛门镜)；
ii.呼吸道：鼻(鼻镜)、下呼吸道(纤维支气管镜)
iii.耳：耳镜
iv.尿路：膀胱镜
v.女性生殖道(妇科镜)：子宫颈(阴道镜)、子宫(子宫镜)、输卵管(输卵管镜)。
vi.通过小切口：腹腔或盆腔(腹腔镜)、关节内部(关节镜)、胸部器官(胸腔镜和纵隔镜)。
d.切除或切开组织或肿块的手术活检
e.在某些实施例中、QMAX装置用于对任何分子、细胞器、细胞内、细胞外或类器官结构进行染色，例如，
f.生物分子包括但不限于：蛋白质、肽、氨基酸(硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、肉碱、鸟氨酸、GABA和牛磺酸)。脂质(糖脂、磷脂、甾醇、花生四烯酸、前列腺素、白三烯)、脂肪酸、碳水化合物(单糖、二糖、多糖)、核酸(核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸)、任何分解代谢物、任何代谢物、次级代谢物、维生素、反应性氧/氮物种、矿物质、多酚大分子和其他小分子。
g.生物分子的修饰/反应包括但不限于：磷酸化、甲基化、乙酰化、脂化、硫醇反应、胺反应、羧酸盐反应、羟基反应、醛和酮反应。
h.细胞器/亚细胞结构包括但不限于：细胞核、核糖体、过氧化物酶体、内质网、高尔基体、线粒体、溶酶体、细胞膜、核内体、外核体、细胞骨架。
i.具有任何生理/病理状况的细胞类型包括但不限于：在肿瘤内(可以源自任何器官的任何上皮，以及血管内皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞)，神经元细胞、脂肪细胞、基质细胞、软骨细胞、视网膜细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞、任何类型的干细胞、任何类型的胚胎细胞、任何类型的内分泌细胞、任何类型的外分泌细胞、任何类型的免疫细胞、树突细胞、骨髓细胞、造血细胞、淋巴细胞……：正常细胞、良性细胞、癌前细胞、恶性细胞、转化细胞、静止细胞、增殖细胞、凋亡细胞、衰老细胞、有丝分裂细胞、炎症细胞、增生细胞、肥大细胞、萎缩细胞、增生细胞、发育不良细胞、化生细胞,……。
j.结缔组织/细胞外结构包括但不限于：疏松的普通结缔组织、脂肪组织、血液和造血组织、致密的普通结缔组织、软骨、骨、任何类型的细胞外囊泡、细胞外基质、血小板……。
在一些实施例中，QMAX装置被用于以下染色方法：
a.染料染色
i.巴氏染色：哈里斯苏木精；橙黄G6；EA50(伊红Y、淡绿色SF)
ii.May-Grünwald Giemsa染色(伊红G、亚甲蓝)
iii.齐尔-尼尔森染色
iv.改良齐尔-尼尔森(用于抗酸杆菌)、革兰氏染色(细菌)、粘液胭脂红(粘蛋白)、PAS(用于糖原、真菌壁、脂褐质等)、油红O(脂质)、佩尔普鲁士蓝(铁)、改良福彻特试验(胆红素)，
v.用于生物分子、细胞器、细胞和生物结构的任何荧光/非荧光染料，例如核酸染料：花青染料(PicoGreen、OliGreen和RiboGreen，SYBR Gold、SYBR Green I和SYBR GreenII，CyQUANT GR染料)、花青二聚体染料(SYTOX、POPO-1、TOTO-1、YOYO-1、BOBO-1、JOJO-1、POPO-3、LOLO-1、TOTO-3、PO-PRO-1、JO-PRO-1、YO-PRO-1、PO-PRO-3、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5)、胺反应性花青染料(SYBR 101染料)、菲啶和吖啶(溴化乙锭(EB)和乙锭同型二聚体-1、碘化丙锭(PI)，吖啶橙(AO)、碘化己锭、二氢乙锭、乙锭同型二聚体-1、乙锭同型二聚体-2、单叠氮乙锭、吖啶同型二聚体双-(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)精胺、ACMA)、吲哚和咪唑(Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580、DAPI)、7-氨基放线菌素D和放线菌素D、羟芪脒、LDS 751、Nissl染色剂
b.IHC/IF染色
i.直接法、间接法、PAP法(过氧化物酶抗过氧化物酶法)、亲和素-生物素复合物(ABC)法、标记的链霉亲和素生物素(LSAB)法、聚合法(基于葡聚糖聚合物技术的EnVision系统、ImmPRESS聚合报告酶染色系统)、CAS系统(来自DAKO)、CSA II-不含生物素的酪酰胺信号放大系统
c.ISH/FISH
i.方法：直接法和间接法
ii.探针：双链DNA(dsDNA)探针、单链DNA(ssDNA)探针、RNA探针(核糖体探针)、合成寡核苷酸
标记探针：例如，DIG(地高辛)、生物素、荧光团(FITC、alexa、酪胺等)。
d.其他材料
在一些实施例中使用吖啶橙(50ug/ml，来自……)和苏木精染色溶液(来自VectorLaboratories)。
样品保持器。样品保持器Q卡包含具有间隔件/柱的两个平行板，间隔件/柱具有大体上均匀的高度和以一致的预定距离彼此分离的几乎均匀的横截面。
在一些实施例中，Q卡的可移动板是175um厚的PMMA，具有柱尺寸为30×40um、柱高度10um和间距80um的柱阵列。在一些实施例中，Q卡的可移动板是175um厚的PMMA，具有柱尺寸为直径40um、柱高度10um和柱间距120um的柱阵列。
样品
应当注意，除非另有说明，本文所用的术语“样品”是指液体生物/化学样品或非液体样品。
在一些实施例中，液体样品最初以液体形式获得，例如血液和唾液。在一些实施例中，最初获得的样品样本不是液态，例如是固态或气态。在这种情况下，当使用本公开提供的装置和方法收集和保存非液体样品时，非液体样品被转化为液体形式。用于这种转化的方法包括但不限于，与液体介质混合而不溶解(最终产物是悬浮液)、溶解在液体介质中、从固体形式熔融成液体形式、从气体形式冷凝成液体形式(例如呼出气体冷凝物)。
在一些实施例中，样品可以在处于开放构造时在其上干燥，并且其中，样品包含体液，体液选自由以下组成的群组：羊水、房水、玻璃体液、血液(例如，全血、分级分离的血液、血浆或血清)、母乳、脑脊髓液(CSF)、耳垢(耳屎)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、粪便、呼吸、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻引流和痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、风湿液、唾液、呼出的冷凝物、皮脂、精液、痰液、汗液、滑液、泪液、呕吐物、尿液，以及它们的任何组合。
在一些实施例中，板中的一个或两个的样品接触区域被配置为使得样品可以在出乎开放构造时在其上干燥，样品包含血液涂片并且在板中的一个或两个上干燥。
在一些实施例中，样品是固体样品，例如组织切片。在一些实施例中，样品是固体组织切片，其厚度在1-200μm的范围内。在一些实施例中，板中的一个或两个的样品接触区域与样品粘合。在一些实施例中，样品是石蜡包埋的。在一些实施例中，样品是固定的(例如福尔马林、多聚甲醛等)。
染色液体
在一些实施例中，染色液体的一个主要功能是作为转移介质。储存(干燥/涂覆)在板上的试剂在接触染色液体时溶解并扩散在染色液体中。这样，染色液体用作转移介质，以提供存储在板上的试剂到样品的通路。
在一些实施例中，染色液体的一个主要功能是用作保持溶液。在一些实施例中，当板被按压以进入闭合构造时，由于由液体样品提供的像毛细管力的力，板被配置成在移除外部压缩力之后“自保持”在闭合构造。在样品样本不是液体形式的情况下，液体介质因此提供如板的“自保持”所需的毛细管力的力。
在一些实施例中，染色液体包含缓冲液对，以平衡最终溶液的pH值。在一些实施例中，染色液体不包含能够改变样品性质的特定成分。
在一些实施例中，染色液体包含处理、固定或染色样品所需的试剂，如以下部分中进一步详细讨论的。
在一些实施例中，染色液体包含能够固定样品的固定剂。
在一些实施例中，染色液包含阻断剂，其中，阻断剂被配置成使样品中的非特异性内源物质不能与用于对目标分析物进行特异性标记的检测剂反应。
在一些实施例中，染色液体包含能够除去样品中的石蜡的脱蜡试剂。
在一些实施例中，染色液体包含能够透化组织样品中含有目标分析物的细胞的透化剂。
在一些实施例中，染色液体包含能够促进抗原修复的抗原修复剂。
在一些实施例中，染色液体包含对样品中的目标分析物进行特异性标记的检测剂。
板存储位点
在一些实施例中，一个或两个板的样品接触区域包含含有样品处理、固定或染色所需试剂的存储位点。这些试剂在接触液体样品或染色液体时溶解并扩散在液体样品/染色液体中。
在一些实施例中，一个或两个板的样品接触区域包含含有阻断剂的存储位点，其中，阻断剂被配置成使样品中的非特异性内源物质不能与用于对目标分析物进行特异性标记的检测剂反应。
在一些实施例中，一个或两个板的样品接触区域包含含有能除去样品中的石蜡的脱蜡剂的储存位点。在一些实施例中，一个或两个板的样品接触区域包含含有透化剂的储存位点，透化剂能够透化组织样品中含有目标分析物的细胞。
在一些实施例中，一个或两个板的样品接触区域包含含有能够促进抗原修复的抗原修复剂的存储位点。在一些实施例中，一个或两个板的样品接触区域包含含有对样品中的目标分析物进行特异性标记的检测剂的存储位点。
在一些实施例中，一个或两个板的样品接触区域包括含有捕获剂的结合位点，其中，捕获剂被配置成结合样品中细胞表面上的目标分析物并固定细胞。
检测剂
在一些实施例中，检测剂包含用于染色的染料，染料选自由以下组成的群组：酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、苯胺蓝WS、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天蓝色A、天蓝色B、天蓝色C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、C.I.甲酚紫、结晶紫、达罗红、伊红B、伊红Y、赤藓红、乙基伊红、乙基绿、固绿FCF、异硫氰酸荧光素、吉姆萨着色剂、苏木精、苏木精和伊红、靛蓝胭脂红、杰纳斯绿B、哲纳尔着色剂1899、淡绿色SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫、(亚甲基青莲)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、弱蛋白银S、派若宁B、派若宁、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四色染剂(MacNeal)、硫氨酸、甲苯胺蓝、魏格特、瑞氏色素(Wright stain)，以及它们的任意组合。
在一些实施例中，检测剂包含被配置成与样品中的蛋白质分析物特异性结合的抗体。
在一些实施例中，检测剂包含寡核苷酸探针，其被配置成特异性结合样品中的DNA和/或RNA。
在一些实施例中，检测剂是用报告分子标记的，其中，报告分子被配置为提供待读取和分析的可检测信号。
在一些实施例中，报告分子包含荧光分子(荧光团)，包括但不限于IRDye800CW、Alexa 790、Dylight800、荧光素、异硫氰酸荧光素、羧基荧光素的琥珀酰亚胺酯、荧光素的琥珀酰亚胺酯、荧光素二氯三嗪的5-异构体、笼状羧基荧光素-丙氨酸-甲酰胺、俄勒冈绿488、俄勒冈绿514；荧光黄、吖啶橙、罗丹明(rhodamine)、四甲基罗丹明、德克萨斯红、碘化丙啶、JC-1(5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物)、四溴罗丹明123、罗丹明6G、TMRM(四甲基罗丹明甲酯)、TMRE(四甲基罗丹明乙酯)、四甲基玫瑰胺(tetramethylrosamine)、罗丹明B和4-二甲基氨基(tetramethylrosamine)、绿色荧光蛋白、蓝移绿色荧光蛋白、青移绿色荧光蛋白、红移绿色荧光蛋白、黄移绿色荧光蛋白、4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸酯基二苯乙烯-2,2'-二磺酸；吖啶及其衍生物，例如吖啶、异硫氰酸吖啶；5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘-亚胺-3,5二磺酸盐；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；4,4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼杂-3a,4a二氮杂-5-引达省-3-丙酸BODIPY；瀑布蓝；亮黄色；香豆素及衍生物：香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC、香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；花青染料；花青素；4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)；5',5”-二溴邻苯三酚磺萘(溴邻苯三酚红)；7-二乙氨基-3-(4’-异硫氰酸根合苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸盐；4,4'-二异硫氰基二氢化芪-2-2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰基芪-2,2'-二磺酸；5-(二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS、丹磺酰氯)；4-二甲氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；伊红及衍生物：伊红、异硫氰酸伊红、赤藓红及衍生物：赤藓红B、赤藓红、异硫氰酸酯；乙啡啶；荧光素及衍生物：5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基-荧光素(DTAF)、2',7'二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素、QFITC、(XRITC)；荧光胺；IR144；IR1446；孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二醛；芘及衍生物：芘、丁酸芘、琥珀酰亚胺1-芘；丁酸根量子点；活性红4(CibacronTM Brilliant Red 3B-A)罗丹明及衍生物：6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-(4'-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)、玫瑰果酸；CAL荧光橙560；铽螯合物衍生物；Cy 3；Cy 5；Cy 5.5；Cy 7；IRD 700；IRD 800；拉荷亚蓝酞菁；以及萘酞菁、香豆素和相关染料、呫吨染料如若丹醇、试卤灵、双甲烷、吖啶、异吲哚、丹酰染料、氨基邻苯二甲酰肼如鲁米诺和异鲁米诺衍生物、氨基邻苯二甲酰亚胺、氨基萘二甲酰亚胺、氨基苯并呋喃、氨基喹啉、二氰基氢醌、荧光铕和铽络合物；它们的组合，等等。合适的荧光蛋白和显色蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)，包括但不限于来源于维多利亚水母(Aequoria victoria)的GFP或其衍生物，例如“人源化”衍生物比如增强的GFP；来自另一物种如海肾(Renilla reniformis)、海肾(Renilla mulleri)或海笔(Ptilosarcus guernyi)的GFP；“人源化”重组GFP(hrGFP)；来自裂殖子物种的多种荧光和有色蛋白质中的任一种；它们的任何组合；等等。
在一些实施例中，信号选自以下组成的群组：
i.选自光致发光、电致发光和电化学发光的发光；
ii.光吸收、反射、透射、衍射、散射或扩散；
iii.表面拉曼散射；
iv.选自电阻、电容和电感的电阻抗；
v.磁弛豫率；以及
vi.i-v的任何组合。
免疫组织化学
在一些实施例中，本公开的装置和方法可以用于对样品进行免疫组织化学。
在免疫组织化学(IHC)染色方法中，将组织样品固定(例如，在多聚甲醛中)，可选地包埋在蜡中，切成小于100μm厚(例如，2μm至6μm厚)的薄切片，然后安装在支撑物如载玻片上。一旦固定，组织切片可以使用增加浓度的酒精洗涤脱水，并使用洗涤剂如二甲苯清洗。在某些情况下，固定也是可选的步骤，例如用于血涂片染色。
在大多数IHC方法中，可以使用第一抗体和第二抗体。在这样的方法中，第一抗体结合相关抗原(例如，生物标记)，并且是未标记的。第二抗体与第一抗体结合，并直接与报告分子或可募集溶液中的报告分子的接头分子(例如生物素)缀合。或者，第一抗体本身可以直接缀合到报告分子或可募集溶液中的报告分子的接头分子(例如生物素)。报告分子包括荧光团(例如，FITC、TRITC、AMCA、荧光素和罗丹明)和酶如碱性磷酸酶(AP)和辣根过氧化物酶(HRP)，对于它们存在多种荧光、显色和化学发光底物如DAB或BCIP/NBT。
在直接法中，将组织切片与标记的第一抗体(例如，FITC缀合抗体)在结合缓冲液中孵育。第一抗体直接与组织切片中的抗原结合，在洗涤组织切片以除去任何未结合的第一抗体后，用显微镜分析切片。
在间接法中，将组织切片与结合组织中的目标抗原的未标记的第一抗体孵育。在洗涤组织切片以除去未结合的第一抗体后，将组织切片与结合第一抗体的标记的第二抗体孵育。
在抗原的免疫组织化学染色后，组织样品可以用另一种染料染色，例如苏木精、Hoechst染料和DAPI，以实现对比和/或鉴定其他特征。
本装置可以用于组织样品的免疫组织化学(IHC)染色。在这些实施例中，该装置可以包含第一板和第二板，其中：板能够相对于彼此移动成不同的构造；板中的一个或两个是柔性的；板中的每一个在其各自的表面上具有用于接触组织样品或IHC染色液体的样品接触区域；第一板中的样品接触区域是光滑且平坦的；第二板中的样品接触区域包含固定在表面上的间隔件，间隔件具有预定的基本上均匀的高度和7μm至200μm范围内的预定的恒定的间隔件间距；
其中，其中一个构造是开放构造，其中：两个板完全或部分地分开，板之间的间隔不由间隔件的调节；并且其中，另一个构造是闭合构造，闭合构造在样品和IHC染色液体在开放构造中沉积之后配置；并且在闭合构造中：至少部分样品位于两个板之间，至少部分染色液体的层位于至少部分样品与第二板之间，其中，至少部分染色液液体的层的厚度由板、样品和间隔件调节，样品表面与第二板表面之间的平均距离等于或小于250μm，变化很小。
如上所述，在一些实施例中，装置可以包含涂覆在一个或两个板的样品接触区域上的干IHC染色剂。在一些实施例中，装置可以包含涂覆在第二板的样品接触区域上的干IHC染色剂，并且IHC染色液体包含溶解干IHC染色剂的液体。在一些实施例中，样品的厚度为2μm至6μm。
H&E、特殊染色和细胞活力染色
在一些实施例中，本公开的装置和方法可以用于进行H&E染色、特殊染色和细胞活力染色。
苏木精和伊红染色或苏木精和伊红染色(H&E染色或HE染色)是组织学中的主要染色之一。它是医学诊断中最广泛使用的染色剂，通常是金标准；例如，当病理学家观察疑似癌症的活检时，组织学切片可能用H&E染色，并称为“H&E切片”、“H+E切片”或“HE切片”。苏木精和伊红的组合产生蓝色、紫色和红色。
在诊断病理学中，“特殊染色”术语最常用于临床环境中，并且简单地表示除了H&E方法之外的用于将颜色赋予样本的任何技术。这也包括免疫组织化学和原位杂交染色。另一方面，H&E染色是组织学和医学诊断实验室中最流行的染色方法。
在任意实施例中，干结合位点可以包含捕获剂如抗体或核酸。在一些实施例中，可释放的干试剂可以是标记的试剂，例如荧光标记的试剂，例如荧光标记的抗体或细胞着色剂，例如罗曼诺夫斯基着色剂、利什曼氏着色剂，梅-格氏着色剂、吉姆萨着色剂、哲纳尔着色剂、韦氏着色剂，或它们的任何组合(例如韦-吉姆萨着色剂)。这种着色剂可以包含伊红Y或带有亚甲蓝的伊红B。在某些实施例中，着色剂可以是碱性着色剂，例如苏木精。
在一些实施例中，特殊染色剂包括但不限于：酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、苯胺蓝WS、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天蓝色A、天蓝色B、天蓝色C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、C.I.甲酚紫、结晶紫、达罗红、伊红B、伊红Y、赤藓红、乙基伊红、乙基绿、固绿FCF、异硫氰酸荧光素、吉姆萨着色剂、苏木精、苏木精和伊红、靛蓝胭脂红、杰纳斯绿B、哲纳尔着色剂1899、淡绿色SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫、(亚甲基青莲)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、弱蛋白银S、派若宁B、派若宁、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四色染剂(MacNeal)、硫氨酸、甲苯胺蓝、魏格特、瑞氏色素，以及它们的任意组合。
术语“细胞活力染色”是指用于区别地对组织样品内的活细胞和死细胞进行染色的染色技术。通常，利用活细胞和死细胞之间的细胞膜和/或核膜通透性的差异来进行差异染色。在其他情况下，细胞凋亡或坏死的标记物(指示垂死细胞或细胞尸体)用于这种染色。
在一些实施例中，装置包含在板中一个或两个上的染料，以针对样品的细胞活力进行染色。在一些实施例中，染料包括但不限于碘化丙啶(PI)、7-AAD(7-氨基放线菌素D)、台盼蓝、钙黄绿素紫AM、钙黄绿素AM、与不同荧光团偶联的固定活力染料(FVD)、SYTO9和其他核酸染料、刃天青和甲胨(MTT/XTT)等线粒体染料，以及它们的任意组合等。在一些实施例中，样品包含细菌，并且希望测定样品中的细菌活力，该装置还在一个或两个板上包含细菌活力染料，例如PI、SYTO9等，以区别染色活细胞与死细胞。可选地，装置在一个或两个板上还包含用于总细菌染色的染料，例如革兰氏染色试剂等。
原位杂交
在一些实施例中，本公开的装置和方法可用于在组织学样品上进行原位杂交(ISH)。
原位杂交(ISH)是一种杂交类型，其使用标记的互补DNA、RNA或修饰的核酸链(即，探针)在组织的一部分或切片中(原位)定位特定DNA或RNA序列，或者如果组织足够小(例如，植物种子、果蝇胚胎)，在整个组织中(全标本ISH)、在细胞中和在循环肿瘤细胞(CTC)中定位。
原位杂交用于揭示染色体上或组织中特定核酸序列的位置，这是理解基因的组织、调节和功能的关键步骤。目前使用的关键技术包括：用寡核苷酸和RNA探针(都是放射性标记的和半抗原标记的)与mRNA进行原位杂交；用光学和电子显微镜进行分析；全标本原位杂交；RNA和RNA加蛋白质的双重检测；以及荧光原位杂交检测染色体序列。DNA ISH可用于确定染色体的结构。荧光DNA ISH(FISH)可，例如，用于医学诊断以评估染色体完整性。RNAISH(RNA原位杂交)用于测量和定位组织切片、细胞、全标本和循环肿瘤细胞(CTC)内的RNA(mRNA、lncRNA和miRNA)。
在一些实施例中，检测剂包含用于原位杂交染色的核酸探针。核酸探针包括但不限于被配置成特异性结合样品中的DNA和/或RNA的寡核苷酸探针。

Claims (26)

1.一种用于在不洗涤的情况下对样品进行染色和成像的方法，包含：
(a)提供第一板和第二板；
(b)将所述样品和染色试剂夹在所述第一板与所述第二板之间，其中，所述染色试剂对所述样品进行染色；
(c)在不洗涤的情况下捕获所述被染色的样品的第一图像，其中，所述洗涤除去所述染色试剂的至少一部分；以及
(d)使用机器学习算法从所述第一图像生成所述被染色的样品的目标图像；
其中，使用训练数据集来训练所述机器学习算法，所述训练数据集包含未经洗涤的所述被染色的样品的至少一张图像和经洗涤的所述被染色的样品的至少一张图像。
2.一种用于在不洗涤的情况下对样品进行染色的试剂盒，包含：
(a)第一板和第二板，所述第一板和所述第二板面向彼此并且由间隔分开；
(b)具有一定浓度的染色试剂，所述染色试剂对所述样品进行染色以用于分析；
其中，选择所述间隔和所述浓度使得当所述样品和所述染色试剂被夹在所述第一板与所述第二板之间并且在不洗涤的情况下进行成像时，所述样品的染色是可见的。
3.一种用于对样品进行染色和成像的系统，包含：
(a)如权利要求2所述的试剂盒；
(b)成像器，所述成像器用于捕获位于所述第一板与所述第二板之间的被染色的样品的图像；
(c)非瞬态存储介质，所述非瞬态存储介质存储机器学习算法，所述机器学习算法从所述被染色的样品的图像生成目标图像。
其中，使用训练数据集来训练所述机器学习算法，所述训练数据集包含未经洗涤的所述被染色的样品的至少一张图像和经洗涤的所述被染色的样品的至少一张图像。
4.一种用于对样品进行染色和成像的方法，包含：
(a)提供第一板和第二板，其中，所述两个板中的一个或两个包含至少三个位置标记，其中，所述至少三个位置标记中的每一对之间具有预定距离；
(b)将所述样品和染色试剂夹在所述第一板与所述第二板之间，其中，所述染色试剂对样品进行染色；
(c)捕获所述被染色的样品和所述至少三个位置标记的第一图像；以及
(d)使用机器学习算法从所述第一图像生成所述被染色的样品的目标图像；
其中，使用训练数据集来训练所述机器学习算法，所述训练数据集包含所述至少三个位置标记和在第一组条件下染色的所述被染色的样品的至少一张图像，以及在第二组条件下染色的所述被染色的样品的至少一张图像。
5.一种用于对样品进行染色的试剂盒，包含：
(a)第一板和第二板，所述第一板和所述第二板面向彼此并且由间隔分开，其中，所述两个板中的一个或两个包含至少三个位置，其中，所述至少三个位置标记中的每一对之间具有预定距离；以及
(b)具有一定浓度的染色试剂，所述染色试剂对所述样品进行染色以用于分析；
其中，选择所述间隔和所述浓度使得当所述样品和所述染色试剂被夹在所述第一板与所述第二板之间并且在不洗涤的情况下进行成像时，所述样品的染色是可见的。
6.一种用于对样品进行染色和成像的系统，包含：
(a)如权利要求2所述的试剂盒；
(b)成像器，所述成像器用于捕获位于所述第一板与所述第二板之间的被染色的样品的图像；
(c)非瞬态存储介质，所述非瞬态存储介质存储机器学习算法，所述机器学习算法从所述被染色的样品的图像生成目标图像。
(d)其中，使用训练数据集来训练所述机器学习算法，所述训练数据集包含所述至少三个位置标记和在第一组条件下染色的所述被染色的样品的至少一张图像，以及在第二组条件下染色的所述被染色的样品的至少一张图像。
7.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒、系统和方法，还包含间隔件，所述间隔件调节所述第一板与所述第二板之间的距离。
8.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒、系统和方法，其中，所述两个板之间的间隔或所述间隔件的高度在0.5um至30um之间选择。
9.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒、系统和方法，其中，所述两个板之间的间隔或所述间隔件的高度为10um。
10.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒、系统和方法，其中，所述两个板能够相对于彼此移动。
11.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒、系统和方法，其中，选择所述两个板之间的间隔或所述间隔件的高度以使染色饱和时间为5秒、10秒、20秒、30秒、60秒或在所述值中任意两者之间的范围内。
12.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒、系统和方法，其中，还包含间隔件，所述间隔件调节所述第一板与所述第二板之间的距离。
13.根据任一前述权利要求所述的方法、试剂盒和系统，其中，所述样品是组织。
14.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒、系统和方法，其中，所述机器学习算法采用CycleGAN。
15.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒、系统和方法，其中，所述机器学习算法采用基于GAN的像素到像素变换。
16.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒、系统和方法，其中，使用训练数据集来训练所述机器学习算法，所述训练数据集包含所述至少三个位置标记和在第一组条件下染色的所述被染色的样品的至少一张图像，以及在第二组条件下染色的所述被染色的样品的至少一张图像。
17.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒、系统和方法，其中，所述机器学习算法至少采用四个位置标记。
18.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒、系统和方法，其中，所述机器学习算法采用位置标记，所述位置标记在x方向上的几何形状和/或所述位置标记之间的间距不同于在与所述x方向正交的y方向上的几何形状和/或间距。
19.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒、系统和方法，其中，所述样品包含体液，所述体液选自由以下组成的群组，羊水、房水、玻璃体液、血液、母乳、脑脊髓液(CSF)、耳垢(耳屎)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、粪便、呼吸、胃酸、胃液、淋巴、粘液、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、风湿液、唾液、呼出的冷凝物、皮脂、精液、痰液、汗液、滑液、泪液、呕吐物、尿液，以及它们的任何组合。
20.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒、系统和方法，其中，染色是H&E染色、免疫组织化学染色、免疫荧光染色和原位杂交染色，或它们的任何组合。
21.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒和方法，其中，所述染色试剂是涂覆在所述板中的至少一个的表面上的干染色试剂。
22.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒和方法，其中，所述染色试剂是涂覆在所述板中的至少一个的表面上的干染色试剂，并且其中，染色溶液是将所述干染色剂转移到所述样品中的转移液体。
23.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒、系统和方法，其中，所述间隔件是位置标记。
24.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒、系统和方法，其中，相邻间隔件之间或相邻位置标记之间的间距在50μm至120μm的范围内。
25.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒、系统和方法，其中，所述间隔件间距(ISD)的四次方除以柔性板的厚度(h)和柔性板的杨氏模量(E)，ISD4/(hE)，等于或小于106um3/GPa。
26.根据任一前述权利要求所述的装置、试剂盒、系统和方法，其中，所述间隔件的高度在1.8至50μm的范围内选择，IDS为100um或以下，所述间隔件间距(IDS)的四次方除以柔性板的厚度(h)和柔性板的杨氏模量(E)(ISD4/(hE))为5×105um3/GPa或以下；柔性板的厚度乘以柔性板的杨氏模量在60至750GPa-um的范围内。
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