CN114354719A - 一种自供能的水体硝酸根微生物电化学检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自供能的水体硝酸根微生物电化学检测方法。本发明检测方法采用的微生物电化学传感器包含一个用于驱动的微生物燃料电池，和一个用于硝酸根检测的微生物燃料电池；串联驱动电池与检测电池，利用驱动电池为检测电池的生物阴极供能，提高其电极电势，强化检测性能。本发明建立一种微生物燃料电池堆栈的生物阴极电压调控策略，使生物阴极的工作电压在检测过程中动态维持在可充分保证检测性能的区间。
Description
技术领域
本发明属于水质检测技术领域，具体涉及一种自供能的水体硝酸根微生物电化学检测方法。
背景技术
环境水体中过量的硝酸盐导致富营养化，硝酸盐的高灵敏检测是水环境质量检测的重要内容。硝酸盐的常规检测方法有分光光度法、荧光法、化学发光法、色谱法、电化学方法等，但这些方法通常需要专门的分析仪器和操作人员，难以应用于实际环境水体硝酸盐的原位监测。因此，开发硝酸盐的原位快速检测方法意义重大。
微生物燃料电池是一种利用电活性微生物氧化降解环境碳源产电的燃料电池技术。微生物电化学传感器是一种基于微生物燃料电池的新兴检测技术，具有无需复杂的样品预处理、可以实现在线连续监测、检测信号转化简单等优势，近年来迅速发展，当前已经可以对很多环境有毒污染物实现高效地检测。微生物电化学传感器以微生物的全细胞作为识别元件，基础电极作为信号转化器，以电流、电阻、电位等电化学参数作为检测信号的一类生物传感器。当有目标毒性物质存在时，会引起微生物细胞新陈代谢途径的改变或对微生物直接产生生物毒性，从而产生可以直接测量的信号，实现检测环境中的有毒物质。
目前已报道了几种检测硝酸根的微生物电化学传感器，主要原理是，以生物阳极同时作为传感器供能和检测单元。生物阳极降解有机物，将释放的电子传递给电极，产生生物电流，硝酸根的存在与电极争夺降解电子，导致电流下降，实现检测。
当前的微生物电化学传感器可在自供能条件下检测硝酸根，但是这一技术具有多种缺点。首先，由于检测原理是硝酸根竞争代谢产生的电子，使细胞传递到电极的电子减少，这一间接检测过程与细胞代谢密切相关，响应时间较长；其次，由于未使用恒电位仪，工作电极的电极电势在不同检测目标物浓度和检测环境下会波动，并反馈工作电极的电极动力学过程，使得线性检测范围远小于恒电位供电的微生物电化学传感器；最后，这是一种负反馈的电流设计方案，因此基底电流(零硝酸根)高，工作电极和对电极的过电势较大，导致检测过程工作电极对电流变化不敏感，检测灵敏度较低。
相对于上述自供能的技术方案，利用恒电位仪控制工作电极电势，可以显著提高生物电极对硝酸根的检测性能。但是，一方面，恒电位仪的使用限制了微生物传感器在无长期稳定外部直接供电的实际环境下的使用；另一方面，大型的恒电位仪也不利于生物传感器的小型化、便携化发展，不利于目标物的在线连续监测。近年来，自供能技术发展地愈发成熟，已成功应用于生物传感领域，使得生物传感器在无需外部电源供应的条件下实现监测，极大地促进了自供能生物传感器的发展。因此，提供一种自供能、高灵敏检测水体硝酸根的方法是挑战。
发明内容
针对背景技术中存在的缺陷，本发明提供了一种基于微生物燃料电池堆栈的自供能的水体硝酸根微生物电化学检测方法，本发明方法利用微生物燃料电池驱动生物阴极检测硝酸根，并在自供能条件下调控检测过程的生物阴极电势，优化检测性能。本发明检测方法采用的微生物电化学传感器包含一个用于驱动的微生物燃料电池，和一个用于硝酸根检测的微生物燃料电池；串联驱动电池与检测电池，利用驱动电池为检测电池的生物阴极供能，提高其电极电势，强化检测性能；建立一种微生物燃料电池堆栈的生物阴极电压调控策略，使生物阴极的工作电压在检测过程中动态维持在可充分保证检测性能的区间。
本发明提供了一种自供能的水体硝酸根微生物电化学检测方法，具体步骤如下：
(1)厌氧活性泥培养：将厌氧活性污泥密封存放，采用矿物盐培养基进行室温培养，并定期更换矿物盐培养基对厌氧活性污泥进行驯化；
(2)微生物燃料电池组装：使用双室微生物燃料电池MFC装置，分为阴极室和阳极室两部分，阳极室中添加阳极液，阴极室中添加铁氰化钾溶液作为MFC的阴极液；
所述阳极液的初始组成为步骤(1)中驯化完成的厌氧活性污泥和矿物盐培养基；
将驯化完成的厌氧活性污泥作为双室微生物燃料电池MFC的阳极微生物，组装完成后密封，阳极和阴极之间通过外部电路连接电阻，在500-1000欧姆的外接电阻Rext下，稳定输出电压大于600mV，即完成微生物阳极富集(如图1所示)；并组装至少两个上述的双室微生物燃料电池MFC装置；
(3)生物阴极检测菌株培养与收集：将希瓦氏菌接种于LB液体培养基中进行培养活化菌体，之后将培养好的活化希瓦氏菌菌液离心获得菌体；利用矿物盐培养基分散菌体后再次离心，以上分散-离心步骤重复2-3次；最后分散菌体至新的矿物盐培养基，其整体作为生物阴极的阴极液；
(4)检测水体硝酸根的生物阴极组装：取一个步骤(2)中富集完成并可输出平稳运行电流的MFC，将阴极室中的铁氰化钾溶液倒去并清洗杀菌，加入步骤(3)中得到的生物阴极的阴极液即含希瓦氏菌的矿物盐培养基，并添加中性红NR、乳酸钠，以新的碳布为电极，得到用于检测的微生物燃料电池装置MFC＇；
(5)微生物电化学传感器组装与优化：取步骤(2)富集完成并可输出平稳电流的一个MFC作为驱动端，步骤(4)的MFC＇为检测端，将MFC与MFC＇串联，得到微生物电化学传感器；
其中，驱动端MFC的阴极与检测端MFC＇的阳极以导线连接，并串联1个电流表；驱动端MFC的阳极与检测端MFC＇的阴极以导线连接，并串联1个电阻Rext(如图2所示)；利用慢速线性伏安法确定MFC和MFC＇各阴阳极的动力学过程，获得最大电流、过电势等相关动力学参数，模拟全系统的动力学过程，获得最优Rext；
通过对串联电流表记录通过外接电阻的电流变化，实际测试中使用电化学工作站CHI660E作电流表，实时检测电流变化；
(6)标准曲线绘制：超纯水配制不同浓度的硝酸盐标准溶液，待传感器体系电流达到稳定后，将不同浓度的硝酸盐标准溶液依次分别加入到上述组装的同一种传感器体系的检测端MFC＇的生物阴极中，记录电流峰值与电流峰面积的变化曲线，利用该线性关系式即可以计算硝酸盐含量；
(7)检测含硝酸盐的样品：向检测端MFC＇生物阴极中加入含硝酸盐的待检测水体，记录电流响应图的峰值和峰面积，根据标准溶液曲线确定样品水体中硝酸盐的含量，即可检测水体中的硝酸根。
本发明对微生物阳极驱动的生物阴极传感器进行电极动力学研究，探索了电极电位、中性红和硝酸盐浓度等因素对生物阴极反应速率的影响，建立了生物阴极反应速率的总体方程。单个MFC驱动的生物阴极传感器生物阴极电势下，亚硝酸盐还原反应受限，通过串联MFC获取更高的电压。当电势过低时容易发生析氢等副反应，影响检测灵敏度。通过理论模拟和实验验证，提出可动态控制生物阴极电极电势的电压调节策略，并发现一种最佳外电阻(Rext)可使生物阴极电位在足以实现最大硝酸盐还原速率的范围内保持波动。
步骤(1)～(3)中的矿物盐培养基均由以下物质组成：KH2PO4 0.2g/L、K2HPO40.68g/L、NaCl 0.5g/L、NH4Cl 0.47g/L、MgSO4 0.12g/L、CaCl2 0.01g/L、1％Wolfe矿物盐溶液、1％Wolfe维生素溶液；步骤(1)中驯化中的厌氧活性污泥每周更换一次培养基，每次更换1/3总体积。
步骤(2)中所使用的双室微生物燃料电池MFC装置，分为阴极室和阳极室两部分，尺寸均为4cm×4cm×2cm，腔室有效容积均为30mL，使用阳离子交换膜分隔开。
步骤(2)中所述阴极液铁氰化钾溶液由以下物质组成：K3[Fe(CN)6]4 16.47g/L、KH2PO4 3g/L、Na2HPO4·12H2O 17.8g/L、KCl 3.73g/L；微生物燃料电池阳极室中阳极液的初始组成为步骤(1)中驯化完成的厌氧活性污泥和矿物盐培养基，所述矿物盐培养基与厌氧活性污泥体积比为3:1；阴极和阳极均采用碳毡电极，尺寸为2cm×3cm，通过钛丝与外电路连接。富集阶段的微生物燃料电池外接电阻为500～1000欧姆，富集阶段的微生物燃料电池输出电压低于50mV时给阳极室补充乙酸钠，以阳极液为基准按1g/L添加乙酸钠，每添加2次乙酸钠后，更换1/3体积的阳极液，阴极液全换。
步骤(3)所述希瓦氏菌(S.oneidensis MR-1)购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)；将保存的希瓦氏菌接种至培养基有氧培养，获得活化菌体；所述LB液体培养基由以下物质组成：酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L。希瓦氏菌的培养温度为30-32℃，摇床转速为150-180rpm，培养时间为14-16小时，离心前菌液的OD600值需控制在2.6-3.0。
步骤(3)离心回收的菌体沉淀需经2-3次矿物盐培养基分散和离心，以去除培养过程产生的可溶性胞外聚合物和细菌自分泌的电子中介体；最终分散的菌液的OD600值需控制在1.0-1.5。有氧培养下菌液浓度、菌体回收过程的多次分散和最终的菌液浓度对生物阴极检测硝酸根的响应性至关重要。
步骤(4)中所用的中性红是促进希瓦氏菌阴极电子传递和硝酸根还原的专用电子中介体，加速电子传递，提高检测效率。中性红添加浓度通过以下方法确定：以生物阴极为工作电极组建电催化还原硝酸根的三电极电化学系统，添加不同浓度中性红溶液进行CV测试，获得中性红介导的希瓦氏菌电还原硝酸根的最大还原电流值。该电流值随着中性红浓度增加而增大，其数值关系遵循莫诺方程，拟合莫诺方程获得饱和还原电流及对应的中性红浓度。用于检测的生物阴极组装过程中，选择添加半饱和浓度的中性红(硝酸根还原电流达到饱和还原电流的一半)。通常，本发明加入的中性红半饱和浓度为5-20μM。
步骤(4)中生物阴极使用碳布电极，需选择合适的碳布电极尺寸，使上述半饱和还原电流值介于300-400μA，且不能高于系统中两个生物阳极的最大催化电流的1/2。通过以下方法确定碳布电池尺寸：分别以步骤(2)获得的生物阳极或铁氰化钾阴极为工作电极组建三电极电化学系统，利用慢速循环伏安法(扫描电压范围-0.7–0.4V，扫描速率1mV/s)表征阳极动力学特性，电流-电压关系遵循莫诺-能斯特方程。其中，铁氰化钾电极的最大电流值应大于3mA，生物阳极电流应大于1mA。若生物阳极电流小于1mA，则应向阳极室添加AQDS等电子中介体、碳纳米管等导电介质，进一步提高阳极电流，达到发明所需的1mA的基准值。碳布电极尺寸初步选择1cm×2cm，对应的半饱和还原电流值应介于300-400μA。如果电流超出这一范围，则相应地改变电极尺寸，使电流范围达到本发明方案要求。
步骤(4)中添加乳酸钠至其在MFC＇生物阴极液中的浓度为10-20mM。
步骤(5)中最优Rext通过以下方法确定：首先对步骤(4)中铁氰化钾阴极、生物阳极和生物阴极慢速循环伏安曲线按如下修正的莫诺-能斯特方程进行拟合，获得Ib、Imax、α、Eka等参数(参数)：
其中，I检测到的电流，Ib为拟合的背景电流值，Imax为Monod项的最大电流值，α为介于0-1的校正系数(α＝1时为理想生物阳极)，Eka生物阳极的特征氧化还原电势。在此基础上，对系统的动力学过程建模，其中，外接电阻端满足如下方程组(2-4)决定：
Ecell＝Epc-Fpa+Esc-Esa-ηohm (2)
Ecell＝I×Rext (3)
ηohm＝I×Rohm (4)
其中，Epc、Epa依次为驱动端MFC的阴、阳极电势，Esc、Esa依次为检测端MFC＇的阴、阳极电势，Ecell为外接电阻两端的电压降，Rohm为传感器体系的欧姆内阻，ηohm为由于欧姆内阻产生过电势。将拟合方程(1)获得的各项参数带入方程组(2-4)，经多次迭代可获得生物阴极电势Esc与外电阻Rext的数值关系。
为准确检测不同浓度的硝酸根，检测过程的生物阴极电势Esc应该始终处于-0.7V至-1V这一范围。为满足这一要求，基于上述模拟获得的生物阴极电势Esc与外电阻Rext的数值关系，筛选出最优Rext，该值通常为在检测饱和浓度硝酸根时令生物阴极电势Esc为-0.7V的外接电阻值。在实际组装系统的过程中，可选择略大于该理论值的电阻值，对于最大电流满足步骤四要求的体系(铁氰化钾电极>5mA，生物阳极>1mA，生物阴极介于300-400μA)，可选择1.5KΩ或2KΩ。
本发明采用由驱动端及检测端两个微生物燃料电池组成的微生物电化学传感器对水体中硝酸根进行检测，利用驱动电池为检测电池的生物阴极供能，提高其电极电势，强化检测性能；建立一种微生物燃料电池堆栈的生物阴极电压调控策略，使生物阴极的工作电压在检测过程中动态维持在可充分保证检测性能的区间。
附图说明
图1为本发明所述以厌氧活性污泥富集微生物燃料电池装置MFC示意图。
图2为本发明所述检测用微生物电化学传感器示意图。
图3为本发明检测端MFC＇的生物阴极添加不同浓度硝酸根标准溶液后电流输出信号结果。
图4为采用本发明所述硝酸根检测方法在1～50μM硝酸根浓度范围内测得的电流峰值与硝酸盐浓度标准曲线。
图5为采用本发明所述硝酸根检测方法在50μM～0.5mM硝酸根浓度范围内测得的电流峰面积与硝酸盐浓度标准曲线。
图1-2中各标注为：1、MFC阴极，2、MFC阳极，3、MFC＇阴极，4、MFC＇阳极，5、驱动端MFC，6、检测端MFC＇。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行具体描述，其目的在于更好地理解本发明的技术内涵，但是本发明的保护范围不限于以下的实施范围。
实施例1
(1)所用的厌氧活性污泥取自当地污水处理厂厌氧池；希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis MR-1)购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)，菌种编号ATCC700550。
(2)污泥电池组装：使用双室微生物燃料电池MFC装置，将驯化完成的厌氧活性污泥作为污泥电池的阳极微生物，阳极室中添加阳极液，阴极液使用铁氰化钾溶液；组装完成后密封，连接外接电阻Rext；定期给阳极室补充乙酸钠碳源，更换培养基与阴极液，对微生物富集；
所述阳极液的初始组成为步骤(1)中驯化完成的厌氧活性污泥和矿物盐培养基，所述矿物盐培养基与厌氧活性污泥体积比为3:1；
(3)希瓦氏菌菌液获得：向100ml的LB培养基(含酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L和氯化钠10g/L，ph＝7.0)中接入希瓦氏菌菌种，接种量为400μL；于温度30℃、震荡转数170rpm培养15h，获得菌液；
(4)配制希瓦氏菌悬浮液：将培养好的希瓦氏菌液离心，得到沉淀均匀分散在矿物盐培养基使OD600为1.5，另外添加终浓度20mM的乳酸钠；
(5)中性红的加入：中性红作为电子中介体，加速了电子传递。在三电极电化学系统中添加不同浓度中性红溶液进行CV测试、拟合，确定添加中性红终浓度为10μM；
(6)对微生物阳极驱动的生物阴极传感器进行电极动力学研究。研究电极电位、中性红和硝酸盐浓度等因素对生物阴极反应速率的影响，按步骤(5)方案模拟动力学过程，确定碳布电极尺寸为1cm×2cm，最优Rext为2KΩ；
(7)生物电化学传感器的组装：选取两个驯化完成可输出平稳运行的电流的污泥电池MFC，其中一个开路，作为驱动端MFC；另一个MFC开路，作为检测端MFC＇，其阳极为生物阴极提供电子，将阴极室的铁氰化物阴极液替换为希瓦氏菌悬浮液和清洁碳布电极，并加入乳酸钠和中性红，为生物阴极检测端；随后串联MFC及MFC＇，并在回路中接入一个最佳外接电阻和一个电流表记录电流变化；实际测试中使用电化学工作站CHI660E作电流表，实时检测电流变化，见图2；
(8)标准曲线绘制：用超纯水配制硝酸盐终浓度为1μM，3μM，5μM，7μM，10μM，20μM，50μM，100μM，200μM，300μM，500μM，1mM的标准溶液。待生物电化学传感器的输出电流达到稳定后，将不同浓度的硝酸盐标准溶液依次加入到同一生物电化学传感器体系中，记录电流峰值与电流峰面积的变化曲线见图3；从图3中即可以看出，随着加入硝酸盐浓度的提高，电流响应越来越大，即二者之间存在一定的线性关系；在1～50μM范围内响应电流峰值与硝酸盐浓度成正比(R2＝0.994)，在50μM～0.5mM范围内响应电流峰面积与硝酸盐浓度成正比(R2＝0.993)(见图4、图5)。由图4与图5可知，利用该线性关系式即可以计算硝酸盐含量；
(9)检测含硝酸盐的样品：按照上述(2)-(5)步骤，制备6个相同的生物电化学传感器用于硝酸盐检测，向这6个传感器中分别加入一种浓度的硝酸盐样品，记录电流响应图的峰值和峰面积，如表1可知，该检测方法可以准确完成对硝酸盐样品浓度的检测；表1中n指的是采用3组数据的平均值。
表1在不同的传感器中分别测试不同硝酸盐样品的结果(n＝3)
由实例及表1中可见，本发明检测方法构建的自供能微生物电化学传感器可以对水体中硝酸盐进行检测，操作过程简单，不需要对待测样品进行预处理。添加硝酸盐待测样品后即可出现电流响应，可以实现同一个系统的连续进样检测，检测效率高效，方便快捷。
Claims (10)
1.一种自供能的水体硝酸根微生物电化学检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)厌氧活性泥培养：将厌氧活性污泥密封存放，采用矿物盐培养基进行室温培养，并定期更换矿物盐培养基对厌氧活性污泥进行驯化；
(2)微生物燃料电池组装：使用双室微生物燃料电池MFC装置，分为阴极室和阳极室两部分，阳极室中添加阳极液，阴极室中添加铁氰化钾溶液作为MFC的阴极液；所述阳极液的初始组成为步骤(1)中驯化完成的厌氧活性污泥和矿物盐培养基；
将驯化完成的厌氧活性污泥作为双室微生物燃料电池MFC的阳极微生物，组装完成后密封，阳极和阴极之间通过外部电路连接电阻，在500-1000欧姆的外接电阻Rext下，稳定输出电压大于600mV，即完成微生物阳极富集；所述双室微生物燃料电池MFC装置组装至少两个；
(3)生物阴极检测菌株培养与收集：将希瓦氏菌接种于LB液体培养基中进行培养活化菌体，之后将培养好的活化希瓦氏菌菌液离心获得菌体；利用矿物盐培养基分散菌体后再次离心，以上分散-离心步骤重复2-3次；最后分散菌体至新的矿物盐培养基，其整体作为生物阴极的阴极液；
(4)检测水体硝酸根的生物阴极组装：取一个步骤(2)中富集完成并可输出平稳运行电流的MFC，将阴极室中的铁氰化钾溶液倒去并清洗杀菌，加入步骤(3)中得到的生物阴极的阴极液即含希瓦氏菌的矿物盐培养基，并添加中性红NR、乳酸钠，以新的碳布为电极，得到用于检测的微生物燃料电池装置MFC＇；
(5)微生物电化学传感器组装与优化：取步骤(2)富集完成并可输出平稳电流的一个MFC作为驱动端，步骤(4)的MFC＇为检测端，将MFC与MFC＇串联，得到微生物电化学传感器；
其中，驱动端MFC的阴极与检测端MFC＇的阳极以导线连接，并串联1个电流表；驱动端MFC的阳极与检测端MFC＇的阴极以导线连接，并串联1个电阻Rext；
(6)标准曲线绘制：超纯水配制不同浓度的硝酸盐标准溶液，待传感器体系电流达到稳定后，将不同浓度的硝酸盐标准溶液依次分别加入到上述组装的同一种传感器体系的检测端MFC＇的生物阴极中，记录电流峰值与电流峰面积的变化曲线，利用该线性关系式即可以计算硝酸盐含量；
(7)检测含硝酸盐的样品：向检测端MFC＇生物阴极中加入含硝酸盐的待检测水体，记录电流响应图的峰值和峰面积，根据标准溶液曲线确定样品水体中硝酸盐的含量，即可检测水体中的硝酸根。
2.根据权利要求1所述的一种自供能的水体硝酸根微生物电化学检测方法，其特征在于，步骤(5)中利用慢速线性伏安法确定MFC和MFC＇各阴阳极的动力学过程，获得最大电流、过电势等相关动力学参数，模拟全系统的动力学过程，获得最优Rext；
通过对串联电流表记录通过外接电阻的电流变化，实际测试中使用电化学工作站CHI660E作电流表。
3.根据权利要求2所述的一种自供能的水体硝酸根微生物电化学检测方法，其特征在于，步骤(1)～(3)中的矿物盐培养基均由以下物质组成：KH2PO4 0.2g/L、K2HPO4 0.68g/L、NaCl 0.5g/L、NH4Cl 0.47g/L、MgSO4 0.12g/L、CaCl2 0.01g/L、1％Wolfe矿物盐溶液、1％Wolfe维生素溶液；
步骤(1)中驯化中的厌氧活性污泥每周更换一次培养基，每次更换1/3总体积。
4.根据权利要求2所述的一种自供能的水体硝酸根微生物电化学检测方法，其特征在于，步骤(2)中所使用的双室微生物燃料电池MFC装置，分为阴极室和阳极室两部分，尺寸均为4cm×4cm×2cm，腔室有效容积均为30mL，使用阳离子交换膜分隔开；
步骤(2)中所述阴极液铁氰化钾溶液由以下物质组成：K3[Fe(CN)6]4 16.47g/L、KH2PO43g/L、Na2HPO4·12H2O 17.8g/L、KCl 3.73g/L；所述阳极液中矿物盐培养基与厌氧活性污泥体积比为3:1；阴极和阳极均采用碳毡电极，尺寸为2cm×3cm，通过钛丝与外电路连接；
富集阶段的微生物燃料电池输出电压低于50mV时给阳极室补充乙酸钠，以阳极液为基准按1g/L添加乙酸钠，每添加2次乙酸钠后，更换1/3体积的阳极液，阴极液全换。
5.根据权利要求2所述的一种自供能的水体硝酸根微生物电化学检测方法，其特征在于，步骤(3)所述希瓦氏菌(S.oneidensis MR-1)购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)；
所述LB液体培养基由以下物质组成：酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L；
所述希瓦氏菌的培养温度为30-32℃，摇床转速为150-180rpm，培养时间为14-16小时，离心前菌液的OD600值需控制在2.6-3.0；最终分散的菌液的OD600值需控制在1.0-1.5。
6.根据权利要求2所述的一种自供能的水体硝酸根微生物电化学检测方法，其特征在于，步骤(4)中以MFC＇生物阴极液为基准，所采用的中性红添加浓度通过以下方法确定：以生物阴极为工作电极组建电催化还原硝酸根的三电极电化学系统，添加不同浓度中性红溶液进行CV测试，获得中性红介导的希瓦氏菌电还原硝酸根的最大还原电流值；该电流值随着中性红浓度增加而增大，其数值关系遵循莫诺方程，拟合莫诺方程获得饱和还原电流及对应的中性红浓度。
7.根据权利要求6所述的一种自供能的水体硝酸根微生物电化学检测方法，其特征在于，步骤(4)中选择添加半饱和浓度的中性红，所述加入的中性红半饱和浓度为5-20μM；
步骤(4)中添加乳酸钠至其在MFC＇生物阴极液中的浓度为10-20mM。
8.根据权利要求6所述的一种自供能的水体硝酸根微生物电化学检测方法，其特征在于，步骤(4)中生物阴极使用碳布电极，需选择合适的碳布电极尺寸，使上述半饱和还原电流值介于300-400μA，且不能高于系统中两个生物阳极的最大催化电流的1/2。
9.根据权利要求8所述的一种自供能的水体硝酸根微生物电化学检测方法，其特征在于，步骤(4)中生物阴极使用的碳布电极电池尺寸的确定方法为：分别以步骤(2)获得的生物阳极或铁氰化钾阴极为工作电极组建三电极电化学系统，利用慢速循环伏安法表征阳极动力学特性，电流-电压关系遵循莫诺-能斯特方程；其中，铁氰化钾电极的最大电流值应大于3mA，生物阳极电流应大于1mA；若生物阳极电流小于1mA，则应向阳极室添加AQDS等电子中介体、碳纳米管等导电介质，达到所需的1mA的基准值；
碳布电极尺寸初步选择1cm×2cm，对应的半饱和还原电流值应介于300-400μA；若电流超出这一范围，则相应地改变电极尺寸，使电流范围达到要求。
10.根据权利要求8所述的一种自供能的水体硝酸根微生物电化学检测方法，其特征在于，步骤(5)中最优Rext通过以下方法确定：首先对步骤(4)中铁氰化钾阴极、生物阳极和生物阴极慢速循环伏安曲线按如下修正的莫诺-能斯特方程进行拟合，获得Ib、Imax、α、Eka等参数(参数)：
其中，I检测到的电流，Ib为拟合的背景电流值，Imax为Monod项的最大电流值，α为介于0-1的校正系数(α＝1时为理想生物阳极)，Eka生物阳极的特征氧化还原电势；其中，外接电阻端满足如下方程组(2-4)决定：
Ecell＝Epc-Epa+Esc-Esa-ηohm (2)
Ecell＝I×Rext (3)
ηohm＝I×Rohm (4)
其中，Epc、Epa依次为驱动端MFC的阴、阳极电势，Esc、Esa依次为检测端MFC＇的阴、阳极电势，Ecell为外接电阻两端的电压降，Rohm为传感器体系的欧姆内阻，ηohm为由于欧姆内阻产生过电势；
将拟合方程(1)获得的各项参数带入方程组(2-4)，经多次迭代可获得生物阴极电势Esc与外电阻Rext的数值关系；
所述检测过程的生物阴极电势Esc始终处于-0.7V至-1V这一范围。
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| CN108195901A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-06-22 | 清华大学 | 一种用于水体中硝酸盐预警的方法 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100200495A1 (en) * | 2009-02-06 | 2010-08-12 | Ut-Battelle, Llc | Microbial fuel cell treatment of fuel process wastewater |
| CN108195901A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-06-22 | 清华大学 | 一种用于水体中硝酸盐预警的方法 |
| CN109860644A (zh) * | 2019-01-24 | 2019-06-07 | 江苏大学 | 一种椴木三维碳电极在微生物燃料电池中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YANG-YANG YU等: "Dynamically controlling the electrode potential of a microbial fuel cell-powered biocathode for sensitive quantification of nitrate", 《ELECTROCHIMICA ACTA》 * |
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