CN114344291B

CN114344291B - 4-苯基-1h-吡咯-3-羧酸在制备治疗骨质疏松药物中的应用、脂质体

Info

Publication number: CN114344291B
Application number: CN202210141947.9A
Authority: CN
Inventors: 李长俊; 黄梅; 罗湘杭; 肖业
Original assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2022-02-16
Filing date: 2022-02-16
Publication date: 2023-09-29
Anticipated expiration: 2042-02-16
Also published as: CN114344291A

Abstract

本发明公开了一种4‑苯基‑1H‑吡咯‑3‑羧酸在制备治疗骨质疏松药物中的应用、脂质体。该脂质体为具有膜结构的囊泡，所述囊泡内部负载药物4‑苯基‑1H‑吡咯‑3‑羧酸，所述膜结合有多肽。本发明D‑L‑Zinc可有效抑制破骨细胞生成及增加成骨细胞生成，从而明显改善PMO，为开发治疗PMO的药物提供研究基础及理论依据。

Description

4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸在制备治疗骨质疏松药物中的应用、脂质体

技术领域

本发明属于医学和生物化学技术领域，涉及4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸及含其的脂质体在制备治疗骨质疏松药物中的应用，具体地说，涉及4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸及含其的脂质体在制备治疗绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis,PMO)制剂中的应用。

背景技术

Zinc01442821(4-phenyl-1h-pyrrole-3-carboxylic acid，4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸，CAS号：132040-12-1)，其分子式为C₁₁H₉NO₂，已有研究表明Zinc01442821可以促进骨形成和抑制脂肪形成，但是Zinc01442821对破骨细胞介导的骨吸收的作用尚未见报道。

破骨细胞介导骨吸收增加导致的骨稳态失衡，是多种骨骼疾病发生的主要原因，如PMO(绝经后骨质疏松症)、乳腺癌的溶骨性骨转移等。针对这类骨骼疾病，目前主要以抗骨吸收为主(如双磷酸盐、雌激素等)，但是存在治疗效果一般、长期治疗费用昂贵、具有一定的副作用、患者依从性差等问题，因此亟需有效的抗骨吸收药物的研发。有效的药物递送系统可以促进药物靶向破骨细胞所在的骨吸收表面，显著降低脱靶效应，进而提高抗骨吸收药物的治疗效果。

因此，进一步研究Zinc01442821的应用，开发其在破骨细胞介导的疾病中应用，是本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有治疗骨质疏松症药物所存在治疗效果不理想、长期治疗费用昂贵、具有一定的副作用、患者依从性差的问题，而提供了4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸在制备治疗骨质疏松药物中的应用、脂质体。本发明发现了4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸及含其的脂质体(D-L-Zinc)可有效抑制破骨细胞的生成，促进成骨细胞生成；进一步地，将其用于制备治疗PMO(绝经后骨质疏松症)药物，为开发治疗PMO的药物提供研究基础及理论依据。

本发明提供了一种4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸在制备治疗骨质疏松药物中的应用。

其中，所述4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸，也可称之为Zinc01442821，其结构式为

本发明提供了一种4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸在制备治疗绝经后骨质疏松症(PMO)药物中的应用。

发明人发现：绝经后骨质疏松发病的机理以破骨细胞增多为主；而其他类型的骨质疏松的发病机理为破骨细胞增多和/或成骨细胞减少。

本发明还提供了一种含4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸的脂质溶液，其包括4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸、脂质和溶剂。

其中，所述脂质可为本领域常规的脂质，例如DOTAP(脂质体)、DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)、Chol(胆固醇)、DSPE-mPEG2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000)和DSPE-PEG2000-MAL(二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺)中的一种或多种，例如DOTAP、DOPE、Chol、DSPE-mPEG2000和DSPE-PEG2000-MAL。

所述脂质体可为2,3-二油酰基-丙基。

当所述脂质为DOTAP、DOPE、Chol、DSPE-mPEG2000和DSPE-PEG2000-MAL时，DOTAP、DOPE、Chol、DSPE-mPEG2000和DSPE-PEG2000-MAL的摩尔比为42：15：38：3：2。

其中，所述溶剂可为本领域常规的溶剂，例如氯仿。

本发明还提供了一种含4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸的脂质体，其为具有膜结构的囊泡，所述囊泡内部负载药物4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸，所述膜结合有多肽。

本发明中，所述多肽可为由八个天冬氨酸的重复序列形成的靶头。

本发明中，所述含4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸的脂质体可为(D-Asp8)-liposome-Zinc01442821(D-L-Zinc)，D-L-Zinc是小分子化合物Zinc01442821经脂质体包裹，并携带由八个天冬氨酸的重复序列形成的靶头(D-Asp8，天冬氨酸可以与骨吸收表面高度结晶的羟基磷灰石高亲和力结合)，该靶向骨吸收表面的脂质体给药系统可以提高载药系统靶向传递的效率，降低药物使用剂量和药物毒副作用，有望成为治疗PMO的高效药物。

本发明还提供了一种所述含4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸的脂质体的制备方法，其包括下述步骤：

S1：将所述含4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸的脂质溶液经干燥、水化，得单层囊泡的脂质体A；

S2：将所述单层囊泡的脂质体A和所述多肽混合反应，即得。

其中，所述水化条件可为本领域常规的水化条件，例如PBS水化。

其中，所述水化后，还可按照本领域常规的后处理获得单层囊泡的脂质体，例如采用脂质体挤出器将水化后的脂质溶液经两层滤膜(孔径分别为0.2μm和0.1μm)滤过五次，即可。

其中，所述单层囊泡的脂质体A和多肽的摩尔比可为1：(1-3)，例如1：2。

其中，所述反应的温度可为20-25℃。

其中，所述反应的时间可为1-3小时，例如2小时。

其中，所述混合反应后的单层囊泡的脂质体A还可与甘露醇水溶液混合后经冻干处理。

本发明提供了一种所述含4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸的脂质体在制备治疗骨质疏松药物中的应用。

本发明提供了一种所述含4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸的脂质体在制备治疗PMO药物中的应用。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

经过实验证明：本发明D-L-Zinc可有效抑制破骨细胞的生成，促进成骨细胞生成，从而明显改善绝经后骨质疏松小鼠的骨量。

附图说明

图1为Zinc01442821抑制破骨细胞生成相关基因表达的示意图；其中，图A为Zinc01442821抑制破骨细胞表达CTSK的示意图，图B为Zinc01442821抑制破骨细胞表达NFATc1的示意图，图C为Zinc01442821抑制破骨细胞表达Rank的示意图；

图2为Zinc01442821抑制破骨细胞数量的示意图；其中，图A为Zinc01442821抑制破骨细胞生成的抗酒石酸酸性磷酸酶(Trap)染色示意图，图B为实施例3中各组别Trap阳性(Trap⁺)破骨细胞数量的统计分析图；

图3为D-L-Zinc增加PMO小鼠股骨骨量的示意图；其中，图A为D-L-Zinc增加PMO小鼠骨量的股骨三维重建示意图，图B为D-L-Zinc增加PMO小鼠股骨骨小梁体积示意图，图C为D-L-Zinc增加PMO小鼠股骨骨小梁厚度示意图，图D为D-L-Zinc增加PMO小鼠股骨骨小梁数目示意图，图E为D-L-Zinc降低PMO小鼠股骨骨小梁分离度示意图；

图4为D-L-Zinc减少PMO小鼠股骨破骨细胞数目的示意图；其中，图A为抗酒石酸酸性磷酸酶(Trap)染色示意图，图B为统计分析图；

图5为D-L-Zinc增加PMO小鼠股骨成骨细胞数目的示意图；其中，图A为骨钙素(OCN)染色示意图，图B为统计分析图；

图6为D-L-Zinc减少PMO小鼠股骨脂肪空泡数目的示意图；其中，图A为股骨HE染色示意图，图B为脂肪空泡统计分析图；

图7为实施例1所制备得到的D-L-Zinc的模式图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1 D-L-Zinc脂质体的制备

①Zinc01442821购于Enamine公司，其结构式为DOTAP(脂质体)(脂质体为2,3-二油酰基-丙基)、DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)、Chol(胆固醇)、DSPE-mPEG2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000)和DSPE-PEG2000-MAL(二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺)均购于sigma公司；

②将DOTAP，DOPE，Chol，DSPE-mPEG2000和DSPE-PEG2000-MAL按照摩尔比为42：15：38：3：2的比例溶解在氯仿中，将脂质干燥，然后用PBS水化形成含有多层囊泡的脂质溶液；

③用脂质体挤出器将脂质溶液经两层滤膜(孔径分别为0.2μm和0.1μm)滤过五次，从而形成单层囊泡的脂质体；

④将脂质体和D-Asp8多肽(购自强耀生物科技有限公司，其氨基酸序列为八个天冬氨酸，SEQ ID No.1)以1：2的摩尔比在环境温度下(20-25℃)反应2小时得到结合多肽的脂质体，使用Sepharose CL-4B(琼脂糖凝胶CL-4B)柱将反应混合物中未结合的D-Asp8多肽去除；

⑤接着将0.5ml的结合多肽的脂质体与0.5ml含甘露醇的蒸馏水混合，然后冻干48小时；

⑥添加0.5ml含Zinc01442821或DMSO(对照溶剂)的水溶液使步骤⑤中具有15μmol脂质的结合多肽的脂质体再水化，并在室温(20-25℃)下孵育20分钟，然后通过无菌过滤器进行除菌，即得D-L-Zinc(其结构参见图7)。

实施例2 Zinc01442821抑制破骨细胞生成相关基因

1.配置10mM储存液：①Zinc01442821(25mg)购于Enamine公司，1000r/min离心5mins；②在超净工作台中，吸取1ml DMSO到药品管中，反复吹打混匀；③取新的50ml离心管，加入12.35ml DMSO，将药品管中所得液体全部移入50ml离心管中，混匀；④将50ml离心管盖紧，在涡旋仪上短暂涡旋混匀；⑤将混匀后的液体分装，-20度保存。

2.配置10μM工作液：①取分装的Zinc01442821储存液置于室温下复温；②按照每1ml培养基，加入1μl储存液的比例配制成工作液，用于后续细胞实验。

3.小鼠破骨细胞的分离培养及干预：将4-6周龄大小的小鼠进行颈椎脱臼处死，75％的酒精浸泡5分钟，细胞台内取股骨和胫骨，α-MEM培基冲洗骨髓收集细胞，接种培养12小时后收集非贴壁细胞，用含M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)(50ng/mL)的完全培养基(10％FBS+1％双抗+89％α-MEM培养基)重悬细胞，以1×10^⁵细胞/孔的密度接种在24孔板中培养3天，将其分为正常+DMSO组(Control)、Rankl+DMSO组(Rankl)、Rankl+Zinc01442821组(zinc)。Control组加入含50ng/ml M-CSF的完全培养基和1μl的DMSO，Rankl组和Zinc组用含有50ng/ml M-CSF和100ng/ml RANKL(RANKL是指Receptor Activator of NuclearFactor-κB Ligand，核因子κB受体活化因子配体)的完全培养基进行分化诱导，同时分别加入1μl的DMSO或Zinc01442821，每3天更换一次培养基，培养9天左右直至形成多核破骨细胞，提取细胞RNA，使用Q-PCR方法检测各组细胞中破骨细胞生成相关基因CTSK、NFATc1、Rank的表达情况。

参见图1，各数值表示为三次检测的平均值±SD。*，与Control组相比p<0.05；#，与Rankl组相比p<0.05。

表1

组别	CTSK相对表达水平	NFATc1相对表达水平	Rank相对表达水平
				Control	0.929±0.102	0.931±0.054	0.952±0.032
RANKL	177.036±8.884**	1.337±0.085**	1.180±0.090*
				Zinc	144.873±3.842#	1.081±0.029##	1.005±0.049#

从图1可以看出，与Control组相比，Rankl组破骨细胞生成相关基因CTSK、NFATc1、Rank表达水平明显增加，而加入了Zinc01442821干预的细胞CTSK、NFATc1、Rank的表达水平明显受到抑制。此结果表明，Zinc01442821可抑制破骨细胞生成相关基因CTSK、NFATc1、Rank的表达，具有抑制破骨细胞生成的有效作用。

实施例3 Zinc01442821抑制破骨细胞数量

提取小鼠骨髓细胞(具体同实施例2第3点)，以1×10^⁵细胞/孔的密度接种在24孔板中培养3天，将其分为正常+DMSO组(Control)、Rankl+DMSO组(Rankl)、Rankl+Zinc01442821组(zinc)。Control组加入含50ng/ml M-CSF的完全培养基和1μl的DMSO，Rankl组和Zinc组用含有50ng/ml M-CSF和100ng/ml RANKL的完全培养基进行分化诱导，同时分别加入1μl的DMSO或Zinc01442821，每3天更换一次培养基，培养9天左右直至形成多核破骨细胞，弃去培养基，4％多聚甲醛固定，Trap染色，显微镜下观察破骨细胞，拍照。

参见图2，各数值表示为三次检测的平均值±SD。*，与Control组相比p<0.05；#，与Rankl组相比p<0.05。

表2

组别	破骨细胞数量
		Control	0.000±0.000
RANKL	292.667±8.179***
		Zinc	90.667±7.040##

从图2可以看出，与Control组相比，Rankl组破骨细胞数目明显增加，而加入了Zinc01442821干预后破骨细胞数目明显受到抑制。此结果表明，Zinc01442821可抑制破骨细胞生成的作用。

实施例4 D-L-Zinc增加PMO小鼠股骨骨量

绝经后骨质疏松症(PMO)是由于雌激素的减退导致骨量显著丢失的一种代谢性骨病，属于高转换率型骨质疏松，表现为破骨细胞大量增加，成骨细胞轻微增加，最终由于骨吸收大于骨形成，导致骨量的显著减少。从实施例2、3中可以观察到Zinc01442821具有显著抑制破骨细胞生成和骨吸收的作用，因此进一步验证其对PMO的骨丢失是否具有改善作用。由于体内直接给药(Zinc01442821)，药物的骨靶向性差，而且毒副作用较大，因此将Zinc01442821予以脂质体包裹，并携带骨靶向的靶头，增加药物在骨吸收表面的分布增加药效，同时减少其他器官的蓄积。

将18只C57BL/C小鼠进行适应性喂养1周后，分为假手术+vehicle组(sham)、卵巢切除+vehicle组(OVX)和卵巢切除+D-L-Zinc组(D-L-Zinc)，每组6只，假手术或者双侧卵巢切除1月后，每组小鼠经尾静脉注射100μlD-L-Zinc(含Zinc01442821 100mg/kg)，每周注射5次，注射4周后称量各组小鼠体重，处死各组小鼠，取血，留取股骨和胫骨，Micro-CT检测分析骨标本显微结构，进行股骨影像学扫描，框选相同位置的骨小梁集中区3D-MED图像处理软件进2D和3D图像重建。

参见图3，各数值表示为三次检测的平均值±SD。*，与sham组小鼠相比p<0.05；#，与OVX模型组小鼠相比p<0.05。

表3

从图3中可看出，与sham组相比，OVX模型组小鼠股骨骨小梁体积、骨小梁厚度、骨小梁数目明显减少，骨小梁分离度明显增加，D-L-Zinc干预后上述指标得到改善。此结果表明，Zinc01442821具有减轻PMO小鼠骨丢失的作用。

表4

组别	Trap+的破骨细胞(N/mm)
		sham	4.584±1.283
OVX	6.874±0.578**
		OVX+D-L-Zinc	4.426±0.421##

从图4中可看出，与sham组相比，OVX模型组小鼠股骨破骨细胞数目明显增加，而D-L-Zinc组小鼠股骨破骨细胞数目较OVX组明显减少。

表5

组别	OCN+的成骨细胞(N/mm)
		sham	8.667±0.933
OVX	8.168±0.504
		OVX+D-L-Zinc	10.940±0.859#

从图5中可看出，与sham组相比，OVX模型组小鼠股骨成骨细胞数目变化不明显，而D-L-Zinc组小鼠股骨成骨细胞数目较OVX组明显增加。

表6

组别	脂肪细胞数目(N/mm2)
		sham	1.867±0.500
OVX	3.830±0.799**
		OVX+D-L-Zinc	1.616±0.470###

从图6中可看出，与sham组相比，OVX模型组小鼠股骨脂肪空泡明显增加，而D-L-Zinc组小鼠股骨脂肪空泡较OVX组明显减少。

上述结果表明，Zinc01442821具有抑制PMO小鼠破骨形成和脂肪形成，增加骨形成的作用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 中南大学湘雅医院

<120> 4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸在制备治疗骨质疏松药物中的应用、脂质体

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp

1 5

Claims

1.一种4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸在制备治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用。

2.一种含4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸的脂质体在制备治疗绝经后骨质疏松症药物中的应用；

所述含4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸的脂质体，其为具有膜结构的囊泡，所述囊泡内部负载药物4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸，所述膜结合有多肽。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述含4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸的脂质体为(D-Asp8)-liposome-Zinc01442821。