CN114317533A - 一组探针和利用杂交捕获法检测药物基因组学相关基因cyp2d6多态性的建库试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一组探针以及一种含有所述一组探针的试剂盒，用于制造一种利用杂交捕获法检测药物基因组学相关基因CYP2D6多态性的建库试剂盒。本发明一次检测就可以快速获得CYP2D6的基因型与代谢药物能力，同时本试剂盒操作简便，耗时小，极易实现自动化检测，特别适用于大样本量相关研究，对于发现新的基因型也有很大意义。

Description

一组探针和利用杂交捕获法检测药物基因组学相关基因 CYP2D6多态性的建库试剂盒

技术领域

本发明涉及一组探针和一种利用杂交捕获法检测药物基因组学相关基因CYP2D6多态性的建库试剂盒。

背景技术

近年来随着精准医疗的逐步推广，药物基因组学(pharmacogenomics,PGx)作为实现个体化给药的有力手段得到了迅猛发展。PGx主要研究影响药物反应(包括疗效、不良反应发生)个体差异的基因多态性，涉及编码药物代谢酶、转运体、作用靶点等的基因.这些基因特性的变化会影响体内药物浓度及靶组织的药物敏感性.故而对这些基因组生物标志物进行检测、分析能够有助于指导临床精准用药、预测药物不良反应的发生、指导新药研发与应用。

CYP450家族是一个与90％临床药物代谢相关的同工酶家族。CYP450代谢酶主要负责的药物清除Ⅰ相反应，是药物代谢的限速步骤，因此编码CYP450家族的基因是与底物药代动力学最相关的遗传学因素。

CYP2D6(cytochrome P450 family 2subfamily D member 6)是CYP450酶系中最先被发现的受单基因控制的酶。迄今已有100余个CYP2D6等位基因被发现，表现出高度的基因多态性。其基因型与代谢药物能力密切相关，各基因型根据药物代谢表型的不同主要分为弱代谢型(poor metabolizer，PM)、中间代谢型(intermediatemetabolizer，IM)、正常代谢型(extensive metabolizer，EM)和超快代谢型(ultrarapid metabolizer，UM)四种，未突变的人群携带的野生型属于EM，在亚洲人群中最常见的突变型为IM，由于对于药物代谢能力的减弱引起蓄积，临床上EM型患者产生药物相关不良反应的概率增加。CYP2D6等位基因的突变率在不同人种中具有显著差异，在亚洲人群中最普遍的突变型为CYP2D6*10，其突变率约为50％，远高于高加索人群中的突变频率(5％)，该突变型可降低CYP2D6活性，而CYP2D6*3和CYP2D6*4突变在亚洲人群中未被发现，CYP2D6*5发生率则与高加索人群及非洲人群相近。CYP2D6*9多态性是G2613-A2615缺失，也可引起代谢酶活性降低。

传统的基因突变检测方法，如Sanger测序、焦磷酸测序和实时荧光PCR等仅能对单个基因，或者单个基因的部分外显子突变进行检测，对复杂变异类型的检测存在局限性。

随着药物基因组学知识的不断积累，以及分子检测技术的不断发展，多位点/多药物的个体化用药检测正在被行业所接受。一次检测就可以获得常用药物或一类药物(如心血管、免疫抑制)的药物代谢酶及作用靶点基因的遗传信息，对药物剂量、药物种类选择及药物间相互作用等个体化用药方案的制定产生决定性影响。

目前获三类证批件的PGx体外诊断试剂远不能覆盖临床所需检测的基因位点，随着二代测序技术的普及，高通量测序能够同时对上百万甚至数十亿个DNA片段进行测序，因此可在较低成本下一次对多至上百个药物基因组学相关基因、全外显子及全基因组进行检测，而且需要的样本量并不增加。高通量测序技术因其在通量、成本和效率方面的优势，在药物代谢酶和药物作用靶点基因检测上展现了广阔的应用价值。

本专利设计一种利用杂交捕获法检测药物基因组学相关基因CYP2D6多态性建库试剂盒。仅需微量基因组DNA，通过酶切打断、加接头构建好文库，然后再利用自主设计探针CYP2D6Panel对文库进行杂交捕获和富集，即可快速完成靶向文库构建。通过简单易用的边合成边NGS测序解决方案，实现对可能影响药物和化合物吸收、分布、代谢和排泄的CYP2D6基因进行快速精准分型。一次检测就可以快速获得CYP2D6的基因型与代谢药物能力，同时本试剂盒操作简便，耗时小，极易实现自动化检测，特别适用于大样本量相关研究，对于发现新的基因型也有很大意义。

发明内容

本发明描述了一种利用杂交捕获法检测药物基因组学相关基因CYP2D6多态性建库试剂盒，以极低起始量的基因组DNA为模板通过一步反应实现酶切打断、末端修复和加A尾；然后加adapter、磁珠纯化；再经过短暂index扩增即可完成文库构建，然后再通过个性化定制探针CYP3A4Panel对文库进行快速杂交，15分钟即可达到常规需要过夜反应才能达到的杂交效率；然后再通过链霉素磁珠对杂交产物进行捕获和富集、扩增纯化后得到最终的靶向文库。然后再对文库进行高通量测序，待测序数据下机后，通过生物信息学分析和比对，利用相关生信分析软件和药物基因组学相关数据库，即可快速完成对CYP2D6基因的精准分型。

本发明提供一组探针，所述一组探针包括碱基序列SEQ ID NO:1～57中的至少一种。

优选地，所述一组探针用于制造一种利用杂交捕获法检测药物基因组学相关基因CYP2D6多态性的建库试剂盒。

本发明还提供一种利用杂交捕获法检测药物基因组学相关基因CYP2D6多态性的建库试剂盒，所述建库试剂盒包括一组探针，所述一组探针包括碱基序列SEQ ID NO:1～57中的至少一种。

本发明还提供一种用于基因突变检测的建库试剂盒，所述建库试剂盒包括一组探针，所述一组探针包括碱基序列SEQ ID NO:1～57中的至少一种。

与现有技术相比，本发明技术方案具有如下优点：

本发明制造出的建库试剂盒，可利用杂交捕获法检测药物基因组学相关基因CYP3A4多态性；仅需微量基因组DNA用于构建DNA文库，模板起始量可低至10ng；将酶切打断、末端补平和加A尾在一个体系里完成，然后再利用自主设计探针CYP3A4Panel对文库进行杂交捕获和富集，耗时短，效率高；其次本试剂盒index多达384对，可实现384个文库同时构建和一起上机测序；另外本试剂盒的快速杂交体系，杂交时间最短可至15min即可实现一般过夜杂交的效率，最终得到文库片段大小在300～400bp左右，能够兼容Illumina各种测序平台进行测序；通过简单易用的边合成边NGS测序解决方案，实现对可能影响药物和化合物吸收、分布、代谢和排泄的CYP2D6基因进行快速精准分型；一次检测就可以快速获得CYP2D6的基因型与代谢药物能力，同时本试剂盒操作简便，耗时小，极易实现自动化检测，在指导器官移植患者服用他克莫司药物治疗的起始剂量中具有良好的临床应用前景，便于临床的推广。

附图说明

图1.实施例1中构建好文库的片段分析结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。

实施1：构建文库

酶切法文库构建

DNA打断、末端修复和加A尾(扩增区)

首先打开PCR仪，将PCR仪热盖温度设置为70℃。

1.0.1 DNA建库起始量为10～100ng，充分混匀瞬离后冰上待用。

1.0.2至试剂准备区，取1新的1.5ml离心管，配制酶切反应混合液。将10xFragmentation Buffer和5x Fragmentation Enzyme(Twist Bioscience)于冰上融化后，根据下表配制混合液，并混匀离心后，将混合液分装至八联管中，然后通过传递窗转移至扩增区。(同时可将下一步纯化所用的DNA纯化磁珠液从冰箱中取出，充分振荡混匀后，一起转移至扩增区，至室温平衡至少30min)

试剂	单反应体积
		10x Fragmentation Buffer	5ul
5x Fragmentation Enzyme	10ul
		Total	40ul

1.0.3待检DNA样本各35ul分别加至配制好反应混合液的八联管中，轻轻震荡混匀，瞬离后迅速放入PCR仪，确定PCR仪热盖温度为70℃，然后采用如下程序：

温度	时间
		32℃	22min
65℃	30min
		4℃	HOLD

连接Universal adapter

1.0.4在以上步骤完成后的每个反应体系分别加入5uL Universal adapter(Twist Bioscience)。用轻轻震荡混匀，离心后置于冰上待用。

1.0.5至试剂准备区，配制连接反应混合液。将DNA Ligation Buffer和DNALigation Mix(Twist Bioscience)于冰上融化后，根据下表配制混合液，混匀离心置于冰上转移至扩增区待用。

试剂	单反应体积
		Water	15ul
DNA Ligation Buffer	20ul
		DNA Ligation Mix	10ul
Total	45ul

1.0.6在每个1.0.3步骤准备好的样本中，加入45ul1.1.2步骤中配置好的连接反应混合液。轻轻震荡混匀，离心后迅速放入PCR仪，20℃连接15分钟(热盖关闭)。结束后取出，立即开始磁珠纯化。

第一步磁珠纯化(扩增区)

1.1.1文库纯化磁珠(Vazyme)在使用前需从4℃取出，充分漩涡震荡混匀，室温平衡至少30min备用。

1.1.2将室温平衡好的纯化磁珠悬浮液(Vazyme)振混1min，按80ul(样本体积0.8倍)/样本分装至1.5ml离心管中。

1.1.3将连接产物全部转到对应离心管的磁珠中，轻轻震荡混匀，避免产生气泡。

1.1.4将离心管于室温下静置5min后，置于磁力架上5min，直至上清澄清。小心移去上清。

1.1.5保持离心管于磁力架上，向各管中加入200ul新鲜配制的80％乙醇，室温静置1min，吸弃上清。

1.1.6重复步骤1.2.5，瞬时离心后将离心管放回磁力架，用10ul移液器尽量吸除管底所有残留乙醇溶液。

1.1.7离心管留于磁力架上室温开盖5min干燥，使乙醇全部挥发，切忌过度干燥。

1.1.8向各管中加入17ul无酶水，使用移液器上下混匀10次。室温孵育5min。

1.1.9将各管置于磁力架上静置5min，直至上清澄清。

UDI接头引物PCR扩增

1.1.10步骤1.2.9静置期间可至试剂准备区，根据样本数，准备八联管于冰盒上，取25ul KAPA HiFiHotStartReadyMix(KAPA)分装至八联管各孔内。

1.1.11再向八联管的各孔中分别加入10ul事先设定好的不同Index的UDI引物(Twist Bioscience，UDI引物的REF为101308、101309、101310、101311，每个REF包含96对UDI引物，分装在96孔板里，4个REF对应4板，共计384对)。然后通过传递窗转移至扩增I区。1.1.12按照已设置好的位置顺序，吸取步骤1.2.9得到的15ul纯化上清液加入至已分装好PCR反应混合液的各孔中，盖上管盖，轻轻震荡，短暂离心收集液体。

1.1.13将配制好的PCR反应管通过传递窗转移至扩增区进行PCR反应。热盖105℃，反应程序设置如下表。

第二步磁珠纯化(扩增区)

1.1.14文库纯化磁珠(Vazyme)在使用前需从4℃取出，充分漩涡震荡混匀，室温平衡至少30min备用。

1.1.15将室温平衡好的纯化磁珠悬浮液振混1min，按50ul(样本等体积)/样本分装至1.5ml离心管中。

1.1.16取出PCR反应产物，离心机离心30s，将产物全部转到对应离心管的磁珠中，轻轻震荡，避免产生气泡。

1.1.17室温下静置5min后，置于磁力分离架上5min，直至上清澄清。小心移去上清。

1.1.18置于磁力分离架上，加入200ul新鲜配制的80％乙醇，室温静置1min，吸弃上清。

1.1.19重复步骤1.4.5，并尽量去除所有残留乙醇溶液。

1.1.20离心管留于磁力架上室温开盖5min干燥，保证所有乙醇全部挥发。

1.1.21加入22ul无酶水，轻轻震荡。室温孵育5min。

1.1.22置于磁力架上5min，取20ul上清(文库)进入下一步文库富集。取1ul稀释10倍后，使用Qubit和片段分析仪分别进行文库浓度和片段大小测定，检测文库的平均片段长度应该在350bp左右。

杂交捕获

文库杂交

2.0.1文库池DNA混合方案：文库池常包含多个不同样本文库，根据文库DNA浓度计算文库池进入量，混合获得文库池。文库池DNA总量为1.5～4μg，建议同质量样本建立文库池。DNA文库用量参考下表：

混合样本数量	每个文库的用量	每个反应文库总量
			1	1000ng	1000ng
2	1000ng	2000ng
			3	1000ng	3000ng
4	800ng	3200ng
			8	400ng	3200ng

2.0.2计算好不同文库用量，于1.5ml离心管中对各文库进行混合，轻轻震荡，瞬离备用。

2.0.3在混合好的样本中分别加入以下预杂交试剂，混匀，瞬时离心，尽量不要产生气泡。

2.0.4将以上混合好的预杂交试剂管打开管盖，然后将管置于真空浓缩仪中，配平后，45℃烘干直至管内溶液干燥完全。烘干过程约30分钟至1小时。

2.0.5烘干快结束时，可先将Fast Hybridization Mix(Twist Bioscience)在65℃孵育10min或直至所有沉淀溶解，然后按照下表，设置PCR仪程序，热盖85℃：

温度	时间
		95℃	5min
60℃	15min～4h

2.0.6烘干结束后，从干燥仪中取出离心管，撕下封口膜，将Fast HybridizationMix(Twist Bioscience)迅速涡旋并取20uL加至管中重悬样本(请不要让杂交液恢复至室温)，指尖轻弹混匀，避免产生气泡，室温静置5min。使用移液器上下吹吸10次，完全溶解DNA后，将管内所有溶液尽可能全部转移至一个新的PCR管中，避免产生气泡。

2.0.7再向管中加入30uL石蜡油覆盖在其内试剂表面，然后瞬时离心去除气泡。

2.0.8将PCR管放入预热好的PCR仪中杂交，孵育15min～2h。(在此期间可至试剂准备区将下一步捕获所用的Streptavidin Binding Beads(Twist Bioscience)从冰箱中取出，充分振荡混匀后，至室温平衡至少30min)。

文库捕获和清洗

2.1.1至试剂准备区，按下表分装富集试剂(单个富集反应试剂用量)至1.5ml离心管中，然后将各组分和平衡好的磁珠组分(Streptavidin Binding Beads)通过传递窗转移至扩增区。

组分	所需体积
		Fast Binding Buffer(Twist Bioscience)	900ul
Fast Wash Buffer 1(Twist Bioscience)	450ul
		Wash Buffer 2(Twist Bioscience)	700ul

2.1.2进入扩增区，在恒温金属浴上，66℃预热450ulFast Wash Buffer 1；48℃预热700ulWash Buffer 2。

2.1.3震荡预平衡的Binding Beads(Twist Bioscience)直至完全混匀，取100uL磁珠至1.5mL离心管中；

2.1.4向离心管中加入200uLFast Binding Buffer并用枪头吹打混匀；

2.1.5将离心管置于磁力架上1min或至溶液澄清，弃去上清，取下离心管；

2.1.6重复以上2.1.4-2.1.5洗涤步骤2次，共3次；

2.1.7第三次清洗后，再加入200uLFast Binding Buffer，震荡重悬使充分混匀；

2.1.8步骤2.0.8杂交结束后，打开PCR仪盖并迅速将杂交液全部转移至平衡好的磁珠液中。注意：快速将PCR仪中的试剂转移至磁珠中是关键步骤，必须直接在PCR仪上样，不要将杂交管取出防止杂交液温度下降。

2.1.9将离心管合盖后再用封口膜封紧管口，然后置于在Biocate振荡器上，1200rpm，室温充分混匀30min。

2.1.10将离心管从混匀仪上取下，快速离心后在磁力架上放置1min，去上清，取下管子，加入200uL预热的Fast Wash Buffer 1(不要将其从金属浴中取出)，轻轻震荡混匀；

2.1.11将离心管迅速置于66℃孵育5min；

2.1.12将离心管瞬离后放置于磁力架上1min，去上清，取下管子，再次加入200ul预热的Fast Wash Buffer 1，轻轻震荡混匀；

2.1.13将离心管迅速置于66℃孵育5min；

2.1.14将离心管瞬离后转移其内所有液体至一个新的1.5ml离心管；磁力架上放置1min，去上清；

2.1.15取下管子，加入200uL预热过的Wash Buffer 2(不要将其从金属浴中取出)，轻轻震荡混匀；

2.1.16将离心管迅速置于48℃孵育5min；

2.1.17将离心管瞬离后放置于磁力架上1min，去上清，取下管子；

2.1.18重复(步骤2.1.15-2.1.17)洗2次，共三次；

2.1.19将离心管瞬离后置于磁力架上，用10uL枪头吸干净洗液；

2.1.20将离心管从磁力架上取下，加入45uL无核酶水，轻轻震荡混匀，冰上孵育该溶液，如果暂时不进行PCR扩增，可以将该磁珠混合液置于20℃保存。

PCR扩增

2.2.1进入试剂准备区，取1个PCR管，配制混合液，向管中分别加入(25ul KAPAHiFiHotStartReadyMix(KAPA)+2.5ul Amplification Primers(Twist Bioscience)＝22.5ul)，然后将PCR管通过传递窗转移至扩增I区。(注意：此时可将DNA PurificationBeads(Vazyme)从冰箱中取出，充分振荡混匀，同PCR管一起转移至扩增区，至室温平衡至少30min)

2.2.2取步骤2.1.20中得到的22.5ul磁珠悬液加入到PCR管中，轻轻振荡混匀瞬时离心。剩余的22.5ul可以保存至–20℃备用。

2.2.3将PCR管置于PCR仪上，热盖105℃，按以下反应程序扩增：

磁珠纯化(扩增区)

2.2.4涡旋充分混匀预平衡的DNA纯化磁珠(Vazyme)，取1干净的1.5ml离心管，加入90ul(1.8*)DNA纯化磁珠，待PCR结束后，将PCR管瞬时离心，然后将PCR管内所有溶液全部转移至1.5ml离心管中，涡旋充分混匀；

2.2.5将离心管于室温孵育5min；

2.2.6将离心管置于磁力架上1min，待溶液澄清后去上清；

2.2.7保持离心管在磁力架上，加入新鲜配制的80％乙醇200ul，孵育1min，弃上清；重复一次80％乙醇洗涤(共2次)；

2.2.8将离心管瞬时离心后置于磁力架上，用10ul枪头小心去除残留的乙醇，室温放置5-10min或至磁珠干燥，忌干裂；

2.2.9从磁力架上取下管子并加入32ul无核酶水，轻轻震荡混匀，室温孵育5min；

2.2.10将离心管置于磁力架上3min或至溶液澄清；

2.2.11转移30ul上清至干净的1.5ml离心管，管盖上标明文库名称和建库日期，然后转移至文库质检区。注：纯化后富集文库若不能立即上机测序，可在-20℃以下保存30天。

2.2.12另取1ul使用

dsDNA HS Assay Kit(Vazyme)进行文库浓度测定，文库浓度应大于0.5ng/ul。同时可采用2100片段分析仪(Agilent)检测文库片段长度分布，平均片段长度应该在300-400bp。

CYP2D6 Panel杂交捕获探针序列如下：

实施例2临床样本检测

取4名志愿者全血样本各1份，检测这4样本CYP2D6基因多态性的情况。先分别提取4名志愿者全血基因组DNA，然后根据实施例1中的所述方法进行建库，成功构建文库(见图1)，将文库于Illumina高通量测序仪上进行测序，测序参数PE：2×150。然后对下机数据进行质控后，再利用相关数据库如PharmGKB、CPIC等对数据进行生物信息学分析，得出各样本CYP3A4基因多态性分布，再通过一代测序对各个位点进行验证，符合率100％。

志愿者1检测结果：

志愿者2检测结果：

志愿者3检测结果：

志愿者4检测结果：

从检测结果可以看出，本发明所述试剂盒能够检测出CYP2D6基因多态性，可以准确地对CYP2D6基因进行精准的分型。本发明所述CYP2D6 Panel杂交捕获探针可以准确的捕获到CYP2D6基因。对常规样本的检测表明本发明所述探针和方法及试剂盒能够检测出CYP2D6基因多态性。

Claims (4)

1.一组探针，其特征在于，所述一组探针包括碱基序列SEQ ID NO:1～57中的至少一种。

2.如权利要求1所示的一组探针，其特征在于，所述一组探针用于制造一种利用杂交捕获法检测药物基因组学相关基因CYP2D6多态性的建库试剂盒。

3.一种利用杂交捕获法检测药物基因组学相关基因CYP2D6多态性的建库试剂盒，所述建库试剂盒包括一组探针，其特征在于，所述一组探针包括碱基序列SEQ ID NO:1～57中的至少一种。

4.一种用于基因突变检测的建库试剂盒，所述建库试剂盒包括一组探针，其特征在于，所述一组探针包括碱基序列SEQ ID NO:1～57中的至少一种。

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