CN114317525A - 一种无损伤鼋基因组dna样品的获取方法、提取方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种无损伤鼋基因组DNA样品的获取方法、提取方法及应用。本发明通过收集脐带组织，无损伤提取高质量的基因组DNA，可满足后期的遗传多样性、父权关系确定、亲子鉴定等分子生物学分析，对开展濒危动物的有效保护具有重要意义。同时该发明通过在鼋生长早期就获得样本，能够降低分窝分池养殖的成本。本方法同时适用于其它濒危龟鳖动物基因组DNA的获得。
Description
本申请是申请日为2021年01月20日、申请号为202110075983.5、发明名称为《一种鼋基因组DNA的提取方法及应用》的分案申请。
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种无损伤鼋基因组DNA样品的获取方法、提取方法及应用。
背景技术
鼋(Pelochelys cantorii，1864)属脊索动物门、爬行纲、龟鳖目、鳖科、鼋属。成年个体背甲长达1m，是鳖科类最大个体之一。1989年，鼋被列为中国国家一级水生野生保护动物，与大熊猫、白鳍豚相提并论，被称为“水中大熊猫”。鼋成熟个体体重大，性成熟年龄晚，其栖息地生境的不断恶化及人类的乱捕，致使其分布区逐渐缩小，种群数量逐渐减少，已经极度濒危，在一些区域已经灭绝，目前仅人工条件下保有亲本13只。鼋也于2000年被世界自然保护联盟(IUCN)定为濒危动物，2003年入濒临绝种野生动植物国际贸易公约(CITES)附录Ⅱ名单。国内于2014年鼋人工驯养繁殖成功，目前人工驯养的4只亲鼋(2雌2雄)已成功繁育1-6龄子一代幼鼋个体800多只，但目前这些子代个体的遗传多样性怎样？每窝卵是否存在多父权关系？这些问题的解决对濒危物种人工驯养繁育管理、种群资源保护以及再引入工程具有重要指导意义。
鼋属于软壳龟科动物，身体以皮革覆盖，体表受伤易感染发炎，严重时危及生命。刚孵出时仅有13g左右，没有合适的获得基因组DNA样本的方法。鼋每年产卵4-6窝，每窝平均43枚卵，人工条件下卵的出苗率在70％左右，如果前期不能弄清楚子代的亲权关系，则需要分窝分池养殖，2只雌鼋子代个体需要大量的养殖设施和场地。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种无损伤鼋基因组DNA样品的获取方法、提取方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，本发明提供了一种无损伤鼋基因组DNA样品的获取方法，包括以下步骤：
用灭菌的剪刀剪下稚鼋肚上的脐带，置于装有纯酒精的离心管中；将稚鼋拿出，放到另外盆中自然收干脐带，得鼋基因组DNA样品；
若看到稚鼋的脐带已经自然脱落，将稚鼋拿出，放到另外盆中自然收干脐带，得鼋基因组DNA样品；
若在孵化介质中找到脱落的脐带，置于装有纯酒精的离心管中，得鼋基因组DNA样品。
优选的，剪刀剪下脐带，留在鼋腹部上脐带长度不少于0.5cm。
优选的，所述离心管中的纯酒精的量为1mL。
本发明提供了上述技术方案所述获取方法在鼋遗传多样性研究、父权关系确定或亲子鉴定中的应用。
本发明提供了上述技术方案所述获取方法在濒危龟鳖动物基因组DNA提取中的应用。
本发明提供了一种鼋基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
用灭菌的剪刀剪下稚鼋肚上的脐带，留下长度不少于0.5cm，置于装有纯酒精的离心管中；将剪过脐带的稚鼋，放到盆中自然收干脐带，盘中为5cm厚的蛭石，蛭石与水的质量比为1：1.2；
若看到稚鼋脐带已自然脱落(人为没剪脐带)，将稚鼋放到盆中自然收干脐带(盘中为5cm厚的蛭石，蛭石与水的质量比为1：1.2)；在孵化介质中找到脱落的脐带，置于装有纯酒精的离心管中；
利用试剂盒提取基因组DNA。
优选的，剪刀剪取长度为0.5cm(约绿豆大小)的脐带。
优选的，所述试剂盒为MicroElute Genomic DNAKit试剂盒。
优选的，离心管中的纯酒精的量为1mL。
本发明还提供了上述的提取方法在鼋遗传多样性研究、父权关系确定或亲子鉴定中的应用。
本发明还提供了上述的提取方法在濒危龟鳖动物基因组DNA提取中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明通过收集脐带组织，无损伤提取高质量的基因组DNA，可满足后期的遗传多样性、父权关系确定、亲子鉴定等分子生物学分析，对开展濒危动物的有效保护具有重要意义。同时该发明通过在鼋生长早期就获得样本，能够降低分窝分池养殖的成本。本方法同时适用于其它濒危龟鳖动物基因组DNA的获得。
附图说明
图1是DNA电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明披露了一种鼋基因组DNA的提取方法及应用，具体如下实施例所示。
实施例
1、脐带组织的获得
在人工条件下，鼋的孵化周期为60-70天，在临近孵化期，要每天早晚各巡查一次孵化房。
(1)看到脐带还连在肚上的稚鼋，用灭菌的小剪刀剪下脐带(留下0.5cm长)，置于装有纯酒精的5ml离心管中，待提取基因组DNA。将该稚鼋拿出，放到另外盆中自然收干脐带。
(2)看到稚鼋脐带已经自然脱落。将稚鼋拿出，放到另外盆中自然收干脐带。在孵化介质中找到脱落的脐带，置于装有纯酒精的5ml离心管中，待提取基因组DNA。
2、基因组DNA的提取
用MicroElute Genomic DNA Kit试剂盒(美国OMEGA)提取。具体步骤：
(1)用干净的剪刀取保存于无水乙醇中的稚鼋脐带约绿豆大小，去离子水洗涤残余的无水乙醇，并置于滤纸上干燥。
(2)把洗净晾干的脐带放入1.5ml离心管，加入200μL Buffer TL，剪碎，便于消化。
(3)加入20μL OB蛋白酶，混匀，55℃，180r/min消解3h，期间可取出摇匀2-3次。
(4)消化完成后，室温下(28℃)1000r离心5min，将上清液转移至新的1.5ml离心管内，弃沉淀。
(5)加入220μl BufferBL，混匀，在70℃恒温水浴锅中放置10min，期间每2至3分钟取出，上下颠倒离心管以混匀。
(6)取出后离心管并加入220μl无水乙醇，混匀。
(7)将上一步中的混合液转移至套在2ml收集管的HiBind DNA柱中，室温下8000r离心1min，将DNA结合到滤膜上，弃滤液。
(8)将柱子转移到另一组2ml收集管中，加入500μL HB Buffer，室温下8000r离心1min，弃滤液。
(9)再将柱子转移到另一组2ml收集管中，加入650μL用乙醇稀释的DNA WashBuffer(DNA Wash Buffer：无水乙醇＝20ml：80ml)，室温中8000r离心1min，弃滤液。
(10)用同一组收集管重复上述步骤。
(11)将柱子重新放在收集管中，室温下14000r离心5min。
(12)将柱子装在1.5ml离心管上，打开柱子盖子，干燥3min，加入50μll70℃预热好的无菌水，再在室温下放置3min。随后在室温下，10000r离心1min。
(13)将滤液重新加到柱子中，同样条件下，再次10000r离心1min，取出后得到的滤液即为DNA溶液。
(14)用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度及完整性，并用NanoQTM微型分光光度计检测DNA浓度，置于-20℃保存备用。
3、基因组DNA结果
其电泳结果如图1所示，图中1-8为鼋脐带提取的总DNA，M为Maker，目的条带位置在Marker DL2000bp最大片段条带之上，说明提取的鼋基因组DNA大于2000bp，完整性较好；拖带不是很明显，说明DNA降解较轻。经分光光度计检测，浓度在50-400μmol/L不等，足以达到后续试验的要求，且大部分DNA OD(260/280)值介于1.8-2.0之间，说明其纯度较高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种无损伤鼋基因组DNA样品的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：
用灭菌的剪刀剪下稚鼋肚上的脐带，置于装有纯酒精的离心管中；将稚鼋拿出，放到另外盆中自然收干脐带，得鼋基因组DNA样品；
若看到稚鼋的脐带已经自然脱落，将稚鼋拿出，放到另外盆中自然收干脐带，得鼋基因组DNA样品；
若在孵化介质中找到脱落的脐带，置于装有纯酒精的离心管中，得鼋基因组DNA样品。
2.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，剪刀剪下脐带，留在鼋腹部上脐带长度不少于0.5cm。
3.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，所述离心管中的纯酒精的量为1mL。
4.权利要求1～3任一项所述获取方法在鼋遗传多样性研究、父权关系确定或亲子鉴定中的应用。
5.权利要求1～3任一项所述获取方法在濒危龟鳖动物基因组DNA提取中的应用。
6.一种鼋基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用试剂盒提取利用权利要求1～3任一项所述获取方法得到的鼋基因组DNA样品的基因组DNA。
7.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述试剂盒为MicroElute GenomicDNAKit试剂盒。
8.权利要求6或7所述的提取方法在鼋遗传多样性研究、父权关系确定或亲子鉴定中的应用。
9.权利要求6或7所述的提取方法在濒危龟鳖动物基因组DNA提取中的应用。
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