CN114317422A - 一种内源性物质促进间充质干细胞增殖、用于间充质干细胞培养的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种内源性物质促进间充质干细胞增殖、用于间充质干细胞培养的用途。本发明发现，内源性物质苯乙酰甘氨酸可以促进UCMSCs增殖，且不影响其干性，因而苯乙酰甘氨酸可以用于制备促进UCMSCs体外增殖的培养基。
Description
技术领域
本发明属于细胞领域，涉及干细胞培养，具体涉及一种内源性物质促进间充质干细胞增殖、用于间充质干细胞培养的用途。
背景技术
间充质干细胞(MSCs)来源于发育早期中胚层，广泛存在于骨髓、脂肪、脐血等多种组织中，具有自我更新，高度增殖及多向分化潜能的成体干细胞，MSCs逐渐成为替代治疗和基因治疗领域中极具实用价值的细胞来源，在组织工程领域具有广阔的应用前景。近年来，与骨髓MSCs相比，脐带间充质干细胞(UCMSCs)以其易得、原始、增殖力强、免疫原性低、不涉及法律伦理等优势越来越受到人们的重视。
UCMSCs具有许多吸引人的优点，包括无创收集过程、体外分离纯化高效、低感染风险、非致瘤性、多能性显著和低免疫原性，无异体排斥反应。目前，UCMSCs在很多不同类型疾病的治疗研究中都表现了很好的治疗效果，对于器官损伤、神经系统疾病、内分泌系统疾病等传统治疗方法存在很大缺陷的疾病治疗中表现了相当好的疗效，在动物模型以及对人体的临床使用中已经为越来越多疾病的治疗带来了新的希望。
因为UCMSCs应用需要先在体外获得足够数量，所以促进UCMSCs增殖是重要研究方向。
苯乙酰甘氨酸是人体内的一种内源性物质，具有应用安全性高的优点，目前未见苯乙酰甘氨酸促进UCMSCs增殖的报道和应用。
发明内容
本发明为了提供一种内源性物质促进间充质干细胞增殖、用于间充质干细胞培养的用途。
本发明技术方案如下：
一种内源性物质促进间充质干细胞增殖的用途，所述内源性物质为苯乙酰甘氨酸，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
一种内源性物质用于制备促进间充质干细胞增殖的培养基的用途，所述内源性物质为苯乙酰甘氨酸，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
有益技术效果：
本发明发现，内源性物质苯乙酰甘氨酸可以促进UCMSCs增殖，且不影响其干性，因而可以用于制备促进UCMSCs体外增殖的培养基。
附图说明
图1为倒置显微镜下观察的UCMSCs，形态符合UCMSCs的特征；
图2为各组UCMSCs生长曲线；
图3为SOX2、NANOG和OCT4蛋白的Westernblot检测图，PhG-L组和PhG-H组SOX2、NANOG和OCT4蛋白表达水平与Control组基本一致。
具体实施方式
下面通过具体的实施例详细介绍本发明实质性内容，但不能以此限定本发明的保护范围。
一、试验材料
DMEM/F12培养基和胎牛血清购自Gibco公司。双抗购自南京森贝伽生物科技有限公司。PBS缓冲液按照配方配制后于4℃保存，24h内使用完。Ⅳ型胶原酶和胰酶购自上海懋康生物科技有限公司，按照说明书使用。苯乙酰甘氨酸购自源叶生物，纯度97％。细胞培养皿和多孔板购自Corning公司。SOX2、NANOG、OCT4和β-actin一抗、二抗购自碧云天生物。
二、试验方法
1、UCMSCs的制备
按常规方法制备UCMSCs，具体为：取正常足月剖腹产新生儿脐带约12cm(脐带采集后4℃保存于含1％双抗的PBS缓冲液中，6h内提取干细胞培养)，用含1％双抗的PBS缓冲液冲洗去除脐动静脉及脐带外膜，分离出华通氏胶组织，剪成约1mm3大小的组织块，均匀铺于培养皿中，置于37℃恒温震荡仪内，先后加入Ⅳ型胶原酶、胰酶分别消化60min和30min提取细胞，再用含10％FBS和1％双抗的DMEM/F12培养基重悬细胞，于37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞约85％融合时用胰酶消化传代，倒置显微镜观察。
2、分组培养
取第3代UCMSCs进行增殖活性和干性测定。测定过程中分组如下：
对照组(Control)：用含10％FBS和1％双抗的DMEM/F12培养基培养；
PhG-L组：在对照组培养基组成基础上增加8μM苯乙酰甘氨酸；
PhG-H组：在对照组培养基组成基础上增加16μM苯乙酰甘氨酸。
各组平行操作。
3、UCMSCs增殖活性测定
取第3代生长状态良好的UCMSCs，接种于6孔板中，每孔2×105个细胞，12h后按照上述分组更换培养基，继续培养24h后，消化收集细胞，用含1％双抗的DMEM/F12培养基重悬，以每孔2500个细胞接种于96孔培养板，37℃、5％CO2培养箱中培养，分别在0、24、48、72h各组取3孔加入10μLCCK8溶液，37℃、5％CO2培养箱中继续培养2h，用酶标仪测定在OD450nm值，以时间为横坐标，OD450nm为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
4、UCMSCs干性测定
取第3代生长状态良好的UCMSCs，接种于6孔板中，每孔2×105个细胞，12h后按照上述分组更换培养基，继续培养24h后，收集细胞，PBS洗涤，裂解液裂解，于4℃下12000r/min离心10min，取离心后的上清，BCA法对蛋白定量后，各组取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳并转膜，脱脂奶粉封闭，SOX2、NANOG、OCT4和β-actin一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜2～3次，每次10～15min，二抗室温孵育2h，TBST洗膜2～3次，每次10～15min，化学试剂显影，凝胶成像系统拍照并进行量化分析。
5、统计学分析
应用SPSS统计软件进行统计学分析，计量资料以平均值±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
三、试验结果
1、UCMSCs的制备
倒置显微镜观察如图1所示，细胞形态为长梭形，排列紧密，呈平行或漩涡状生长，符合UCMSCs的形态学特征。
2、增殖活性
各组OD450nm值如表1所示，细胞生长曲线如图2所示，PhG-L组和PhG-H组UCMSCs的增殖活性明显强于Control组(P＜0.05)，且PhG-H组UCMSCs的增殖活性明显强于PhG-L组(P＜0.05)。
表1各组OD450nm值
3、干性测定
SOX2、NANOG和OCT4为代表干细胞干性的标志，通过跟踪SOX2、NANOG和OCT4的变化可以快速评价干细胞的干性。Westernblot如图3所示，PhG-L组和PhG-H组SOX2、NANOG和OCT4蛋白表达水平与Control组无明显差异。
上述试验说明，苯乙酰甘氨酸可以促进UCMSCs增殖，且不影响其干性，因而可以用于制备促进UCMSCs体外增殖的培养基。
Claims (2)
1.一种内源性物质促进间充质干细胞增殖的用途，所述内源性物质为苯乙酰甘氨酸，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
2.一种内源性物质用于制备促进间充质干细胞增殖的培养基的用途，所述内源性物质为苯乙酰甘氨酸，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
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