CN114306396A

CN114306396A - 羊栖菜中抗老年痴呆活性油脂微胶囊产品的制备方法和应用

Info

Publication number: CN114306396A
Application number: CN202210166771.2A
Authority: CN
Inventors: 张翼; 黎燕媚; 聂影影; 夏秋瑜; 刘亚月; 周龙建; 洪鹏志; 马泽源; 宋采; 胡雪琼
Original assignee: Guangdong Ocean University; Shenzhen Research Institute of Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University; Shenzhen Research Institute of Guangdong Ocean University
Priority date: 2022-02-23
Filing date: 2022-02-23
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明提供羊栖菜中抗老年痴呆活性油脂微胶囊产品的制备方法和应用，涉及抗老年痴呆活性油脂技术领域。采用亚临界萃取对羊栖菜进行活性成分提取后去除溶剂得到粗浸膏；粗浸膏进行正相硅胶柱梯度层析；对所得洗脱组分进行抑制乙酰胆碱酯酶活性筛选，得到具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的组分；合并具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的组分得到具有抗老年痴呆活性的功能油脂，该活性油脂可被制备成微胶囊产品HFFOM。在行为学水平上，该微胶囊产品能够明显改善由LPS导致的斑马鱼记忆认知障碍；在生化水平上，该微胶囊能够明显降低由LPS导致的斑马鱼神经炎症、抑制大脑乙酰胆碱酯酶活性，能显著改善正常小鼠学习记忆能力。

Description

羊栖菜中抗老年痴呆活性油脂微胶囊产品的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗老年痴呆活性油脂技术领域，具体涉及羊栖菜中抗老年痴呆活性油脂微胶囊产品的制备方法和应用。

背景技术

阿尔茨海默症(Alzheimer's disease，AD)是一种以认知功能障碍和行为障碍为特征的慢性中枢神经系统性疾病，发生于老年前期和老年期。AD发病涉及多种因素，包括遗传因素、神经递质、免疫因素和环境因素。研究者就其发病机制已提出多种理论假说，包括胆碱能缺失理论、β-淀粉样蛋白理论、tau蛋白理论、氧化应激理论、神经和血管理论等。

其中，胆碱能缺失理论是最为经典的理论，是目前治疗AD药物的主要机制。胆碱能神经递质系统广泛分布于人脑，在调节记忆、学习、注意力和行为等诸多过程中发挥着重要作用。乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach)是胆碱能神经递质系统的关键，Ach可被乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)分解为胆碱和乙酸，从而终止了神经传递信号。目前，临床上用于治疗AD的AChE抑制剂主要有毒扁豆碱、加兰他敏、石杉碱甲、利斯的明、安吖啶他克林及哌啶多奈哌齐等，这些药物价格昂贵，并且除了石杉碱甲，均具有一定的毒副作用，因此筛选出具有抗AD相关活性的新型化合物变得尤为迫切。另外，近年来，越来越多研究报道关于神经炎症在AD发展过程中发挥的重要作用。AD神经炎症主要表现为小胶质细胞的过度激活产生了炎症因子，引起神经炎症，导致神经元死亡。因此，寻找有效的神经抗炎药或神经保护剂也有望成为防止AD的策略之一。

羊栖菜(Hizikia fusiforme，也被称为Sargassum fusiforme)，属褐藻类马尾藻科，生长在低潮带岩石上，中国南方沿海生长繁茂。羊栖菜是珍贵的海洋藻类植物，《本草纲目》等药典均有记载，并作为药物使用至今，也是东北亚国家人民喜爱的海洋食品，其食用和药用价值，越来越受到人们的重视。目前对羊栖菜的化学成分的研究主要集中在多糖、多酚、多肽等的研究，而对于羊栖菜在预防和治疗阿尔茨海默症方面的研究很少。

发明内容

基于上述内容，本发明的目的在于提供羊栖菜中抗老年痴呆活性油脂微胶囊产品的制备方法和应用。采用更加绿色安全保真的提取方法制备得到抗老年痴呆活性油脂(HFFO)，并用微胶囊技术制备成抗老年痴呆活性油脂微胶囊(HFFOM)产品。

本发明的技术方案之一，一种具有抗老年痴呆活性的功能油脂，以羊栖菜为原料经亚临界萃取提取得到。

具体成分包括：亚油酸、油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和岩藻甾醇。更具体的，包括十六烯酸、8,11,14,17-二十碳四烯酸、9,12-十八碳二烯酸、9-十八碳二烯酸、5,8,11,14-二十碳四烯酸、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸和岩藻甾醇。

进一步地，以羊栖菜为原料经亚临界萃取提取后洗脱分离，合并具有乙酰胆碱酯酶活性的组分，得到所述具有抗老年痴呆活性的功能油脂。

本发明的技术方案之二，上述具有抗老年痴呆活性的功能油脂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：采用亚临界萃取对羊栖菜进行活性成分提取后去除溶剂得到粗浸膏；

步骤2：粗浸膏进行正相硅胶柱梯度层析；

步骤3：对步骤2所得洗脱组分进行抑制乙酰胆碱酯酶活性筛选，得到具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的组分；

步骤4：合并具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的组分得到具有抗老年痴呆活性的功能油脂。

进一步地，所述步骤1中，亚临界萃取条件：温度30～50℃，压力0.2～0.6MPa，溶剂为乙酸乙酯和正丁烷的混合溶液，其中羊栖菜与正丁烷的用量比为1kg:1L～1kg:2L，羊栖菜和乙酸乙酯的比例为100g：2～8mL，时间30～50min，萃取次数3次；通过减压旋蒸去除溶剂，减压旋蒸温度30～60℃。其中乙酸乙酯的作用为夹带剂。

进一步地，所述步骤2中，采用100％石油醚、98％石油醚、95％石油醚、90％石油醚、85％石油醚、80％石油醚、75％石油醚、100％乙酸乙酯依次进行正相硅胶柱梯度层析，得到Fr1～Fr8；所述正相硅胶柱梯度层析采用200-300目硅胶。

进一步地，所述步骤3中，抑制乙酰胆碱酯酶活性筛选包括洗脱组分的薄层层析分析及生物自显影及AChE抑制活性的测定。

进一步地，所述硅胶薄层层析分析条件：硅胶薄层层析板上展开剂为体积比4:1的石油醚-乙酸乙酯溶液。通过硅胶薄层层析254nm紫外分析、硅胶薄层层析365nm荧光分析、硅胶薄层层析抑制乙酰胆碱酯酶活性自显影、硅胶薄层层析溴甲酚绿化学显色来初步筛选活性油脂所在的组分。所述AChE抑制活性的测定采用改良的Ellman法。

进一步地，进行步骤4前，运用气相色谱-质谱(GC-MS)技术进行分析鉴定，通过与美国国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)谱图库和中国科学院南海海洋研究所的GC-MS系统谱图库比对质谱谱图，来确定化合物的成分。

进一步地，GC-MS的分析条件为：柱温箱80℃，进样口温度280℃，分流比为5，载气为He，升温程序如下：0～2min，80℃；2～6min，80℃～120℃；6～11min，120℃；11～16min，120℃～180℃；16～22min，180℃；22～32min，180℃～280℃；32～60min，280℃。离子源温度为250℃，接口温度为280℃，m/z范围为50～500。

本发明的技术方案之三，上述具有抗老年痴呆活性的功能油脂在制备预防神经炎症和/或改善记忆和/或抗老年痴呆药物或保健品中的应用。

本发明的技术方案之四，一种具有抗老年痴呆活性的功能油脂微胶囊，以上述的具有抗老年痴呆活性的功能油脂为芯材，以明胶和六偏磷酸钠为壁材，采用复合凝聚法制备得到。

进一步地，所述复合凝聚法具体包括以下步骤：

步骤a：将所述具有抗老年痴呆活性的功能油脂和明胶水溶液混合后搅拌乳化得到油水乳状液；

步骤b：将六偏磷酸钠水溶液加入所述油水乳状液中得到混合乳液；

步骤c：向所述混合乳液中逐滴滴入磷酸溶液调节pH值至4.6以下进行复合凝聚得到微胶囊乳液；

步骤d：微胶囊乳液经冷冻干燥得到所述微胶囊乳液。

进一步地，所述步骤a中：明胶水溶液质量浓度为6％～10％，具有抗老年痴呆活性的功能油脂和明胶水溶液的质量比为1:5～1:10；所述搅拌乳化在氮气氛围下，冰水浴中进行；

进一步地，所述步骤b中：六偏磷酸钠水溶液的质量浓度为0.33％～0.73％；所述明胶水溶液和所述六偏磷酸钠水溶液的质量比为1:0.5～1:2；

进一步地，所述步骤c中：磷酸溶液质量浓度为0.5％～2％；在滴加磷酸溶液调节pH值至4.6过程中温度条件控制如下：45～55℃固定20～40min，以10℃/h的速度降低至5℃，保持20～40min，以5℃/h的速度提升至25℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

亚临界萃取技术是利用在常温下为气体的萃取溶剂，在低中压力下可以被液化成液体，根据相似相溶的物理特性，用于萃取物料中的目标组分的方法。与传统的油脂溶剂浸出工艺相比，亚临界萃取技术具有溶剂方便循环使用、有机溶剂总使用量少、溶剂残留量低、对热敏性物料无影响、节能、生产成本低等优点。为了制备预防神经炎症和/或改善记忆药物或相关用途的功能保健食品，本发明在采用更加绿色安全保真的亚临界萃取技术提取制备得到HFFO并用微胶囊技术制备成HFFOM微胶囊产品，经过GC-MS揭示该活性油脂的主要成分为亚油酸、油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和岩藻甾醇等。该活性油脂可被制备成微胶囊产品HFFOM。经过斑马鱼实验验证，在行为学水平上，该微胶囊产品能够明显改善由LPS导致的斑马鱼记忆认知障碍；在生化水平上，该微胶囊能够明显降低由LPS导致的斑马鱼神经炎症、抑制大脑乙酰胆碱酯酶活性，该微胶囊产品可能通过乙酰胆碱酯酶抑制活性-抗炎靶点来预防LPS导致神经炎症和/或改善记忆认知障碍。经过小鼠Morris水迷宫、跳台、避暗、穿梭箱试验，证明该微胶囊产品能显著改善正常小鼠学习记忆能力。本发明验证了所述的HFFOM可以应用到制备预防神经炎症和/或改善记忆能力的药物和/或保健食品中，进而可为临床医学上预防神经退行性疾病提供可行方案。所述的HFFOM通过提高大脑中乙酰胆碱含量来预防LPS诱导的斑马鱼神经炎症和/或记忆认知障碍，通过降低大脑炎症因子TNF-α、IL-1β水平，预防LPS诱导的斑马鱼神经炎症和/或记忆认知障碍。

附图说明

图1为HFFO的主要成分的结构式。

图2为HFFOM产品形态图；(a)HFFOM光学显微镜10倍镜下图；(b)HFFOM光学显微镜40倍镜下图；(c)HFFOM外观图。

图3为本发明实施例所述的HFFOM对斑马鱼记忆认知障碍测试的结果；(a)斑马鱼进入EC区的潜伏时间；(b)斑马鱼进入EC区的次数。

图4为本发明实施例所述的HFFOM逆转斑马鱼偏好T-富集区的行为表现的3D热图：(a)注射生理盐水和喂食正常饲料的对照组斑马鱼对T-富集区的偏好的行为表现3D热图；(b)喂食正常饲料对逆转斑马鱼偏好T-富集区的行为表现的影响；(c)150mg/kgHFFOM对逆转斑马鱼偏好T-富集区的行为表现的影响；(d)300mg/kgHFFOM对逆转斑马鱼偏好T-富集区的行为表现的影响；(e)600mg/kgHFFOM对逆转斑马鱼偏好T-富集区的行为表现的影响。

图5为本发明实施例所述的HFFOM对斑马鱼生化指标的测定结果：(a)斑马鱼大脑组织ACh的水平；(b)斑马鱼大脑组织MDA水平；(c)斑马鱼大脑组织TNF-α；(d)斑马鱼大脑组织IL-1β水平。

图6本发明实施例所述的HFFOM的小鼠水迷宫试验结果：(a)定位航行实验中HFFOM对小鼠的逃避潜伏期的影响；(b)空间探索实验中HFFOM对小鼠平台所在象限路程百分比的影响；(c)空间探索实验中HFFOM对小鼠平台象限时间百分比的影响。

图7本发明实施例所述的HFFOM的小鼠跳台试验结果：(a)HFFOM对小鼠在训练阶段跳下平台的潜伏期的影响；(b)HFFOM对小鼠在重复阶段跳下平台的潜伏期的影响；(c)HFFOM对小鼠在消退阶段跳下平台的潜伏期的影响；(d)HFFOM对小鼠在训练阶段跳下平台的错误次数的影响；(e)HFFOM对小鼠在重复阶段跳下平台的错误次数的影响；(f)HFFOM对小鼠在消退阶段跳下平台的错误次数的影响。

图8本发明实施例所述的HFFOM的小鼠避暗试验结果：(a)HFFOM对小鼠在训练阶段进入暗室的潜伏期的影响；(b)HFFOM对小鼠在重复阶段进入暗室的潜伏期的影响；(c)HFFOM对小鼠在消退阶段进入暗室的潜伏期的影响；(d)HFFOM对小鼠在训练阶段进入暗室的错误次数的影响；(e)HFFOM对小鼠在重复阶段进入暗室的错误次数的影响；(f)HFFOM对小鼠在消退阶段进入暗室的错误次数的影响。

图9本发明实施例所述的HFFOM的大鼠穿梭箱试验结果：(a)HFFOM对大鼠的主动回避时间的影响；(b)HFFOM对大鼠的被动回避时间的影响。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

本实施例提供一种羊栖菜中改善记忆功能(具有抗老年痴呆活性)的活性油脂HFFO的提取制备及其微胶囊产品HFFOM的制备方法，具体如下：

步骤1.羊栖菜的来源及前处理

羊栖菜，20kg羊栖菜2021年02月购自浙江省洞头县，100kg羊栖菜2021年04月购自浙江省洞头县，两者均为养殖产品，自然晒干后，粉碎机粉碎成羊栖菜粉末，冰箱-4℃下保存备用。

步骤2.亚临界萃取

两批次的羊栖菜粉末的提取方法为亚临界萃取的方法，采用CBE-160L亚临界萃取科研实验装置。在萃取温度40℃、萃取压力0.43MPa条件下，溶剂为乙酸乙酯和正丁烷的混合溶液(其中羊栖菜粉末与正丁烷的重量：体积比为1:1.3(kg/L)，羊栖菜和乙酸乙酯的比例为100g：5mL)在萃取罐中萃取3次，每次萃取40min。在45℃以下经旋转蒸发去除溶剂得到粗提物。

步骤3.分离纯化

将步骤2中得到的两批次羊栖菜粗提物分别经200-300目的正相硅胶柱层析，依次用100％石油醚、98％石油醚、95％石油醚、90％石油醚、85％石油醚、80％石油醚、75％石油醚、100％乙酸乙酯依次洗脱得到Fr1～Fr8。

步骤4.活性初筛

将步骤3中的8个组分进行薄层层析分析及生物自显影

a.用毛细管吸取活性样品液各约15μL(样品浓度为5mg/mL)分别点样于两块GF254硅胶薄层层析板，置层析缸中以石油醚:乙酸乙酯(V/V＝4:1)为展开剂展开后取出晾干，置于254nm及365nm的紫外灯下观察并拍摄图像。

b.其中一块板子均匀喷上0.5U/mL AChE，晾干，使酶液固定，然后在c37℃的恒温培养箱中保湿孵育20min。孵育结束后，将DTNB与ATCh以1:1混合，喷雾到硅胶板上，再37℃孵育10min，观察实验现象，活性部分显白色，而薄层板其余部分显黄色。

c.另外一块板子用溴甲酚绿溶液直接显色。显色方法为：0.1g溴甲酚绿溶于500mL乙醇中，缓慢加入0.1mol/L NaOH水溶液，至刚好出现蓝色沉淀。用配制好的溴甲酚绿显色剂均匀喷在GF254板子上，脂肪酸类物质会在蓝色背景产生黄色斑点。

步骤5.活性复筛：AChE抑制活性的测定

将步骤4中抑制AChE生物活性自显影中显示白色斑点和在溴甲酚绿化学显色中显色黄色斑点的组分进行AChE活性的测定。测试方法为：以盐酸多哌奈齐作为阳性对照。每孔的反应体系均为100μL，将样品用DMSO配制成一系列浓度。实验设置四个组，样品组(A₁)：加入配好的待测样品1μL+49μL PBS溶液(100mmol/L)+10μL AChE溶液(0.2U/mL)+20μL DTNB(5mmol/L)，将板子置于控温培养箱中，37℃孵育10min，然后拿出，加入20μL底物ATCh(10mmol/L)，再放入培养箱中37℃恒温孵育20min；样品对照组(A₂)将AChE溶液换成BSA(1mg/mL)，其它同样品组；空白组(A₃)：不加入样品，其它同样品组；空白对照组(A₄)：不加入样品，其它同样品对照组。全部孵育完成，将96孔板置于酶标仪，测定其在405nm波长下的吸光值。用以下公式计算系列浓度下的AChE抑制率。将浓度对数与对应的抑制率导入Graphpad Prism 8软件。通过非线性拟合(four parameters)得到浓度对数曲线，并计算得到IC50。计算公式：

合并IC50值为0.859～1.355mg/mL的部分，得到功能性油脂HFFO。

步骤6.成分分析

a.样品前处理(甲酯化)：称取HFFO 40mg，用1mL的正己烷溶解，加入1mL 0.4mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液，充分振荡，放置于70℃的水浴1h。静置后，取出上层清液，加入饱和食盐水至9mL，5000r/min，离心10min。静置后，分三层(上层为甲酯化产物，中层为未甲酯产物，下层为水层)，取出上清，在旋转蒸发仪上浓缩干燥后称重，用正己烷配成1mg/mL的浓度，过0.22μm有机滤膜，备用。

b.GC-MS条件：柱温箱80℃，进样口温度280℃，分流比为5，载气为He，升温程序如下：0～2min，80℃；2～6min，80℃～120℃；6～11min，120℃；11～16min，120℃～180℃；16～22min，180℃；22～32min，180℃～280℃；32～60min，280℃。离子源温度为250℃，接口温度为280℃，m/z范围为50～500。通过与美国国家标准与技术研究院(National Instituteof Standards and Technology，NIST)谱图库和中国科学院南海海洋研究所的GC-MS系统谱图库比对质谱谱图，来确定HFFO的成分，结果见表1。

表1 GC-MS揭示的甲酯化后HFFO的主要成分

步骤7.微胶囊的制备

a.将40g的HFFO与300g明胶水溶液混合(8％，w/w)，使用搅拌器在1200r/min条件下搅拌预乳化5min。

b.然后使用均质机将混合乳液在18000r/min下均质乳化10min，20000r/min下均质乳化10min，25000r/min下乳化均质10min。整个乳化均质的过程要在冰水浴中以减少高温氧化的风险。

c.然后将300g六偏磷酸钠水溶液(0.53％，w/w)加入油水乳状液中，以700r/min搅拌。再逐滴加入1％磷酸溶液调节混合乳剂的PH值至4.6以下。

d.复合凝聚条件：在pH降低的过程中，使用显微镜监测复合凝聚过程。复合凝聚过程在匀速恒温槽中进行。凝固过程中的温度固定在50℃，保持30分钟，以10℃/h的速度冷却到5℃。样品在5℃保持30分钟。然后将浆液温度以5℃/h提高到25℃。

e.冷冻干燥得HFFOM产品。

步骤8.微胶囊包埋率的测定

a.微胶囊包埋率测定：分别称取1g HFFOM粉末于锥形瓶中，其中一个锥形瓶加入乙酸乙酯充分震荡后过滤得表面油。另外一个锥形瓶加入70℃热水溶解破坏HFFOM表面结构使油脂析出，加入乙酸乙酯萃取得总油。设两个平行，取平均值作为最终结果。最后在45℃以下通过减压旋转蒸发去除溶剂得到表面油质量m₁和总油质量m₂。计算公式如下所示：

b.微胶囊水溶解性测定

分别称取0.5g微胶囊于30mL样品瓶中，加入20mL水，放置于25℃、35℃、45℃、55℃、65℃下水浴加热30min。取出后过滤烘干得滤渣质量m₃。设两个平行，取平均值作为最终结果。计算公式如下所示：

c.根据国标GB5009.227-2016对活性油脂组分和微胶囊产品的过氧化值进行测定。

结果表明，采用亚临界萃取技术、正相硅胶柱层析法制备HFFO，以羊栖菜干重计算，HFFO得率约为0.2％。20kg羊栖菜和100kg羊栖菜分别购买于不同时间，用同种方法提取分离得到HFFO，两批次的HFFO的AChE抑制IC50值和成分之间有一定的差异。20kg羊栖菜分离得到的HFFO的IC50值为1.35±0.29mg/mL，100k羊栖菜分离得到的HFFO的IC50值为1.17±0.31mg/mL。两批次的HFFO甲基化后分别通过GC-MS进行分析，如表1所示，两批次HFFO的主要成分均含有十六烷酸、亚油酸、油酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸，其中100kg羊栖菜批次的HFFO还含有岩藻甾醇。20kg羊栖菜批次的HFFO的总脂肪酸含量占功能性油的94.61％，100kg羊栖菜批次的HFFO的总脂肪酸含量占功能性油的61.92％,岩藻甾醇占功能性油的23.91％。其主要化学结构式如图1所示。

采用复合凝聚法可制备得到羊栖菜功能性油脂的微胶囊产品。由图2可知，该微胶囊产品为淡黄色的粉末状，粒径大小为200-3000μm。该微胶囊产品的包埋率、水溶解性和过氧化值如下表2所示。

表2微胶囊的各性能值

实施例2 HFFOM改善斑马鱼记忆认知障碍的测定

取生长良好的约6～8个月大成年野生AB型斑马鱼(雄性:雌性比例50％：50％)在50L水箱中进行2周的适应，温度为25±2℃，光暗循环按14h：10h进行，分别于上午9点和下午2点饲喂卤虫幼虫。

将150条斑马鱼(3.0±0.4cm)随机分为对照组、LPS模型组和3个实验组，每组30条，每缸10条。实验组每天喂食HFFOM含量分别为150mg/kg、300mg/kg和600mg/kg的食物14天。对照组和模型组分别饲喂等量的正常食物。2周后，模型组和实验组斑马鱼麻醉之后腹腔注射LPS溶液(0.015mg/mL，5μL)，对照组注射等量生理盐水。注射24h后在T迷宫中进行记忆测试。

每组随机挑选10条鱼，在腹腔注射之前的4天，每天分别对10条鱼进行5min的单独T迷宫训练，以确定找到富营养EC区。如果一条鱼在5min时间内没有进入富营养EC区，将被引导进入EC区并停留10s。经过4天的训练之后，第5天(腹腔注射24h后)对训练过的鱼在T迷宫进行行为测试，进入EC区并停留10s以上记为潜伏时间有效；如果鱼在5min内没有进入EC区，则记录潜伏期为300s。行为测试在上午9点到下午1点之间进行。使用微软LifeCamStudio1080p高清摄像机与powersoft软件(中国香港powersoft有限公司)录制视频。使用Supersys软件进行分析首次进入EC区的潜伏时间(s)和进入EC区次数。

结果如图3所示，在第5天的T迷宫行为测试中，与模型组相比，喂食HFFOM含量为150mg/kg和600mg/kg组的斑马鱼极显著缩短找到EC区的潜伏时间(图3a,P＜0.0001)，喂食HFFOM含量为300mg/kg组的斑马鱼显著缩短找到EC的潜伏时间(图3a,P＜0.01)；与模型组相比，喂食HFFOM含量为150mg/kg和600mg/kg组的斑马鱼显著增加进入富营养EC区的次数(图3b,P＜0.01)。如图4所示，与模型组相比，HFFOM处理组能够延长斑马鱼在EC区的停留时长。

上述结果显示，本发明所述的HFFOM产品能够明显改善LPS导致的斑马鱼记忆认知障碍，说明该HFFOM产品有潜在的防治记忆损伤的作用。

实施例3 HFFOM对斑马鱼的生化指标的影响的测定方法

在行为测试24h后，鱼被安乐死，每组中每6条鱼为1个样本，分别采集大脑和周围组织，并在-20℃冰箱保存。所有样品均在生理盐水中均匀化以作进一步分析。4℃条件下1500r/min离心15min，收集上清。利用斑马鱼脑组织上清检测组织生物标志物Ach水平、GSH水平和MDA水平的变化。此外，斑马鱼的大脑样本和外周组织上清液被用于测定TNF-α和IL-1β的水平。根据OD值计算TNF-α和IL-1β标准曲线的回归方程，logistic曲线(各4个参数)作为拟合模型。

结果表明，如图5所示，与模型组相比，喂食HFFOM含量为150mg/kg和600mg/kg的斑马鱼大脑组织ACh的水平显著提高了(图5a,P＜0.01)；与模型组相比，喂食HFFOM含量为150mg/kg的斑马鱼大脑内MDA水平显著降低了(图5b,P＜0.05)；与模型组相比，喂食HFFOM含量为300mg/kg的斑马鱼大脑内炎症因子TNF-α水平显著降低了(图5c,P＜0.05)；与模型组相比，喂食HFFOM含量为150mg/kg、300mg/kg和600mg/kg的斑马鱼大脑内炎症因子IL-1β水平均显著降低了(图5d,P＜0.05)；

上述结果显示，本发明所述的HFFOM能够明显改善LPS导致的斑马鱼神经炎症，且可能是直接通过乙酰胆碱酯酶抑制活性-抗炎靶点来预防由脂多糖(LPS)导致的斑马鱼神经炎症。

以上的数据统计方法均用Graphpad Prism 8.0.2作图，采用One-way ANOVA和Dunnett’s post hoc检验评价模型组与对照组、实验组与模型组之间的差异。

实施例4 HFFOM对大鼠的急性经口毒性测试

1.动物分组

选用20只检疫合格且同性别实验动物个体间体重相差不超过平均体重的±20％的SD大鼠，纳入试验组，雌雄各半。试验开始体重：172.9～201.8g。

2.微胶囊产品的配制

称取40g HFFOM粉末，用适量的去离子水溶解至80mL，得0.5g/mL的HFFOM水溶液。

3.剂量设计

动物按10mL/kg体重给予浓度为0.5g/mL的HFFOM水溶液，灌胃染毒2次，剂量为10g/kg体重。

4.实验步骤

动物试验前，禁食过夜，不限制饮水。正式试验时，动物按10mL/kg体重给予HFFOM水溶液，灌胃2次，灌胃间隔5h。大鼠在给予HFFOM后继续禁食3h。给予HFFOM后30min内，至少每只动物观察一次，前24h内定时观察(观察时间间隔视中毒反应、发作时间以及恢复周期的长短而决定，在前4h内要特别注意)，观察并记录中毒作用体征出现和消失时间和死亡时间，之后每天观察1次，共14天；分别在第0、7、14天称重。

5.结果分析

动物在染毒期间及14天观察期内均未见异常症状，体重增长(表3)，未见动物死亡，LD₅₀>10g/kg体重。

表3急性经口毒性试验结果

本品按GB 15193.3-2014食品安全国家标准急性经口毒性试验检测，对SD大鼠的急性经口毒性LD₅₀>10g/kg体重，毒性分级(表4)为实际无毒。

表4急性毒性(LD₅₀)剂量分级表

实施例5 HFFOM改善正常小鼠学习记忆能力的Morris水迷宫试验

1.实验药品与试剂

1.1HFFOM产品剂量设计

HFFOM产品的动物斑马鱼剂量的低、中、高剂量分别为150、300、600mg/kg体重。斑马鱼体重W_a为0.00054kg，表面积A_a为0.00042m²，根据公式k＝A/W^2/3，斑马鱼体型系数k_a为0.0633。根据《药理实验方法学(第4版)》，小鼠体重W_b为0.02kg，体型系数k_b为0.0899。根据下列公式计算得出小鼠低、中、高剂量分别为64、128、256mg/kg体重。大鼠体重Wb为0.2kg，体型系数kb为0.086。根据下列公式计算得出大鼠低、中、高剂量分别为28、57、114mg/kg体重。阳性对照品选用石杉碱甲片。石杉碱甲片成人(60kg)用量为0.4mg/日，即剂量为6.7μg/kg体重；以成人剂量的10倍作为动物试验剂量，即67μg/kg体重。

D_b＝D_a×(k_b/k_a)×(W_a/W_b)^1/3。

1.2 HFFOM溶液的配制

称取192mg的HFFOM置于研钵中，加入少量的去离子水研磨溶解，再加少量去离子水研磨，重复数次后将溶液转移到定容容器中；用少量去离子水清洗研钵中的残留供试品，转移到定容容器中，重复数次；向容器缓慢加入去离子水至终体积15mL，得12.8mg/mLHFFOM高剂量溶液。取6mL的高剂量溶液，加入等体积的去离子水稀释，得6.4mg/mL HFFOM中剂量溶液。取4mL的中剂量溶液，加入等体积的去离子水稀释，得3.2mg/mL HFFOM低剂量溶液。

1.3阳性对照品的配制

取一片规格为50μg的石杉碱甲片置于研钵中，研碎成粉末，加入少量的去离子水研磨溶解，再加少量去离子水研磨，重复数次后将溶液转移到定容容器中；用少量去离子水清洗研钵中的残留供试品，转移到定容容器中，重复数次；向容器缓慢加入去离子水至终体积14.9mL，得3.4μg/mL的石杉碱甲溶液。

2.实验步骤

2.1动物分组

C57CL/6小鼠，SPF级，50只，15.9～19.2g，雄性，适应性饲养3天。随机分为空白对照组、阳性对照组、HFFOM受试物高、中、低剂量组，10只/组。各组按照20ml/kg灌胃给药，空白对照组给予等量的蒸馏水，1次/日，连续30天。

2.2实验方法

末次灌胃次日，动物进行5天的定位航行试验，此阶段平台放置于一个固定位置，手抓小鼠背部，面向池壁在4个象限的固定入水点放入水中，记录动物的游泳轨迹、从入水到站上平台的时间(逃避潜伏期)及游泳路程，如果实验动物在60s内未能登陆平台，则记录其逃避潜伏期值为60s，然后将实验动物牵引至平台，停留20s，如动物能在60s内登陆平台，则让动物在平台继续停留5s后放回鼠笼，如此逆时针重复完成4个象限。定位航行结束次日，进行空间探索试验。此阶段需撤去平台，手抓动物背部皮肤，面向池壁在离平台最远的象限入水点入水，记录60s内动物在平台象限数据占总路程、总时间的百分比及穿越平台次数。

3.结果分析

水迷宫实验是迫使小鼠游泳，学习寻找藏在水下平台的一个实验，被用来测试小鼠学习记忆空间位置和方向的能力。通过记录小鼠在水箱中游泳并找到平台所用的时间及轨迹等，以此来测定小鼠的学习和记忆以及空间认知能力。小鼠在水箱中找到平台所用的时间越少或轨迹越短，证明小鼠的学习记忆以及空间认知能力越强。

如图6a所示，Morris水迷宫试验定位航行阶段，与空白对照组比较，阳性对照组与HFFOM处理组小鼠在5天内到达平台前花了更少的时间。HFFOM低剂量组第2、3、5天潜伏期显著降低(P＜0.05)；HFFOM中剂量组第2天潜伏期显著降低(P＜0.01)；HFFOM高剂量组第2天潜伏期显著降低(P＜0.05)。如图6b-c所示，空间探索阶段，与空白对照组比较，HFFOM低剂量组的平台所在象限路程百分比、平台所在象限时间百分比升高(P<0.05)。

以上结果说明，HFFOM低中剂量处理组具有促进正常小鼠学习记忆的作用。其中HFFOM低剂量效果更好。

实施例6 HFFOM改善正常小鼠学习记忆能力的跳台试验

1.实验药品与试剂，同实施例5步骤1。

2.实验步骤

2.1动物分组

BALB/c小鼠，SPF级，50只，18.2～22.2g，雄性。适应性饲养3天，检疫合格后，随机分为空白对照组、阳性对照组、HFFOM受试样品高、中、低剂量组，10只/组。各组按照20ml/kg灌胃给药，空白对照组给予等量的蒸馏水，1次/日，连续30天。

2.2跳台检测

末次给药后次日动物单独放进跳台仪反应箱内(平台上、下均让动物熟悉)适应3min后，将动物放置铜栅上，立即通以36V交流电，动物受电击后将跳回平台躲避伤害，以此训练1次后，将动物放至反应箱平台上，记录5min每只动物第一次跳下平台的潜伏期以及跳下平台的错误次数，以此作为学习成绩。记忆巩固试验：24h后重复试验，将动物放至反应箱平台上，记录每只动物第一次跳下平台的潜伏期、3min内受电击次数、受电击的动物总数，以此为记忆巩固成绩。记忆消退试验：停止训练5天后(包括第5天)进行一次记忆消退试验，方法同记忆巩固试验。

3.结果分析

跳台试验的原理是当将小鼠放在反应箱时，小鼠可能大多数时间喜爱在角落或者边缘活动，如果在反应箱中间设一个平台，底部铺有铜栅，铜栅连接电源，将小鼠引导到平台上后，一旦它跳到铜栅上，将会受到电击，它会迅速跳回平台以躲避电击，多次受到电击后，小鼠便会产生记忆。小鼠跳下平台的潜伏期和跳下平台的错误次数作为评价指标。跳下平台逃避潜伏期越长，跳下平台的错误次数越少，则HFFOM的改善记忆作用越好。

由图7a、d可知，训练阶段，与空白对照组比较，阳性对照组和HFFOM低中高处理组的跳下平台潜伏期、错误次数均无统计学差异(P＞0.05)。由图7b、e可知，重复试验阶段，与空白对照组比较，阳性对照组跳下平台的错误次数显著减少(P＜0.05)；HFFOM低剂量组跳下平台的潜伏期显著延长(P＜0.05)，跳下平台的错误次数显著减少(P＜0.05)；HFFOM中剂量组跳下平台的潜伏期显著延长(P＜0.05)，跳下平台的错误次数显著减少(P＜0.01)；HFFOM高剂量组跳下平台的错误次数显著减少(P＜0.05)。由图7c、f可知，记忆消退阶段，与空白对照组比较，HFFOM低剂量组跳下平台的潜伏期显著延长(P＜0.05)，跳下平台的错误次数显著减少(P＜0.05)。

实施例7 HFFOM改善正常小鼠学习记忆能力的避暗试验

1.实验药品与试剂：同实施例5步骤1.

2.实施步骤

2.1动物分组

BALB/c小鼠，SPF级，50只，15.4～18.7雄性。适应性饲养3天，检疫合格后，随机分为空白对照组、阳性对照组、HFFOM受试样品高、中、低剂量组，10只/组。各组按照20ml/kg灌胃给药，空白对照组给予等量的蒸馏水，1次/日，连续30天。

2.2避暗试验

末次给药后次日开始训练，动物在避暗仪中适应3min后背向避暗仪洞口，放入明室，同时启动计时器，暗室电压调为40V，动物穿过洞口进入暗室受到电击时，计时器自动停止，此时间即为潜伏期，训练5min，记录5min内电击次数。24h后重复试验，记录潜伏期、5min内的电击次数、进入暗室的动物数。停止训练5天后，进行记忆消退实验，方法同重复试验。

3.结果分析

由图8可知，与空白对照组比较，各组动物在训练、重复试验和记忆消退阶段的进入暗室潜伏期、错误次数均无统计学差异(P>0.05)。

实施例8 HFFOM改善正常大鼠学习记忆能力的穿梭箱试验

1.实验药品与试剂

1.1 HFFOM产品剂量设计同实施案例5。

1.2 HFFOM溶液的配制

称取570mg的HFOM置于研钵中，加入少量的去离子水研磨溶解，再加少量去离子水研磨，重复数次后将溶液转移到定容容器中；用少量去离子水清洗研钵中的残留供试品，转移到定容容器中，重复数次；向容器缓慢加入去离子水至终体积50mL，得11.4mg/mL HFOM高剂量溶液。取25mL的高剂量溶液，加入等体积的去离子水稀释，得5.7mg/mL HFOM中剂量溶液。取25mL的中剂量溶液，加入等体积的去离子水稀释，得2.8mg/mL HFOM低剂量溶液。

1.3阳性对照品的配制

取四片规格为50μg的石杉碱甲片置于研钵中，研碎成粉末，加入少量的去离子水研磨溶解，再加少量去离子水研磨，重复数次后将溶液转移到定容容器中；用少量去离子水清洗研钵中的残留供试品，转移到定容容器中，重复数次；向容器缓慢加入去离子水至终体积29.8mL，得6.7μg/mL的石杉碱甲溶液。

2.实施步骤

2.1动物分组

SD大鼠，SPF级，50只，174.5～192.1g，雄性，适应性饲养3天，检疫合格后，随机分为空白对照组、阳性对照组、受试样品高、中、低剂量组，10只/组。各组按照10ml/kg灌胃给药，空白对照组给予等量的蒸馏水，1次/日，连续30天。

2.2穿梭箱试验检测

末次给药后次日开始训练，将大鼠放入箱内任何一侧，20s开始呈现灯光或蜂鸣音，持续20s，后10s内同时给以电刺激(100V，0.2mA，50Hz，AC)。大鼠在遭电击后即逃避，必须跑到对侧顶端，挡住光电管后才可中断电击，此为被动回避反应，在每次电击前给予条件刺激，反复强化后，大鼠在接受条件刺激后即跳向对侧并挡住光电管而逃避电击，此为主动回避反应，每隔天训练一回，每回50次，连续训练4回后，动物的主动回避反应率可达80～90％以上。停止训练第5、10天，分别测定其记忆消退情况1次。

3.结果分析

第1次到第4次试验为训练4回阶段的数据，第5次试验为训练结束后第5天测定的数据，第6次试验为训练结束后第10天测定的数据。由图9a可知，与空白对照组比较，HFOM中剂量第2、5次试验的主动回避时间显著缩短(P<0.05)。由图9b可知，各组之间的被动回避时间均无显著性差异(P＞0.05)。

综上所述，HFFOM处理组的老鼠相对于空白对照组的老鼠有明显的记忆改善作用，说明HFFOM对正常老鼠的记忆改善具有一定的保健作用。其中HFFOM低中剂量的效果比高剂量的要好。

以上的数据统计方法均用Graphpad Prism8.0.2作图，采用One-way ANOVA和Dunnett’s post hoc检验评价空白对照组与阳性对照组、HFFOM低剂量组、HFFOM中剂量组、HFFOM高剂量组之间的差异。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种具有抗老年痴呆活性的功能油脂，其特征在于，以羊栖菜为原料经亚临界萃取提取得到。

2.根据权利要求1所述的具有抗老年痴呆活性的功能油脂，其特征在于，以羊栖菜为原料经亚临界萃取提取后洗脱分离，合并具有乙酰胆碱酯酶活性的组分，得到所述具有抗老年痴呆活性的功能油脂。

3.一种根据权利要求1-2任一项所述的具有抗老年痴呆活性的功能油脂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤2：粗浸膏进行正相硅胶柱梯度层析；

4.根据权利要求3所述的具有抗老年痴呆活性的功能油脂的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，亚临界萃取条件：温度30～50℃，压力0.2～0.6MPa，溶剂为乙酸乙酯和正丁烷的混合溶液，其中羊栖菜与正丁烷的用量比为1kg:1L～1kg:2L，羊栖菜和乙酸乙酯的比例为100g：2～8mL，时间30～50min；通过减压旋蒸去除溶剂，减压旋蒸温度30～60℃。

5.根据权利要求3所述的具有抗老年痴呆活性的功能油脂的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，采用100％石油醚、98％石油醚、95％石油醚、90％石油醚、85％石油醚、80％石油醚、75％石油醚、100％乙酸乙酯依次进行正相硅胶柱梯度层析，得到Fr1～Fr8；所述正相硅胶柱梯度层析采用200-300目硅胶。

6.根据权利要求3所述的具有抗老年痴呆活性的功能油脂的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，抑制乙酰胆碱酯酶活性筛选包括洗脱组分的薄层层析分析及生物自显影及AChE抑制活性的测定。

7.一种根据权利要求1-2任一项所述的具有抗老年痴呆活性的功能油脂在制备预防神经炎症和/或改善记忆和/或抗老年痴呆药物或保健品中的应用。

8.一种具有抗老年痴呆活性的功能油脂微胶囊，其特征在于，以权利要求1-2任一项所述的具有抗老年痴呆活性的功能油脂为芯材，以明胶和六偏磷酸钠为壁材，采用复合凝聚法制备得到。

9.根据权利要求8所述的具有抗老年痴呆活性的功能油脂微胶囊，其特征在于，所述复合凝聚法具体包括以下步骤：

步骤d：微胶囊乳液经冷冻干燥得到所述微胶囊乳液。

10.根据权利要求9所述的具有抗老年痴呆活性的功能油脂微胶囊，其特征在于：

所述步骤a中：明胶水溶液质量浓度为6％～10％，具有抗老年痴呆活性的功能油脂和明胶水溶液的质量比为1:5～1:10；所述搅拌乳化在氮气氛围下，冰水浴中进行；

所述步骤b中：六偏磷酸钠水溶液的质量浓度为0.33％～0.73％；所述明胶水溶液和所述六偏磷酸钠水溶液的质量比为1:0.5～1:2；

所述步骤c中：磷酸溶液质量浓度为0.5％～2％；在滴加磷酸溶液调节pH值至4.6过程中温度条件控制如下：45～55℃固定20～40min，以10℃/h的速度降低至5℃，保持20～40min，以5℃/h的速度提升至25℃。