CN114303685B - 检测单子叶植物中产生pti反应的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测植物中产生PTI免疫反应的方法。具体而言涉及一种在单子叶植物中检测PTI的实验体系，该检测方法可实现单子叶植物的抗病反应的检测，操作简单、易于判断，高效、快速，适合大规模筛选。

Description

检测单子叶植物中产生PTI反应的方法

技术领域

本发明涉及一种检测植物中产生PTI免疫反应的方法。更具体地，本发明涉及一种在单子叶植物中检测PTI免疫反应的方法。

背景技术

植物在自然环境中面临大量多样的病原微生物的侵袭。植物抗病性通过两种方式保护植物免受病原体侵害：预先形成的结构(如角质层，细胞壁等)和化学物质(例如，抗菌化学品如糖苷、皂苷，抗菌蛋白及酶抑制剂等)，以及通过感染引起的免疫系统反应来识别和消除病原物。

植物免疫途径包括两个层面，病原物相关分子模式促发的免疫(PAMP-triggeredimmunity，PTI)和效应子促发的免疫(effector-triggered immunity，ETI)。

PTI免疫是植物的基础免疫，植物可通过定位于细胞膜上的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)识别病原微生物的病原物相关分子模式(pathogen-associated molecular Patterns，PAMPs)，从而促发寄主与病原菌互作早期的免疫反应，抑制病原微生物在植物组织中的定殖。另外，模式识别受体PRRs除可以识别PAMPs之外，也可以识别与损害相关的化合物，即损伤相关分子模式(damage-associatedmolecular Patterns，DAMPs)。

PAMPs是微生物的保守特征，在病原微生物及非病原微生物中均存在，因此也被称为微生物相关分子模式(microbe-associated molecular Patterns，MAMPs)。宿主识别PAMPs后会产生一系列的PTI免疫反应，其表现包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生、MAPK的激活、防卫基因的诱导表达、植物抗毒素的产生等。

目前，得益于对模式植物拟南芥的遗传筛选及功能研究，对植物免疫的分子机制有了很大的了解。但对单子叶植物(包括最重要的粮食作物)的免疫的分子机制的了解仍然滞后。单子叶植物中缺乏有效的植物免疫生物测定方法，是阻碍单子叶植物与病原菌相互作用的研究进展的重要因素。

水稻(Oryza sativa)是重要的粮食作物，也是重要的单子叶模式植物。目前，检测水稻中产生PTI反应的方法通常利用在水稻悬浮细胞或组织中检测PTI反应的主要指标，如ROS的爆发、MAPK的激活、防卫基因的表达等而进行。

但这些方法存在以下问题，由于需要进行蛋白质或RNA的提取、及蛋白和利用PCR的检测等，因此过程复杂，耗时，用于大规模筛选时实用性差。

例如，如果要检测MAPK的激活及防卫基因的表达，则有必要提取蛋白质或RNA，之后进行蛋白质免疫印迹或实时荧光定量PCR检测。一方面，RNA容易降解，整个过程中操作繁琐；另一方面，在样本量庞大时，逐个提取蛋白或RNA的操作需要大量人力、试剂和时间，不适合大规模筛选。而对ROS爆发而言，虽然能够进行快速高效的检测，但目前只能在水稻悬浮细胞中进行，而将需要筛选的水稻株系全部进行细胞培养是十分耗时的工作。在水稻组织或植株中直接进行ROS爆发的检测仍是一大挑战。

因此，对水稻或其它单子叶植物中是否发生PTI免疫反应，需要一种操作简单、易于判断，高效而可适用于大规模筛选的生物测定方法。

发明内容

发明人经过深入研究，建立了在单子叶植物中，不需要进行蛋白质或RNA的提取及蛋白和利用PCR而检测产生PTI免疫反应的方法。该方法基于对单子叶植物的幼苗侧根长度的测定而判断是否出现侧根发育抑制，当确定出现侧根发育抑制时，则判断为产生了PTI免疫反应。

上述方法的操作简单、易于判断，高效，即使需要筛选的样本总量庞大也易于进行，可直接对植株进行，不需要格外的细胞培养。因此适用于单子叶植物尤其是水稻的大规模筛选，能够节省人力物力，在日本晴、品种中花11、品种黄华占、东乡野生稻等多种品种中均有效果，为一种可靠而适用性高的检测方法。

通过进一步在上述方法中使用激发物石莼多糖处理植株，即使对于单独处理时造成的抑制效果较小的PAMP也能获得良好的检测效果。

在本发明的实施方式中，发明人分别使用作为细菌PAMP的Flg22，作为真菌的PAMP的几丁质及作为损伤相关分子模式DAMP的OG处理水稻幼苗检验了本发明的检测方法，证实通过测量是否发生侧根发育抑制，能够有效检测是否发生由这些物质引起的PTI免疫反应。

作为细菌PAMP的Flg22是来源于细菌菌毛的保守的22个氨基酸的多肽，可以被作为PRR的FLS2识别。FLS2在拟南芥和水稻中均存在，为一个富含亮氨酸重复的受体样激酶。几丁质(几丁质)是目前研究较多的真菌的PAMPs，其来源于真菌细胞壁。据报道，几丁质寡糖能够激活单子叶植物和双子叶植物的免疫反应。在这样的过程中，具体而言，拟南芥中的含有LYK5的受体复合体和水稻中的含有CEBiP及CREK1的受体复合体可以识别几丁质。

作为DAMP，例如可以列举OG。在拟南芥中，受体激酶WAK1可以识别病原菌侵染或机械损伤造成的细胞壁产生的OGs(寡半乳糖苷，oligogalacturonides)。

在本发明的一个实施方式中，作为单子叶植物使用了日本晴、品种中花11、品种黄华占、野生稻等水稻，但不限于此。作为单子叶植物可列举：小麦、玉米。

在本发明的一个实施方式中，使用了石莼多糖作为激活更强的防卫反应的激发物，但并不限于此，只要是能够激活单子叶植物防卫反应的试剂如β-1,6-1,3-葡聚糖、来源于藻类的多糖等，激发手段(例如机械性损伤，过量光照，特殊波长射线的照射，能够引起晒伤的高温，能够引起冻伤的低温等)，或以上试剂与以上激发手段的组合即可，具体采用的处理时间及浓度可以由本领域技术人员适当地确定。当使用石莼多糖时，浓度例如为20μg/ml，优选为100μg/ml。

在本发明的一个实施方式中，使用了PTI激发因素为实验用激发子(Elicitors)，但并不限于此，也可以为激活PTI反应的其他因素。

在本发明的一个实施方式中，对使用的处理单子叶植物的PTI激发因素的处理时间及试验开始时幼苗的天龄或周龄而言，能够根据试验目的的不同及单子叶植物的种类进行适当调整。当所述单子叶植物为水稻时，例如为日本晴。

在本发明中，侧根长度Llr或侧根长度Llrc是指将植物正常平铺摆放时，从距茎基部下方1.5cm至4.5cm的主根区域上某一侧根发生处到该侧根末端的长度。

所述侧根长度的测量优选于接种后不超过第8天，优选在接种的第7天进行，第7天观察结果已有明显差异，超出时限后由于培养皿空间限制，不便于后期观察。

本发明中，所述侧根发育抑制指侧根长度的抑制，当测量在PTI激发因素处理后的侧根长度Llr，并与初始萌发情况相似但无PTI激发因素处理的幼苗的侧根长度Llrc相比，p<0.01时，认为出现显著的侧根长度抑制。

本发明包括以下内容：

1.一种检测单子叶植物中产生PTI反应的方法，包括

用PTI激发因素处理单子叶植物的幼苗，例如水稻、小麦、玉米，优选为水稻，特别优选为选自品种日本晴、品种中花11、品种黄华占、东乡野生稻中的品种的幼苗。

测量在PTI激发因素处理后的侧根长度Llr，并与初始萌发情况相似但无PTI激发因素处理的幼苗的侧根长度Llrc相比，p<0.01则认为出现侧根发育抑制，判断为产生了PTI反应。

2.根据项1所述的方法，包括在PTI激发因素处理前、或处理过程中使用石莼多糖处理所述幼苗。

3.根据项1或2所述的方法，其中，石莼多糖处理的浓度为优选为100μg/ml，处理时间优选为与激发因素共同处理幼苗3～4天

4.根据项1～3中任一项所述的方法，其中，侧根长度的测量的统计区域为幼苗主根从上至下1.5～4.5cm的区域。

5.根据项1～4中任一项所述的方法，其中，

所述PTI激发因素的处理时间为1～5天，优选为3～4天，更优选为4天，6.根据项1～5中任一项所述的方法，其中，

单子叶植物的幼苗为将种子接种在培养基上后无菌培养到第3天的幼苗，所述侧根长度的测量于接种后不超过第8天，优选在接种的第7天进行。

7.根据项1～6中任一项所述的方法，其中，

所述培养基为培养基平板，优选为1/2MS培养基平板，

所述无菌培养在光照培养箱中进行，优选所述光照培养箱设定为日照(120μmolm^-2s^-1)28℃13小时，黑暗26℃11小时。

8.根据项1～7中任一项所述的方法，其中，所述PTI激发因素为PAMP或DAMP，优选选自真菌PAMP、细菌PAMP或DAMP：更优选选自Flg22，几丁质或寡半乳糖苷(OG)，

其中，进一步优选当所述PTI激发因素为Flg22时，其施用浓度为1μM～10μM的浓度，当所述PTI激发因素为几丁质时，其施用浓度为0.1～2mg/mL，优选为0.5～2mg/mL，更优选为1.0mg/mL，当所述PTI激发因素为OG时，其施用浓度为0.5～1mg/mL，

所述PTI激发因素例如为能够激活单子叶植物防卫反应的试剂如β-1,6-1,3-葡聚糖、来源于藻类的多糖等，激发手段(例如机械性损伤，过量光照，特殊波长射线的照射，能够引起晒伤的高温，能够引起冻伤的低温等)，或这些试剂与这些激发手段的组合。

9.项1～8中任一项所述的方法在单子叶植物例如水稻、小麦、玉米的筛选中的应用，所述单子叶植物优选为水稻。

10.项1～8中任一项所述的方法在单子叶植物例如水稻、小麦、玉米的抗病反应的检测中的应用，所述单子叶植物优选为水稻。

附图说明

图1.Flg22处理造成的水稻幼苗侧根长度抑制，A.Flg22处理的幼苗主根以及侧根的照片，图中左下比例尺表示1cm对应长度。方框处对应侧根根长以及侧根密度测定的测定区域。B、C和D.分别为幼苗的侧根长度、主根长度以及侧根密度的统计图。E.不同浓度Flg22对水稻幼苗的侧根长度的影响统计图。F为对osfls2突变体幼苗的侧根长度影响统计图。图中标记*或字母：显著性关系为P<0.01。

图2.寡半乳糖苷(OG)处理造成的水稻幼苗侧根长度抑制，A.不同浓度OG处理的幼苗主根以及侧根的照片，图中左下比例尺表示1cm对应长度，方框对应侧根根长以及侧根密度测定的测定区域。B、C和D分别为不同浓度OG处理的幼苗的侧根长度、主根长度以及侧根密度的统计图。图中标记*或字母：显著性关系为P<0.01。

图3.几丁质(Chitin)和石莼多糖(Ulvan)共处理表现的水稻幼苗侧根长度抑制，A.不同浓度几丁质处理的幼苗侧根长度的统计图。B.几丁质和石莼多糖共处理的幼苗的侧根长度的统计图。C.1mg/mL几丁质和不同浓度的石莼多糖共处理的幼苗的侧根长度的统计图。D.100μg/mL石莼多糖和不同浓度的几丁质共处理的幼苗的侧根长度的统计图。图中标记*或字母：显著性关系为P<0.01。

图4.Flg22处理后水稻根系中的PTI响应指标的变化。A.Flg22处理后磷酸化的MAPK蛋白水平的图，B.基因OsPR10、PAL和PBZ1的qRT-PCR图。

图5.水稻不同栽培种以及稻属其他种中的幼苗侧根生长抑制。A.Flg22处理后粳稻中花11的侧根长度的统计图。B.Flg22处理后籼稻黄华占的侧根长度的统计图。C.Flg22处理后野生稻的侧根长度的统计图。图中标记*或字母：显著性关系为P<0.01。

具体实施方式

虽然本发明对其具体实施方式进行了以下描述，然而某些修改和等同物对于本领域技术人员是显而易见的，并且旨在包括在本发明的范围之内。

通过以下实施例对本发明进行阐述，但以下实施例不以任何方式限制本发明。

方法

植物材料的准备和培养

实验中所使用的水稻品种为粳稻日本晴和中花11以及籼稻黄华占(均购自中国科学院微生物研究所)。其中osfls2和oscerk1突变体通过CRISPR-Cas9系统的基因编辑技术的敲除方式完成构建。

构建过程：发明人利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，以pHUE411质粒为出发载体(购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)，分别创建了含有靶向OsFLS2和OsCerk1的sgRNA的基因编辑载体pHUE411_FLS2-2和pHUE411_CERK1-1，其中，OsFLS2的基因组核苷酸序列示于SEQ ID NO:10，基因编辑的靶序列为CTAGCTGCTCGAGCTCGCCG。OsCerk1的基因组核苷酸序列示于SEQ ID NO:11，基因编辑的靶序列为AACTTTCTAATGCTACACAG。

分别将构建的sgRNA载体pHUE411_FLS2-2和pHUE411_CERK1-1使用农杆菌AGL1通过农杆菌转化方式对水稻日本晴植株进行遗传转化，获得基因编辑的突变体植株及种子，以上载体的转化过程委托武汉伯远生物科技有限公司完成。

将各组水稻种子在培养前首先进行表面消毒，先用75％酒精浸泡1分钟后，再用次氯酸钠消毒20分钟。此后用无菌水冲洗表面消毒处理后的水稻种子，均匀平铺移至1/2MS培养基平板上，并置于光照培养箱竖直培养两天。第三天从中选取根长1.5-2.0cm的萌发相对一致的幼苗移至不同实验处理的1/2MS培养基平板，并置于光照培养箱竖直培养。光照培养箱设置为日照28℃13小时，黑暗26℃11小时，相对湿度约为85％。

实验用激发子(Elicitors)

本实验主要使用的植物PTI激发子为Flg22，几丁质和OG。其中，Flg22肽(氨基酸序列，QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA，SEQ ID NO:1)由GenScript公司合成。几丁质获自哥本哈根大学。寡半乳糖苷(Oligogalacturonides，OG)获自中国科学院大连化学物理研究所，其聚合度主要为4-9。此外实验中使用的石莼多糖(ULV010)由Elicityl公司购入。以上使用的激发子和试剂均溶于无菌水中配置相应终浓度的储液。并在此后实验中加入相应的量的储液至水或1/2MS培养基中配置为目的终浓度。

平板苗的根的生长指标测定

水稻幼苗在1/2MS培养基平板竖直生长至第七天(由平铺消毒处理后种子至平板上记为第一天)时进行根的生长指标测定。将平板上幼苗生长状况进行拍照记录后，通过Image J软件利用照片统计幼苗的主根根长，侧根数量和侧根长度等数据。其中侧根统计区域为幼苗主根从上至下1.5-4.5cm区域。最后将统计的原始数据记录于Excel表格中。

蛋白提取和MAPK激活检测

取无菌培养7天的水稻幼苗，不同激发因素处理不同时间后，立即截取根段于液氮速冻。通过蛋白提取缓冲液(50mM PH7.5的Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl₂，15mM EGTA，30mMβ-glycerolPhosphate，0.1％NP-40，2mM DTT，protease inhibitor cocktail[Roche公司]，PhosStop[Roche公司])完成总蛋白的提取。并通过Bradford法测定提取的总蛋白浓度。此后利用Phospho-p44/42MAPK(Erk1/2)抗体通过蛋白质免疫印迹实验来进行MAPK激活检测。

RNA提取和qRT-PCR

取无菌培养7天大的水稻幼苗，不同激发子处理不同时间后，立即截取根段于液氮速冻。通过TRIzol reagent(Tiangen公司)提取总RNA。每份样品取1μg的总RNA经DNase I(Invitrogen公司)处理后再通过M-MLV Reverse Transcriptase(Promega公司)进行反转并最终获得对应的cDNA。

qRT-PCR使用SYBRPremix Ex Taq(TakaRa Bio Inc.公司)通过BioRad CFX96设备(Bio-Rad Laboratories)按照相应的说明进行操作。其中mRNA水平的标准化是通过ACTIN2作为内参基因。其中每样品处理至少三次重复。qRT-PCR的温度条件：95℃/90s,95℃/15s,65℃/30s,72℃/15s(收集),40个循环；65-95℃/收集。

检测中使用的引物如下

PBZ1的qRT-PCR检测

正向引物为5’-GGTGTGGGAAGCACATACAA-3’(SEQ ID NO:2)，反向引物为5’-GTCTCCGTCGAGTGTGACTTG-3’(SEQ ID NO:3)。

PAL的qRT-PCR检测

正向引物为5’-TGAATAACAGTGGAGTGTGGAG-3’(SEQ ID NO:4)，反向引物为5’-AACCTGCCACTCGTACCAAG-3’(SEQ ID NO:5)。

PR10的qRT-PCR检测

正向引物为5’-CCTCAGCCATGCCATTCAG-3’(SEQ ID NO:6)，反向引物为5’-CTTGTCCACGTCCAGGAACTC-3’(SEQ ID NO:7)。

Actin的qRT-PCR检测

正向引物为5’-AGGCTCCTCTCAACCCCAAG-3’(SEQ ID NO:8)，反向引物为5’-TTTCCTGGTCATAGTCCAGG-3’(SEQ ID NO:9)。

实施例1.Flg22对水稻幼苗的侧根生长抑制。

将粳稻日本晴的种子按照“植物材料的准备和培养”中进行培养。在1/2MS培养基平板上培养的第三天，选择萌发状况一致的根长约1.5-2.0cm的水稻幼苗分为两组，移至含有10μM Flg22(处理组)或不含Flg22的1/2MS培养基平板(非处理组)上竖直培养7天，此后拍照统计分析根系指标(图1A-D)。

之后，将Flg22的浓度梯度设置为0、1μM、5μM、10μM并同样地进行了上述试验，统计了侧根长度的变化(参见“平板苗的根的生长指标测定”，图1E)。

其后，将日本晴普通种子更换为osfls2突变体种子(osfls2)，以Flg22的浓度为10μM的条件(osfls2+flg22)，其他操作不变，同样地进行了上述试验，统计了侧根长度的变化(图1F)。并将以上结果示于图1。

上述图中值表示为平均值±SD，均进行了三次独立实验(样本重复数n>12)。图中标记*或字母表示显著性关系P<0.01。

不同根系指标的比较：从图1A-D可见，对于水稻幼苗的主根长度而言，10μM Flg22处理没有带来明显的抑制；但经过Flg22处理的水稻幼苗的侧根长度受到了显著的抑制，同时，侧根密度并没有表现出显著变化。

不同处理浓度的比较：从图1D中可见，使用1μM、5μM、10μM浓度的Flg22处理时，均出现了侧根长度的抑制，且对侧根长度的抑制呈现浓度依赖性。

Flg22处理对OsFLS2敲除突变体osfls2的影响：相比未处理的突变体(osfls2组)，经过Flg22处理的osfls2突变体(osfls2+flg22组)的侧根长度没有显示显著变化。

讨论：在此前的研究中发现，Flg22可以抑制拟南芥的主根的生长长度。但试验表明，与拟南芥不同，对于水稻幼苗而言，Flg22处理对主根长度及侧根密度均没有明显的抑制，但出现了侧根长度的抑制现象：处理组平均侧根长度Llr仅为非处理组平均侧根长度Llrc的约三分之一，并且这样的抑制具有浓度依赖性。通过利用CRISPR-Cas9基因编辑技术创建的OsFLS2(相关基因组核苷酸序列见SEQ ID NO:10)的敲除突变体osfls2进行试验，进一步确定该侧根长度抑制为由Flg22激发的特异的PTI反应。提示对侧根长度的抑制能够作为水稻中产生了PTI免疫反应的清晰指标。

实施例2.OG对水稻幼苗的侧根生长抑制。

与实施例1同样地进行了试验，其中，使用的种子为粳稻日本晴，将Flg22改变为0.5mg/mL或1mg/mL的OG，同样检测了三种根系指标。并将以上结果示于图2。上述图中值表示为平均值±SD，均进行了三次独立实验(样本重复数n>12)。图中标记*或字母表示显著性关系P<0.01。

不同根系指标的比较：从图中可见，对于水稻幼苗的主根长度而言，OG处理没有带来明显的抑制，同时，侧根密度并没有表现出显著变化；与未处理组比较，经过0.5mg/mL或1mg/mL的OG处理的水稻幼苗的侧根长度均受到了显著的抑制，其中，1mg/mL的OG处理组中的侧根长度更短(图2A-D)。

讨论：如图2所示，当使用作为可以激活PTI的DAMP的OG进行处理时，水稻幼苗的主根长度或侧根密度没有明显影响，而侧根长度出现了显著的抑制。同时，类似于Flg22，OG对侧根长度的抑制也表现为剂量依赖性。这些结果进一步证明，基于侧根长度的侧根生长抑制在单子叶植物水稻中的PTI响应过程的一种普遍存在的表型。

实施例3.几丁质对水稻幼苗侧根的生长抑制。

与实施例1同样地进行了试验，其中，使用的种子为粳稻日本晴，将Flg22改变为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL的几丁质，检测了侧根长度的变化(图1A)。而后，同样地进行了试验，其中，培养基中的处理试剂为仅1mg/mL几丁质、1mg/mL几丁质+20μg/mL石莼多糖、或仅20μg/mL石莼多糖(图1B)。

再后，同样地进行了试验，其中，培养基中的处理试剂分别为1mg/mL几丁质+2μg/mL石莼多糖、1mg/mL几丁质+20μg/mL石莼多糖，1mg/mL几丁质+200μg/mL石莼多糖，仅2μg/mL石莼多糖，仅20μg/mL石莼多糖，仅200μg/mL石莼多糖(图3C)。

而后，同样地进行了试验，其中，培养基中的处理试剂分别为0.1mg/mL几丁质+100μg/mL石莼多糖、0.5mg/mL几丁质+100μg/mL石莼多糖，1.0mg/mL几丁质+100μg/mL石莼多糖(图3D)。最后，同样地进行了试验，其中种子为oscerk1突变体的种子，培养基中的处理试剂为0.5mg/mL几丁质+100μg/mL石莼多糖。

将以上结果示于图3。上述图中值表示为平均值±SD，均进行了三次独立实验(样本重复数n>12)，同时设立培养基中不含处理试剂的对照组。图中标记*或字母表示显著性关系P<0.01。

结果显示：从图3中可见，仅使用几丁质处理时，与未处理组比较，在0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL的几丁质处理下，对于水稻幼苗的侧长度均没有带来明显的变化(图3A)。与仅使用石莼多糖或仅使用几丁质处理比较，在20μg/mL石莼多糖和1mg/mL几丁质共同处理时，侧根长度被显著抑制；与对照组比较，仅用石莼多糖处理时侧根长度没有被抑制(图3B)。当几丁质与2～100μg/mL的石莼多糖共处理时均观察到了侧根长度的抑制，其中，与100μg/mL的石莼多糖共处理时，侧根长度的抑制最显著(图3C)。

进一步，当0.1mg/mL、0.5mg/mL，1.0mg/mL浓度的几丁质与100μg/mL的石莼多糖共处理时，对侧根长度显示出几丁质浓度依赖性的抑制效果，在1.0mg/mL浓度的几丁质与100μg/mL的石莼多糖共处理组中观察到侧根长度的抑制最显著(图3D)。并且，在使用100μg/mL石莼多糖+1mg/mL几丁质共处理oscerk1突变体时，相比于不处理的oscerk1突变体，幼苗侧根长度并没有显著差异。

讨论：为了进一步测试使用其他PAMP处理时是否具有侧根长度抑制，本发明选取了被广泛研究的真菌PAMP几丁质进行测试。结果发现，当利用仅几丁质处理水稻幼苗时，侧根长度并没有明显的抑制(图3A)。这样的结果可能是由于几丁质单独处理引起的PTI免疫反应较弱，无法直接通过侧根长度抑制被检测。

当植物先受到某些生化刺激后植物会启动免疫，并在此后的刺激后激活更强的防卫反应。石莼多糖是此前水稻研究中发现的一种能引起启动效应的激发物。利用石莼多糖进行共处理的结果发现，在20μg/mL石莼多糖和1mg/mL几丁质的共处理下能观察到侧根长度被显著抑制，同时单独利用石莼多糖处理并不会引起侧根生长抑制的现象。推断是通过提前激活防卫反应而放大了此后几丁质处理造成的侧根抑制效果。

进一步优化了石莼多糖的浓度后，发现在100μg/mL石莼多糖处理下，不同浓度几丁质处理对侧根生长显示出浓度依赖性的抑制效果，同时较低浓度的几丁质也显示出显著的侧根生长抑制效果(图3C和3D)。提示石莼多糖可作为本方法中用于扩大检测范围的辅助处理剂。

之后，检测了编码几丁质受体基因OsCERK1(相关的核苷酸序列见SEQ ID NO:11)的敲除突变体oscerk1中的情况。发现在使用100μg/mL石莼多糖和1mg/mL几丁质的共同处理时，相比于不处理的oscerk1突变体，oscerk1突变体的侧根生长并没有显著变化，确定侧根长度抑制为由几丁质激发的特异的PTI反应。进一步验证了即使在免疫原为真菌PAMP时，对侧根长度的抑制也能够作为水稻中产生了PTI免疫反应的清晰指标。

实施例4.水稻幼苗根系中的其他PTI响应指标的验证。

将同前述无菌培养至7天大的日本晴和osfls2突变体水稻幼苗用5μM Flg22分别处理0、15min、30min后，通过Western法利用p42/44抗体(购自CST，货号4370L，二抗GAR购自Sigma公司，货号A6154)检测了MAPK的磷酸化(参见“蛋白提取和MAPK激活检测”，图4A)，然后，将无菌培养7天大的日本晴水稻幼苗使用5μM Flg22处理，分别在处理到0、1、3、6h时截取水稻幼苗根部全长取样(参见“RNA提取和qRT-PCR”)，并利用qRT-PCR使用相应引物检测了OsPR10、PAL和PBZ1(参见“RNA提取和qRT-PCR”)并将各基因的相对标准化表达作图(图4B)。其中数值表示品均值±标准差(SD)，每样品至少3次生物学重复。

结果显示：从图4中可见，在Flg22处理30分钟时，与osfls2突变体组相比，在日本晴组幼苗(WT)的根系中，MAPKs被磷酸化的程度显著。使用5μM Flg22处理日本晴幼苗时，OsPR10、和PBZ1的相对标准化表达随0、1、3、6h时逐渐增加，PAL相对标准化表达在1h时达到最高，3、6h时依次降低。

讨论：对水稻幼苗根系的其他PTI响应的指标，包括MAPK激活和防卫相关基因的表达进行检测发现，可以看出MAPKs在Flg22处理30分钟时被显著激活。此外防卫相关基因OsPR10、PAL和PBZ1也表现出明显的表达模式。这些数据进一步表明在这些水稻幼苗的根部中发生了由激发子如Flg22诱导的PTI免疫反应，提示Flg22处理引起的特异性侧根长度抑制与植株中发生的PTI免疫反应密切相关。从另一个方面验证，将侧根长度抑制作为单子叶植物如水稻中产生了PTI免疫反应的观测指标的方法的准确性。

实施例5.侧根长度抑制在日本晴以外的水稻品种或种中的验证。

与实施例1同样地进行了试验，其中，使用的种子为中花11(粳稻)(图5A)和黄华占(籼稻)(图5B)，用于处理的Flg22浓度为0、1、5、10μM，测定了侧根的长度，分别将统计图示于图5A、B。同样地进行了试验，其中，使用的种子为东乡野生稻(获自中科院遗传与发育研究所储成才实验室)，用于处理的Flg22浓度为5μM，测定了侧根的长度，将统计图示于图5C。上述图中值为平均值±SD，均进行了三次独立实验(样本重复数n>12)。图中标记*或字母表示显著性关系P<0.01。

结果显示，在中花11(粳稻)和黄华占(籼稻)中，使用不同浓度的Flg22处理组中均观察到了幼苗的侧根长度抑制，其中，随Flg22的浓度增高，侧根长度抑制的程度变大。与对照组相比，在Flg22处理的野生稻中，也观察到了侧根长度抑制现象。

讨论：在另外两个品种—中花11(粳稻)和黄华占(籼稻)中，对于Flg22处理引起的PTI免疫反应产生进行了试验，结果表现出了与日本晴相似的浓度依赖性的侧根长度抑制现象(图5A和5B)。进一步在稻属其他种中检测是否也有相似的效果时，发现在Flg22处理下，野生稻也同样表现出侧根长度抑制现象(图5C)。

这一结果表明，PTI免疫反应的发生与侧根长度抑制的出现的密切相关性在不同水稻品种或稻属不同种中具有广适性。提示侧根长度抑制的观察能够作为检测单子叶植物中产生PTI免疫反应的指标而在各种品种中广泛应用。

工业实用性

本发明的方法为水稻或其它单子叶植物中是否发生PTI免疫反应的一种操作简单、易于判断，高效而可适用于大规模筛选的生物测定方法。能够直接获得单子叶植物产生免疫反应的情况，可应用于各种单子叶植物尤其是水稻的大规模筛选，例如植物抗病性育种过程等。

Claims (15)

1.一种检测单子叶植物中是否产生了PTI反应的方法，包括：

用PTI激发因素处理单子叶植物的幼苗，所述PTI激发因素为Flg22，几丁质或寡半乳糖苷，所述单子叶植物为水稻、小麦或玉米；

测量在PTI激发因素处理后的侧根长度Llr，并与初始萌发情况相似但无PTI激发因素处理的幼苗的侧根长度Llrc相比，Llr显著更短，p<0.01则认为出现侧根发育抑制，判断为产生了PTI反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其中当所述单子叶植物为水稻时，所述水稻为品种日本晴、品种中花11、品种黄华占或东乡野生稻。

3.根据权利要求1所述的方法，包括在PTI激发因素处理前、或处理过程中使用石莼多糖处理所述幼苗。

4. 根据权利要求3所述的方法，其中，石莼多糖处理的浓度为100 μg/ml，处理时间为与激发因素共同处理幼苗3~4天。

5.根据权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，侧根长度的测量的统计区域为幼苗主根从上至下1.5~4.5cm的区域。

6.根据权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，所述PTI激发因素的处理时间为1~5天。

7.根据权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，所述PTI激发因素的处理时间为3~4天。

8.根据权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，所述PTI激发因素的处理时间为4天。

9.根据权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，

单子叶植物的幼苗为将种子接种在培养基上后无菌培养到第3天的幼苗，

所述侧根长度的测量于接种后不超过第8天。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述侧根长度的测量在接种的第7天进行。

11. 根据权利要求9所述的方法，其中，所述培养基为1/2 MS培养基平板，所述无菌培养在光照培养箱中进行。

12. 根据权利要求11所述的方法，其中，所述光照培养箱设定为日照(120 µmol m^-2 s^-1)28℃ 13小时，黑暗26℃ 11小时。

13. 根据权利要求1所述的方法，其中，当所述PTI激发因素为Flg22时，其施用浓度为1μM~10 μM的浓度，当所述PTI激发因素为几丁质时，其施用浓度为0.1~2 mg/mL，当所述PTI激发因素为寡半乳糖苷时，其施用浓度为0.5~1 mg/mL。

14.权利要求1~13中任一项所述的方法在单子叶植物筛选中的应用，其中，所述单子叶植物为水稻、小麦或玉米。

15.权利要求1~13中任一项所述的方法在单子叶植物的抗病反应的检测中的应用，其中，所述单子叶植物为水稻、小麦或玉米。

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