CN114302966A - 单细胞胞内捕获的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于在细胞内高通量条码化核酸和/或蛋白质的方法。细胞内单细胞捕获方法使用个体细胞本身作为隔室，并将多种独特标识符(如条形码)递送到细胞内，直接捕获细胞内的核酸和/或蛋白质靶标。它显著简化了单细胞分析实验设置，并消除了对外部隔室生成的需要。它提供了高通量的单细胞表达谱分析和细胞蛋白定量的方法。带有细胞内捕获的靶向测序能够显著增强对于低频率突变(例如在癌症很早期的体细胞突变)检测的灵敏度和特异性，真正实现早期癌症检测。

Description

单细胞胞内捕获的方法及其应用
本专利申请要求2019年3月12日提交的临时文件US62817106和2019年6月6日提交的临时文件US62858270的优先权。其整体引入本文。本文中述及的所有出版物、专利和其他文件都通过引用全文纳入本文。
技术领域
本发明涉及单细胞检测和测序的一般方法。特别地，本文提供的方法涉及在大规模并行规模中制备从个体细胞中捕获核酸和/或蛋白质，以及其在细胞鉴定、基因表达谱分析、基因分型、肿瘤细胞检测和蛋白质定量方面的应用。
背景技术
在过去十年间，已经测序了来自各种不同物种的大量基因组。还有更多的组织和细胞样品已经针对其基因组特征和转录组概况被测序。同一组织中的细胞通常被认为是具有相同状态的功能单元。在大多数情况下，测序的核酸样本是从数百至数百万个混合在一起的细胞中提取的。这种对数千个细胞的批量测序分析了细胞群体的总体反应和稳定状态，它平均了个体细胞的差异，可能无法精确解释生物体的生长和发育机制。最近研究个体细胞的能力为了解细胞间的个体差异打开了新的窗口(Janiszewska等，2015)。细胞在增殖、分化和代谢过程中与内部和外部因素的相互作用造成了细胞间的许多差异。即使是同源细胞，胞内物质的组成和含量也有很大的不同。最近关于高效和准确捕获单细胞的技术的进展使得研究人员能够检测个体细胞之间的细微变化(Spitzer和Nolan，2016和Zeisel等，2015)。单细胞核酸测序已经揭示了多种生物学问题，例如检测新的癌症细胞类型(Grün等，2015)，鉴定基因调控机制(Datlinger等，2017)，研究发育过程的动态(Li等，2017)以及揭示癌症中的免疫细胞概况(Zheng等，2017)。高通量单细胞测序不仅可以分析相同表型的遗传异质性，还可以从那些通常难以培养的细胞中获得遗传信息。
两种流行的单细胞测序方法是基于平板的方案和基于微滴的方法。基于平板的方案如SMART-Seq2(Picelli等，2013；Picelli等，2014；Tang等，2009)在基因检测中有较高的灵敏度，但为个体细胞构建测序文库成本高昂。相应地，基于微滴的方法如Drop-seq(Klein等，2015和Macosko等，2015)、10xGenomics Chromium和Biorad ddSEQ通过为大量细胞建立条码化文库，以相对较低的成本并行地分析大量细胞，测序效率更高。这些方法通常在同一液滴中分离单细胞和多个独特的条形码，以每个细胞为基础构建条码化文库。这种类型的方案仍然需要将个体细胞分隔成具有不同标识符(如条形码)的不同隔室，且通常依赖于液滴发生器来创建作为隔室的液滴。
本发明提供了细胞内单细胞核酸捕获方法，它是胞内核酸条码化反应，使用个体细胞本身作为隔室并将多个独特的标识符(如条形码)递送进入细胞，无需额外的隔室化，直接捕获细胞中的遗传信息。它显著简化了单细胞实验设置，并消除了对外部隔室生成的需要。带有细胞内捕获的靶向测序能够显著增强对于极低频率突变检测的灵敏度和特异性，例如在癌症发展的很早期鉴定体细胞突变，这是早期癌症检测所需要的。
发明内容
一方面，本文描述的是无隔室化的条码化胞内核酸的方法。本方法包括提供多个克隆条形码模板、多个细胞和逆转录酶。在无隔室化的条件下，将克隆条形码模板转染到细胞中，其中条形码模板与所述细胞内的核酸杂交。在转染克隆条形码模板进入细胞之前，或在转染克隆条形码模板进入细胞的同时，或在转染克隆条形码模板进入细胞之后，将逆转录酶转运进细胞。在细胞内使用条形码模板作为引物合成互补DNA。
一方面，本文描述的是无隔室化的条码化胞内核酸的方法。本方法包括提供多个克隆条形码模板、多个细胞和逆转录酶。在无隔室化的情况下，将克隆条形码模板转染到细胞中，其中条形码模板与所述细胞内的核酸杂交。在转染克隆条形码模板进入细胞之前，或在转染克隆条形码模板进入细胞的同时，或在转染克隆条形码模板进入细胞之后，将逆转录酶转运进细胞。在细胞内使用条形码模板作为引物合成互补DNA。在细胞中加入转座体(transpososome)，在细胞内的RNA/cDNA杂交体上进行链转移反应或标签化反应。
一方面，本文描述的是无隔室化的条码化胞内核酸的方法。本方法包括提供微粒上多个克隆条形码模板、多个细胞和逆转录酶。在无隔室化的情况下，将克隆条码化微粒转染到细胞中，其中微粒上的条形码模板与所述细胞内的核酸杂交。在转染克隆条码化模板进入细胞之前，或在转染克隆条码化模板进入细胞的同时，或在转染克隆条码化模板进入细胞之后，将逆转录酶转运进细胞。在细胞内使用条形码模板作为引物合成互补DNA。
一方面，本文描述的是无隔室化的条码化胞内核酸的方法。本方法包括提供微粒上多个克隆条形码模板、多个细胞和逆转录酶。在无隔室化的情况下，将克隆条码化微粒转染到细胞中，其中微粒上的条形码模板与所述细胞内的核酸杂交。在转染克隆条码化模板进入细胞之前，或在转染克隆条码化模板进入细胞的同时，或在转染克隆条码化模板进入细胞之后，将逆转录酶转运进细胞。在细胞内使用条形码模板作为引物合成互补DNA。在细胞中加入转座体，在细胞内的RNA/cDNA杂交体上进行链转移反应或标签化反应。
一方面，本文描述的是无隔室化的条码化胞内核酸的方法。本方法包括提供多个克隆条形码模板和多个细胞。在无隔室化的情况下，将克隆条形码模板转染到细胞中，其中条形码模板与细胞内的核酸杂交。本方法进一步包括裂解转染的细胞而不从杂交的核酸中分离条形码模板，提供逆转录酶并使用条形码模板作为引物合成互补DNA。
一方面，本文描述的是无隔室化的条码化胞内核酸的方法。本方法包括提供多个克隆条形码模板和多个细胞。在无隔室化的情况下，将克隆条形码模板转染到细胞中，其中条形码模板与细胞内的核酸杂交。本方法进一步包括裂解转染的细胞而不从杂交的核酸中分离条形码模板，提供逆转录酶并使用条形码模板作为引物合成互补DNA。向反应中加入转座体，直接在RNA/cDNA杂交体上进行链转移反应或标签化反应。
在一个方面，本文所述的是利用胞内条码化核酸进行使用模板转换方法或使用一般第二链cDNA合成方法(如用RNA酶H/DNA聚合酶/DNA连接酶组合)的第二链cDNA合成的方法。
一方面，本文所述的是利用胞内条码化核酸制备测序文库用于单细胞表达谱分析(single cell expression profiling)、单细胞靶向测序和免疫组库分析(immunerepertoire analysis)的方法。
一方面，本文所述的是检测早期癌症的方法。本方法包括提供独立细胞形式的测试样本，条码化胞内核酸以生成带细胞条形码标签的互补DNA，使用互补DNA生成涵盖含有一个或多个致瘤变体(tumorigenic variant)和细胞条形码标签的区域的测序文库，基于它们的细胞条形码序列对测序读数进行分组，并基于每个细胞确定致瘤变体的存在，以及计数测试样本中的肿瘤细胞数量并确定肿瘤细胞百分比。
一方面，本文描述的是无隔室化的条码化胞内蛋白质的方法。本方法包括提供多个带有第一条形码模板的蛋白质捕获部分和多个细胞，蛋白质捕获部分与细胞内特异性靶向的内源性蛋白质结合；提供多个第二克隆条形码模板；将第二克隆条形码模板转染到细胞内而无隔室化，其中第二条形码模板与捕获细胞内靶向的内源性蛋白质的捕获部分上的第一条形码模板杂交。用从细胞中捕获的蛋白质释放条码化模板，并测序条形码模板以确定每个细胞的捕获蛋白质水平。
一方面，本文描述的是用于无隔室化细胞特异性胞内核酸条码化的方法。本方法包括将多个细胞与多个克隆条形码模板接触，其中每个克隆包括一个细胞特异性锚；通过细胞特异性锚将条形码模板的克隆锚定在特定类型的细胞上；将克隆条形码模板转染到该类型的细胞中，而不进行隔室化，其中条形码模板与细胞内的核酸杂交；基于条形码信息基于每个细胞分析锚定细胞的基因表达或基因型。
一方面，本文描述的是无隔室化的条码化胞内核酸用于靶向应用的方法。本方法包括提供带有第一组靶特异性引物的克隆条形码模板，该引物用于细胞内捕获一种或多种特异性核酸靶标。在无隔室化的情况下，将克隆条形码模板和第一组靶特异性引物转染进细胞中。在细胞内或在细胞裂解后进行逆转录反应，收集带有靶向第一链cDNA的克隆条码化模板，并用第二组靶特异性引物进一步引发第一链cDNA，生成双链DNA用于下游应用，包括标签化、扩增或测序文库生成。
一方面，本文描述的是无隔室化的条码化胞内核酸用于靶向应用的方法。本方法包括提供带有一组靶特异性引物的克隆条形码模板，该引物用于细胞内捕获一种或多种特定核酸靶标。在无隔室化的情况下，将克隆条形码模板和靶特异性引物转染进细胞中。在细胞内或在细胞裂解后进行逆转录反应，收集带有靶向第一链cDNA的克隆条码化模板，在RNA/cDNA杂交双链分子上用转座体进行链转移反应或标签化反应，用于下游应用，包括扩增或测序文库生成。
一方面，本文所述的是细胞内条码化并从细胞核或线粒体捕获DNA的方法。本方法包括将克隆条码化模板转染进细胞中之前或之后的固定步骤。
一方面，本文描述的是无隔室化的条码化胞内核酸的方法。为不同的用途调整克隆条形码模板和细胞的比例。通常，优选一个细胞中一种类型的克隆条形码模板。一个细胞中大于一种类型的克隆条形码模板可用于基因变异检测和免疫组库分析。当不同类型的克隆条形码模板的细胞来源可以通过额外的计算方法确定时，这种情况也可用于定量分析，如基因表达谱分析。
一方面，公开了一种无隔室化的胞内条码化靶标的方法，其包括：提供条形码模板，提供细胞，将条形码模板转染到细胞中；以及其中当细胞处于多个其他细胞的环境中时，该细胞没有通过分区与其他细胞分隔开，其中条形码模板在细胞内捕获了胞内靶标，生成核酸序列，该核酸序列来源于细胞内被捕获的胞内靶标，或来源于在细胞被裂解后被捕获的胞内靶标，以及其中核酸序列附接至来自条形码模板的条形码序列或互补的条形码序列，基于相附接的条形码序列的存在，鉴定该核酸序列和/或其来自细胞的互补序列；以及其中另一个具有相同条形码序列的核酸序列与同一细胞相关。另一方面，条形码模板是在多个条形码模板之间，且它们被固定在微粒上；其中微粒大小为约100nm至约100μm；且其中多个条形码模板彼此是克隆的。微粒的大小为1μm至20μm。在一个方面，微粒是磁性的或可降解的。
在一个方面，微粒在多个微粒中；其中多个微粒中的一个群体是非条码化的，多个微粒中的另一个群体包括条形码模板；其中这两个群体是混合的；以及其中具有条形码模板的微粒群体中的条形码模板相对于每个微粒来说是克隆的。
一方面，条形码模板是非固定化的。非固定化的条形码模板被封装在脂质体或液滴中；其中在每个脂质体或每个液滴中，条形码模板相对于脂质体或液滴中的另一个条形码模板而言是克隆的。
在一个方面，条形码模板的克隆包括条形码模板的约10个或更多的拷贝。在一个方面，条形码模板的克隆包括约10,000个或更多的拷贝。在一个方面，条形码模板的克隆包括约10,000,000个或更多的拷贝。
在另一个方面，在微粒上或在脂质体或液滴内，条形码模板相对于条形码模板群体中的另一个条形码模板是克隆的；并且其中在微粒上或在脂质体或液滴内存在一个以上的条形码模板群体。在微粒上或在脂质体或液滴内，存在一个以上的条形码模板群体，其中条形码模板的第一群体相对于多个条形码模板中的另一个条形码模板的第一群体是克隆的；而条形码模板的第二群体相对于多个条形码模板中的另一个条形码模板的第二群体是相同的。
在一个方面，条形码模板在多个条形码模板之间，而细胞在多个细胞中；其中条形码模板与细胞的比例是这样的：当条形码模板被转染到细胞中时，少于约30％的转染细胞包含超过一个条形码模板克隆群体，而超过约70％的转染细胞包括一个或更少的条形码模板克隆群体。在另一个方面，少于约20％的转染细胞包括超过一个条形码模板克隆群体，以及超过约80％的转染细胞包括一个或更少的条形码模板克隆群体。在另一个方面，少于约10％的转染细胞包括超过一个条形码模板克隆群体，以及超过约90％的转染细胞包括一个或更少的条形码模板克隆群体。
在一个方面，在细胞内，多个条形码模板的超过一个群体是在细胞内的；并且其中每个条形码模板群体内的条形码模板是克隆的。
在一个方面，条形码模板包含一个条形码序列，以及至少一个衔接子(adaptor)，其能够引发、杂交、扩增、链转移或其组合。在一个方面，条形码模板的一个克隆包括UMI序列。在另一个方面，衔接子选自下组：多聚-T序列、靶特异性序列、不同靶特异性序列池、随机简并序列，及其组合。
一方面，胞内靶标选自下组：RNA、DNA、寡核苷酸、寡核苷酸标记的蛋白质、寡核苷酸标记的化合物及其组合。另一方面，胞内靶标作为胞外成分通过细胞的特异性识别进入细胞。
一方面，细胞选自下组：培养的细胞、血液细胞、组织、组织切片、活检样品、来自细胞的核及其组合。
一方面，用固定剂固定细胞，所述固定剂选自下组：醇、Hepes-谷氨酸缓冲液介导的有机溶剂保护作用(HOPE)固定剂及其组合。
一方面，通过磁力或离心促进转染。
一方面，靶标捕获是通过杂交、连接、链转移直接或间接地介导或其组合介导。
一方面，来自被捕获的胞内靶标的核酸序列是通过逆转录、引物延伸、连接、扩增、标签化或其组合产生的。
一方面，其中胞内条码化靶标是用于单细胞表达谱分析、单细胞靶向测序、免疫组库分析和/或单细胞蛋白质分析。
一方面，公开了一种用于无隔室化胞内蛋白质条码化的方法，该方法包括提供条形码模板，提供蛋白质捕获部分，该捕获部分包括通过条形码模板捕获的捕获位点和对靶蛋白的捕获位点，提供细胞，将蛋白质捕获部分转染到细胞中，其中该细胞相对于另一细胞不是隔室化的，并且其中该蛋白质捕获部分被配置为当靶蛋白存在时与细胞内的靶蛋白结合，将条形码模板转染到细胞中，其中该细胞相对于另一细胞不是隔室化的，而其中当靶蛋白存在时，条形码模板与细胞内的蛋白捕获部分结合，在细胞内或细胞被裂解后生成一个或多个核酸序列，其来自条形码模板和结合的蛋白捕获部分，其中一个或多个核酸序列与细胞内来自条形码模板的相同的条形码序列或互补的条形码序列附接，并测序该核酸序列，基于共同的条形码序列和捕获部分衍生的序列的存在，基于每个细胞确定靶蛋白水平。在另一个方面，条形码模板是在多个条形码模板中；多个条形码模板相互之间是克隆的。
在一个方面，公开了一种无隔室化的细胞特异性胞内核酸条码化的方法，其包括(a)提供条形码模板，其中条形码模板包括细胞特异性锚，(b)提供细胞，将(a)的克隆条形码模板和(b)的细胞接触，并通过细胞特异性锚将条形码模板的克隆锚定到特定细胞类型，将克隆条形码模板转染到细胞中，其中细胞相对于其他细胞未隔室化，并且其中条形码模板与细胞内的核酸靶标杂交，在细胞内或细胞被裂解后生成一个或多个衍生自的条形码模板和杂交的核酸靶标的核酸序列，其中一个或多个核酸序列与细胞内条形码模板的相同条形码序列相附接，并对核酸序列进行测序，基于共同条形码序列的存在，基于每个细胞表征特定细胞的核酸靶标。在另一个方面，条形码模板是在多个条形码模板中；多个条形码模板相互之间是克隆的。
一方面，公开了一种用于早期疾病检测的方法，包括提供一种测试样本，其包括(a)细胞或细胞组分，(b)对细胞或细胞组分内的核酸进行条码化，以生成带细胞条形码标签的核酸序列；生成测序文库，其中该测序文库包括含有一个或多个致病变体的区域和使用(b)中的带条形码标签的核酸序列的细胞条形码标签，基于它们的细胞条形码序列对测序读数进行分组，基于每个细胞确定致病变体的存在，并计算测试样本中含有致病变体的细胞的数量。在另一个方面，条形码模板是在多个条形码模板中；多个条形码模板相互之间是克隆的。
附图简要说明
图1说明了生成表面有固定化的多聚-T加尾的寡核苷酸的微粒的聚合方法。
图2说明了生成有固定化的多聚-T加尾的寡核苷酸的微粒的聚合方法，所述寡核苷酸还包括独特分子标识符(UMI)序列。A)固定化的单链条形码模板的结构，包括3’端的多聚-T尾和UMI；B)在使用聚合方法生成A中所示的微粒之前，将UMI和多聚-T寡核苷酸杂交到克隆条码化微粒上。
图3说明了生成表面有固定化的多聚-T加尾的寡核苷酸的微粒的基于连接的方法。
图4说明了一种使用克隆条形码寡核苷酸包被的微粒直接在单细胞内捕获核酸的方法，随后进行胞外逆转录反应，以生成带有从被捕获的核酸靶标合成的互补DNA的条码化微粒。
图5说明了一种使用克隆条形码寡核苷酸包被的微粒直接在单细胞内捕获核酸的方法，随后进行胞内逆转录反应，以生成带有从被捕获的核酸靶标合成的互补DNA的条码化微粒。
图6说明了改善寡核苷酸包被的微粒转染到细胞中的效率的方法。(A)对于悬浮细胞(包括来自均质化的组织的细胞)，在加入寡核苷酸包被的微粒之前，通过离心使细胞松散地沉降到容器底部；(B)对于黏着细胞；借助离心力和/或磁力将寡核苷酸包被的微粒转染到细胞中。
图7说明了使用非固定化的克隆条形码寡核苷酸在单细胞内直接捕获核酸的方法。
图8说明了生成靶向捕获文库的方法，其用于使用细胞内被捕获的核酸对一个靶标或多个靶标进行基于单细胞的靶向基因表达分析和/或基因分型分析。
图9说明细胞内靶向测序可以显著改善体细胞突变的检测能力，具有细胞鉴定和独特分子鉴定的组合能力。
图10说明了使用细胞内捕获的核酸与模板转换反应的单细胞转录组应用。
图11说明了使用细胞内被捕获的mRNA直接在DNA/RNA杂交体上进行细胞内标签化的单细胞转录组应用。
图12是用TELL珠转染的HCT116细胞的图片。
图13是在2％的e-胶EX上跑样的PCR产物的图片泳道1和泳道5的产物是成功地在细胞内将GAPDH mRNA捕获到多聚-T延伸TELL珠上，并在原位逆转录生成第一链cDNA的结果。泳道3和泳道5是阳性对照，使用提取的mRNA而不是细胞作为反应输入物。泳道2、4、6和8为阴性对照，反应中没有逆转录酶。
具体实施方式
个体细胞是不同的。即使是同基因型的细胞群，也比我们以前认为的有很大的细胞间异质性。通过使用细胞群的平均分子或表型测量来代表个体细胞的行为，结论可能会被大多数细胞群的表达谱或过度表达的异常值所偏离；而且我们将没有鉴定来自个体细胞的所有独特模式的灵敏度，所述模式可能是细胞在给定的位置和时间的独特功能行为。研究单细胞提供了理解细胞间个体差异的新窗口。大规模的单细胞基因表达的研究有可能揭示罕见细胞群和谱系关系，但需要高效的细胞捕获和mRNA测序方法(Kawaguchi A等，2008；Shalek AK等，2013；Shapiro E等，2013；Treutlein B等，2014)。此外，由于来自正常细胞或组织的高背景野生型信号的存在，目前检测非常低频的体细胞突变的能力有限，这大大限制了早期肿瘤检测的能力。然而，随着鉴定每个单细胞能力的提高，我们将能够通过单细胞水平的基因分型将突变的肿瘤细胞与野生型细胞分开。这将完全消除正常细胞产生的野生型背景信号，使体细胞突变检测与种系突变检测一样容易。
两种常用的单细胞测序方法是基于平板的方案和基于微滴的方法。基于平板的方案在基因检测方面有更高的灵敏度，但为每个细胞文库构建成本高昂，非常耗时，而且很难将这个方法规模扩大到成千上万的细胞。基于微滴的方法在测序方面更有效率，通过为大量细胞建立一个条码化文库，以相对较低的成本并行地分析大量细胞。它需要将每个细胞分离到具有多个独特条形码的隔室中进行测序文库的生成，这通常需要一个专门设计的微流控装置(microfiuidic device)。
本发明提供了一种细胞内单细胞捕获方法，它可以直接捕获细胞内的核酸，而不需要任何额外的隔室来隔离每个细胞。在细胞内而不是在细胞外捕获mRNA，是一种更高效的捕获mRNA分子的方法，应该可以接近完全捕获mRNA。这将克服常规的单细胞捕获方法的低mRNA捕获效率和高遗漏率(drop-out rate)(Bagnoli等2018)。这种胞内核酸捕获反应极大地简化了单细胞表达分析、单细胞基因分型和测序分析的样品制备工作流程，并将为基于单细胞的研究提供一个更具成本效益的解决方案。
细胞内单细胞捕获方法是建立在几十年的原位杂交、活细胞成像研究和DNA转染技术的知识基础上。
用标记的线性寡核苷酸(ODN)探针在细胞中定位mRNA的方法很早以前就通过原位杂交得到证实(Bassell GJ等，1994)，其中细胞被固定和透化以提高探针的递送效率。此外，过去十年开发的活细胞成像技术表明，寡核苷酸探针可以与活细胞内的mRNA结合(KamY等，2012；Okabe K等，2011；RodrigoJP等，2005)。对于原位杂交和活细胞成像，寡核苷酸探针需要被递送进靶细胞。通常，转染是故意将裸核酸或纯化的核酸引入真核细胞的过程。将外来DNA引入真核细胞的方法有很多。有些依赖于物理处理(电穿孔、细胞挤压、纳米颗粒、磁转染)；其他则依赖于化学材料或作为运载体的生物颗粒(病毒)。在基于物理处理的递送机制中，有几种基于颗粒的方法，如基因枪、磁转染(Hughes C等，2001；Krotz F等，2003；Scherer F等，2002)、纳米纤维插入(impalefection)(McKnight TE等，2004)和颗粒轰击(Uchida M等，2009)等。磁转染，或称磁辅助转染，是一种利用磁力将DNA递送进靶细胞的转染方法。核酸首先与磁性纳米颗粒相关联。然后，磁力的应用驱动核酸颗粒复合物趋向并进入靶细胞，在那里释放载物。这种方法已经成功地证明，与核酸载物相关联的磁性颗粒在适当的条件下可以高效地进入细胞。
细胞内单细胞捕获方法是将条码化的模板(即作为细胞标识符的独特序列)克隆地转染到细胞内，并将条形码模板直接与细胞内的核酸靶标杂交。
本文所用的术语“条形码”是指5至100个核苷酸的核酸序列，并被用作标识符。
本文所用的术语“条形码模板”是指包括条形码和至少一个衔接子的核酸序列。该核酸序列可以是DNA、RNA或DNA/RNA混合物。
本文所用的术语“克隆条形码模板”是指具有相同条形码序列的多个条形码模板。它们可以以各种形式传递，包括在液滴中、在脂质体中、在微粒上、作为纳米球或其组合。
本文所用的术语“衔接子”是指可以包括以下一项或多项的核酸序列：引物结合序列、条形码、捕获序列、独特分子标识符(UMI)序列、亲和部分、限制性位点、配体、转座子或其组合。
本文所用的术语“微粒”是指尺寸小于1mm，最好在0.1μm和100μm之间的颗粒、球体或珠或任何其他形状的固体材料。
本文所用的术语“克隆”是指多个相同分子。
本文所用的术语“转染”是指将核酸材料运输到细胞中的方法。
本文所用术语“捕获”是指来自以下一种或多种的结合反应：杂交、连接、亲和部分结合、点击反应、交联、抗体与抗原结合、配体与受体结合，或其组合。
本文所用的术语“细胞内”是指细胞内部(inside a cell)或胞内(intracellular)。
本文所用的术语“转座酶”是指作为能够进行转座的功能性核酸蛋白质复合物的组分并介导转座的蛋白质，包括但不限于Tn、Mu、Ty和Tc转座酶。术语“转座酶”也指来自逆转录转座子(retrotransposon)或逆转录病毒来源的整合酶。它还指野生型蛋白、突变型蛋白和带标签的融合蛋白，如GST标签、His标签等及其组合。
本文所用的术语“转座体”是指由转座酶与转座子非共价结合形成的稳定的核酸和蛋白质复合物。它可以包括相同或不同的单体单元的多聚体单元。
本文所用的“链转移反应”是指核酸和转座体之间的反应，其中形成稳定的链转移复合物。
本文所用的“标签化反应”是指片段化反应，其中转座体通过链转移反应插入靶核酸并形成链转移复合物，然后链转移复合物在某些条件下被破坏，例如，蛋白酶处理、高温处理或蛋白质变性剂(如SDS溶液、盐酸胍、尿素等或其组合)，使靶核酸断裂成带有转座子末端附接的小片段。
制备具有捕获序列的克隆条码化的微粒
我们开发了一个制备克隆或半克隆条码化微粒的方法，如专利申请WO2017/151828所述，其通过引用全文纳入本文。在一些实施方式中，克隆条码化微粒是通过克隆扩增产生的。在一些实施方式中，克隆条码化微粒是通过在微粒表面直接合成产生的。在一些实施方式中，通过多轮基于连接的拆分与汇集(split and pool)方法产生克隆条码化微粒。
正如本文和所附权利要求中所使用的，在专利申请WO2017/151828中还描述了条形码模板和其上固定有克隆条形码模板或半克隆条形码模板的固体支持物，其通过引用全文纳入本文。在本发明中，固体支持物优选微粒或珠。
在一些实施方式中，所有的固体支持物都附接有条形码模板。在一些实施方式中，只有部分固体支持物附接有条形码模板。带有条形码的固体支持物的分数可以从1％到100％不等。
为了广泛地捕获核酸，可以在克隆条码化微粒上的条形码模板的3’端附接4-聚到20-聚的随机简并序列。
为了特异性地捕获mRNA的3’端，需要在克隆条码化微粒上的条形码模板的3’端添加含有15至40个脱氧胸腺嘧啶的多聚-T尾。在一些实施方案中，在多聚-T尾的3’端加入V(dATP、dCTP或dGTP)或VN(dATP、dCTP、dGTP或dTTP)核苷酸，以提高mRNA捕获效率。
在一个实施方式中，可以在条形码模板设计的3’和远端加入多聚-T序列，并用于克隆扩增，以产生克隆条码化微粒，所有条形码寡核苷酸上都有多聚-T尾。在另一个实施方式中，多聚-T序列可以在用带多聚-A加尾的引物克隆扩增时被纳入条形码模板。
在一些实施方式中，如专利申请WO2017/151828中所述，多聚＝T尾可以在克隆条码化微粒制备完成后再加入。图1说明了一种方法。简而言之，多聚-A加尾的寡核苷酸(103)与单链的(102)克隆条码化微粒(101)杂交。用一种能产生钝端双链DNA的聚合酶，填充反应(fill-in reaction)后将多聚-T序列添加到微粒(105)上的每个固定化的条形码模板上。在变性条件下，可以从微粒上去除多聚-A引物或链。在一些实施方式中，可作为每个条形码(202)模板的独特分子标识符的简并序列(203)是多聚-A加尾引物(204)的部分。使用与图1相同的杂交和聚合方法，可以用独特随机序列(UMI)和多聚-T尾延伸每个条形码模板(图2A)。
在一些实施方式中，可以使用基于连接的方法将多聚-T尾添加到克隆条码化模板上(图3)。这种方法的一个优点是，对多聚-T序列的任何修饰(如使用硫代磷酸酯保护多聚-T尾免受核酸酶的降解)都可以很容易地纳入含有多聚-T序列的连接接头(303)中。双链连接和单链连接都可用于此目的。
为了捕获靶特异性核酸，可以将靶特异性的引物或靶特异性引物池附接到克隆条码化微粒的3’端而不是如前所述的多聚-T尾，使用图1的杂交和填充法或图3的连接法。
使用条码化微粒进行细胞内核酸的捕获
在过去的十年中，已经开发了使用纳米磁性颗粒的核酸转染，并显示出高转染效率和低毒性。该方法通常被称为磁转染(Hughes C等，2001；Krotz F等，2003；Scherer F等，2002)。磁转染，或称磁辅助转染，是一种利用磁力提高DNA进入靶细胞的递送转染方法。核酸首先与磁性纳米颗粒相关联。然后，施加磁力驱动核酸颗粒复合物趋向并进入靶细胞，在那里释放载物。基于磁辅助颗粒转染比基于非磁性颗粒转染方法更流行，但是，研究表明，磁转染和用类似的非磁性载体进行基因递送之间可能没有根本机制性差异(de Bruin K等，2007；Huth S等，2004；Namgung R等，2010；Sauer AM等，2009)。聚乙烯亚胺(PEI)经常被用来在转染前将DNA和纳米颗粒包装在一起。带有PEI包被的纳米颗粒的DNA与细胞表面结合。包括纳米颗粒的PEI-DNA复合物通过内吞作用的自然摄取过程被内化到称为内体的胞内囊泡中。逃逸出内体对功能性核酸递送是必要的，因为否则载体会被细胞分解机制降解(Plank C等，1994)。PEI-DNA复合物被认为是由于所谓的质子海绵效应而逃逸(Boussif O等，1995)。
在本发明提供的细胞内捕获方法的一些实施方式中，使用基于颗粒的转染方法将条码化微粒递送进靶细胞(图4)。个体细胞(401)，例如来自组织培养的细胞或来自血液的淋巴细胞、来自均质化组织的细胞，被收集在试管或平板中。在有或没有磁力辅助的情况下，将条码化微粒(402)转染进靶细胞。微粒的大小可以为10nm-50μm，优选100nm-20μm。在一些实施方式中，将使用优化的微粒与细胞比例，以降低多个颗粒进入一个细胞的概率。在一些实施方式中，没有条形码模板的微粒与克隆条码化微粒混合，并作为间隔物使条码化微粒分开。在一些实施方式中，将使用大于1的条码化微粒与细胞的比例，以增加至少有一个条码化微粒的细胞的比例。该条件将在免疫组库测序中有效发挥作用，以收集来自B细胞的抗体的配对的重链和轻链信息，或收集来自T细胞的TCR的配对的α和β链信息。当每个细胞水平的定量信息不是很关键时，它也用于检测遗传变异和靶向测序应用。为了鉴定不同条形码的细胞来源，可以基于它们共享的核酸序列开发额外的计算方法。当条码化微粒进入靶细胞时，一段时间的孵化后，微粒上的条码化捕获序列将通过杂交或连接在细胞中捕获mRNA或核酸靶标。对于留在细胞外的条码化微粒，加入单链DNA特异性核酸酶将降解微粒表面的寡核苷酸(403)。用蛋白酶K、SDS、高盐处理或这些的组合破碎细胞。将与靶细胞中被捕获的mRNA或靶核酸结合的释放的微粒(404)从细胞碎片中分离出来。当分离的微粒与逆转录酶孵化时，可以通过逆转录在条码化微粒上合成被捕获的核酸的cDNA(405)。
在一些实施方式中，可以在细胞内捕获反应后立即在细胞内进行逆转录(图5)。逆转录酶(503)可以与条码化微粒(502)同时或在转染条形码微粒之前引入。可以用去污剂(如Triton X-100)处理细胞，使其变得更可渗透。逆转录酶将穿透细胞膜进入细胞。微粒上的条码化捕获序列通过杂交捕获细胞中的mRNA或核酸靶标后，将在细胞内通过逆转录反应产生第一链cDNA。胞外的微粒(504)将被清洗，以去除表面的单链寡核苷酸，避免对下游过程的干扰。然后裂解细胞，释放出有核酸被捕获和准备好的第一链cDNA(505)的条码化微粒。
在一些实施方式中，可以加入转座体(如Mu或Tn5)对细胞内或细胞外的RNA/DNA杂交体进行链转移反应或标签化反应。这将通过跳过第二链cDNA的合成来简化下游工作流程。
高效地将条码化微粒转染到细胞中是很重要的。离心和磁力都可以用来提高转染效率(图6)。组织将被均质化为悬浮细胞。在加入条码化珠(602)之前或同时，悬浮细胞(601)将被松散地收集在离心管的底部(图6A)。如果条码化微粒是磁性的，进一步离心和/或施加磁力将促进微粒转染到细胞中。对于黏着细胞，可以直接在细胞层的顶部添加条码化微粒(图6B)。额外的离心和/或磁力将有助于将微粒递送入细胞。
使用非固定化克隆条形码进行细胞内核酸捕获
微粒表面的克隆固定化条形码模板由于运动受限，在细胞内捕获核酸靶标的效率可能很低。在一个实施方式中是将克隆条码化微粒个体地包裹在脂质体中。在一个实施方式中，固定化的条形码模板可以从微粒中酶促释放。在另一个实施方式中，微粒可以被溶解并释放条形码模板。例如，基于水凝胶的微粒可以在升高的温度下被溶解。在一些实施方式中，条形码模板包括生物素标记，需要时可用于被链霉亲和素珠捕获。含有释放的克隆条码化模板(702)的脂质体被转染到感兴趣的细胞中(图7，701)。条码化模板将从细胞内的脂质体中进一步释放，并与一种或多种它的核酸靶标杂交。在一些实施方式中，逆转录酶也被递送入细胞。使用条码化模板上的捕获序列作为引物的第一链cDNA合成，将条形码序列附接在新合成的cDNA上。当细胞被裂解时，这些带条形码标签的cDNA(703)可以被链霉亲和素珠(704)捕获，用于进一步的下游处理。
还有其他方法可以生成非固定化的克隆条形码模板。在一个实施方式中，直接合成的条形码模板被克隆包装到脂质体或油包水乳化液滴中。在一些实施方式中，条形码模板在油包水乳化液滴中克隆扩增。在一些实施方式中，条形码模板在脂质体中克隆扩增。
脂质体是含有模仿细胞膜的脂质膜的囊泡，有各种尺寸。小单层脂质体(SUV)的直径为20-100nm，大单层脂质体囊泡(LUV)的直径为100-1000nm，巨型单层脂质体囊泡(GUV)的直径大小为1-200um(Laouini等2012)。在一些实施方式中，GUV或LUV被用来封装独特的条形码模板和引物，至少一组引物包含多个UMI序列，以及其他必要的寡核苷酸扩增试剂。脂质体中的克隆扩增将产生多个附接UMI序列的条形码模板，所有的条形码模板共享相同的条形码序列。LUV或SUV可以用来封装逆转录酶和其他必要的试剂，用于mRNA的第一链合成。
克隆可扩增的GUV可以使用水性溶液中的Paper-Abetted亲水脂分子水合作用(Paper-Abetted amPhiphile hYdRation in aqUeous Solutions)(PAPYRUS)方法制备(Pazzi和Subramaniam 2018)。在这种情况下，水性溶液将条码化在PCR缓冲液中的模板、引物和DNA聚合酶。GUV的大小可以为直径1μm＝10μm。这种方法易于扩展，因此在一个反应中可以生成数百万个GUV。一旦生成了GUV，20-30个循环的PCR扩增应该能够生成克隆扩增的条形码模板。扩增周期应最大化，以确保GUV的最佳扩增，但也要限制，以减少GUV脂质体的破裂。在一些实施方式中，将SYBR绿添加到PCR扩增混合物中，以通过显微镜或FACS确定扩增的脂质体的数量。FACS分选可以通过大小和整体荧光来纯化扩增的GUV。
脂质体通过两种主要机制整合到细胞中，即内吞作用或细胞膜融合(Braun等2016)。前者需要内体的溶酶体降解，可能需要更多的时间在细胞内高效递送条形码荷载物(Parker等2003)。在一些实施方式中，在脂质体生成阶段加入可光转换脂质(photoswitchable lipid)，以绕过内体的溶酶体降解(Miranda和Lovell 2016)。然后可以将高功率的波长施加于细胞，以破坏脂质体膜的稳定性，从而将条形码荷载物释放到细胞质中。在一些实施方式中，可以应用电融合方法来提高细胞-膜融合相对于内吞作用的速率(Raz-Ben Aroush等2015，Pereno等2017)。
逆转录可以以许多方式发生。在一些实施方式中，封装逆转录酶的LUV或SUV可以与含有克隆扩增的条形码模板的GUV共同转染到细胞中。在一些实施方式中，封装逆转录酶的LUV或SUV和含有克隆扩增的条形码模板的GUV可以在细胞递送前融合在一起，从而使一个内体被整合到细胞中，而不是多个。在一些实施方式中，细胞可以被固定和透化，以允许直接摄入逆转录酶而不需要脂质体的递送。在一些实施方式中，捕获的RNA分子的逆转录可以在细胞裂解后进行。
在一些实施方式中，通过在脂质膜上添加抗体部分，脂质体被用于靶向特定细胞类型。已经创建了靶向特定细胞类型用于药物递送用途的免疫脂质体(Eloy等2017)。这些基团改变了脂质膜的组成，使硫醇化抗体与脂质体表面的马来酰亚胺基团共价结合(Eloy等2017)。这种免疫脂质体方法应用于单细胞RNA-seq的应用，提供了新的和高效的方法来跟踪对免疫疗法治疗反应的T细胞状态。
在一些实施方式中，脂质体可以与细胞衍生的外泌体融合，以增加脂质体载物的细胞类型递送的选择性。外泌体是细胞衍生的、自然分泌的膜外囊泡。它们保留了它们的膜蛋白质组分，用来与其他靶细胞沟通(Antimisiaris等，2018)。通过将脂质体与细胞衍生的外泌体融合，实现更高的细胞融合率(Sato等，2016)。在某些情况下，细胞来源的外泌体可以来自T细胞或B细胞，并使用金标准的超速离心法纯化(Lu等，2018)。最终，外泌体融合的脂质体将有助于将克隆扩增的条形码递送给靶细胞以进行核酸捕获。
在一些实施方式中，条形码模板被直接设计成和克隆扩增为DNA纳米球而无任何固体支持物。这些DNA纳米球被转染到细胞中以捕获靶核酸。在一些实施方式中，在转染之前，可以将条码化DNA纳米球包裹在脂质体或油包水乳化液滴中，纳米球结构首先溶解在脂质体或液滴中。
在一些实施方式中，细胞内条码化和捕获方法可以被修改为专门捕获细胞核或线粒体的DNA。细胞用醇基固定剂或Hepes-谷氨酸缓冲液介导的有机溶剂保护作用(HOPE)固定剂处理，以释放细胞内的DNA，以被条形码模板捕获。这个固定步骤可以在将克隆条形码模板转染到细胞中之前或之后进行。在一些实施方式中，加入转座体，并在细胞固定后但在转染克隆条形码模板前进行链转移反应。在一些实施方式中，链转移反应可以在细胞固定和将克隆条形码模板转染进细胞后进行。
细胞内捕获的核酸的应用
本发明的细胞内捕获的核酸可用于多种下游应用。值得注意的是，它将成为全转录组分析、靶向基因表达谱分析和靶向基因分型的方便的新工具。细胞内捕获将为低频等位基因的检测提供无可比拟的灵敏度，例如，在检测癌症早期阶段的情况下。通过提供抗体的重链和轻链或TCR的α链和β链的配对信息，其也将是有价值的免疫组库概况分析方法。
在一个实施方式中，第一链cDNA合成后，细胞内捕获的条码化核酸将使用模板转换方法或用第二链cDNA合成试剂盒进行第二链cDNA合成，在进一步使用前生成条码化双链cDNA。
在一个实施方式中，带有靶特异性引物或靶特异性引物池的条码化微粒被用于一种或多种特定核酸靶标的细胞内捕获。在细胞内或细胞裂解后完成逆转录反应之后，细胞裂解后收集带有第一链cDNA的条码化微粒(图8，801)。核酸靶标的原始拷贝通过变性去除，带有单链cDNA拷贝的条码化微粒可以用靶特异性引物或引物池(802)进一步引发，以产生双链可扩增模板用于下游应用，例如，PCR检测和/或测序文库构建。
在一个实施方式中，带有第一组靶特异性引物的条码化微粒被用于细胞内捕获一种或多种特定核酸靶标。在无隔室化的情况下，将克隆条形码模板和第一组靶特异性引物转染进细胞中。在细胞内或在细胞裂解后进行逆转录反应，收集带有靶向第一链cDNA的克隆条码化模板，并用第二组靶特异性引物进一步引发第一链cDNA，生成双链DNA并用转座体(如Mu和Tn5)标签化。标签化的双链cDNA片段可用于下游应用，如PCR检测和/或测序文库构建。
在一个实施方式中，带有一组靶特异性引物的条码化微粒被用于细胞内捕获一种或多种特定核酸靶标。在无隔室化的情况下，将克隆条形码模板和靶特异性引物转染进细胞中。在细胞内或细胞裂解后进行逆转录反应，收集带有靶向第一链cDNA的克隆条码化模板。RNA/DNA杂交体双链分子可以用转座体(如Mu和Tn5)标签化。标签化的RNA/DNA杂交体双链片段可用于下游应用，如PCR检测和/或测序。
本发明所述的细胞内捕获方法将使条码化每个单细胞在操作和经济上都可行。由于能够对所有细胞或大多数细胞进行独特条形码标记，我们可以在单细胞水平上检测任何突变，这将有效地消除来自周围细胞的背景噪音。这将解决检测极低频率体细胞突变的灵敏度问题，而这正是早期癌症检测所需要的。图9说明了在单细胞水平上基因分型的能力。有细胞含有突变的等位基因A(901)，但在同一个样品中，有许多野生型细胞含有正常的等位基因T(902)。在用细胞独特条形码、分子独特UMI和测序进行细胞内捕获后，我们可以基于它们的细胞ID对测序读数进行分组。对于每个细胞，我们可以基于UMI鉴定测序错误，并轻松地进行正确的变体识别。这种方法可以应用于循环肿瘤细胞、组织活检样本或组织切片。
当应用于B细胞和T细胞样本时，细胞内靶向捕获可用于鉴定抗体重链和轻链配对，T细胞α和β链配对，以及的整体的免疫组库概况分析。
当多聚T-加尾引物和/或随机引物用作细胞内捕获的条形码模板上的捕获序列时，细胞内捕获也可用于单细胞转录组概况分析。一个实施方式是使用条码化微粒在细胞内捕获信使RNA，在细胞内或外合成第一链cDNA，并在细胞内或外进行模板转换反应，以进行整体转录组分析(图10)。另一个实施方式是使用条码化微粒在细胞内捕获信使RNA，在细胞内或外逆转录该mRNA，并在细胞内或外使用转座体(如MuA或Tn5)标签化该RNAJDNA杂交体双链片段，以进行整体转录组分析(图11)。
蛋白质的细胞内条码化捕获
在一个实施方式中，蛋白质捕获部分被附接到具有独特条形码序列的第一条码化模板。许多不同的蛋白质捕获部分与条形码模板附接，每个都有不同的第一条形码序列。蛋白质捕获部分可以是抗体、抗体衍生物、亲和体、纳米抗体、适配体或蛋白质配体。将一个或多个不同的蛋白质捕获部分运至细胞中。在无隔室化的情况下，将多个第二克隆条形码模板转染到细胞中，其中第二条形码模板可与蛋白质捕获部分上的第一条形码模板杂交，捕获细胞内的内源性蛋白质。破碎细胞，释放附接到内源蛋白质上的条形码。测序第一和第二条形码模板。基于条形码的定量和特性，我们可以基于每个细胞(第二条形码)测量内源性蛋白质(第一条形码)的水平。
在一些实施方式中，其他分子(如化学化合物)也可以成为细胞内捕获的靶标，当第一条码化序列附接到这些分子上时。
在一些实施方式中，在捕获内源性蛋白质靶标的同时，第二克隆条形码模板可用于捕获细胞内的核酸靶标。
尽管本发明已经就实施方式进行了解释，但应该理解，在不背离本文所述的本发明的精神和范围的情况下，可以进行许多其他可能的修改和变化。
此外，一般来说就本文所描述的过程、系统、方法等而言，应当理解，尽管此类过程等的步骤被描述为按照一定的顺序发生，但此类过程可以按照本文所描述的顺序以外的顺序来实施所述步骤。还应理解的是，某些步骤可以同时进行，可以增加其他步骤，或者可以省略此处描述的某些步骤。换言之，本文对过程的描述是为了说明某些实施方式而提供的，而不应该被解释为限制所要求保护的发明。
此外，应理解，上述描述的目的是说明性的，而不是限制性的。除所提供的实施例外，对于本领域的技术人员来说，许多实施方式和应用在阅读上述描述后将是显而易见的。在确定本发明的范围时，不应参照上述描述，而应参照所附的权利要求，以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围。在本文所讨论的技术中将会出现未来的发展，预期所公开的系统和方法将被纳入这种未来的实施方式中。总之，应理解，本发明是能够修改和变化的，并且只受以下权利要求的限制。
最后，本申请中使用的所有定义的术语旨在给予其与本文提供的定义一致的最广泛的合理解释。权利要求书中使用的所有未定义的术语，除非本文中有明确的相反指示，将按照本领域技术人员理解的普通含义给予其最广泛的合理解释。具体来说，单数冠词例如“一个”、“一种”、“所述”等应被理解为叙述一个或多个所述要素，除非权利要求明确表明相反的限制。
实施例
实施例1
多聚-T延伸克隆条码化珠的制备
TELL珠，3μm克隆条码化珠，来自TELL-Seq WGS文库制备试剂盒(TELL-Seq WGSLibrary PrepKit)(UST公司(UST Corporation)，PN#100000)。3’端多聚-T延伸TELL珠是用Pfu DNA聚合酶和多聚A-UMI(独特分子标识符)寡核苷酸A22-tUMI10
(5′-NBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAABNNNNNNNNNGTGACCTGTCCCAGCGTCTCCAC-3’)制备的，用于TELL珠的引物延伸，如下所述(图1)。
制备了8个50μL的反应，包括1x Pfu缓冲液、1mM dNTP、2.5mM MgCl2、0.5μM A22-tUMI10、2000万TELL珠和0.06U/μL Pfu聚合酶。使用以下PCR程序：95℃持续1分钟，然后95℃持续10秒、62℃持续45秒、72℃持续45秒进行10个循环，然后72℃持续3分钟。PCR之后，合并所有珠，用珠洗涤缓冲液(10mM Tris HCl，0.1mM EDTA，0.1％吐温，pH 8)洗涤三次。然后将通过将珠重新悬浮在500μL新鲜稀释的0.2N NaOH中并孵育5分钟剥离珠。然后用0.2NNaOH洗涤珠三次，以去除所有剥离的寡核苷酸，再用珠洗涤缓冲液洗涤三次，以去除所有NaOH的痕量。将珠重新悬浮在珠洗涤缓冲液中，浓度为500,000珠/μL。
实施例2
将条码化珠转染进细胞用于细胞内捕获
用添加了10％FBS(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，PN#26140-079)、1x青霉素/链霉素(赛默飞世尔科技公司，PN#15140-122)、1xGlutamax(赛默飞世尔科技公司，PN#35050-061)和0.05mM2-巯基乙醇(赛默飞世尔科技公司，PN#21985-023)的DMEM培养基(赛默飞世尔科技公司，PN#11965-092)培养和维持HCT116细胞。对于RNA提取，当细胞达到～75％汇合度时(约1百万个细胞)，裂解细胞并使用凯杰公司(Qiagen)的RNeasy试剂盒(凯杰公司，PN#74104)纯化RNA。遵循制造商的方案，进行柱上DNA酶处理(凯杰公司，PN#79254)和RNA纯化步骤(需要额外的DNA酶处理)。使用宽范围Qubit检测(BroadRange Qubit assay)(赛默飞世尔科技公司，PN#Q10210)对RNA进行定量。
一旦HCT116细胞达到约80-90％汇合度(约1-1.5M个细胞)，就用多聚-T延伸TELL珠转染细胞。为了制备用于转染的珠，向四份1.5mL蛋白质低结合微量离心管中各加入500μL无FBS的完全DMEM培养基。在含有DMEM培养基的每个试管中加入2μL先前制备的10ng/μL(w/v)PEI储液。在每个试管中加入3μL 500,000/μL的多聚-T延伸TELL珠，并立即以最大速度涡旋一秒钟。将珠在DMEM-PEI溶液中在室温下孵育30分钟。去除细胞上的培养基，用PBS洗涤细胞两次，以去除任何残留的FBS。合并四个试管中带有PEI包被的珠，然后加入到细胞中。将细胞板放在OzBioscience平板磁体(OzBiosciences PN#MF10000)上，然后置于37℃的5％CO2培养箱中3分钟。移除磁体，并将细胞留在培养箱中1小时。孵化后，去除培养基，用PBS清洗细胞1次。向细胞中加入200μL 0.125％胰蛋白酶，并置于培养箱3分钟。然后加入含有10％FBS的800μL DMEM培养基并通过吹打10次混合细胞。细胞被转移到1.5mL蛋白低结合的微量离心管中。使用OzBioscience磁体，将细胞置于靠磁体的边缘2分钟。转染的细胞附接在微量离心管壁上，而未转染的细胞则留在溶液中。移除阴性细胞并置于新的微量离心管中。将阳性细胞和非转染珠通过重悬于1mL低渗重悬缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.4，10mM NaCl，3mM MgCl2)中再纯化两次，同时从溶液中去除阴性细胞。最后重悬在体积为25μL的重悬缓冲液中。然后用血细胞计数器对阳性细胞和阴性细胞进行计数。平均而言，40％的细胞被一颗珠转染。在转染过程中加入更多的珠后，观察到转染率高达75％。对于有珠转染的细胞，在图12A中，有些细胞只含有一个(1201，1202和1203)或两个3μmTELL珠(1204)；在图12B中，其他细胞含有超过两个TELL珠(1205和1206)。
实施例3
在珠转染的活细胞中原位逆转录
Superscript IV第一链合成系统试剂盒(Superscript IV First-StrandSynthesis System kit)(赛默飞世尔科技公司，PN#18091050)，对活细胞进行逆转录(RT)。使用实施例2中大约150,000个珠转染的细胞作为输入，执行制造商推荐的方案。500,000个多聚-T延伸TELL珠与500ng总RNA被用作阳性对照，无逆转录酶作为阴性对照。没有进行制造商方案中描述的最终RNA酶H处理。逆转录后，将200μL重悬缓冲液加入到RT混合物中，并通过在磁体上捕捉珠/细胞2分钟，进行纯化。去除溶液，只有细胞/珠被留下并附接在试管的一侧。共进行了三次洗涤，最后的珠/细胞被重悬在25μL重悬缓冲液中。为了确认逆转录反应，使用1x Phusion、1μL逆转录产物和TELL珠特异性引物，P7UP(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCAGAGCCTCTCTATGGGCAG-3’)与GAPDH-特异性引物，GAPDH Fwd1引物(5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’)，其距离GAPDH mRNA的多聚-A尾约400bp，进行PCR反应。当GAPDHmRNA被多聚-T延伸TELL珠捕获，并使用珠上的多聚-T序列作为RT引物进行逆转录以产生第一链cDNA时，该PCR应该能够扩增出～530bp的产物(图13泳道1和泳道3)。图13中的泳道3是mRNA的捕获和珠上的RT反应的阳性对照。图1中的泳道1是成功地在细胞内将GAPDH mRNA捕获到多聚-T延伸TELL珠上，并在原位逆转录生成第一链GAPDH cDNA的结果。此外，还使用了另一个GAPDH-特异性引物，GAPDH-Fwd2(5’＝GAGCCGCACCTTGTCATGTAC-3’)引物，它与多聚-A尾的GAPDH mRNA相距50bp。当GAPDH mRNA被多聚-T延伸TELL珠捕获，并使用珠上的多聚-T序列作为RT引物进行逆转录以产生第一链cDNA时，该PCR产物应该为～180bp(图13泳道5和泳道8)。相似地，图13中的泳道7是mRNA的捕获和珠上的RT反应的阳性对照。图1中的泳道5是成功地在细胞内将GAPDH mRNA捕获到多聚-T延伸TELL珠上，并在原位逆转录生成第一链GAPDH cDNA的结果。PCR循环条件包括98℃ 1分钟，然后是98℃持续15秒、60℃持续15秒、72℃持续15秒的24-28个循环，然后是72℃持续2分钟的一个循环。PCR产物在琼脂糖凝胶上出现涂抹状条带是由于在GAPDH mRNA的多聚-A尾的不同位置开始逆转录。
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Claims (33)

1.一种用于无隔室化胞内条码化靶标的方法，其包括：
a.提供条形码模板；
b.提供细胞；
c.将所述条形码模板转染到所述细胞内；其中当所述细胞在多个其他细胞之间时，所述细胞没有通过分区与所述其他细胞分隔开，且其中所述条形码模板在所述细胞内捕获胞内靶标；
d.在所述细胞内生成衍生自所述被捕获的胞内靶标或在所述细胞被裂解后衍生自所述被捕获的胞内靶标的核酸序列，且其中所述核酸序列被附接到来自所述条形码模板的条形码序列或互补序列；以及
e.基于相附接的所述条形码序列的存在，鉴定所述来自所述细胞的核酸序列和/或其互补序列；且其中另一个具有所述相同条形码序列的核酸序列与同一细胞相关。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述条形码模板是在多个条形码模板之间，且它们被固定在微粒上；其中所述微粒尺寸在约100nm至约100μm之间；且其中所述多个条形码模板彼此是克隆的。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述微粒大小为1μm至20μm。
4.如权利要求2所述的方法，其中，所述微粒是磁性的或可降解的。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述微粒在多个微粒中；其中多个微粒中的一个群体是非条码化的，多个微粒中的另一个群体包括条形码模板；其中所述两个群体是混合的；以及其中具有条形码模板的微粒群体中的所述条形码模板相对于每个微粒来说是克隆的。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述条形码模板是非固定化的。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述非固定化的条形码模板被封装在脂质体或液滴中；其中在每个脂质体或每个液滴中，条形码模板相对于所述脂质体或所述液滴中的另一个条码模板而言是克隆的。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述条形码模板的克隆包括所述条形码模板的约10个或更多的拷贝。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述条形码模板的克隆包括约10,000个或更多的拷贝。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述条形码模板的克隆包括约10,000,000个或更多的拷贝。
11.如权利要求1所述的方法，其中在微粒上或在脂质体或液滴内，所述条形码模板相对于条形码模板群体中的另一个条形码模板是克隆的；并且其中在所述微粒上或在所述脂质体或所述液滴内存在超过一个条形码模板群体。
12.如权利要求1所述的方法，其中在微粒上或在脂质体或液滴内，存在超过一个条形码模板群体，其中所述条形码模板的第一群体相对于多个条形码模板中的另一个条形码模板的第一群体是克隆的；而所述条形码模板的第二群体相对于多个条形码模板中的另一个条形码模板的第二群体是相同的。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述条形码模板在多个条形码模板之间，而所述细胞在多个细胞中；其中所述条形码模板与细胞的比例是这样的：当所述条形码模板被转染到所述细胞中时，少于约30％的所述转染细胞包含超过一个条形码模板克隆群体，而超过约70％的所述转染细胞包括一个或更少的条形码模板克隆群体。
14.如权利要求1所述的方法，其中当所述条形码模板被转染进所述细胞时，少于约20％的所述转染细胞包含超过一个条形码模板克隆群体，而超过约80％的所述转染细胞包含一个或更少的条形码模板克隆群体。
15.如权利要求1所述的方法，其中当所述条形码模板被转染进所述细胞时，少于约10％的所述转染细胞包含超过一个条形码模板克隆群体，而超过约90％的所述转染细胞包含一个或更少的条形码模板克隆群体。
16.如权利要求1所述的方法，其中在所述细胞内，多个条形码模板的超过一个群体是在所述细胞内的；并且其中每个条形码模板群体内的所述条形码模板是克隆的。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述条形码模板包含条形码序列，以及至少一个衔接子，其能够引发、杂交、扩增、链转移或其组合。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述条形码模板的一个克隆包括UMI序列。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述衔接子选自下组：多聚-T序列、靶特异性序列、不同靶特异性序列池、随机简并序列，及其组合。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述胞内靶标选自下组：RNA、DNA、寡核苷酸、寡核苷酸标记的蛋白质、寡核苷酸标记的化合物及其组合。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述胞内靶标作为胞外成分通过所述细胞的特异性识别进入所述细胞。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞选自下组：培养的细胞、血液细胞、组织、组织切片、活检样品、来自所述细胞的核及其组合。
23.如权利要求1所述的方法，其中用固定剂固定所述细胞，所述固定剂选自下组：醇、Hepes-谷氨酸缓冲液介导的有机溶剂保护作用(HOPE)固定剂及其组合。
24.如权利要求1所述方法，其中通过磁力或离心促进所述转染。
25.如权利要求1所述的方法，其中所述靶标捕获是通过杂交、连接、链转移直接或间接地介导或其组合介导。
26.如权利要求1所述方法，其中来自所述被捕获的胞内靶标的核酸序列是通过逆转录、引物延伸、连接、扩增、标签化或其组合产生的。
27.如权利要求1所述方法，其中所述胞内条码化靶标是用于单细胞表达谱分析、单细胞靶向测序、免疫组库分析和/或单细胞蛋白质分析。
28.一种用于胞内无隔室化的蛋白质条码化的方法，其包括：
a.提供条形码模板；
b.提供蛋白质捕获部分，其包括通过所述条形码模板捕获的捕获位点和对靶蛋白的捕获位点；
c.提供细胞；
d.将所述蛋白质捕获部分转染进所述细胞，其中所述细胞相对于其他细胞不是隔室化的，且其中所述蛋白质捕获部分被配置为当所述靶蛋白存在时，结合所述细胞内的所述靶蛋白；
e.将所述条形码模板转染进所述细胞，其中所述细胞相对于其他细胞不是隔室化的，并且当所述靶蛋白存在时，其中所述条形码模板结合所述细胞内的所述蛋白质捕获部分；
f.在所述细胞内或细胞裂解后，产生来自所述条形码模板和所述结合的蛋白质捕获部分的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列与所述细胞内来自所述条形码模板的相同条形码序列或互补的条形码序列相附接；以及
g.测序所述核酸序列，以基于共同的条形码序列和捕获部分衍生的序列的存在基于每个细胞确定靶蛋白水平。
29.如权利要求28所述的方法，其中当所述条形码模板是在多个条形码模板中时，所述多个条形码模板相互之间是克隆的。
30.一种用于无隔室化的细胞特异性胞内核酸条码化的方法，其包括：
a.提供条形码模板，其中所述条形码模板包括细胞特异性锚；
b.提供细胞；
c.将(a)的所述克隆的条形码模板和(b)的所述细胞接触，并通过所述细胞特异性锚将所述条形码模板的克隆锚定到特定细胞类型；
d.将所述克隆的条形码模板转染进所述细胞，其中所述细胞相对于其他细胞不是隔室化的，且其中所述条形码模板杂交所述细胞内的核酸靶标；
e.在所述细胞内或细胞裂解后，生成来自所述条形码模板和所述杂交的核酸靶标的一个或多个核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列与所述细胞内来自所述条形码模板的相同条形码序列相附接；以及
f.测序所述核酸序列，以基于共同条形码序列的存在并基于每个细胞表征所述特定细胞内的所述核酸靶标。
31.如权利要求30所述的方法，其中当所述条形码模板是在多个条形码模板中时，所述多个条形码模板相互之间是克隆的。
32.一种用于早期疾病检测的方法，其包括：
a.提供包括细胞或细胞组分的测试样本；
b.将所述细胞内或细胞组分内的核酸条码化，以生成带细胞条形码标签的核酸序列；
c.生成测序文库，其中所述测序文库包括含有一个或多个致病变体的区域和使用(b)中所述带条形码标签的核酸序列的细胞条形码标签；
d.基于细胞条形码序列将测序读数分组并基于每个细胞确定所述致病变体的存在；和
e.计数所述测试样本中含有致病变体的细胞数目。
33.如权利要求32所述的方法，其中当所述条形码模板是在多个条形码模板中时，所述多个条形码模板相互之间是克隆的。
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