CN117980071A - 用于纯化和裂解生物颗粒的方法、装置和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于裂解和/或纯化生物颗粒例如细胞核的装置、试剂盒及其使用方法。可以在容器中采用一个或多个触变层来纯化生物颗粒。可以采用具有尖锐特征的装置来裂解生物颗粒或其内容物。

Description

用于纯化和裂解生物颗粒的方法、装置和试剂盒

背景技术

许多生物医学应用依赖于对与液滴或颗粒中的一种或多种试剂结合的样品进行高通量测定。例如，在研究和临床这两类应用中，使用目标特异性试剂的高通量基因检测能够在药物发现、生物标志物发现和临床诊断及其他过程中提供关于样品的信息。许多这些应用依赖于生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞核)的存在。然而，在液滴形成之前可能需要精确的样品制备。用于纯化生物颗粒的现有装置和方法可能干扰和改变其特征(例如，基因表达、激活或活力)。因此，用于温和且可靠地裂解和纯化生物颗粒的装置和方法将是有益的。

发明内容

在一个方面，本发明的特征在于一种纯化生物颗粒的方法。该方法包括提供容器，该容器包括入口；第一层，该第一层包含具有第一密度的第一液体；以及设置在第一层上方的触变层。该方法还包括向容器的入口提供包含生物颗粒的液体混合物，其中液体混合物的密度小于第一密度；以及对容器进行离心。触变层分离第一层和液体混合物，并在离心过程中允许生物颗粒传递到第一层。

在一些实施方案中，该方法还包括在离心后去除上清液。

在一些实施方案中，将容器插入外部容器中。

在一些实施方案中，容器包括出口。

在一些实施方案中，该方法还包括打开容器的顶端以形成出口。

在一些实施方案中，该方法还包括对容器进行离心，其中生物颗粒经由出口离开容器并被收集在外部容器中。

在一些实施方案中，第一层和/或液体混合物包含碘克沙醇。

在一些实施方案中，第一层包含约30％碘克沙醇。

在一些实施方案中，液体混合物包含约25％碘克沙醇。

在一些实施方案中，触变层包含聚合物凝胶。

在一些实施方案中，聚合物凝胶包含聚酯。

在一些实施方案中，生物颗粒是细胞或其微粒组分。

在一些实施方案中，生物颗粒是细胞器，例如细胞核。

在另一个方面，本发明的特征在于一种装置，该装置包括离心管，该离心管含有具有预先确定的密度的液体，该液体由组织培养基构成。例如，该装置可以包含具有组织培养基和浓度为约10％至约50％(例如，约15％至约45％、约20％至约35％、约22％至约32％或约24％至约30％)的碘克沙醇的液体。

离心管可以是例如微量离心管或PCR管，或被配置为装配在离心机内的任何其他合适的结构。

在一些实施方案中，该液体的密度为约1.11g/mL至约1.12g/mL(例如，约1.146g/mL至约1.175g/mL，例如约1.1107g/mL、1.117g/mL、1.127g/mL、1.136g/mL、1.146g/mL、1.156g/mL、1.165g/mL或1.175g/mL)。该液体可以含有碘克沙醇或用于产生与碘克沙醇相似的密度的类似组分，诸如ficoll、histopaque或蔗糖。

在另一个方面，本发明的特征在于一种通过提供包括离心管的装置来纯化生物颗粒的方法。该方法还包括向离心管提供包含生物颗粒的液体混合物并对离心管进行离心。在离心过程中，生物颗粒移动到离心管的底部。

在一个实施方案中，进行第一离心步骤，其中组织培养基的所有内容物被沉淀。在第一次离心之后，可以去除上清液，例如通过倾析或弃去。然后可以将细胞培养基添加到沉淀物中。当对该样品进行离心时，仅某些(例如，期望的)生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞核)被沉淀。

在另一个方面，本发明的特征在于一种试剂盒，该试剂盒包括外部容器和可移除插入件，该可移除插入件被配置为装配在该容器中。可移除插入件包括入口；第一层，该第一层包含具有第一密度的第一液体；以及设置在第一层上方的触变层。触变层被配置为分离第一层和稀释液，该稀释液的密度低于向插入件的入口提供的第一密度。

在一些实施方案中，可移除插入件包括出口。出口可以包括易断的或可移除的顶端。

在一些实施方案中，第一层包含碘克沙醇。

在一些实施方案中，第一层包含约30％碘克沙醇。

在一些实施方案中，试剂盒还包含稀释液。稀释液可包含约25％碘克沙醇。

在一些实施方案中，触变层包含聚合物凝胶。聚合物凝胶可以包含聚酯。

在一些实施方案中，试剂盒还包含细胞裂解缓冲液。细胞裂解缓冲液可以包含RNA酶抑制剂。细胞裂解缓冲液可以包含表面活性剂(例如，约0.01％至约1.0％的表面活性剂)。在一些实施方案中，细胞裂解缓冲液包含10mM Tris-HCl(pH 7.4)、10mM NaCl、3mMMgCl₂、0.01％ IGEPAL CA-630(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、0.2U/μl RNA酶抑制剂(例如，酶促RNA酶抑制剂，例如保护剂RNA酶)、0.1％ BSA、2mM精胺以及约0.01％至约1.0％的表面活性剂/去污剂(例如，TWEEN-20(聚山梨醇酯20)或IGEPAL CA-630(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)。例如，细胞裂解缓冲液可以包含10mM Tris-HCl(pH7.4)、10mM NaCl、3mM MgCl₂、0.01％ IGEPAL CA-630(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、0.2U/μl SUPERase In RNA酶抑制剂、0.1％ BSA、2mM精胺和0.1％TWEEN-20(聚山梨醇酯20)。在一些方面，裂解缓冲液包含裂解剂、还原剂和表面活性剂。

在一些实施方案中，试剂盒还包含等渗缓冲液。等渗缓冲液可以包含RNA酶抑制剂。等渗缓冲液可以包含表面活性剂(例如，约0.01％至约1.0％的表面活性剂)。等渗缓冲液可以包含20mM Tris-HCl(pH 7.4)、0.25M蔗糖、25mM KCl、5mM MgCl₂、0.01％ IGEPALCA-630、0.2U/μl SUPERase In RNA酶抑制剂、0.1％ BSA、2mM精胺和0.1％ TWEEN-20(聚山梨醇酯20)。在一些方面，本文所述的缓冲液中的一种或多种是等渗的。在一些方面，本文所述的缓冲液中的一种或多种不是等渗的。在一些方面，本文所述的缓冲液中的一种或多种不是高渗的。在一些方面，本文所述的缓冲液中的一种或多种不是低渗的。在一些方面，本文所述的裂解缓冲液是等渗缓冲液。在一些方面，本文所述的裂解缓冲液不是高渗缓冲液。在一些方面，本文所述的裂解缓冲液不是低渗缓冲液。在一些方面，本文所述的碎片去除缓冲液是等渗缓冲液。在一些方面，本文所述的碎片去除缓冲液不是高渗缓冲液。在一些方面，本文所述的碎片去除缓冲液不是低渗缓冲液。在一些方面，本文所述的洗涤和悬浮缓冲液是等渗缓冲液。在一些方面，本文所述的洗涤和悬浮缓冲液不是高渗缓冲液。在一些方面，本文所述的洗涤和悬浮缓冲液不是低渗缓冲液。

在一些实施方案中，试剂盒还包括帽，该帽被配置为密封可移除插入件的入口。

在另一个方面，本发明的特征在于一种用于裂解生物颗粒的装置，该装置包括流动路径，该流动路径具有入口；出口；以及设置在流动路径中的拐角半径小于约1mm的至少一个特征。

在一些实施方案中，流动路径包括多个特征，每个特征具有小于约1mm的拐角半径并且设置在流动路径中。

在一些实施方案中，这些特征中的至少两个特征被定位成对准并且位于流动路径的相对两侧上。

在一些实施方案中，多个特征以锯齿图案布置。

在一些实施方案中，该装置包括多个流动路径，每个流动路径具有入口；出口；以及设置在流动路径中的拐角半径小于约1mm的至少一个特征。

在一些实施方案中，多个流动路径基本上平行。

在一些实施方案中，该装置还包括过滤器，该过滤器定位在流动路径中的出口处或出口的上游，并且被配置为截留预先确定的尺寸的颗粒。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于一种试剂盒，该试剂盒包括容器和用于裂解生物颗粒的装置，该装置包括流动路径，该流动路径具有入口；出口；以及设置在流动路径中的拐角半径小于约1mm的至少一个特征。该装置被配置为装配在容器中。

在一些实施方案中，试剂盒还包括帽，该帽被配置为密封该装置的入口。

在一些实施方案中，流动路径包括多个特征，每个特征具有小于约1mm的拐角半径并且设置在流动路径中。

在一些实施方案中，这些特征中的至少两个特征被定位成对准并且位于流动路径的相对两侧上。

在一些实施方案中，多个特征以锯齿图案布置。

在一些实施方案中，该装置包括多个流动路径，每个流动路径具有入口；出口；以及设置在流动路径中的拐角半径小于约1mm的至少一个特征。

在一些实施方案中，多个流动路径基本上平行。

在一些实施方案中，试剂盒还包括过滤器，该过滤器定位在流动路径中的出口处或出口的上游，并且被配置为截留预先确定的尺寸的颗粒。

在另一个方面，本发明的特征在于一种用于裂解生物颗粒的方法。该方法包括提供一种装置，该装置包括具有入口和出口的流动路径，该流动路径具有至少一个特征，该至少一个特征具有小于约1mm的拐角半径并且设置在流动路径中。该方法还包括使包含生物颗粒的液体混合物流过流动路径。至少一个特征裂解生物颗粒，并且生物颗粒或其内容物的至少一部分经由出口离开流动路径。

在一些实施方案中，该方法还包括洗涤流动路径中的生物颗粒。

在一些实施方案中，该方法还包括提供与生物颗粒或其内容物的至少一部分结合的磁性颗粒。

在另一个方面，本发明的特征在于一种用于裂解生物颗粒的方法。该方法包括提供容器和装置，该装置包括具有入口和出口的流动路径，该流动路径包括至少一个特征，该至少一个特征具有小于约1mm的拐角半径并且设置在流动路径中，其中该装置定位在该容器中。该方法还包括向该装置的入口提供包含生物颗粒的液体混合物，以及对该容器中的该装置进行离心。在离心时，至少一个特征裂解生物颗粒，并且生物颗粒或其内容物的至少一部分经由出口离开流动路径并被收集在容器中。

在另一个方面，本发明的特征在于一种试剂盒，该试剂盒包括容器和装置，该装置被配置为装配在该容器中。该装置包括入口；出口；以及过滤器，该过滤器定位在该装置中的出口处或出口的上游，并且被配置为截留预先确定的尺寸的颗粒。

在一些实施方案中，该装置还包括层，该层包括具有至少一个特征的流动路径，该至少一个特征具有小于约1mm的拐角半径并且设置在流动路径中。该层设置在出口处或出口的上游(例如，过滤器的上游或下游)。

在一些实施方案中，该层包括多个流动路径，该层中的每个流动路径具有入口；出口；以及设置在流动路径中的拐角半径小于约1mm的至少一个特征。

在一些实施方案中，该层中的多个流动路径基本上平行。

在一些实施方案中，该容器包含密度大于1.0g/m的介质。

在另一个方面，本发明的特征在于一种用于使用如本文所述的试剂盒纯化生物颗粒的第二子组的方法。该方法包括提供试剂盒；向该装置的入口提供具有生物颗粒的液体混合物；以及对该容器中的该装置进行离心。生物颗粒的第一子组被过滤器截留，并且生物颗粒的第二子组离开出口并被收集在该容器中。

在一些实施方案中，该容器包含密度大于1.0g/m的介质，并且生物颗粒的第二子组位于该介质中，例如在离心期间沉淀。

在另一个方面，本发明的特征在于一种用于使用如本文所述的试剂盒裂解生物颗粒的方法，该试剂盒包括装置(例如，具有带有流动路径的层，该流动路径具有设置在流动路径中的拐角半径小于约1mm的至少一个特征)和用于容纳该装置的容器。该方法包括提供试剂盒；向该装置的入口提供具有生物颗粒的液体混合物；以及对该容器中的该装置进行离心。至少一个特征裂解生物颗粒，并且生物颗粒的内容物的至少一部分经由出口离开流动路径并被收集在容器中。

在另一个方面，本发明的特征在于一种用于裂解生物颗粒的试剂盒。该试剂盒包括容器，该容器包括沿着该容器的壁设置的具有小于约1mm的拐角半径的多个特征。该试剂盒还包括研杵，该研杵被配置为装配在容器内。研杵可以包括沿着研杵的壁设置的具有小于约1mm的拐角半径的多个特征。

在一些实施方案中，容器的多个特征和/或研杵的多个特征以锯齿图案布置。

在另一个方面，本发明的特征在于一种裂解生物颗粒的方法。该方法包括提供如本文所述的试剂盒；在容器中提供包含生物颗粒的液体混合物；以及在容器中旋转研杵。容器的多个特征和/或研杵的多个特征裂解生物颗粒。

定义

在值被描述为范围的情况下，应当理解，此类公开内容包括此类范围内的所有可能子范围的公开内容，以及落入此类范围内的具体数值，而不论具体数值或具体子范围是否被明确陈述。

如本文所用，术语“约”是指所列举值的±10％。

术语“衔接物”、“衔接子”和“标签”可以同义地使用。可以通过任何方法(包括连接、杂交或其他方法)将衔接物或标签偶联到要“加标签”的多核苷酸序列。

如本文所用，术语“条形码”一般是指传达或能够传达关于分析物的信息的标签或标识符。条形码可以是分析物的一部分。条形码可以是连接至分析物(例如，核酸分子)的标签或该标签加上分析物的内在特性(例如，分析物或末端序列的大小)的组合。条形码可以是独特的。条形码可以具有多种不同的形式。例如，条形码可以包括：多核苷酸条形码；随机核酸和/或氨基酸序列；以及合成核酸和/或氨基酸序列。条形码能够以可逆或不可逆方式连接到分析物。条形码可以在样品测序之前、期间和/或之后加入例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段中。条形码可以允许实时鉴定和/或量化各个测序读段。

如本文所用，术语“载体”通常是指不是生物颗粒的颗粒。该颗粒可以是固体或半固体颗粒。该颗粒可以是珠粒，诸如凝胶珠粒。凝胶珠粒可以包括聚合物基质(例如，通过聚合或交联形成的基质)。聚合物基质可以包括一种或多种聚合物(例如，具有不同官能团或重复单元的聚合物)。聚合物基质中的聚合物可以是随机排列的，例如在随机共聚物中，和/或具有有序结构，例如在嵌段共聚物中。交联可以经由共价、离子或诱导相互作用或者物理缠结实现。珠粒可以是大分子。珠粒可以由结合在一起的核酸分子形成。珠粒可以经由分子(例如，大分子)诸如单体或聚合物的共价或非共价组装形成。此类聚合物或单体可以是天然的或合成的。此类聚合物或单体可以是或包括例如核酸分子(例如DNA或RNA)。珠可以由聚合材料形成。珠粒可以是磁性的或非磁性的。珠粒可以是刚性的。珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。珠粒可以是可破坏的或可溶解的。珠粒可以是覆盖有包含一种或多种聚合物的涂层的固体颗粒(例如，基于金属的颗粒，包括但不限于氧化铁、金或银)。此类涂层可以是可破坏的或可溶解的。

如本文所用，术语“生物颗粒”一般是指来源于生物样品的离散生物系统。生物颗粒可以是病毒。生物颗粒可以是细胞或细胞的衍生物。生物颗粒可以是来自细胞的细胞器。来自细胞的细胞器的实例包括但不限于细胞核、内质网、核糖体、高尔基氏体、内质网、叶绿体、胞吞囊泡、胞吐囊泡、液泡和溶酶体。生物颗粒可以是来自细胞群的稀有细胞。生物颗粒可以是任何类型的细胞，包括但不限于原核细胞、真核细胞、细菌、真菌、植物、哺乳动物或其他动物细胞类型、支原体、正常组织细胞、肿瘤细胞或无论从单细胞生物体还是多细胞生物体衍生的任何其他细胞类型。生物颗粒可以是细胞的成分。生物颗粒可以是或可以包括DNA、RNA、细胞器、蛋白质或它们的任何组合。生物颗粒可以是或可以包括基质(例如，凝胶或聚合物基质)，该基质包含细胞或来自细胞的一种或多种成分(例如，细胞珠粒)，诸如来自细胞的DNA、RNA、细胞器、蛋白质或它们的任何组合。生物颗粒可以获自受试者的组织。生物颗粒可以是硬化的细胞。此类硬化的细胞可以包括或可以不包括细胞壁或细胞膜。生物颗粒可以包括细胞的一种或多种成分，但是可以不包括细胞的其他成分。此类成分的一个实例是细胞核或细胞的另一种细胞器。细胞可以是活细胞。活细胞可以是能够被培养的，例如，当被封闭在凝胶或聚合物基质中时被培养，或者当包含凝胶或聚合物基质时被培养。

如本文所用，术语“流体地连接”是指至少两个装置元件(例如，通道、储器等)之间的直接连接，其允许流体在此类装置元件之间移动，而无需穿过中间元件。

如本文所用，术语“基因组”一般是指来自受试者的基因组信息，该基因组信息可以是例如受试者的遗传信息的至少一部分或全部。基因组可以在DNA中或RNA中编码。基因组可以包含(编码蛋白质的)编码区以及非编码区。基因组可以包含生物体中所有染色体一起的序列。例如，人类基因组具有总共46个染色体。所有这些染色体一起的序列可以构成人类基因组。

如本文所用，术语“与……流体连通”是指至少两个装置元件(例如，通道、储器等)之间的连接，其允许流体在穿过或不穿过一个或多个中间装置元件的情况下在此类装置元件之间移动。

如本文所用，术语“对准”是指基本上对准的一对尖锐特征。例如，对准的一对尖锐特征可以具有在流动路径的相对两侧上基本上对准的尖锐特征的顶端，例如，顶端可以偏移不超过50μm，例如不超过40、30、20、10、5或1μm。具有定位在流动路径的相对两侧上的多个尖锐特征的装置可以具有多个匹配对，其中每个匹配对的尖锐特征的顶端在流动路径的相对两侧上基本上对准。

如本文所用，术语“大分子成分”一般是指包含在生物颗粒内或来自生物颗粒的大分子。大分子成分可以包含核酸。在一些情况下，生物颗粒可以是大分子。大分子成分可以包括DNA或DNA分子。大分子成分可以包括RNA或RNA分子。RNA可以是编码的或非编码的。RNA可以是例如信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转运RNA(tRNA)。RNA可以是转录物。RNA分子可以是(i)成簇的规则间隔短回文(CRISPR)RNA分子(crRNA)或(ii)单向导RNA(sgRNA)分子。RNA可以是长度小于200个核酸碱基的小RNA，或长度大于200个核酸碱基的大RNA。小RNA可以包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、转运RNA(tRNA)、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、与Piwi蛋白相互作用的RNA(piRNA)、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)和小rDNA衍生的RNA(srRNA)。RNA可以是双链RNA或单链RNA。RNA可以是环状RNA。大分子成分可以包含蛋白质。大分子成分可以包含肽。大分子成分可以包括多肽或蛋白质。该多肽或蛋白质可以是细胞外或细胞内的多肽或蛋白质。大分子成分也可以包括代谢物。本领域技术人员将会知道这些和其他合适的大分子成分(也称为分析物)(参见美国专利号10,011,872和10,323,278，以及PCT公开号WO 2019/157529，其中每一者均全文以引用方式并入本文)。

如本文所用，术语“分子标签”一般是指能够结合于大分子成分的分子。分子标签可以以高亲和力结合于大分子成分。分子标签可以以高特异性结合于大分子成分。分子标签可以包含核苷酸序列。分子标签可以包含寡核苷酸或多肽序列。分子标签可以包含DNA适体。分子标签可以是或包含引物。分子标签可以是或包含蛋白质。分子标签可以包含多肽。分子标签可以是条形码。

如本文所用，术语“油”通常是指与水不可混溶的液体。油可以具有高于或低于水的密度和/或高于或低于水的粘度。

术语“细胞的微粒组分”是指来源于细胞或其片段并且至少一种尺寸为0.01μm(例如，至少0.01μm、至少0.1μm、至少1μm、至少10μm，或至少100μm)的离散生物系统。例如，细胞的微粒组分可以是细胞器，诸如细胞核、外泌体、脂质体、内质网(例如，糙面或光面)、核糖体、高尔基氏体、叶绿体、胞吞囊泡、胞吐囊泡、液泡、溶酶体或线粒体。

如本文所用，术语“样品”一般是指受试者的生物样品。生物样品可以是核酸样品或蛋白质样品。生物样品可以来源另一种样品。样品可以是组织样品，诸如活检样品、芯针活检样品、针抽吸物或细针抽吸物。样品可以是液体样品，诸如血液样品、尿液样品或唾液样品。样品可以是皮肤样品。样品可以是颊拭子。样品可以是血浆或血清样品。样品可以包含生物颗粒，例如细胞或病毒，或者它们的群体，或者样品可以替代性地不含生物颗粒。无细胞样品可以包含多核苷酸。可以从身体样品分离多核苷酸，该身体样品可以选自由血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、粪便和泪液组成的组。

如本文所用，术语“测序”一般是指用于确定一个或多个多核苷酸中的核苷酸碱基的序列的方法和技术。这些多核苷酸可以是例如核酸分子，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，包括其变体或衍生物(例如，单链DNA)。测序可以由当前可用的各种系统执行，诸如但不限于Pacific Biosciences/>Oxford或Life Technologies(ION/>)生产的测序系统。另选地或此外，测序可以使用核酸扩增、聚合酶链反应(PCR)(例如，数字PCR、定量PCR或实时PCR)或等温扩增来执行。此类系统可以提供与受试者(例如，人类)的遗传信息相对应的多个原始遗传数据，如这些系统从受试者提供的样品所生成的。在一些实例中，此类系统提供测序读段(本文也称为“读段”)。读段可以包括与已被测序的核酸分子的序列相对应的一连串核酸碱基。在一些情况下，本文所提供的系统和方法可以与蛋白质组信息一起使用。

如本文所用，术语“受试者”一般是指动物诸如哺乳动物(例如，人类)或禽(例如，鸟)，或其他生物体诸如植物。受试者可以是脊椎动物、哺乳动物、小鼠、灵长类动物、猿或人。动物可以包括但不限于农场动物、运动动物和宠物。受试者可以是健康或无症状的个体、患有或疑似患有疾病(例如，癌症)或易患该疾病的个体或需要治疗或疑似需要治疗的个体。受试者可以是患者。

如本文关于液滴或颗粒形成所用的术语“基本上静止”，通常是指当连续相中形成的液滴或颗粒的运动是被动运动(例如，由分散相与连续相之间的密度差引起)时的状态。

附图说明

图1是本发明的试剂盒的示意图。该试剂盒包括外部容器和可移除插入件，该可移除插入件被配置为装配在该容器中。该可移除插入件包括入口和触变层，该触变层分离具有不同密度的液体层。

图2是如本文所述的方法的示意图。对含有具有生物颗粒和碎片的悬浮液的液体混合物的容器进行离心。弃去上清液，并将生物颗粒重悬于没有碎片的新液体中。

图3是如本文所述的装置的示意图。该装置包括多个含有尖锐特征的流动路径，这些尖锐特征被配置为在细胞通过流动路径时裂解细胞。在裂解时，细胞的内容物(诸如细胞质RNA和细胞核)从细胞中释放。

图4是如图3中的装置的示意图，并且还包括被配置为截留预先确定的尺寸的颗粒的过滤器。

图5是如图3中的装置的示意图，该装置还包括多个磁性颗粒，该多个磁性颗粒被配置为结合并截留某些生物材料，诸如细胞质RNA。

图6A和图6B是装置的横截面的示意图，并且对应于如图3和图5所示的横截面A和横截面B。图6A示出了完整的细胞，并且图6B示出了裂解的细胞。

图7是示出试剂盒的示意图，该试剂盒包括装置，该装置包括多个含有尖锐特征的流动路径，这些尖锐特征被配置为在细胞通过流动路径时裂解细胞。该装置被配置为装配在容器内并且包含帽，该帽密封该装置的入口。离心后，细胞破裂，并且细胞核收集在容器底部。

图8是示出图7的试剂盒中的装置的特写视图的示意图。

图9是示出如本文所述的试剂盒和方法的示意图。该试剂盒包括装置和容器，并且被配置为收集生物颗粒。该装置含有聚合物过滤器和容器，该容器含有收集生物颗粒的重介质。左侧示出的是具有生物颗粒悬浮液的容器。然后可以将试剂盒离心、涡旋并再次离心以收集生物颗粒的沉淀物，如右侧所示。

图10是示出如本文所述的试剂盒的示意图，该试剂盒包含装配在容器内的装置。该装置包括被配置为裂解生物颗粒的一层纹理化通道(例如，包含尖锐特征)。该装置还包括过滤层(例如，多孔过滤器)和出口以允许生物颗粒(例如，细胞核)的内容物收集在容器中。该容器还包含用于收集生物颗粒的重介质。

图11是示出如本文所述的试剂盒的示意图。该试剂盒包含纹理化的研杵和纹理化的裂解柱(例如，包含尖锐特征)。研杵装配在柱内并且可以旋转以裂解生物颗粒。

图12描绘了对于目前描述的实施例1的细胞核分离方法与广泛采用的自制细胞核分离方案而言细胞中的核酸读段的分数(左)；以及比较使用实施例1的方法与广泛采用的自制细胞核分离方案在细胞中鉴定的每个细胞的基因中位数的小提琴图(右)。目前描述的方法将数据产率提高了约40％，并将所捕获的基因数量方面的复杂性增加了约20％。样品是冷冻的小鼠肾组织。

图13表明，目前描述的实施例1的细胞核分离方法是对已知的使用成年小鼠肾组织(左)和人肾癌组织(右)的细胞核分离方案的改进，其中细胞核分离试剂盒数据点是目前描述的细胞核分离方案。本发明的细胞核分离方法产生比其他方法更高的信噪比，即使对于坏死程度更高的组织如癌症样品也是如此。与Salty EZ裂解方法相比，目前描述的细胞核分离方法将数据产量提高了至少约15％，并且比简单的细胞核分选样品方法提高了40％。Salty EZ方法是Salty-EZ10方案。

图14表明，目前描述的细胞核分离方法在小鼠肾和人肾癌组织中产生增加的唯一分子标识符(UMI)和检测到的基因(～20％增加)。

图15表明，目前描述的细胞核分离方法在包含髓磷脂和其他复杂碎片的样品中提供了充分的碎片清除。与“解离后的样品”显微分图相比，“Chromium细胞核分离”分图提供了在已经执行本公开的细胞核分离方法之后的最终样品的显微视图。此外，如在“过滤后”显微分图中可以看到的，在解离后立即简单地过滤样品不能为细胞核分离提供足够的碎片清除。虽然某种程度上是可接受的，但是不同尺寸的大颗粒肯定会堵塞细胞核的下游单细胞分析所需的微流体通道。

图16表明，细胞不需要完全来自有组织的致密组织，它们可以处于悬浮状态，诸如先前解离的细胞或培养的细胞或不生长/组织为三维组织的非粘附细胞。该图是用本文所述的细胞核分离方法处理的解离的肿瘤细胞与从相同类型的实体瘤组织开始的结果。该图表明，细胞悬浮液的UMI计数的条形码等级与仅单独细胞的条形码等级紧密相符。

图17表明，由从解离的肿瘤细胞的细胞悬浮液分离的细胞核与解离的肿瘤组织的细胞(来自悬浮细胞的细胞核与悬浮细胞)产生的单细胞分析数据的复杂性(如通过每个细胞的基因中位数和每个细胞的UMI中位数测量的)在统计学上彼此不显著-这意味着利用来自细胞悬浮液的细胞核产生非常相似的复杂性，如通过每个细胞的基因中位数/UMI中位数所测量的。

具体实施方式

本发明提供了用于纯化或裂解生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞核)的装置和试剂盒及其使用方法。该方法、装置和试剂盒可以用于纯化具有所需性质和/或尺寸的生物颗粒。然后，纯化的生物颗粒可以适用于掺入到可用作微型化学反应器的液滴或颗粒中，例如以用于基因测序。一般来讲，本文所述的试剂盒包括容器，该容器包括入口和设置在该容器中的触变层。该容器还可以包括出口以允许流过其中。外部容器可以用于收集通过出口的液体，例如在离心之后。如本文所述的装置或试剂盒的其他实施方案包括具有一个或多个特征(例如，尖锐特征)的流动路径，该一个或多个特征被配置为裂解生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞核)以分离或纯化生物颗粒或其内容物。作为纯化的结果，本发明可以提供纯化的生物颗粒群体(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞器，诸如细胞核)。

新鲜组织处理具有挑战性，因为通常必须立即处理才能获得最佳结果，并且样品收集点可能不具备将样品解离成单细胞以进行单细胞分析的设备或专业知识。组织储存溶液仅提供短期储存，通常约72小时或更短，并且储存后所得的活力与样品有很大关系。组织冷冻保存需要将组织切成非常小的碎片，如果对组织形态感兴趣，这就不可行。除了福尔马林/甲醛固定外，快速冷冻组织是最常用的方法。细胞核分离可以是优于保存或快速处理组织的方法，因为：(1)一些样品不能容易地解离成单细胞，但可以通过从多种组织(包括冷冻组织)分离细胞核来制备；(2)细胞核分离避免了在新鲜组织解离过程中经常出现的细胞(诸如神经元和脂肪细胞)损失，并避免了可能改变基因表达并造成细胞类型偏差(诸如神经胶质激活所发生的)的长时间酶促温育；并且它能获取转录和表观遗传信息-细胞核含有大量未剪接的mRNA和染色质，并且基因表达和染色质结构的谱分析可以用于定义细胞阶段、谱系追踪以及更好地了解基因调控。

本文所述的装置、试剂盒和方法提供了优于本领域已知的其他可用装置和技术的各种优点。特别地，本文所述的装置、试剂盒和方法可以去除背景(例如，细胞质)RNA和DNA，去除死细胞(例如，提供具有高细胞活力的样品)，去除细胞碎片，去除团块和双细胞，以及去除低质量细胞核。在一个实施方案中，该装置、试剂盒和方法提高了生物颗粒(例如，细胞或细胞核)的制备物的质量，其中较高质量的制备物通常最大限度地减少来自裂解细胞或非完整细胞核的碎片的存在。例如，可以通过细胞活力测量方案来评估质量。可以通过对制备物进行染色(例如，用台盼蓝)，然后对生物颗粒进行计数(例如，自动计数器或血细胞计数器)来评估活力。活力可以通过测量拒染(例如，台盼蓝)的未裂解细胞来确定，而细胞核可以按不拒染来测量。另选地，可以通过荧光染料来测量细胞核，例如，可以使用乙锭同型二聚体-1来测量和区分细胞核与碎片。此外，可以通过显微镜观察来测量高质量的细胞核。高质量细胞核制备物的特征在于细胞核是无团块和无碎片的细胞核，和/或具有光滑和圆润的完整膜。低质量细胞核制备物的特征在于细胞核具有受损的膜，例如外观呈皱褶状。受损的膜还可以包括起泡(blebbing)，这指示可能因过度裂解造成的核膜完整性丧失。在一个实施方案中，通过测量约小于1％至约小于10％活输入细胞来证明细胞裂解后的高质量细胞核制备物。在其他实施方案中，通过测量约小于1％、约小于2％、约小于3％、约小于4％、约小于5％、约小于6％至约小于7％活输入细胞、约小于8％、约小于9％或约小于10％活输入细胞来证明细胞裂解后的高质量细胞核制备物。

通过温和地分离、纯化和分配或储存生物颗粒，该装置或试剂盒不会激活、灭活或改变生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞核)的基因表达、活力或功能性。当使用固定或冷冻的细胞或细胞器(例如细胞核)时，该特征特别重要。因此，被分析的样品不被具有改变的表达模式或替代的细胞亚型的生物颗粒污染。其他技术较苛刻，这降低了样品制备的效率。本文所述的装置和试剂盒减少损失并提供增强的纯化，从而提供用于后续步骤的生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞核)的更高产率和增加的纯度。本发明的其他特征和优点作为整体在实施例中提供。

装置和试剂盒

用于纯化生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞器，诸如细胞核)的试剂盒包括具有入口的容器，可以向该入口提供液体。容器还包括设置在容器中的触变层(参见图1)。容器还可以包括出口，以允许液体流出容器，例如流到外部容器。外部容器可以用于收集通过出口的液体，例如在离心之后。

容器

本文所述的装置和试剂盒可以包括容器。容器可以是装配在外部容器内的可移除插入件。容器可以包含出口。例如，容器可以包含可移除的或易断的顶端，使得一旦顶端被移除，液体就可以流过出口。容器可以是任何合适的几何形状，诸如圆柱形、圆锥形等。容器可以是例如微量离心管或PCR管或可以可移除地插入在微量离心管或PCR管内的类似装置。容器的体积可以为例如1nL至100mL(例如1nL、2nL、3nL、4nL、5nL、6nL、7nL、8nL、9nL、10nL，例如10nL至100nL，例如20nL、30nL、40nL、50nL、60nL、70nL、80nL、90nL、100nL，例如100nL至1μL，例如200nL、300nL、400nL、500nL、600nL、700nL、800nL、900nL、1μL，例如1μL至10μL，例如2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL，例如10至100μL，例如20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL，例如100μL至1mL，例如200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1mL，例如1mL至10mL，例如2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL，例如10mL至100mL，例如20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL)。容器的体积可以为小于约10,000μL(例如小于约1,000μL、小于约100μL或小于约10μL，例如约1μL至约10,000μL、约10μL至约10,000μL、约100μL至约10,000μL、约1,000μL至约10,000μL、约10μL至约5,000μL、约10μL至约1,000μL、约100μL至约1,000μL、约500μL至约1,000μL、约1μL至约1,000μL、约1μL至约500μL、约1μL至约100μL、约1μL至约50μL或约1μL至约10μL)。

容器的厚度可以为约10μm至约10mm(例如，约10μm至约1mm、约10μm至约100μm、约50μm至约100μm、约100μm至约10mm、约1mm至约10mm、约500μm至约1mm、约1mm至约5mm、约1mm至约2mm，例如约1.5mm)。在一些实施方案中，容器的厚度可以为约10μm至约100μm，例如约10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm，例如约100μm至约1000μm，例如约200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm，例如约1mm至约10mm，例如2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm。

容器可以包含覆盖和/或密封容器的帽。帽可以附接到容器或单独的部件。在随后的使用过程中，例如在离心过程中，帽可以装配在入口上并覆盖容器。

在一些实施方案中，容器包含设置在容器内的触变层。触变层分离具有不同密度的液体层以允许生物颗粒的分离和纯化。触变层可以包含聚合物凝胶，诸如聚酯。触变层可以设置在容器内以允许具有不同密度的液体的有效分离。例如，触变层在容器内可以具有圆盘或圆柱形形状。触变层的长度、宽度和高度可以至少独立地为例如0.1μm至10mm(例如0.1至1μm，例如0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm，例如1至10μm，例如1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm，例如10至100μm，例如20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm，例如100μm至1000μm，例如200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm，例如1mm至10mm，例如2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm)。触变层的体积可以为例如1nL至10mL(例如1nL、2nL、3nL、4nL、5nL、6nL、7nL、8nL、9nL、10nL，例如10nL至100nL，例如20nL、30nL、40nL、50nL、60nL、70nL、80nL、90nL、100nL，例如100nL至1μL，例如200nL、300nL、400nL、500nL、600nL、700nL、800nL、900nL、1μL，例如1μL至10μL，例如2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL，例如10至100μL，例如20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL，例如100μL至1mL，例如200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1mL，例如1mL至10mL，例如2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL)。

触变层可以分离具有第一密度的第一液体层和具有第二密度的第二液体层，从而在容器内形成密度梯度。第二液体可以具有比第一液体的密度低的密度。

容器可以装载有具有第一密度的第一液体层。第一层可以设置在触变层下方。第一层可以定位在出口和触变层之间。第一层可以包含碘克沙醇。例如，第一层可以包含约10％至约50％的碘克沙醇(例如，约15％至约45％、约20％至约40％、约25％至约35％、约26％至约34％、约27％至约33％、约28％至约32％、约29％至约31％、约29.5％至约30.5％，例如约30％。

在另一个实施方案中，装置可以包括离心管，该离心管含有具有预先确定的密度的液体，该液体由组织培养基构成。例如，离心管可以包含具有组织培养基和浓度为约10％至约50％(例如，约15％至约45％、约20％至约35％、约22％至约32％或约24％至约30％)的碘克沙醇的液体。

离心管可以是例如微量离心管或PCR管，或被配置为装配在离心机内的任何其他合适的结构。

在一些实施方案中，该液体的密度为约1.11g/mL至约1.12g/mL(例如，约1.146g/mL至约1.175g/mL，例如约1.1107g/mL、1.117g/mL、1.127g/mL、1.136g/mL、1.146g/mL、1.156g/mL、1.165g/mL或1.175g/mL)。该液体可以含有碘克沙醇或用于产生与碘克沙醇相似的密度的类似组分，诸如ficoll、histopaque或蔗糖。

使用具有组织培养基和上述密度的液体的优点允许例如在离心期间容易地去除细胞碎片，同时仍然保持生物颗粒或其微粒组分(例如，细胞核)的存活条件。

外部容器

在一些实施方案中，本发明采用外部容器来容纳容器并且任选地从容器(例如，其是外部容器内的可移除插入件)的出口收集液体。外部容器可以是任何合适的几何形状，诸如圆柱形、圆锥形等。外部容器可以是例如微量离心管或PCR管或被配置为容纳微量离心管或PCR管的类似装置。外部容器的体积可以为例如1nL至100mL(例如1nL、2nL、3nL、4nL、5nL、6nL、7nL、8nL、9nL、10nL，例如10nL至100nL，例如20nL、30nL、40nL、50nL、60nL、70nL、80nL、90nL、100nL，例如100nL至1μL，例如200nL、300nL、400nL、500nL、600nL、700nL、800nL、900nL、1μL，例如1μL至10μL，例如2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL，例如10至100μL，例如20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL，例如100μL至1mL，例如200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1mL，例如1mL至10mL，例如2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL，例如10mL至100mL，例如20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL)。外部容器的体积可以为小于约10,000μL(例如小于约1,000μL、小于约100μL或小于约10μL，例如约1μL至约10,000μL、约10μL至约10,000μL、约100μL至约10,000μL、约1,000μL至约10,000μL、约10μL至约5,000μL、约10μL至约1,000μL、约100μL至约1,000μL、约500μL至约1,000μL、约1μL至约1,000μL、约1μL至约500μL、约1μL至约100μL、约1μL至约50μL或约1μL至约10μL)。外部容器可以具有与可移除插入件相同或更大的体积。

外部容器的厚度可以为约10μm至约10mm(例如，约10μm至约1mm、约10μm至约100μm、约50μm至约100μm、约100μm至约10mm、约1mm至约10mm、约500μm至约1mm、约1mm至约5mm、约1mm至约2mm，例如约1.5mm)。在一些实施方案中，容器的厚度可以为约10μm至约100μm，例如约10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm，例如约100μm至约1000μm，例如约200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm，例如约1mm至约10mm，例如2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm。

外部容器可以包含覆盖和/或密封外部容器的帽。帽可以附接到外部容器或可以是单独的部件。帽可以在使用之后装配在外部容器的入口上并且覆盖外部容器，例如用于将组分储存在其中。

在一些实施方案中，外部容器可以包含具有大于约1.0g/m的密度的介质，例如以收集生物颗粒或其内容物。例如，该介质的密度为约1.11g/mL至约1.12g/mL(例如，约1.146g/mL至约1.175g/mL，例如约1.1107g/mL、1.117g/mL、1.127g/mL、1.136g/mL、1.146g/mL、1.156g/mL、1.165g/mL或1.175g/mL)。该液体可以含有碘克沙醇或用于产生与碘克沙醇相似的密度的类似组分，诸如ficoll、histopaque或蔗糖。

具有尖锐特征或过滤器的装置和试剂盒

如本文所述的用于裂解、分离或纯化生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞核)的装置的另一个实施方案包括具有入口、出口和过滤器和/或设置在流动路径中的拐角半径小于约10mm(例如小于约1mm)的至少一个特征。例如，尖锐特征的拐角半径可以小于约10mm(例如小于约9mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm或1mm，例如小于约990μm、980μm、970μm、960μm、950μm、940μm、930μm、920μm、910μm或900μm，例如小于约800μm、700μm、600μm、500μm、400μm、300μm、200μm或100μm，例如小于约90μm、80μm、70μm、60μm或50μm，例如小于约45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、15μm或10μm，例如小于约9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm或1μm，例如约10mm至约1μm、约1mm至约1μm、约500μm至约1μm、约100μm至约1μm、约10μm至约1μm、约1mm至约10μm、约100μm至约10μm、约50μm至约10μm、约10μm至约1μm、约10mm至约1mm、约10mm至约5mm、约5mm至约500μm、约1mm至约500μm或约1mm至约10μm)。

在一些实施方案中，该装置包括至少两个尖锐特征，例如，每个尖锐特征具有小于约10mm(例如，小于约1mm)的拐角半径。例如，该装置可以具有设置在流动路径内的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500个或更多个尖锐特征。

设置在流动路径内的尖锐特征允许该装置在生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞器，诸如细胞核)经过尖锐特征时裂解生物颗粒(图3)。尖锐特征可以具有多边形形状。例如，该特征的横截面可以是具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12条或更多条边的多边形。多边形的顶点可以具有小于约10mm(例如，小于约1mm)的拐角半径。该装置可以包括具有多个尖锐特征的突起或各自具有尖锐特征的多个突起。

在一些实施方案中，该装置包括设置在流动路径中的多个尖锐特征。多个特征可以例如以锯齿图案布置。在一些实施方案中，这些特征定位在流动路径的相对两侧上(例如，对准)以便产生生物颗粒穿过的窄区域以增加被裂解的概率(图6A和图6B)。在一些实施方案中，该装置包括设置在流动路径中的多个匹配的特征对，其中每个匹配的对是对准的。

尖锐特征可以例如以预先确定的间隔隔开。例如，(例如，锯齿图案的)尖锐特征可以隔开1μm至约1cm，例如约1μm至10μm，例如2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm，例如约10μm至约100μm，例如20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm，例如约100μm至约1mm，例如200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm，例如1mm至约10mm，例如2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm，例如约10mm至约100mm，例如20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm，例如约100mm至约1cm，例如200mm、300mm、400mm、500mm、600mm、700mm、800mm、900mm或1000mm。

在一些实施方案中，尖锐特征以一定图案布置，该图案诸如为线性图案或网格图案(例如，其间具有规则隔开的间隔)。

在一些实施方案中，流动路径的相对两侧上的尖锐特征之间的距离例如以预先确定的间隔隔开。该间距可以被配置为匹配待裂解的生物颗粒的尺寸。例如，流动路径的相对两侧上的尖锐特征之间的距离可以小于细胞或其特定组分(例如，细胞核)的直径，例如以允许在与尖锐特征接触时有效裂解。在一些实施方案中，尖锐特征在流动路径的相对两侧上隔开约1μm至约1mm，例如约1μm至10μm，例如2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm，例如约10μm至约100μm，例如20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm，例如约100μm至约1mm，例如200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm。

在一些实施方案中，该装置包括多个流动路径，每个流动路径具有入口和出口，以及设置在流动路径中的拐角半径小于约10mm(例如，小于约1mm)的至少一个尖锐特征。多个流动路径可以是基本上平行的(图3)。多个流动路径可以各自具有多个尖锐特征。

在一些实施方案中，该装置包括过滤器，该过滤器定位在流动路径中的出口处或出口的上游，并且被配置为截留预先确定的尺寸的颗粒(例如，生物颗粒)(图4和图9)。过滤器可以用于截留大的生物颗粒(例如，细胞)或组织颗粒，例如在与尖锐特征接触之前。在一个实施方案中，该装置包括过滤器，例如，如本文所述，以及包括具有尖锐特征的流动路径的层，例如，该尖锐特征的拐角半径小于约10mm，例如小于约1mm，如本文所述(图10)。该层可以设置在过滤器的上游或下游。该层可以包括例如处于基本上平行的取向的多个流动路径。在一些实施方案中，流动路径包括多个尖锐特征。在这样的实施方案中，该装置可以包含具有大于约1.0g/m的密度的介质，例如以收集生物颗粒或其内容物。

过滤器可以包含聚合物，例如固体聚合物结构。例如，过滤器可以包含聚乙烯或聚乙烯衍生物、环烯烃共聚物(COC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、聚甲醛、聚醚醚酮、聚碳酸酯、聚苯乙烯等。

在一些方面，过滤器是多孔过滤器。在一些方面，过滤器的平均孔径为约5μm至约100μm。在一些方面，过滤器的平均孔径为约5μm、约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm、约45μm、约50μm、约55μm、约60μm、约65μm、约70μm、约75μm、约80μm、约85μm、约90μm、约95μm或约100μm。在一些方面，过滤器的平均孔径为约5μm至约90μm、约5μm至约80μm、约5μm至约70μm、约5μm至约60μm、约5μm至约50μm、约5μm至约40μm、约5μm至约30μm、约5μm至约20μm、约5μm至约10μm、约10μm至约100μm、约10μm至约80μm、约10μm至约60μm、约10μm至约40μm、约10μm至约20μm、约20μm至约100μm、约20μm至约100μm、约20μm至约80μm、约20μm至约60μm、约20μm至约40μm、约30μm至约100μm、约30μm至约80μm、约30μm至约60μm、约30μm至约40μm、约40μm至约100μm、约40μm至约80μm、约40μm至约60μm、约50μm至约100μm、约50μm至约80μm、约50μm至约60μm、约60μm至约100μm、约60μm至约80μm、约70μm至约100μm、约70μm至约80μm、约80μm至约100μm或约90μm至约100μm。

在一些方面，过滤器的厚度为约0.2mm至约30mm。在一些方面，过滤器的厚度为约0.2mm、约0.3mm、约0.4mm、约0.5mm、约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm、约15mm、约16mm、约17mm、约18mm、约19mm、约20mm、约21mm、约22mm、约23mm、约24mm、约25mm、约26mm、约27mm、约28mm、约29mm或约30mm。在一些方面，过滤器的厚度为约0.5至约30mm、约0.5至约25mm、约0.5mm至约20mm、约0.5mm至约15mm、约0.5mm至约10mm、约0.5mm至约5mm、约0.5mm至约1mm、约1至约30mm、约1至约25mm、约1mm至约20mm、约1mm至约15mm、约1mm至约10mm、约1mm至约5mm、约5至约30mm、约5至约25mm、约5mm至约20mm、约5mm至约15mm、约5mm至约10mm、约10至约30mm、约10至约25mm、约10mm至约20mm、约10mm至约15mm、约15至约30mm、约15至约25mm、约15mm至约20mm、约20至约30mm、约20至约25mm或约25mm至约30mm。

在一些方面，过滤器是聚合物。在某个方面，过滤器是纤维状的，在一些方面，过滤器是基质。在一些方面，过滤器是疏水的。在一些方面，过滤器涂覆有疏水涂层。在一些方面，过滤器是亲水的。在一些方面，过滤器涂覆有亲水涂层。

在一些实施方案中，具有尖锐特征的装置用于试剂盒中，其中该装置被配置为装配在如本文所述的容器(例如，外部容器)内(参见例如图7、图8和图10)。容器可以是任何合适的几何形状，诸如圆柱形、圆锥形等。外部容器可以是例如微量离心管或PCR管或类似装置。当液体离开流动路径的出口时，容器收集液体。在一些实施方案中，该装置定位在外部容器(例如，微量离心管)中。外部容器可以包含密度大于向该装置提供的混合物的密度(例如，大于1.0g/m)的液体。

本文的特征还在于一种用于裂解生物颗粒的试剂盒。该试剂盒包括容器，该容器包括沿着该容器的壁设置的具有小于约10mm(例如，小于约1mm，如本文所述)的拐角半径的至少一个尖锐特征(例如，多个特征)。该试剂盒还包括研杵，该研杵被配置为装配在容器内。研杵可以包括沿着研杵的壁设置的具有小于约1mm的拐角半径的至少一个特征(例如，多个特征)。在一些实施方案中，容器的多个特征和/或研杵的多个特征以锯齿图案布置(图11)。研杵可以包含手柄，例如以便于操纵。

样品

可以与本文所述的装置和试剂盒一起使用的样品可以是含有生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞器，诸如细胞核)的任何液体，例如水性液体。样品可以含有不溶性物质，例如细胞碎片、蛋白质、核酸等，包括细胞外分子或分析物。

在一些情况下，含有细胞的样品中的不需要的分子或分析物可以是细胞外分子或分析物。细胞外分析物可以是细胞外的化学、生物或生物化学分子或颗粒。细胞外分析物可以包括任何种类的分子，诸如核酸分子、肽、蛋白质、底物、核酸序列、氨基酸序列或其他种类的分子。细胞外分子可以包括细胞外核酸分子，诸如DNA和/或RNA或不在细胞或细胞核内的任何其他类型的核酸分子和/或其任何组合。在一些情况下，细胞外分子可以是样品中的杂质。关于不需要的细胞外分析物的另外的公开内容在美国临时专利申请号63/109,972中提供，该临时专利申请全文以引用方式并入本文。

细胞外分子(例如，细胞外核酸分子)也可以称为自由漂浮分子(例如，自由漂浮核酸分子)、环境分子(例如，环境核酸分子)和/或背景分子(例如，背景核酸分子)。细胞外分子可以包括样品中不在细胞或细胞核内的分子，其可以充当杂质并且可以干扰从分析样品的细胞或细胞核获得的数据的质量。在一些情况下，可以存在细胞外分子而不干扰从分析样品的细胞或细胞核获得的数据的质量。

在一些情况下，细胞外分子可以包括诸如细胞外肽、蛋白质、底物、氨基酸序列、化学物质、杂质和/或其任何组合的分子。例如，具有细胞或细胞核的样品还可以包含细胞外分子，诸如蛋白质和/或肽。

在一些情况下，细胞外分子可以包括或者是细胞外核酸分子。细胞外核酸分子可以包括核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。在一些实例中，细胞外核酸可以包括信使RNA(mRNA)、染色体和基因组DNA(gDNA)中的至少一种。在一些实例中，细胞外核酸分子的大小可以为至少约5个碱基对(bp)或核苷酸(nt)，例如，至少约5bp或nt、10bp或nt、15bp或nt、20bp或nt、25bp或nt、30bp或nt、35bp或nt、40bp或nt、50bp或nt、60bp或nt、70bp或nt、80bp或nt、90bp或nt、100bp或nt、200bp或nt、300bp或nt、400bp或nt、500bp或nt、600bp或nt、700bp或nt、800bp或nt、900bp或nt、1kbp或knt或更大的大小。在一些情况下，细胞外核酸分子可以等于或小于约：500bp或nt、400bp或nt、300bp或nt、200bp或nt、100bp或nt、50bp或nt、40bp或nt、30bp或nt、20bp或nt、10bp或nt、5bp或nt或更小，例如小于50bp或nt。

细胞外分析物(例如，细胞外核酸分子)可能已经在样品中从细胞或细胞核中释放出来，例如，由于加工、处理和/或操纵包含细胞和/或细胞核的样品(例如，在样品制备期间)而释放。这种加工可能导致细胞裂解或细胞膜和/或核膜的完整性丧失。这种现象可以发生在任何种类的细胞中，诸如本文其他地方列出的任何细胞类型或其他类型的细胞。在一些情况下，更脆弱的细胞类型可能更易于在样品制备期间裂解。这种细胞类型更有可能在样品中释放细胞外分子。另选地，细胞外分子(例如，细胞外核酸分子)可以具有其他来源和/或原因。认识到需要解决细胞外分子(例如，细胞外核酸分子)对样品的污染(或交叉污染)及其对数据分析(例如，单细胞分析，诸如单细胞测序或其他样品处理和分析技术或程序)的干扰。

在一些情况下，包含细胞和/或细胞核的样品中存在细胞外分子(例如，细胞外核酸分子)可能不利地影响和/或至少在一定程度上损害分析结果(例如，单细胞分析和/或数据聚类结果)的精度或质量。例如，目标可以是分析样品的细胞和/或细胞核中的核酸分子(例如，细胞内核酸分子)。该方法还可以包括将针对样品的细胞和/或细胞核生成的数据聚类成多于一个亚群(例如，将细胞聚类成多个亚群)。该方法还可以包括鉴定特征和/或参数(例如，标记物)的组合，其可以提供关于每个亚群的重要信息和/或根据样品或受试者的给定状态或状况(例如，受试者的疾病标记物或诊断)来定义亚群。细胞外分子(诸如细胞外核酸分子)的存在可能以一种或多种方式干扰这种聚类和/或鉴定。这种现象也可以称为交叉污染。例如，细胞外分子(例如，环境或背景分子，诸如核酸分子)的存在可能导致两个或更多个亚群混合在一起，并且与细胞、细胞核和/或其细胞内核酸分子相关的数据(例如，信号或测序读段)在两个或更多个亚群中被检测或分类。细胞外分子(例如，细胞外核酸分子)可能导致数据中的伪影和/或噪声，改变由聚类分析产生的亚群的数量，以其他方式干扰数据，和/或其任何组合。这可能导致数据不精确，并且可能不利地影响结果的解释和/或基于这样的数据和/或数据聚类的决策。因此，取决于应用，可能需要在用于例如单细胞处理(包括分隔)之前确定样品的组成。

在一些情况下，细胞外分子(例如，细胞外核酸分子)，诸如在样品内的细胞或细胞核外部的核酸分子，可以在样品处理和/或分析期间产生信息，诸如信号(例如，序列读段)。例如，可以对包含细胞或细胞核的样品(其还包含细胞外核酸分子)进行处理和分析，例如单细胞测序(例如，单细胞RNA测序)。在这种情况下，从细胞外核酸分子获得的信号可以被认为是噪声，并且可以污染从细胞内核酸分子获得的数据或从细胞核内的核酸分子获得的数据。在该实例中，从样品中消化或以其他方式减少或去除细胞外核酸分子(例如，在测序之前)可以增强单细胞测序数据及其聚类的质量。

在一些情况下，组合物(例如，经处理的样品)中细胞外分子(例如，细胞外核酸分子)的量减少或其不存在可以产生具有减少的噪声、伪影、不精确性和/或误差的更精确和/或更多信息的数据。这样的数据可以具有更高的质量，并且可以改进对结果的解释和/或做出更明智的决策。在一些情况下，细胞外分子(例如，细胞外核酸分子)的消除可以减少数据分析的时间和费用，例如，通过提供具有降低的噪声的更干净的数据。

本文所述的装置对于小体积样品(例如，小于100μL、90μL、80μL、70μL、60μL、50μL、40μL、30μL、20μL、10μL、9μL、8μL、7μL、6μL、5μL、4μL、3μL、2μL或1μL)或含有少量生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞核)的样品体积特别有利。

样品中的生物颗粒可以在掺入到液滴中之前使用本发明进行纯化。另选地，样品可以源自液滴，例如在液滴破裂或去稳定化之后。液滴通常是指悬浮在第二不混溶液体中的一种液体，并且可以形成为其中一个或多个生物颗粒被包封在液滴内。

可以将生物颗粒悬浮在任何合适的缓冲液中。例如，可以将细胞悬浮在合适的细胞裂解缓冲液中。细胞裂解缓冲液可以包含RNA酶抑制剂。细胞裂解缓冲液可以包含表面活性剂(例如，约0.01％至约1.0％的表面活性剂)。在一些实施方案中，细胞裂解缓冲液包含10mM Tris-HCl(pH 7.4)、10mM NaCl、3mM MgCl₂、0.01％ IGEPAL CA-630(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、0.2U/μl RNA酶抑制剂(例如，酶促RNA酶抑制剂，例如保护剂RNA酶(ProtectorRNAse))、0.1％ BSA、2mM精胺和约0.01％至约1.0％的表面活性剂/去污剂(例如，TWEEN-20(聚山梨醇酯20)或IGEPAL CA-630(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)。裂解缓冲液可以包含例如10mM Tris-HCl(pH 7.4)、10mM NaCl、3mM MgCl₂、0.01％ IGEPAL CA-630(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、0.2U/μlSUPERase In RNA酶抑制剂、0.1％ BSA、2mM精胺和0.1％ TWEEN-20(聚山梨醇酯20)。如果要从细胞中纯化细胞器，诸如细胞核，则可以在裂解缓冲液中裂解细胞。然后可以将细胞核重悬于等渗缓冲液中以便分配到容器的入口中。等渗缓冲液可以包含RNA酶抑制剂。等渗缓冲液可以包含表面活性剂(例如，约0.01％至约1.0％的表面活性剂)。合适的等渗缓冲液可以包含例如20mM Tris-HCl(pH 7.4)、0.25M蔗糖、25mM KCl、5mMMgCl₂、0.01％IGEPAL CA-630、0.2U/μl SUPERase In RNA酶抑制剂、0.1％ BSA、2mM精胺和0.1％ TWEEN-20。

在一些方面，使包含细胞的样品或包含裂解细胞的样品经受碎片去除过程，在该过程中利用碎片去除缓冲液。在一些方面，碎片去除缓冲液包含碎片去除剂和还原剂。在一些方面，使包含细胞的样品或包含裂解细胞的样品经受洗涤和重悬缓冲液，其中洗涤和重悬缓冲液包含任选的RNA酶抑制剂；牛血清白蛋白(BSA)，其最终浓度可以为约1％、5％或10％；以及缓冲盐水，诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

可以将生物颗粒悬浮或重悬于稀释液中。稀释液可以是具有第二密度的第二液体，该第二密度例如低于第一液体的密度。第二液体可以包含碘克沙醇。例如，第二层可以包含约5％至约45％的碘克沙醇(例如，约10％至约40％、约15％至约35％、约20％至约30％、约21％至约29％、约22％至约28％、约23％至约27％、约24％至约26％、约24.5％至约26.5％，例如约25％。

在一些实施方案中，通过如本文所述的装置、试剂盒或方法(例如，裂解或纯化方法)获得或提供生物样品或其生物颗粒(例如，细胞或细胞核)。例如，生物样品可以经受多轮裂解和/或纯化，并用于如本文所述的不同方法中。

液滴或颗粒源装置

本文所述的装置和系统可以用于纯化生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞核)以掺入到液滴或颗粒中。用于产生液滴或颗粒的装置可以与本文描述的试剂盒和方法结合使用。例如，本文所述的一种或多种试剂盒可以与用于产生含有纯化的生物颗粒的液滴的装置结合使用。

一般来讲，液滴或颗粒由液滴或颗粒源提供。可以首先通过使第一液体流经通道并进入包含第二液体(即，连续相)的液滴或颗粒源区域而形成液滴或颗粒，该第二液体可以是主动流动的，也可以是不主动流动的。

用于产生液滴或颗粒的装置包括液滴或颗粒源。液滴或颗粒源提供液滴或颗粒，例如用于后续使用。液滴或颗粒源可以包括液滴或颗粒源区域。液滴或颗粒可以通过本领域已知的任何合适的方法来形成。一般来讲，液滴形成包括两种液相。这两种液相可以是例如样品相和油相。在形成期间，形成多个离散体积的液滴或颗粒。

液滴可以通过以下方式来形成：摇动或搅拌液体以形成各个液滴，从而产生含有各个液滴的悬浮液或乳液，或者通过移液技术(例如用针头等)形成液滴。可以使用毫米流体、微米流体或纳米流体液滴生成器来形成液滴。此类液滴生成器的实例包括例如T型结液滴生成器、Y型结液滴生成器、通道内通道结液滴生成器、交叉(或“X”形)结液滴生成器、流动聚焦结液滴生成器、微毛细管液滴生成器(例如，同向流动或流动聚焦)和三维液滴生成器。液滴可以使用流动聚焦装置或使用乳化体系(诸如均化、膜乳化、剪切细胞乳化和流体乳化)来产生。

离散的液滴可以被润湿微通道的载送流体包封。这些液滴(有时称为栓塞)形成在其中发生反应的分散相。使用栓塞的系统与分段流动注射分析的不同之处在于栓塞中的试剂不与微通道发生接触。在T型结中，分散相和连续相从“T”的两个分支注入。分散相的液滴由于流体-流体界面处的剪切力和界面张力而产生。与通道壁具有较低界面张力的相是连续相。为了在流动聚焦构造中生成液滴，连续相通过两个外部通道注入，分散相通过中央通道注入窄孔口中。本领域技术人员将会知道用于产生液滴的其他几何设计。产生液滴的方法在以下文献中公开：Song等人，Angew.Chem.45:7336-7356,2006；Mazutis等人，Nat.Protoc.8(5):870-891,2013；美国专利号9,839,911；美国专利公开号2005/0172476、2006/0163385和2007/0003442；PCT公开号WO 2009/005680和WO 2018/009766。在一些实施方案中，电场或声波可以用于产生液滴，例如，如PCT公开号WO 2018/009766中所述。

在一个实施方案中，液滴源区域包括搁板区域，该搁板区域允许液体基本上在一个维度上(例如，垂直于流动方向)膨胀。搁板区域的宽度大于第一通道在其远侧端部处的宽度。在某些实施方案中，第一通道是不同于搁板区域的通道，例如，搁板区域相比第一通道的远侧端部加宽，或者以比第一通道的远侧端部更陡的斜率或曲率加宽。在其他实施方案中，第一通道和搁板区域合并成连续的流动路径，例如，从其近侧端部到其近侧端部线性或非线性地加宽的流动路径；在这些实施方案中，第一通道的远侧端部可以被认为是沿合并的第一通道和搁板区域的任意点。在另一个实施方案中，液滴源区域包括台阶区域，其提供空间位移并允许液体在多于一个维度上膨胀。空间位移可以相对于通道向上或向下，或者向上和向下。对方向的选择可以基于分散相和连续相的相对密度来进行，当分散相的密度小于连续相时采用向上的台阶，当分散相的密度大于连续相时采用向下的台阶。液滴源区域也可以包括搁板区域和台阶区域的组合，例如，搁板区域设置在通道与台阶区域之间。该实施方案的示例性装置在WO 2019/040637、WO 2020/139844和WO 2020/176882中描述，该专利的液滴形成装置据此以引用方式并入本文。

生物样品

本发明设想了从生物样品中裂解和/或纯化生物颗粒。生物颗粒包含例如细胞或其微粒组分(例如细胞器，诸如细胞核或线粒体)和/或其大分子成分(例如，细胞的组分(例如，细胞内或细胞外蛋白质、核酸、聚糖或脂质)或细胞产物(例如，分泌产物))。可以由本发明的装置、试剂盒和方法提供生物颗粒。

可以使用细胞分析物或源自生物颗粒(例如，细胞或细胞核)的分析物，并且这些分析物可以包含但不限于来自细胞或由细胞产生的任何或所有分子或物质。在化学上，细胞分析物可以包含蛋白质、多肽、肽、糖、多糖、脂质、核酸、其组合以及其他生物分子。细胞分析物可以包含蛋白质、代谢物、代谢副产物、抗体或抗体片段、酶、抗原、碳水化合物、脂质、大分子或它们的组合(例如，蛋白聚糖)，或者其他生物分子。细胞分析物可以是核酸分子。细胞分析物可以是脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。DNA分子可以是基因组DNA分子。细胞分析物可以包含编码或非编码RNA。RNA可以是例如信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转运RNA(tRNA)。RNA可以是转录物。RNA可以是长度小于200个核酸碱基的小RNA，或长度大于200个核酸碱基的大RNA。小RNA可以包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、转运RNA(tRNA)、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、与Piwi蛋白相互作用的RNA(piRNA)、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)和小rDNA衍生的RNA(srRNA)。RNA可以是双链RNA或单链RNA。RNA可以是环状RNA。

在一些情况下，分析物可以包含在样品中。样品可以仅包含分析物，或者除了一种或多种附加组分之外，还可以包含分析物。在一些实例中，样品可以包含生物颗粒。在一些实例中，生物颗粒可以是细胞、细胞的部分或细胞器，如细胞核。生物颗粒可以包括细胞，对细胞的种类或类型没有任何限制。细胞可以是真核的、原核的或古生菌。细胞可以是来自细胞系或细胞培养样品的真核细胞。细胞可以是哺乳动物细胞。细胞可以是动物细胞。细胞可以是人细胞。细胞可以来自细胞培养物。细胞可以来自永生化细胞系。细胞可以来自原代样品，诸如患者样品。细胞可以来自冷冻的细胞储备液(例如，冷冻保存的细胞)。细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞。细胞可以来自组织样品，诸如活检样品、芯针活检样品、针抽吸物或细针抽吸物。含有细胞的样品可以来自体液，诸如血液、尿液或唾液。样品可以是皮肤样品。样品可以是颊拭子。样品可以含有外周血单核细胞(PBMC)。本公开还涵盖包含细胞的部分或来自细胞的细胞器的样品。在一些实例中，样品可以含有来自真核细胞的细胞核。

在一些方面，组织样品为约1mg至约100mg。在一些方面，组织样品为约1mg至约90mg、约1mg至约80mg、约1mg至约70mg、约1mg至约60mg、约1mg至约50mg、约1mg至约40mg、约1mg至约30mg、约1mg至约20mg、约1mg至约10mg、约1mg至约5mg、约5mg至约100mg,5mg至约70mg、约5mg至约60mg、约5mg至约50mg、约5mg至约40mg、约5mg至约30mg、约5mg至约20mg、约5mg至约10mg、约10mg至约100mg、约10mg至约70mg、约10mg至约60mg、约10mg至约50mg、约10mg至约40mg、约10mg至约30mg、约10mg至约20mg、约20mg至约100mg、约20mg至约70mg、约20mg至约60mg、约20mg至约50mg、约20mg至约40mg、约20mg至约30mg、约30mg至约100mg、约30mg至约70mg、约30mg至约60mg、约30mg至约50mg、约30mg至约40mg、约40mg至约100mg、约40mg至约70mg、约40mg至约60mg、约40mg至约50mg、约50mg至约100mg、约50mg至约70mg、约50mg至约60mg；约60mg至约100mg、约60mg至约70mg、约70mg至约100mg、约80mg至约100mg、约80mg至约90mg或约90mg至约100mg。

细胞包括例如植物细胞、动物细胞、人细胞、昆虫来源的细胞、细菌、藻类、心肌细胞、干细胞、神经元、原代神经元、胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)、肝细胞、原代心脏瓣膜细胞、原代造血细胞、胃肠细胞、淋巴细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、树突细胞、造血细胞、β细胞、体细胞、生殖细胞、胚胎(人和动物)、受精卵、配子、肝细胞、脂肪细胞和心肌细胞。

组织可以包含来自肾、肝、脑、心脏、小肠、眼、骨骼肌、脊髓、膀胱、卵巢、结肠、胃、睾丸、空肠、十二指肠、回肠、乳腺、前列腺及其任何一种或多种癌组织的细胞。

可以通过使用裂解试剂来获得生物颗粒以便释放生物颗粒的内容物(例如，细胞的内容物或含有一种或多种分析物(例如，生物分析物)的内容物)。在此类情况下，裂解剂可以在引入生物样品或生物颗粒的同时或在即将引入生物样品或生物颗粒之前与生物颗粒悬浮液接触。裂解剂的实例包括生物活性试剂，例如用于裂解不同细胞类型(例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等)的裂解酶，诸如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、labiase、立枯丝核菌裂解酶(kitalase)、溶壁酶和可从例如Sigma-Aldrich,Inc.(StLouis,MO)获得的多种其他裂解酶，以及其他可商购获得的裂解酶。除此之外或另选地，其他裂解剂可以在纯化期间与生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞核)一起使用以引起生物颗粒的内容物释放。例如，在一些情况下，可以使用基于表面活性剂的裂解溶液来裂解细胞，但这些对于基于乳液的系统可能不太理想，在这种系统中表面活性剂可干扰稳定的乳液。在某些情况下，裂解溶液可以包含非离子表面活性剂，诸如TRITON X-100和TWEEN 20。在一些情况下，裂解溶液可以包含离子型表面活性剂，诸如十二烷基肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施方案中，裂解溶液是低渗的，从而通过渗透压休克使细胞裂解。在某些情况下也可以使用电穿孔、热、声或机械方式来破坏细胞。

除了裂解剂之外，其他试剂也可以与生物颗粒一起使用，包括例如DNA酶和RNA酶失活剂或抑制剂，诸如蛋白酶K、螯合剂(诸如EDTA)，以及用于去除或以其他方式降低不同细胞裂解物组分对后续核酸处理的负活性或影响的其他试剂。

各个生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞核)的大分子组分(例如，生物分析物)可以具有唯一标识符(例如，条形码)，使得在表征那些大分子组分时，此时来自细胞异质群体的组分可能已经混合并且散布或溶解在共同液体中，任何给定的组分(例如，生物分析物)可以追溯到从其获得该组分的生物颗粒(例如，细胞)。通过将独特标识符特异性地分配给单独生物颗粒或生物颗粒组来提供将特征归属于单独生物颗粒或生物颗粒组的能力。可以为各个生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞核)或生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞核)的群体分配或关联例如核酸条形码形式的唯一标识符，以便用这些唯一标识符为生物颗粒的大分子组分(因此其特征)加标签或进行标记。然后，这些独特标识符可以用于将生物颗粒的组分和特征归属于单独生物颗粒或生物颗粒组。在产生液滴的某些实施方案中，如本文的试剂盒和方法中所述，这可以通过形成包括具有唯一标识符的各个生物颗粒或生物颗粒组的液滴(经由颗粒，例如珠粒)来进行。

在一些方面，以寡核苷酸的形式提供独特标识符，所述核酸分子包含核酸条形码序列，所述核酸条形码序列可以与单独生物颗粒的核酸内容物连接或以其他方式相关联，或与生物颗粒的其他组分连接，特别是与这些核酸的片段连接。在实施方案中，将寡核苷酸分隔开，使得在给定液滴中的寡核苷酸之间，其中所含有的核酸条形码序列相同，但在不同液滴之间，寡核苷酸可以具有并且确实具有不同的条形码序列，或者至少代表给定分析中所有液滴上的大量不同条形码序列。在一些方面，仅一个核酸条形码序列可以与给定液滴相关联，但在一些情况下，可以存在两个或更多个不同的条形码序列。

核酸条形码序列可以在寡核苷酸序列内包含6个至约20个或更多个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度可以为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以为至多6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更短。这些核苷酸可以是完全连续的，即在相邻核苷酸的单段中，或者它们可以被分成两个或更多个被1个或更多个核苷酸分开的单独子序列。在一些情况下，分开的条形码子序列的长度可以为约4至约16个核苷酸。在一些情况下，条形码子序列可以为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以为至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以为至多4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更短。

分析物部分(例如，寡核苷酸)也可以包括在处理来自包含在样品中的生物颗粒的核酸时有用的其他功能序列。这些序列包括例如靶向或随机/通用扩增引物序列，以用于扩增来自液滴内各个生物颗粒的基因组DNA，同时附接相关联的条形码序列、测序引物或引物识别位点、杂交或探测序列，例如用于鉴别这些序列的存在或者用于下拉加条形码的核酸或许多其他潜在功能序列中的任何一个。

在一个实例中，提供了颗粒(例如珠粒)，其各自包括大量可释放地附接到珠粒的上述加条形码的寡核苷酸，其中附接到特定珠粒的所有寡核苷酸将包括相同的核酸条形码序列，但是在所使用的珠粒群体中代表了大量不同的条形码序列。在一些实施方案中，水凝胶珠粒(例如具有聚丙烯酰胺聚合物基质的珠粒)用作寡核苷酸例如进入液滴的固体载体和递送媒介物，因为它们能够携带大量寡核苷酸分子，并且可以被构造成在暴露于特定刺激时释放那些寡核苷酸，如本文别处所述。在一些情况下，珠粒群体将提供多样的条形码序列文库，该文库包括至少约1,000个不同的条形码序列、至少约5,000个不同的条形码序列、至少约10,000个不同的条形码序列、至少约50,000个不同的条形码序列、至少约100,000个不同的条形码序列、至少约1,000,000个不同的条形码序列、至少约5,000,000个不同的条形码序列或至少约10,000,000个不同的条形码序列或更多。此外，每个珠粒可以具有大量附着的寡核苷酸分子。特别地，各个珠粒上包含条形码序列的寡核苷酸分子的数目可以为至少约1,000个寡核苷酸分子、至少约5,000个寡核苷酸分子、至少约10,000个寡核苷酸分子、至少约50,000个寡核苷酸分子、至少约100,000个寡核苷酸分子、至少约500,000个寡核苷酸分子、至少约1,000,000个寡核苷酸分子、至少约5,000,000个寡核苷酸分子、至少约10,000,000个寡核苷酸分子、至少约50,000,000个寡核苷酸分子、至少约100,000,000个寡核苷酸分子，并且在一些情况下至少约十亿个寡核苷酸分子，或更多个寡核苷酸分子。

此外，珠粒群体也可以包括多样的条形码文库，该文库包括至少约1,000个不同的条形码序列、至少约5,000个不同的条形码序列、至少约10,000个不同的条形码序列、至少约50,000个不同的条形码序列、至少约100,000个不同的条形码序列、至少约1,000,000个不同的条形码序列、至少约5,000,000不同的条形码序列或至少约10,000,000个不同的条形码序列。此外，群体可以包含至少约1,000个寡核苷酸分子、至少约5,000个寡核苷酸分子、至少约10,000个寡核苷酸分子、至少约50,000个寡核苷酸分子、至少约100,000个寡核苷酸分子、至少约500,000个寡核苷酸分子、至少约1,000,000个寡核苷酸分子、至少约5,000,000个寡核苷酸分子、至少约10,000,000个寡核苷酸分子、至少约50,000,000个寡核苷酸分子、至少约100,000,000个寡核苷酸分子，并且在一些情况下至少约十亿个寡核苷酸分子。

在一些情况下，可能期望将多个不同的条形码掺入样品内，这些条形码附接到样品内的单个或多个颗粒(例如珠粒)。例如，在一些情况下，混合但已知的条形码序列组可以在随后的处理中为鉴别提供更大的保证，例如，通过向给定样品或其部分提供更强的条形码地址或归属，作为对来自给定样品的输出的重复确认或独立确认。

在施加特定刺激时，寡核苷酸可以能够从颗粒(例如珠粒)释放。在一些情况下，该刺激可以是光刺激，例如通过光不稳定键的裂解，由此释放寡核苷酸。在其他情况下，可以使用热刺激，其中颗粒(例如珠粒)环境的温度升高将导致键断裂，或者寡核苷酸从颗粒(例如珠粒)的其他释放。在还有其他情况下，使用化学刺激物来裂解寡核苷酸与珠粒的键联，或以其他方式导致寡核苷酸从颗粒(例如珠粒)释放。在一种情况下，此类组合物包括上述用于封装生物颗粒的聚丙烯酰胺基质，并且可以通过暴露于还原剂(诸如二硫苏糖醇(DTT))而降解以释放附接的寡核苷酸。

本文所述的样品可以包含一个或多个生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞核)、一个或多个携带条形码的颗粒(例如珠粒)，或者至少包含一个生物颗粒和一个携带条形码的颗粒(例如珠粒)两者。

在一些方面，本发明的方法可以应用于OCT包埋组织，并且申请人的数据(未展示)表明，从OCT包埋组织中分离的细胞核适用于分离后的下游样品处理，并进一步产生强大的复杂数据。

在一些方面，本文所述的方法(包括实施例1的那些方法)已经成功地从以下样品中分离出活细胞核：免疫细胞；神经元细胞(脑组织)；以及癌组织样品，诸如肾、乳腺、肠、结肠、直肠、肺、皮肤、卵巢、胰腺和前列腺的肿瘤。不相容的样品是钙化组织，诸如骨、植物组织、几丁质昆虫组织和固定组织(诸如FFPE或PFA样品)。

纯化方法

本发明提供了用于例如从生物样品(例如，组织样品，例如冷冻组织样品)纯化生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞器，诸如细胞核)的方法。可以例如通过如本文所述的方法、通过裂解缓冲液、超声处理、机械裂解或其组合来裂解生物样品。本文所述的方法可以用于将生物颗粒纯化例如相对于起始混合物的至少50％(例如，至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多)。

通常通过提供本发明的试剂盒并向容器的入口提供包含生物颗粒的液体混合物来纯化生物颗粒。液体混合物的密度小于容器中的液体层的密度。触变层在出口和触变层之间保持第一液体的密度梯度。该方法通常包括对该容器进行离心。触变层分离第一层和液体混合物，并在离心过程中允许生物颗粒通过触变层传递到第一层。各种细胞碎片和完整细胞可以保留在触变层上方的顶层中，而诸如细胞器(例如，细胞核)之类的微粒组分可以在容器的底部沉淀。

该方法还可以包括在离心后去除上清液，例如通过倾析或弃去上清液。可以将容器插入外部容器中以收集流过的液体。该方法可以包括打开容器的顶端以形成出口，使得液体可以流过出口。该方法还可以包括洗脱生物颗粒。洗脱可以包括对容器进行离心，使得生物颗粒经由出口离开容器并被收集在外部容器中。该方法还可以包括洗涤生物颗粒。该方法还可以包括例如在洗脱之前或之后，将生物颗粒重悬于例如合适的储存缓冲液(诸如等渗缓冲液)中。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于一种用离心管纯化生物颗粒的方法。离心管包含由细胞培养基和预先确定的密度(例如，约10％至约50％)的碘克沙醇(例如，约15％至约45％、约20％至约35％、约22％至约32％或约24％至约30％，例如约24％至约30％碘克沙醇，或密度为例如约1.11g/mL至约1.2g/mL(例如约1.146g/mL至约1.175g/mL，例如约1.1107g/mL、1.117g/mL、1.127g/mL、1.136g/mL、1.146g/mL、1.156g/mL、1.165g/mL或1.175g/mL，例如约1.146g/mL至约1.175g/mL))构成的液体。离心管可以与具有生物颗粒(例如，细胞或细胞核)悬浮液的液体一起离心。液体的密度允许生物颗粒在离心管的底部沉淀，并且由于尺寸较小，碎片保留在溶液中(图2)。

离心可以以单一速度或以多种速度进行。例如，可以将液体混合物以第一速度离心(例如，约150g至约300g，例如持续约5至约10分钟)，然后以第二速度离心(例如，高于第一速度，例如约500g至约1000g，例如持续约5至约10分钟，例如约10分钟)。通过使用两种速度的离心，生物材料可以以第一速度沉淀，上清液可以被交换，并且期望的生物颗粒随后以第二速度在离心管的底部沉淀。

该方法还可以包括在离心后去除上清液，例如通过倾析或弃去上清液。该方法还可以包括洗涤生物颗粒。该方法还可以包括例如在洗脱之前或之后，将生物颗粒重悬于例如合适的储存缓冲液(诸如等渗缓冲液)中。

合适的储存缓冲液包括例如磷酸盐缓冲盐水，或包含例如20mM Tris-HCl(pH7.4)、0.25M蔗糖、25mM KCl、5mM MgCl₂、0.01％ IGEPAL CA-630、0.2U/μl SUPERase InRNA酶抑制剂、0.1％ BSA、2mM精胺和0.1％TWEEN-20(聚山梨醇酯20)的缓冲液。

在另一个实施方案中，进行第一离心步骤，其中样品的所有内容物被沉淀。在第一次离心之后，可以去除上清液，例如通过倾析或弃去。然后可以将细胞培养基添加到沉淀物中。细胞培养基可以具有预先确定的密度(例如，约10％至约50％)的碘克沙醇，例如约15％至约45％、约20％至约35％、约22％至约32％或约24％至约30％，例如约24％至约30％碘克沙醇，或密度为例如约1.11g/mL至约1.2g/mL，例如约1.146g/mL至约1.175g/mL，例如约1.1107g/mL、1.117g/mL、1.127g/mL、1.136g/mL、1.146g/mL、1.156g/mL、1.165g/mL或1.175g/mL，例如约1.146g/mL至约1.175g/mL，例如约1.146g/mL至约1.175g/mL。当对该样品进行离心时，仅某些(例如，期望的)生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞核)保留在沉淀物中。

在另一个实施方案中，本文所述的方法包括使用如本文所述的试剂盒纯化生物颗粒的第二子组，该试剂盒例如包含具有入口、出口和定位在装置中的过滤器的装置。该试剂盒还包括该装置装配在其中的容器。该方法包括提供试剂盒；向该装置的入口提供具有生物颗粒的液体混合物；以及对该容器中的该装置进行离心。生物颗粒的第一子组被过滤器截留，并且生物颗粒的第二子组离开出口并被收集在该容器中。

在一些实施方案中，该容器包含密度大于1.0g/m的介质，并且生物颗粒的第二子组被收集在该介质中，例如在离心期间沉淀。

在一些实施方案中，本文所述的纯化方法允许用户产生具有期望特征的生物颗粒群体。例如，在一些实施方案中，纯化产生生物颗粒群体，其包含可用的(例如，活的)细胞或其微粒组分的合适级分，例如细胞器，例如细胞核(例如，50％至100％、60％至100％、70％至100％、80％至100％、90％至100％或95％至100％的生物颗粒)。在一些实施方案中，纯化产生至少10％的生物颗粒，例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的生物颗粒可用于期望的目的。

纯化方法可以以不干扰细胞完整性、改变特征(例如，基因表达)、激活、灭活、分化细胞或降低细胞活力的方式进行。在一些实施方案中，纯化后，每个基因的相对表达水平改变小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于2％或小于1％。在一些实施方案中，细胞的每个基因的相对表达水平保持基本上恒定。在一些实施方案中，该方法不激活或灭活细胞。例如，纯化可以避免机械地破坏细胞，这种破坏将引发激活或灭活细胞(例如，免疫细胞，诸如T细胞或B细胞)的信号级联。在一些实施方案中，纯化方法不损伤或杀死生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞核)，例如，导致其中的内容物泄漏。在一些实施方案中，纯化方法不引发细胞凋亡或坏死。

本文描述的方法可以用于纯化生物颗粒(例如，细胞或其微粒组分，例如细胞核)，例如以高通量产生均匀且可预测的尺寸的生物颗粒群体。这些方法可以用于纯化生物颗粒以供后续使用，诸如掺入到作为微型化学反应器的液滴中，其中化学反应物的体积很小(约数pL)。

裂解方法

在另一个实施方案中，本发明的特征在于一种用具有一个或多个尖锐特征的装置裂解生物颗粒的方法。该装置包括具有入口和出口的流动路径以及设置在流动路径中的至少一个尖锐特征。该方法包括提供该装置并使含有生物颗粒的液体混合物流过流动路径(例如，经由入口)。生物颗粒在与尖锐特征相互作用时被裂解，并且生物颗粒或其内容物的至少一部分经由出口离开流动路径。该方法还可以包括例如用合适的洗涤缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)洗涤流动路径中的生物颗粒，例如一次或多次。

在一些实施方案中，该方法包括向液体混合物或流动路径提供磁性颗粒(图4)。磁性颗粒(例如，珠粒)可以被配置为结合和/或捕获生物材料，诸如细胞破裂后的背景(例如，细胞质)RNA。磁性颗粒还可以增加生物颗粒的裂解效率。磁性颗粒可以用于分离出附着于磁性颗粒的生物材料(例如，通过使磁性颗粒沉淀)或使用磁体来选择性地去除或移动附着有生物颗粒的磁性颗粒。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于一种利用与容器一起使用的具有一个或多个尖锐特征的装置裂解生物颗粒的方法。该方法包括将该装置放置在该容器(例如离心管)中。该方法还包括向该装置的入口提供包含生物颗粒的液体混合物，以及对该容器进行离心。在离心时，至少一个特征裂解生物颗粒，并且生物颗粒或其内容物的至少一部分经由出口离开流动路径并被收集在容器中。

在一些实施方案中，期望的生物颗粒(例如，细胞核)被收集在容器中。在一些实施方案中，不期望的生物颗粒被收集在容器中。

在一些实施方案中，不同的生物材料优先在不同的时间离开流动路径的出口，从而允许分离。例如，在一个实施方案中，期望的生物颗粒(诸如细胞核)首先离开出口并被收集在容器中，而不期望的生物材料(诸如细胞碎片、背景(例如，细胞质)RNA或其他破裂的细胞组分)保留在流动路径中。在一些实施方案中，不期望的生物材料(诸如细胞碎片、背景(例如，细胞质)RNA或其他破裂的细胞组分)首先离开出口并被收集在容器中，而期望的生物颗粒(诸如细胞核)保留在流动路径中。可以洗涤期望的颗粒一次或多次以去除过量的不期望的颗粒。

在一些实施方案中，本文所述的裂解方法采用具有过滤器的装置，该过滤器例如定位在流动路径中的出口处或出口的上游，并且被配置为截留预先确定的尺寸的颗粒。过滤器可以例如充当流动路径中的基于尺寸的过滤器或充当一系列障碍物。过滤器可以截留期望的生物颗粒。另选地，过滤器可以截留不期望的生物材料。过滤器也可以在尖锐特征的上游采用，例如以去除大的碎片(图4和图10)。

在一些实施方案中，用于裂解生物颗粒的方法包括使用如本文所述的试剂盒，该试剂盒包括装置(例如，具有入口和出口以及带有流动路径的层，该流动路径具有设置在流动路径中的拐角半径小于约1mm的至少一个特征)和用于容纳该装置的容器。该方法包括提供试剂盒；向该装置的入口提供具有生物颗粒的液体混合物；以及对该容器中的该装置进行离心。至少一个特征裂解生物颗粒，并且生物颗粒的内容物的至少一部分经由出口离开流动路径并被收集在容器中。在一些实施方案中，该容器包含密度大于1.0g/m的介质，并且生物颗粒的内容物被收集在该介质中，例如在离心期间沉淀。在一些实施方案中，该装置还包括设置在该装置中的过滤器，并且该过滤器例如在裂解之前或之后将预先确定的尺寸的生物颗粒截留在该过滤器中。

在另一个实施方案中，裂解方法包括采用具有容器和研杵的试剂盒，例如，它们各自具有沿着容器和/或研杵的壁设置的具有小于约1mm的拐角半径的一个或多个特征。该方法包括提供试剂盒；在容器中提供包含生物颗粒的液体混合物；以及在容器中旋转研杵(例如，一次或多次)。容器和/或研杵的特征裂解生物颗粒(图11)。

在一些实施方案中，本文所述的裂解方法允许用户在不存在裂解试剂(诸如表面活性剂)的情况下进行裂解。另外，裂解方法可以在存在量太低而不能单独引起裂解的裂解剂的情况下进行。

裂解方法可以以在裂解后不干扰生物颗粒的某些内容物(例如，细胞组分，诸如细胞核)的完整性、改变特征(例如，基因表达)、激活、灭活、分化生物颗粒的某些内容物或降低生物颗粒的某些内容物的活力的方式进行。在一些实施方案中，裂解后，每个基因的相对表达水平在细胞组分(例如，细胞核或线粒体)中改变小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于2％或小于1％。在一些实施方案中，细胞组分的每个基因的相对表达水平保持基本上恒定。在一些实施方案中，该方法不激活或灭活生物颗粒。例如，裂解可以避免机械地破坏细胞核，这种破坏将引发激活或灭活细胞核的信号级联。在一些实施方案中，裂解方法不损伤或杀死生物颗粒(例如，细胞核)，例如，导致其中的内容物泄漏。

下游方法

如本文所述的裂解和/或纯化方法可以用于产生用于下游方法或应用的生物颗粒。多种应用需要评估生物颗粒群内不同生物颗粒或生物体类型的存在和定量，包括例如微生物组分析和表征、环境测试、食品安全性测试、例如在污染物溯源中的流行病学分析等。

本公开的装置、系统、组合物和方法可以用于各种应用，诸如处理来自单个细胞或细胞核的单种分析物(例如生物分析物，例如RNA、DNA或蛋白质)或多种分析物(例如生物分析物，例如DNA和RNA、DNA和蛋白质、RNA和蛋白质，或者RNA、DNA和蛋白质)。例如，生物颗粒(例如细胞、细胞核或病毒)可以在液滴中形成，并且来自生物颗粒(例如细胞或细胞核)的一种或多种分析物(例如生物分析物)可以被修饰或检测(例如，被分析物部分结合、标记或以其他方式修饰)用于后续处理。多种分析物可以来自单个细胞或细胞核。该过程可以实现例如对细胞/细胞核或其群体的蛋白质组、转录组和/或基因组分析(例如，对细胞/细胞核或其群体同时进行蛋白质组、转录组和/或基因组分析)。

修饰分析物的方法包括在液体载体(例如，水性载体)中提供多个颗粒(例如，珠粒)；提供在样品液体中含有分析物(例如，作为细胞、细胞核或者其组分或产物的一部分)的样品；以及使用该装置来结合这些液体并且形成含有一种或多种颗粒和一种或多种分析物(例如，作为一个或多个细胞、细胞核或者其组分或产物的一部分)的分析物液滴。液滴中一种或多种颗粒与分析物(例如，与细胞或细胞核相关联的生物分析物)的这种隔离使得能够对大的异源样品(例如，异源群体内的单个细胞或细胞核)的离散部分进行标记。液滴或颗粒一旦被标记或以其他方式进行修饰，就可以随后被分选或结合(例如，通过破坏乳液)，并且可以分析所得的液体以确定与众多单细胞或细胞核中的每一者相关联的多种特性。

另一个实施方案提供了单细胞(或单细胞核)核酸测序的方法，其中细胞/细胞核的异源群体可以通过它们各自的基因表达例如相对于该群体的其他细胞/细胞核来表征。本文论述的和本领域已知的为细胞/细胞核加条形码的方法可以是本文提供的单细胞(或单细胞核)核酸测序方法的一部分。在加条形码之后，对已经加条形码的核酸转录物进行测序，并且可以根据已知方法对序列进行处理、分析和储存。在一些实施方案中，这些方法能够生成包含异源群体内的任何单细胞或细胞核的基因表达数据的基因组文库。

在另一个方面，本公开提供了一种用于从具有生物颗粒的样品中去除或耗竭不需要的组分(例如，死细胞或细胞外分子)的替代方法。在一个实施方案中，该方法包括提供具有生物颗粒和源自生物颗粒(例如，活细胞或死细胞)的不需要的组分的样品。在另外的实施方案中，生物颗粒是活的(或完整的)细胞或完整的细胞核。在另外的实施方案中，生物颗粒是活的(或完整的)细胞或完整的细胞核。在另一个实施方案中，不需要的组分包括死亡或垂死的细胞、不完整的细胞核、细胞外分析物或分子和其他碎片中的一种或多种。在一个实施方案中，该方法包括磁性地标记不需要的组分(例如，死细胞)和/或磁性地捕获或截留样品中不需要的组分(例如，细胞外分子，诸如背景RNA)以提供具有被磁性标记的不需要的组分和未被标记(即未被磁性标记)的生物颗粒(例如，活细胞或完整的细胞核)的悬浮液(例如，水性悬浮液或液体)。在不需要的细胞外分子的情况下，可以使用被配置为结合或截留这样的分子的磁性颗粒。在一个实施方案中，该方法包括提供用于分离的装置，该装置包括具有入口和出口的流动路径(以及任选地，容器)和磁源，该磁源被设置成在流动路径中的颗粒上或在磁性颗粒离开流动路径之后在磁性颗粒上施加磁场。在一个实施方案中，该方法还包括使悬浮液例如经由入口流入流动路径中。在另一个实施方案中，该装置经受一定条件，这些条件允许被磁性标记的不需要的组分例如经由磁源来固定在样品中的一定位置。

在一些方面，本公开涉及从细胞分离细胞核的方法，该方法包括在等渗缓冲液中温育哺乳动物细胞并使包含哺乳动物细胞的组合物通过过滤器，其中通过的组合物包含与细胞分离的细胞核。在另一个方面，进一步纯化包含细胞核的组合物以去除细胞碎片。

实施例

实施例1

从固体组织或悬浮细胞中分离细胞核的方案。

A.将离心机预冷至4℃并将试剂和管置于冰上。

B.将样品解离管置于干冰上。

C.获得冷冻的组织样品并立即置于干冰上。

D.将冷冻的组织(约3至约50mg之间)转移至预冷的样品解离管。

E.将样品解离管转移至湿冰。将裂解缓冲液添加到样品解离管中。解离组织直到均匀，可以用研杵或其他手段进行。对于多个样品，将裂解缓冲液添加到每个组织中，然后一次解离一个组织。

F.添加裂解缓冲液并混合(任选地用移液管)。如果移液管吸头被未均质化的组织堵塞，继续用任选的研杵解离组织，直到能用移液管混合。

G.在冰上温育10分钟。

H.将解离的组织转移到与收集管组装在一起的预冷细胞核分离柱中。将所有液体从解离管转移到细胞核分离柱，以避免细胞核损失。

I.任选地在约4℃下以约16,000rcf离心约20秒，使细胞核离心沉降以将细胞碎片与细胞核分离。

J.丢弃柱。收集管中的流出物将含有细胞核。任选地通过涡旋，将细胞核重悬于收集管中。

K.对收集管进行离心，任选地在约4℃下以约500rcf离心约3分钟。弃去上清液，不要扰动细胞核沉淀物。如果细胞核沉淀物不明显，留下一小部分(约200μl)上清液。

L.将细胞核沉淀物重悬于碎片去除缓冲液中，任选地重悬于约500μl碎片去除缓冲液中。轻轻混合，直到看不到沉淀物。

M.离心，任选地在约4℃下以约700rcf离心约10分钟。小心地弃去上清液，不要扰动细胞核沉淀物。如果细胞核沉淀物不明显，留下一小部分(约200μl)上清液。

N.将细胞核沉淀物重悬于洗涤和重悬缓冲液中，任选地重悬于1mL洗涤和重悬缓冲液中。

O.离心，任选地在约4℃下以约500rcf离心约5分钟。使用移液管小心地弃去上清液，不要扰动细胞核沉淀物。如果细胞核沉淀物不明显，留下一小部分(约200μl)上清液。

P.将细胞核沉淀物重悬于洗涤和重悬缓冲液中，任选地约1mL洗涤和重悬缓冲液。

Q.离心，任选地在约4℃下以约500rcf离心约5分钟。弃去尽可能多的上清液，不要扰动细胞核沉淀物。如果沉淀物不可见，留下少量剩余体积。

R.将细胞核沉淀物重悬于洗涤和重悬缓冲液中，任选地约50至500μL洗涤和重悬缓冲液，这可能取决于输入组织类型和质量的预期回收率。轻轻混合(任选地用移液管)。

S.涡旋细胞核，任选地在即将计数之前以约3,200rpm或最大速度涡旋约3秒，以确保准确的细胞核计数。涡旋后脉冲旋转管以收集管底部的液体。不要脉冲旋转管超过1秒，以确保细胞核不会在管的底部沉淀。

T.确定细胞核浓度，任选地使用AOPI或乙锭同型二聚体-1荧光染色染料，并且必要时稀释以达到目标细胞核负荷。

U.涡旋细胞核，任选地以约3,200rpm或最大速度涡旋约3秒。涡旋后脉冲旋转管以收集管底部的液体。不要脉冲旋转管超过1秒，以确保细胞核不会在管的底部沉淀。

V.将样品保持在冰上并立即进行分离的细胞核的相关测定，任选地表征分离的细胞核的核酸。

Claims (62)

1.一种纯化生物颗粒的方法，包括：

a)提供容器，所述容器包括：

(i)入口；

(ii)第一层，所述第一层包含具有第一密度的第一液体；以及

(ii)设置在所述第一层上方的触变层；

(b)向所述容器的所述入口提供包含所述生物颗粒的液体混合物，其中所述液体混合物的密度小于所述第一密度；以及

(c)对所述容器进行离心；

其中所述触变层分离所述第一层和所述液体混合物，并在离心过程中允许所述生物颗粒传递到所述第一层。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括(d)在离心后去除上清液。

3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中，将所述容器插入外部容器中。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述容器包括出口。

5.根据权利要求4所述的方法，还包括打开所述容器的顶端以形成所述出口。

6.根据权利要求4所述的方法，还包括对所述容器进行离心，其中所述生物颗粒经由所述出口离开所述容器并被收集在所述外部容器中。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一层和/或所述液体混合物包含碘克沙醇。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一层包含约30％碘克沙醇。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述液体混合物包含约25％碘克沙醇。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述触变层包含聚合物凝胶。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述聚合物凝胶包含聚酯。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物颗粒是细胞或其微粒组分。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述微粒组分是细胞器。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞器是细胞核。

15.一种试剂盒，包括外部容器和可移除插入件，所述可移除插入件被配置为装配在所述容器中，所述可移除插入件包括：

(a)入口；

(b)第一层，所述第一层包含具有第一密度的第一液体；以及

(c)设置在所述第一层上方的触变层，其中所述触变层被配置为分离所述第一层和稀释液，所述稀释液的密度低于向所述插入件的所述入口提供的所述第一密度。

16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述可移除插入件包括出口。

17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述出口包括易断的或可移除的顶端。

18.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述第一层包含碘克沙醇。

19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述第一层包含约30％碘克沙醇。

20.根据权利要求18所述的试剂盒，还包括所述稀释液。

21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述稀释液包含约25％碘克沙醇。

22.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述触变层包含聚合物凝胶。

23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述聚合物凝胶包含聚酯。

24.根据权利要求15所述的试剂盒，还包括细胞裂解缓冲液。

25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述细胞裂解缓冲液包含10mM Tris-HCl(pH7.4)、10mM NaCl、3mM MgCl₂、0.01％IGEPAL CA-630(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、0.2U/μlSUPERase In RNA酶抑制剂、0.1％BSA、2mM精胺和0.1％TWEEN-20(聚山梨醇酯20)。

26.根据权利要求15所述的试剂盒，还包括等渗缓冲液。

27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述等渗缓冲液包含20mM Tris-HCl(pH7.4)、0.25M蔗糖、25mM KCl、5mM MgCl₂、0.01％IGEPAL CA-630、0.2U/μlSUPERaseIn RNA酶抑制剂、0.1％BSA、2mM精胺和0.1％TWEEN-20。

28.根据权利要求15所述的试剂盒，还包括帽，所述帽被配置为密封所述可移除插入件的所述入口。

29.一种装置，包括离心管，所述离心管包含具有组织培养基和约10％至约50％碘克沙醇的液体。

30.根据权利要求29所述的装置，其中所述液体包含约24％至约30％碘克沙醇。

31.根据权利要求29所述的装置，其中所述液体的密度为约1.11g/mL至约1.12g/m。

32.一种纯化生物颗粒的方法，包括：

(a)提供根据权利要求29所述的装置；

(b)向所述离心管提供包含所述生物颗粒的液体混合物；以及

(c)对所述离心管进行离心；

其中在离心过程中，所述生物颗粒移动到所述离心管的底部。

33.一种用于裂解生物颗粒的装置，包括流动路径，所述流动路径包括：

(a)入口；

(b)出口；以及

(c)设置在所述流动路径中的拐角半径小于约1mm的至少一个特征。

34.根据权利要求33所述的装置，其中所述流动路径包括多个特征，每个特征具有小于约1mm的拐角半径并且设置在所述流动路径中。

35.根据权利要求34所述的装置，其中所述特征中的至少两个特征被定位成对准并且位于所述流动路径的相对两侧上。

36.根据权利要求34所述的装置，其中所述多个特征以锯齿图案布置。

37.根据权利要求33所述的装置，其中所述装置包括多个流动路径，每个流动路径包括：

(a)入口；

(b)出口；以及

(c)设置在所述流动路径中的拐角半径小于约1mm的至少一个特征。

38.根据权利要求37所述的装置，其中所述多个流动路径基本上平行。

39.根据权利要求33所述的装置，还包括过滤器，所述过滤器定位在所述流动路径中的所述出口处或所述出口的上游，并且被配置为截留预先确定的尺寸的颗粒。

40.一种试剂盒，包括根据权利要求33所述的装置和容器，其中所述装置被配置为装配在所述容器中。

41.根据权利要求40所述的试剂盒，还包括帽，所述帽被配置为密封所述装置的所述入口。

42.根据权利要求40所述的试剂盒，其中所述流动路径包括多个特征，每个特征具有小于约1mm的拐角半径并且设置在所述流动路径中。

43.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述特征中的至少两个特征被定位成对准并且位于所述流动路径的相对两侧上。

44.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述多个特征以锯齿图案布置。

45.根据权利要求40所述的试剂盒，其中所述装置包括多个流动路径，每个流动路径包括：

(a)入口；

(b)出口；以及

(c)设置在所述流动路径中的拐角半径小于约1mm的至少一个特征。

46.根据权利要求45所述的试剂盒，其中所述多个流动路径基本上平行。

47.根据权利要求40所述的试剂盒，还包括过滤器，所述过滤器定位在所述流动路径中的所述出口处或所述出口的上游，并且被配置为截留预先确定的尺寸的颗粒。

48.一种用于裂解生物颗粒的方法，包括：

(a)提供装置，所述装置包括具有入口和出口的流动路径，所述流动路径包括至少一个特征，所述至少一个特征具有小于约1mm的拐角半径并且设置在所述流动路径中；以及

(b)使包含所述生物颗粒的液体混合物流过所述流动路径，

其中所述至少一个特征裂解所述生物颗粒，并且其中所述生物颗粒或其内容物的至少一部分经由所述出口离开所述流动路径。

49.根据权利要求48所述的方法，还包括洗涤所述流动路径中的所述生物颗粒。

50.根据权利要求48所述的方法，还包括提供与所述生物颗粒或其内容物的至少一部分结合的磁性颗粒。

51.一种用于裂解生物颗粒的方法，包括：

(a)提供容器和装置，所述装置包括具有入口和出口的流动路径，所述流动路径包括至少一个特征，所述至少一个特征具有小于约1mm的拐角半径并且设置在所述流动路径中，其中所述装置定位在所述容器中；以及

(b)向所述装置的所述入口提供包含所述生物颗粒的液体混合物；

(c)对所述容器中的所述装置进行离心；

其中所述至少一个特征裂解所述生物颗粒，并且其中所述生物颗粒或其内容物的至少一部分经由所述出口离开所述流动路径并被收集在所述容器中。

52.一种试剂盒，包括容器和装置，所述装置被配置为装配在所述容器中，所述装置包括：

(a)入口；

(b)出口；以及

(c)过滤器，所述过滤器定位在所述装置中的所述出口处或所述出口的上游，并且被配置为截留预先确定的尺寸的颗粒。

53.根据权利要求52所述的试剂盒，其中所述装置还包括层，所述层设置在所述出口处或所述出口的上游，并且包括具有至少一个特征的流动路径，所述至少一个特征具有小于约1mm的拐角半径并且设置在所述流动路径中。

54.根据权利要求53所述的试剂盒，其中所述层包括多个流动路径，所述层中的每个流动路径包括：

(i)入口；

(ii)出口；以及

(iii)设置在所述流动路径中的拐角半径小于约1mm的至少一个特征。

55.根据权利要求54所述的试剂盒，其中所述层中的所述多个流动路径基本上平行。

56.根据权利要求52所述的试剂盒，还包括密度大于1.0g/m的介质。

57.一种用于纯化生物颗粒的第二子组的方法，包括：

(a)提供根据权利要求52所述的试剂盒；

(b)向所述装置的所述入口提供包含所述生物颗粒的液体混合物；以及

(c)对所述容器中的所述装置进行离心；

其中所述生物颗粒的第一子组被截留在所述过滤器中，并且所述生物颗粒的第二子组离开所述出口并被收集在所述容器中。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述容器包含密度大于1.0g/m的介质，并且生物颗粒的所述第二子组被收集在所述介质中。

59.一种用于裂解生物颗粒的方法，包括：

(a)提供根据权利要求53所述的试剂盒；

(b)向所述装置的所述入口提供包含所述生物颗粒的液体混合物；以及

(c)对所述容器中的所述装置进行离心；

其中所述至少一个特征裂解所述生物颗粒，并且其中所述生物颗粒的所述内容物的至少一部分经由所述出口离开所述流动路径并被收集在所述容器中。

60.一种用于裂解生物颗粒的试剂盒，包括：

(a)容器，所述容器包括沿着所述容器的壁设置的具有小于约1mm的拐角半径的多个特征；以及

(b)研杵，所述研杵被配置为装配在所述容器内，所述研杵包括沿着所述研杵的壁设置的具有小于约1mm的拐角半径的多个特征。

61.根据权利要求60所述的试剂盒，其中所述容器的所述多个特征和/或所述研杵的所述多个特征以锯齿图案布置。

62.一种裂解生物颗粒的方法，包括：

(a)提供根据权利要求60所述的试剂盒；

(b)在所述容器中提供包含所述生物颗粒的液体混合物；以及

(c)在所述容器中旋转所述研杵，其中所述容器的所述多个特征和/或所述研杵的所述多个特征裂解所述生物颗粒。