CN114288415A - 磷酸钙纳米载药体系及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种磷酸钙纳米载药体系及其制备方法与应用，其包括：S1、提供Ca2+、Tat溶液、Cas9溶液和sgRNA溶液，将所述Ca2+和Tat溶液混合得到第一溶液，将所述Cas9溶液和sgRNA溶液混合得到第二溶液；S2、混合所述第一溶液和第二溶液，分离沉淀得到磷酸钙纳米载药体系。此方法制备过程无任何聚合物及表面活性剂添加，保护了CRISPR/Cas9系统结构完整性，且具有高生物安全性及负载效率等特点。

Description

磷酸钙纳米载药体系及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种磷酸钙纳米载药体系及其制备方法与应用，属于纳米材料领域。
背景技术
磷酸钙(CaP)包括羟基磷灰石具有良好的生物相容性，主要原因是因为它是自然界和脊椎动物硬组织中的主要无机成分，因此，磷酸钙被广泛应用于生物医学领域，如硬组织缺损修复和替换、药物和基因载体、医学成像等。此外，磷酸钙纳米结构具有的pH响应降解性及高效装载能力和持续释放性能，也迅速成为具有良好前景的输送药物/基因/蛋白质的纳米载体。本项研究着重关注于磷酸钙纳米载药体系递送CRISPR/Cas9基因编辑技术方面的研究。
在现有的非病毒纳米载体应用于基因治疗的研究中，已有下述相关报道：
1)Biomaterials Feb；28(6):1267-79报道了通过优化Ca/P化学计量以及Ca2+和PO4 3-溶液的混合模式，合成了纳米级和单分散的CaP-pDNA(质粒DNA)杂交纳米颗粒。但是核酸/Cap混合纳米结构材料合成的传统共聚策略具有生长不受控制以及聚集的缺点
2)J Control Release 2011 Feb 28；150(1):87-93报道了一种无表面活性剂的方法，通过使用PEG双磷酸盐作为稳定剂来稳定DNA/Cap纳米颗粒。二磷酸盐和Cap之间的相互作用形成稳定和生物可吸收的粒子形成，颗粒大小约为200nm。与无需使用PEG双磷酸盐制备的对照样本相比，二磷酸盐稳定DNA/Cap纳米颗粒在几天内表现出更好的分散性和稳定性。但是，这一类聚合物无机纳米载体的共性就是合成步骤较复杂，为材料的合成带来许多不确定因素。
就目前而言，钙基纳米颗粒应用于非病毒载体仍有问题亟待解决，如合成复杂、分散性薄弱等，对其是否可以用于工业化生产至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磷酸钙纳米载药体系及其制备方法与应用，此方法制备过程无任何聚合物及表面活性剂添加，保护了CRISPR/Cas9系统结构完整性，且具有高生物安全性及负载效率等特点。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种磷酸钙纳米载药体系的制备方法，其包括：
S1、提供Ca2+、Tat溶液、Cas9溶液和sgRNA溶液，将所述Ca2+和Tat溶液混合得到第一溶液，将所述Cas9溶液和sgRNA溶液混合得到第二溶液；
S2、混合所述第一溶液和第二溶液，分离沉淀得到磷酸钙纳米载药体系。
进一步地，所述Ca2+来自CaCl2溶液，所述CaCl2溶液的浓度为0.7～0.9mol/L；和/或，所述Tat溶液的浓度为0.6×10-3～0.8×10-3mol/L。
进一步地，所述CaCl2溶液的浓度为0.831mol/L；和/或，所述Tat溶液的浓度为0.69×10-3mol/L。
进一步地，将所述Ca2+和Tat溶液混合得到第一溶液，包括：
将所述Ca2+与Tat溶液充分混合，其中，反应温度为25～30℃，反应时间为1～2h。
进一步地，将所述Cas9溶液和sgRNA溶液混合得到第二溶液，包括：
将Cas9与sgRNA进行混合，其中，反应温度为25～30℃，反应时间为0.5～1h。
进一步地，所述Cas9与sgRNA以摩尔比1:1的反应比例进行混合。
进一步地，步骤S2具体包括：
将所述第一溶液和第二溶液在25～30℃下充分混合，反应1～2h后，得到悬浊液；
将所述悬浊液离心分离，弃去上清液，将下方沉淀复溶，得到所述磷酸钙纳米载药体系。
进一步地，所述Tat溶液包括Tat粉末和分散介质，所述Tat粉末与所述sgRNA的摩尔比为25:1。
本申请还提供一种根据所述的制备方法制得的磷酸钙纳米载药体系，在所述磷酸钙纳米载药体系中，Ca与RNP的质量比为10～50:1。
本申请还提供一种根据所述的磷酸钙纳米载药体系在制备基因诊断与治疗产品中的应用。
与现有技术相比，本申请的有益效果在于：
本申请将CRISPR/Cas9基因编辑系统有效地与Ca2+及Tat结合，形成纳米颗粒，同时可满足生物安全性高、毒性小、RNP Cas9负载效率高且具有pH响应性等特点。
同时，该其合成方法简单、成本低、合成条件绿色环保，稳定性高，易于后续扩大化从而实现工业化生产。并且，所制得磷酸钙非病毒纳米载体在前列腺癌细胞模型中得到验证，可用于临床各类疾病的基因治疗。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为本申请的磷酸钙纳米载药体系的制备方法的流程图；
图2为本申请实施例一的磷酸钙纳米载药体系的透射电镜图；
图3为本申请实施例一的磷酸钙纳米载药体系的粒径测试图；
图4为本申请实施例一的磷酸钙纳米载药体系中的RNP蛋白的圆二色光谱图；
图5为本申请实施例二的磷酸钙纳米载药体系在不同pH的分散介质中的粒径测试图；
图6为本申请实施例三的不同浓度的磷酸钙纳米载药体系在λ＝260nm附近RNP的紫外吸收光谱图；
图7为本申请实施例三的不同浓度的磷酸钙纳米载药体系在λ＝260nm附近RNP的及标准曲线方程；
图8为本申请实施例三的磷酸钙纳米载药体系的紫外吸收光谱图；
图9为本申请实施例四的磷酸钙纳米载药体系的CCK细胞毒性分析图；
图10为本申请实施例五的磷酸钙纳米载药体系在前列腺癌细胞的蛋白质印迹。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
需要说明的是：本发明的“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等用语只是参考附图对本发明进行说明，不作为限定用语。
请参见图1，本申请公开了一种磷酸钙纳米载药体系的制备方法，其包括：
S1、提供Ca2+、Tat溶液、Cas9溶液和sgRNA溶液，将所述Ca2+和Tat溶液混合得到第一溶液，将所述Cas9溶液和sgRNA溶液混合得到第二溶液；
S2、混合所述第一溶液和第二溶液，分离沉淀得到磷酸钙纳米载药体系。
可选的，所述Ca2+来自CaCl2溶液，所述CaCl2溶液的浓度为0.7～0.9mol/L；诚然，在其他实施例中，Ca2+还可以来自其他钙盐溶液。并且，作为本申请示出的实施例，CaCl2溶液可以是CaCl2固体粉末溶解于去离子水中所形成。
可选的，所述Tat溶液的浓度为0.6×10-3～0.8×10-3mol/L。并且，作为本申请示出的实施例，Tat溶液可以是细胞穿膜肽Tat粉末溶解于去离子水中所形成。
优选的，所述CaCl2溶液的浓度为0.831mol/L；所述Tat溶液的浓度为0.69×10- 3mol/L。
具体的，步骤S1中：
将所述Ca2+和Tat溶液混合得到第一溶液，包括：将所述Ca2+与Tat溶液充分混合，其中，反应温度为25～30℃，反应时间为1～2h。
将所述Cas9溶液和sgRNA溶液混合得到第二溶液，包括：将Cas9与sgRNA进行混合，其中，反应温度为25～30℃，反应时间为0.5～1h。
步骤S2包括：
将所述第一溶液和第二溶液在25～30℃下充分混合，反应1～2h后，得到悬浊液；
将所述悬浊液离心分离，弃去上清液，将下方沉淀复溶，得到所述磷酸钙纳米载药体系。
可选的，所述Cas9与sgRNA以摩尔比1:1的反应比例进行混合。所述Tat溶液包括Tat粉末和分散介质，所述Tat粉末与所述sgRNA的摩尔比为25:1。
可选的，在离心分离过程中，离心条件为10000rmp，离心时间为20min
本申请还提供一种根据所述的制备方法制得的磷酸钙纳米载药体系，在所述磷酸钙纳米载药体系中，Ca与RNP的质量比为10～50:1，作为本申请示出的实施例，所用Ca与RNP的质量比优选为40:1，所制得的载药体系的负载RNP含量高达74％。
本申请还提供一种根据所述的磷酸钙纳米载药体系在制备基因诊断与治疗产品中的应用，作为本申请示出的实施例，以前列腺癌细胞系DU145为模型，分别以CaCl2:RNP质量比为10:1、20:1、30：1、40:1的合成方案，以验证蛋白敲低表达效率。
下面将结合具体实施例来对本申请进行进一步详细说明。
实施例一 磷酸钙纳米载药体系的制备
a)称量CaCl2固体粉末溶解于分散介质中，配制CaCl2溶液待用，所述CaCl2溶液的浓度为0.831mol/L，所述分散介质为去离子水；
b)将细胞穿膜肽Tat粉末溶解于分散介质中，配制Tat溶液待用，所述Tat溶液的浓度为0.69×10-3mol/L，所述分散介质为去离子水；
c)将所述CaCl2溶液与Tat溶液充分混合，所用Ca:RNP质量比为40:1，所用Tat(提供胺基)与sgRNA(提供PO4 3-)摩尔比为25:1，反应温度为25℃，反应时间为1h。
d)另外，将Cas9与sgRNA以摩尔比1:1的反应比例进行混合，所述Cas9溶液浓度为1.86g/L，所述sgRNA溶液浓度为0.43g/L，反应温度25℃，反应时间30min，得到轻度白色浑浊溶液。
e)将上述两种溶液充分混合，反应温度为25℃，反应时间1h，得到透明澄清的纳米颗粒悬浊液；
f)将所述悬浊液离心分离(10000rpm、时长为20min)，弃去上清，下方沉淀去离子水复溶，得到最终的磷酸钙纳米载药体系。
除此之外，还通过本实施例的方法制备了其他不同浓度的磷酸钙纳米载药体系，具体的，所有制得的磷酸钙纳米载药体系中，磷酸钙纳米颗粒的浓度为0.01μg/μL、0.02μg/μL、0.05μg/μL、0.08μg/μL、0.1μg/μL。
请参见图2至图4，图2示出了本实施例的磷酸钙纳米颗粒的粒径为170-220nm，其形貌为球形且均一，同时具有较好的分散性。图3则观察了本实施例的磷酸钙纳米颗粒在0-7天的粒径大小情况，由图可知本申请所制备得到的磷酸钙纳米颗粒具有较好的稳定性。图4观察了RNP Cas9在制备过程中其蛋白结构情况，该圆二色光谱图反映了RNP Cas9结构在制备过程中无任何改变，其合成安全，无结构破坏。
实施例二 磷酸钙纳米颗粒的pH响应性
将实施例一中所制得的磷酸钙纳米载药体系分别置于分散介质为pH＝5.0、pH＝6.5、pH＝7.4的溶液中，并检测其粒径变化情况，其中pH＝5.0及pH＝6.5分散介质为乙酸溶液配制获得；pH＝7.4分散介质为去离子水。该纳米颗粒在pH＝5.0时立即解离，即体外模拟溶酶体内酸性环境中，发生pH响应；在pH＝6.5时，即体外模拟肿瘤微环镜pH值，纳米颗粒仍可保持结构稳定。请参见图5，因此可说明，由于RNP高效入核，该纳米颗粒在进入肿瘤微环境初期，不会提前释放RNP，而是经过细胞内吞经过溶酶体时，才会产生pH响应。
实施例三 磷酸钙纳米载药体系的RNP负载率
测量根据实施例一的方法制得的磷酸钙纳米颗粒浓度为0.01μg/μL、0.02μg/μL、0.05μg/μL、0.08μg/μL、0.1μg/μL的磷酸钙纳米载药体系在λ＝260nm附近RNP的紫外吸收光谱，如图6所示。再将其离心提纯，取上清液测量其紫外吸收峰值，如图8所示，根据计算：(总RNP浓度-上清RNP浓度)/总RNP浓度，得到RNP的负载率为70％。具体的，根据拟合方程Y＝10.3X-0.01(图7)计算可得，在260nm吸收峰处，溶液总RNP浓度为0.05μg/μL，上清RNP浓度为0.015μg/μL。
实施例四 磷酸钙纳米载药体系的细胞毒性考察
检测根据实施例一的方法制得的磷酸钙纳米颗粒浓度在0、0.1mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、0.75mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL的磷酸钙纳米载药体系与去势抵抗性前列腺癌细胞系PC3细胞孵育24小时后，弃上清，加入等量CCK溶液，1～2小时后测量CCK溶液在450nm处的吸光值(OD值)，以检测96孔板内细胞活力，结果如图9所示。
实施例五 磷酸钙纳米载药体系在前列腺癌细胞的蛋白敲低表达效率
请参见图10，本实施例根据实施例一的方法制备磷酸钙纳米载药体系，且按照CaCl2:RNP质量比为10:1、20:1、30：1、40:1的合成方案，以前列腺癌细胞系DU145为模型来验证蛋白敲低表达效率。该图以前列腺癌细胞系PC-3为实例，利用Western blot技术在蛋白表达方面验证CRISPR/Cas9基因敲除验证。
综上所述：
本申请将CRISPR/Cas9基因编辑系统有效地与Ca2+及Tat结合，形成纳米颗粒，同时可满足生物安全性高、毒性小、RNP Cas9负载效率高且具有pH响应性等特点。
同时，该其合成方法简单、成本低、合成条件绿色环保，稳定性高，易于后续扩大化从而实现工业化生产。并且，所制得磷酸钙非病毒纳米载体在前列腺癌细胞模型中得到验证，可用于临床各类疾病的基因治疗。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种磷酸钙纳米载药体系的制备方法，其特征在于，包括：
S1、提供Ca2+、Tat溶液、Cas9溶液和sgRNA溶液，将所述Ca2+和Tat溶液混合得到第一溶液，将所述Cas9溶液和sgRNA溶液混合得到第二溶液；
S2、混合所述第一溶液和第二溶液，分离沉淀得到磷酸钙纳米载药体系。
2.如权利要求1所述的磷酸钙纳米载药体系的制备方法，其特征在于，所述Ca2+来自CaCl2溶液，所述CaCl2溶液的浓度为0.7～0.9mol/L；和/或，所述Tat溶液的浓度为0.6×10-3～0.8×10-3mol/L。
3.如权利要求2所述的磷酸钙纳米载药体系的制备方法，其特征在于，所述CaCl2溶液的浓度为0.831mol/L；和/或，所述Tat溶液的浓度为0.69×10-3mol/L。
4.如权利要求1所述的磷酸钙纳米载药体系的制备方法，其特征在于，将所述Ca2+和Tat溶液混合得到第一溶液，包括：
将所述Ca2+与Tat溶液充分混合，其中，反应温度为25～30℃，反应时间为1～2h。
5.如权利要求1所述的磷酸钙纳米载药体系的制备方法，其特征在于，将所述Cas9溶液和sgRNA溶液混合得到第二溶液，包括：
将Cas9与sgRNA进行混合，其中，反应温度为25～30℃，反应时间为0.5～1h。
6.如权利要求5所述的磷酸钙纳米载药体系的制备方法，其特征在于，所述Cas9与sgRNA以摩尔比1:1的反应比例进行混合。
7.如权利要求1所述的磷酸钙纳米载药体系的制备方法，其特征在于，步骤S2具体包括：
将所述第一溶液和第二溶液在25～30℃下充分混合，反应1～2h后，得到悬浊液；
将所述悬浊液离心分离，弃去上清液，将下方沉淀复溶，得到所述磷酸钙纳米载药体系。
8.如权利要求1所述的磷酸钙纳米载药体系的制备方法，其特征在于，所述Tat溶液包括Tat粉末和分散介质，所述Tat粉末与所述sgRNA的摩尔比为25:1。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的制备方法得到的磷酸钙纳米载药体系，其特征在于，在所述磷酸钙纳米载药体系中，Ca与RNP的质量比为10～50:1。
10.根据权利要求9所述的磷酸钙纳米载药体系在制备基因诊断与治疗产品中的应用。
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