CN114276916B - 一种贴壁细胞非消化计数方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种贴壁细胞非消化计数方法和装置。其可解决操作过程对贴壁细胞数量及活率的影响，并能够提高操作效率，保障准确性。其包括中空管；所述中空管第一端连接有液体注入机构，中空管第二端通过四通接头与十字形显示管相连通。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种贴壁细胞非消化计数方法和装置。
背景技术
在现如今的间充质干细胞、DC免疫细胞等制备培养行业中，常规使用的细胞计数仪，都需要将贴壁细胞消化下来，进行取样计数，对于这些操作，十分耗时且麻烦，而且对细胞的扩增数量及传代、收获时间确定不确切，会很主观的判断细胞增长融合度及数量。另外，还存在消化细胞对细胞状态及活率的影响，且容易损耗细胞数量、计数结果不准确。
为提高效率，在保证细胞质量的前提下，需对细胞进行数量及活率检测。故有必要对现有技术的贴壁细胞进行细胞计数装置及方法进行研究，以解决行业痛点。
发明内容
本发明就是针对现有技术存在的缺陷，提供一种贴壁细胞非消化计数方法和装置，其可解决操作过程对贴壁细胞数量及活率的影响，并能够提高操作效率、保障准确性，为一种能使细胞状态良好的计数方法和装置。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案，贴壁细胞非消化计数装置，包括中空管；其特征在于，所述中空管第一端连接有液体注入机构，中空管第二端通过四通接头与十字形显示管相连通。
进一步地，所述十字形显示管包括四条带刻度的管体，四条管体与四通接头相连后，形成十字形结构。
更进一步地，所述中空管呈透明状，中空管第二端向上弯曲，所述四通接头安装于所述第二端端部，第二端端部作为四通接头的入口，四通接头的四个出口分别与给自对应的管体相连。
更进一步地，所述管体为透明管体，所述管体的第一端与四通接头相连，管体的第二端安装有堵头胶塞；管体上的刻度为360度环绕刻度线。
进一步地，所述液体注入机构采用注射器。
进一步地，所述液体注入机构包括注射腔体及带螺纹活塞杆，该注射腔体的一端与中空管体的第一端相连通，所述活塞杆由注射腔体的另一端伸入至注射腔体内腔，且活塞杆与注射腔体另一端螺纹连接；活塞杆露出注射腔体的一端端部设置有手柄。
更进一步地，调节活塞杆伸入至注射腔体的深度，活塞杆上的活塞在注射腔体内的位置可调。
进一步地，所述注射腔体内装有带颜色液体。
贴壁细胞非消化计数方法，包括以下步骤：
步骤一、细胞培养器皿采用培养皿或细胞培养瓶或细胞培养袋；
步骤二、计数装置内注入带颜色指示剂，将计数装置及细胞培养器皿放置于倒置显微镜下，向十字形显示管内注入带颜色指示剂，指示剂充满十字型显示管；当测量时候，将十字型中心置于被测量位置中心处，并向外侧旋转活塞杆，使得指示剂回退，至十字形显示管内指示剂与细胞培养器皿内细胞待测量轮廓相吻合或一致；测量结束后将旋钮向内侧旋并复原，再次使指示剂充满十字型测量管；
观察十字形显示管测量范围内的细胞数量；(优选方案、细胞培养器皿位于十字形显示管正上方；)
步骤三、计数装置的计数方式为：(依据单位面积平均细胞数的不同表达方式，设计此计算方式；显微镜视野下观察细胞数与观察面积的比是单位面积平均细胞数，培养器皿内细胞总数与底面积的比等于平均单位面积细胞数；)
五个视野内的细胞数与培养器皿面积和十字形显示管测量面积的倍率之商的乘积，公式如下：
N镜下/S镜下＝N总数/S培养面积；
N总数＝N镜下*(S培养面积/S镜下)；
N镜下表示同一物镜看到的视野下的细胞数量；S镜下表示十字形显示管测量下的物镜观察的视野面积；N总数表示待测量培养器皿内的细胞总数；S培养面积表示细胞培养器皿的面积。
举例说明1：S镜下＝π*r2；
物镜下测量面积为半径为0.4mm的圆型视野，实际培养面积为cm2；
则S镜下＝π*r2＝3.14*0.42≈0.5mm2；
(N1+N2+N3+N4+N5)/5*S镜下＝N总数/S培养面积*100；
N总数＝(N1+N2+N3+N4+N5)*(S培养面积/5*0.5)*100
＝(N1+N2+N3+N4+N5)*40S培养面积；N1、N2、N3、N4、N5分别为同一物镜下的五个不同视野细胞数；100为面积单位进率，1cm2＝100mm2。
举例说明2：以T175、T75、T25培养瓶为例，即S培养面积为培养瓶的底面积即ST175\T75\T25分别为175cm2、75cm2、25cm2；
(N1+N2+N3+N4+N5)/5*S镜下＝N总数/ST175\T75\T25*100；
即N总数＝(N1+N2+N3+N4+N5)*7\3\1*1000。T175表示面积为175cm2的培养瓶；ST175表示面积为175cm2。
进一步地，还包括步骤四、显微镜成像分析计数，根据公式在电脑成像的图片中，采用自动边缘识别技术，对所成像的图片进行物理分割和统计，对平均亮度以下的图像与总细胞分割计数之商作为细胞活率计数；活细胞饱满，光通透率高，成像亮，边缘淡，而死细胞的光通透性差，边缘清晰暗淡，成像图片中，暗淡致密边缘清晰的为死细胞，其它透亮为活细胞。
与现有技术相比本发明有益效果。
本发明使用的装置简单，原理清晰易懂，操作简便。只需要使用特制的卡尺，与T25，T75或者T175培养瓶安装在一起，并固定在显微镜的载物台上，通过显微镜观察，电脑分析，根据面积换算，得到细胞数量；根据分析细胞的透光度，得到细胞活率。该装置简单易操作，且不用消化收集细胞，便可以进行细胞的数量及活率计算，极大的提高工作效率，且不损伤细胞，避免了浪费。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。本发明保护范围不仅局限于以下内容的表述。
图1是贴壁细胞非消化计数装置整体结构示意图。
图2是图1局部剖开示意图。
图3-4是不同角度的计数装置结构示意图。
图5是20X物镜下电脑采集培养瓶为T75图像。
图6是20X物镜下电脑采集培养瓶为T175图像。
图中，1为手柄、2为活塞杆、3为注射腔体、4为中空管、5为十字形显示管、6为四通接头、7为堵头胶塞、8为带颜色液体、9为活塞。
具体实施方式
如图1-6所示，贴壁细胞非消化计数装置，包括中空管；所述中空管第一端连接有液体注入机构，中空管第二端通过四通接头与十字形显示管相连通。
优选地，所述十字形显示管包括四条带刻度的管体，四条管体与四通接头相连后，形成十字形结构。
更优选地，所述中空管呈透明状，中空管第二端向上弯曲，所述四通接头安装于所述第二端端部，第二端端部作为四通接头的入口，四通接头的四个出口分别与给自对应的管体相连。
更优选地，所述管体为透明管体，所述管体的第一端与四通接头相连，管体的第二端安装有堵头胶塞；管体上的刻度为360度环绕刻度线。
优选地，所述液体注入机构采用注射器。
优选地，所述液体注入机构包括注射腔体及带螺纹活塞杆，该注射腔体的一端与中空管体的第一端相连通，所述活塞杆由注射腔体的另一端伸入至注射腔体内腔，且活塞杆与注射腔体另一端螺纹连接；活塞杆露出注射腔体的一端端部设置有手柄。
更优选地，调节活塞杆伸入至注射腔体的深度，活塞杆上的活塞在注射腔体内的位置可调。
优选地，所述注射腔体内装有带颜色液体。
本发明工作原理：利用细胞贴壁生长后的体积、个数、活性、密集程度不同时对光学的通透效不同，以显微镜在不同倍率物镜观察下的成像数据进行计算分析，以得到非消化状态下的贴壁细胞数量、活性等重要数据。
技术方案：
1)目前，通用细胞培养装置为培养皿、细胞培养瓶、细胞培养袋，而进行细胞观察所用装置为倒置显微镜，设计十字花型计数卡尺(即计数装置)。
2)计算方法为：计数卡尺内的计数为五个视野内的细胞数与实际培养器皿面积和对比版面积的倍率之商的乘积，后附公式。
3)显微镜成像分析计数，根据前一公式在电脑成像的图片中，采用自动边缘识别技术，对所成像的图片进行物理分割和统计，对平均亮度一下的图像与总细胞分割计数之商作为细胞活率计数。
所述显微镜为常规倒置显微镜，目镜为10x，物镜为4x,10x,20x,100x,对应放大倍数为40倍，100倍，200倍，400倍。显微镜载物台上可以固定计数装置，且本发明需与电脑相连，可以进行电脑识别细胞图像，进行电脑计算。
通过测量倒置显微镜下培养器皿内的镜下视野面积内的细胞，通过电脑计算出特定倍数的视野内细胞数量N1-N5，对应瓶子的底面积为Sa-Se，换算系数为M(M40,M100,M200,M400),不同型号的显微镜系数，以实际实验数据确认该型号显微镜的计算系数。
本实验使用的显微镜为奥林巴斯CKX53,物镜为20X，孔径内瓶子面积与瓶子总面积换算系数为底面积分别为T25、T75，T175。则瓶内孔径细胞数量为(N1+N2+N3+N4+N5)/5*S＝N/T175\T75\T25*100，N＝(N1+N2+N3+N4+N5)*7\3\1*1000,暨换算的系M200数为T25、T75，T175分别为1、3、7，视野计数直径为0.8mm,S＝3.14*0.4*0.4。
细胞活率通过细胞通透率来计数，通过电脑软件进行分析。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.贴壁细胞非消化计数装置，包括中空管；其特征在于，所述中空管第一端连接有液体注入机构，中空管第二端通过四通接头与十字形显示管相连通；
所述十字形显示管包括四条带刻度的管体，四条管体与四通接头相连后，形成十字形结构；
所述中空管呈透明状，中空管第二端向上弯曲，所述四通接头安装于所述第二端端部，第二端端部作为四通接头的入口，四通接头的四个出口分别与给自对应的管体相连；
所述管体为透明管体，所述管体的第一端与四通接头相连，管体的第二端安装有堵头胶塞；管体上的刻度为360度环绕刻度线；
所述液体注入机构包括注射腔体及带螺纹活塞杆，该注射腔体的一端与中空管体的第一端相连通，所述活塞杆由注射腔体的另一端伸入至注射腔体内腔，且活塞杆与注射腔体另一端螺纹连接；活塞杆露出注射腔体的一端端部设置有手柄；
调节活塞杆伸入至注射腔体的深度，活塞杆上的活塞在注射腔体内的位置可调；
所述注射腔体内装有带颜色液体。
2.贴壁细胞非消化计数方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、细胞培养器皿采用培养皿或细胞培养瓶或细胞培养袋；
步骤二、计数装置内注入带颜色指示剂，将计数装置及细胞培养器皿放置于倒置显微镜下，向十字形显示管内注入带颜色指示剂，指示剂充满十字型显示管；当测量时候，将十字型中心置于被测量位置中心处，并向外侧旋转活塞杆，使得指示剂回退，至十字形显示管内指示剂与细胞培养器皿内细胞待测量轮廓相吻合或一致；测量结束后将旋钮向内侧旋并复原，再次使指示剂充满十字型测量管；所述计数装置为权利要求1所述计数装置；
观察十字形显示管测量范围内的细胞数量；
步骤三、计数装置的计数方式为：五个视野内的细胞数与培养器皿面积和十字形显示管测量面积的倍率之商的乘积，公式如下：
N镜下/S镜下=N总数/ S培养面积；
N总数= N镜下×（ S培养面积/ S镜下）；
N镜下表示同一物镜看到的视野下的细胞数量；S镜下表示十字形显示管测量下的物镜观察的视野面积；N总数表示待测量培养器皿内的细胞总数；S培养面积表示细胞培养器皿的面积。
3.根据权利要求2所述的贴壁细胞非消化计数方法，其特征在于：还包括步骤四、显微镜成像分析计数，根据公式在电脑成像的图片中，对所成像的图片进行物理分割和统计，对平均亮度以下的图像与总细胞分割计数之商作为细胞活率计数。
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