CN104830680A - 一种非接触式显微测量辅助装置及其测量方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种非接触式细菌或孢子显微测量辅助装置及其测量方法，其特征在于，组成包括：由透明测定盘和套板，计数纸配件三部分组成。透明测定盘由透明材料制成，其为圆形板状，具有一定厚度，从圆心向外绘有若干条半径线，套板为长方形，在其长度方向相对的两侧，计数纸配件包括设在计数纸槽上下两端的上卡槽和下卡槽。还涉及一种利用测量辅助装置进行的非接触式细菌或孢子显微测量方法，该方法在测量前进行调整，在测量中进行辅助，在测量后获取图像信息并用于计算。

Description

一种非接触式显微测量辅助装置及其测量方法

技术领域

本发明属于微生物显微领域，尤其涉及一种非接触式显微测量辅助装置及其测量方法。

背景技术

在动物学、植物学、细胞学和微生物学实验和研究中，经常测定细胞、微生物孢子、菌丝的大小，其中包括其宽度和长度，特别是进行真核生物研究时，要求测定30个或者更多细胞或者孢子的平均宽度和长度。这就给使用绘图显微镜或者利用显微电脑操作系统的人带来测量数据的麻烦。

目前，测定孢子或者细胞大小的方法主要有以下几种：1、利用绘图显微镜，手动绘出孢子的草图，然后再计算一定数量的孢子的大小平均数；2、利用电脑和数码成像系统系统，将显微镜视野中的图像传输到电脑中，并通过处理软件显示出来，然后再去操作和计算孢子的大小；3、利用目镜测微尺对孢子进行测定；4、用数码相机拍出孢子图片后再测量细胞或者孢子的大小。

以上测定孢子的方法，存在的缺点是：1、绘图测量法太麻烦，操作时要不停前后和左右移动显微镜载物台，而且玻片种细胞等位置形态各异，有时造成从任何角度都不能很好测量细胞大小的情况；2、利用显微成像系统专业软件处理和计算孢子大小，也存在鼠标频繁移动、定位不准和无法处理特殊细胞大小的问题，费时、费力，而且配合显微镜的操作；3、目镜测微尺测定细胞大小时，需要前后、左右频繁移动载物台，而且测定角度不正的细胞时，要移动载物台数次，才能定位准确，非常麻烦；4、用数码相机拍出孢子图片后再测量的方法，存在一次性要选取大量孢子的麻烦，再者还要把相关图像打印或者洗出来，费时费力。

从手动绘图或测定的角度来看，目前的测定方式要么利用手动，要么利用电脑测绘，手动方法自动性差，耗时长，容易出错，记录不准确，但是存在可选择性，灵活性等优点，利用辅助测绘装置的话，一般又不够灵活，方式较死板，电脑测绘的话，自动性强，但是在识别和计算所需数据时，人工识别往往又不可替代，尤其是所测定样本本身有多种杂质或是有选择地测定特殊细菌或孢子的时候。

发明内容

本发明属于多功能绘图显微镜的配套仪器，利用手动绘制或者测量细胞或者孢子时，可以克服目前细胞或者孢子大小测定的缺点和麻烦，快速、有效和准确的解决该问题，具体优点如下：1、该产品属于外置式和手持式，使用方便，移动灵活，不需要像目镜测量尺一样反复移动；2、可测量任意角度的细胞大小，测定培养样本中的何种细菌或孢子可以方便选择；3、不需要校正和换算，可以直接读出近似读数；4、廉价、简易；5、配置专用记录板，可实现数据及时记录，可换纸利用，也可利用可擦写纸，用后一擦即净；7、使用可根据视野光线情况，灵活选用各种外源灯光等。

本发明要求保护一种非接触式细菌或孢子显微测量辅助装置，其特征在于，组成如下：

由透明测定盘和套板，计数纸配件三部分组成；

透明测定盘由透明材料制成，其为圆形板状，具有一定厚度，从圆心向外绘有若干条半径线，该若干条半径线均与接触圆周处的法线垂直，该若干条半径线上有垂直于该半径线自身的均匀刻度线，每条半径线上的均匀刻度线所对应的单位刻度均不同，每隔一定数量刻度线设置一个数值用于示意性读数，在每个半径线靠近圆心处都注以标示，以标明该半径线上的单位刻度为何种大小，这里的标示可以是特定的形状的符号，也可以是特定颜色的符号；

所述单位刻度可以为1mm、0.5mm、0.2mm、0.1mm、0.05mm、0.02mm、0.01mm、0.005mm尺寸，可以每2、5、10、20个单位刻度给出示意性读数，标明该半径线上的单位刻度为何种大小的标示可以为文字,厘米/毫米/十分之一毫米/百分之一毫米/微米,也可以为,英文简称, ,cm/mm/1/10mm/1/00mm/um也可以为自行约定的符号,如α、β、γ等；

套板为长方形，在其长度方向相对的两侧，一侧有用于放置透明测定盘的圆形槽，另一侧有放置计数纸配件的计数纸槽，计数纸槽为正方形，圆形槽的厚度与透明测定盘相当；计数纸槽的厚度也可以较圆形槽为浅；

计数纸配件包括设在计数纸槽上下两端的上卡槽和下卡槽，以及由上卡槽和下卡槽共同夹持的计数纸若干张，上卡槽、下卡槽、计数纸高度均低于计数纸槽的深度；

透明测定盘和套板的表面光滑或是有一定摩擦性，透明测定盘和套板表面均平整，透明测定盘和套板上的用于放置透明测定盘的圆形槽大小相适应，透明测定盘刚好可以卡入转动并且不明显松动；

所夹持的计数纸可以为长方形或正方形，计数纸上印有计数格，计数纸可以适于普通笔书写或者适于荧光笔书写；

前述的一种测量辅助装置，利用其进行的非接触式细菌或孢子显微测量方法，其特征在于；

       1）根据需要制备适合的装置：

按用于测量的培养皿或培养平板的情况，选择适合的透明测定盘的大小，并由此决定相配的套板和计数纸配件的尺寸：透明测定盘的尺寸可以比圆形槽尺寸小0.1mm-1mm距离不等。

三步灭菌：用环氧乙烷将透明测定盘、套板和计数纸槽中的上卡槽和下卡槽用环氧乙烷灭菌处理，并除去残留；再用高温蒸汽进行二次灭菌，干燥，然后将透明测定盘、套板和计数纸槽中的上卡槽和下卡槽和测定用的计数纸一起用紫外灯照射2-10min灭菌；

       将透明测定盘卡入圆形槽、将所需数量的计数纸卡入上卡槽和下卡槽固定；即制得所需测量辅助装置；圆形槽边缘可以设有复数个沿圆形槽边缘均匀分布的卡扣以固定透明测定盘；

       2）利用显微镜针对培养皿或者培养平板上的细菌或孢子进行显微测定，先选择合适的培养皿或者培养平板，然后根据使用的培养皿或者培养平板的规格或尺寸，选择或制备尺寸相符的测量辅助装置；

       3）根据培养皿或者培养平板上细菌或孢子处于靠上或靠下的位置，将测量辅助装置放置在培养皿或者培养平板之上或之下，以便于测量；

       根据放置在培养皿或者培养平板之上或之下的不同，圆形槽可以向上面开或者向下面开，透明测定盘可以是从上向下放置或者从下向上放置；

       4）开启显微镜，将培养皿或者培养平板与叠合的测量辅助装置一并放置于载物台上，调节显微镜，在视野中观察寻找欲测量尺寸的种类的细菌或孢子；

       这里的细菌或者孢子，可以是某一类或者某几类，或者是某一类中尺寸在要求范围内的，如革兰氏阳性菌，或孢子尺寸在10um-1um之间的；

       5）可借助外界光源辅助，调节显微镜视野内的光线强弱，针对视野中找到的欲测量尺寸的种类的细菌或孢子，调节显微镜，使得其清晰可辨，在此前提下，转动透明测定盘，将符合显微镜放大倍数观测需要的单位刻度的半径线转动到欲测量尺寸的种类的细菌或孢子附近，并依据该单位刻度及其上的标示将欲测量尺寸的种类的细菌或孢子的尺寸大致读出，用笔记载在计数纸上；

       6）在套板的圆形槽底部设置网格，网格线是水平垂直交叉的，或者是以圆形槽圆心处放射线与以该圆心为圆心的半径不同的圆形线，网格线有反光特性，网格给予编号，在步骤4中欲测量尺寸的种类的细菌或孢子清晰可辨的前提下，确认其处于的网格编号，在登记其尺寸时一并登记；

       在此，如果是以圆形线和半径线切割成的区域，则可以以字母+数字来命名，例如最小圆与圆心之间切割成的扇形，最内圈区域以A1-A9编号，外一层用B1-B9编号，再外一层用C1-C9编号，依次类推，数字依半径线具体划出的区域而定；如果是水平线和垂直线切割成的区域，则可以用两位字母来命名，例如从上到下第A行和从左到右第H列交汇处可以AH格；

       7）在透明测定盘重叠下的视野中逐个确认欲测量尺寸的种类的细菌或孢子，在登记了其尺寸、网格编号后，将培养皿或者培养平板与与其叠合的辅助测量装置保持原位置一并取出，将透明测定盘取下，用光学成像装置对其成像，并将该图像在PC端生成并截取在透明测定盘重叠下的视野中的圆形区域的图像；

       8）根据反光形成的网格线的形状，在PC端的图像处理软件中仅仅加载步骤6所得图像，根据预先登记了的网格的信息，对前述图像突出显示登记了的网格，并根据灰度测算程序，对图像中所有疑似为细菌和孢子的图像，用图像捕捉程序进行自动套取，以特定鲜艳颜色突出显示；

       9）通过PC端软件对显示出的所有疑似为细菌和孢子的套取了的图像，进行手动点选，选中全部已测量并登记过的欲测量尺寸的种类的细菌或孢子，并向PC段程序输入确认信息，PC端的图像处理软件对确认过的属于测量并登记过的欲测量尺寸的种类的细菌或孢子，按图像进行大小尺寸的自动识别，并记录数据，完成显微测量。

第9步骤主要是应对特殊的情形，如欲测定细菌或孢子有很多外形相似的菌种，非人工不好辨别，或者虽然关注某一种菌种，但是只关注某个尺寸范围内的情形；

本发明前述的非接触式细菌或孢子显微测量方法，其还可以用另外一种全计算的方式对前面的结果进行验证，

还包括一种全自动计算验证方法，包括以下步骤：

(A)用高分辨率CCD相机获取整个感兴趣区域的图像，对高分辨率CCD相机获取的细菌或孢子图像分析整张图片的形态，进行种类识别， 识别出是培养皿、培养平板、或属于纸片培养基、还是圆形平面培养基，并自动提取识别区域。

(B)对识别区域进行色彩空间的HSV分析，自动判别出细菌或孢子所属的子类；选择特定的或者预设的某种类的细菌或孢子；

(C)在无人工干预以及无需人工设置参数的情况下，自适应的识别出细菌或孢子的数量以及形状特征，完成细菌或孢子的计数以及相关特征的统计。

(D)通过分析步骤(3)得到的识别结果，将其与步骤9中记录的数据对比验证，确定显微测量结果。

步骤(C)中，可以对于圆形培养皿采用自适应圆形平皿细菌或孢子计数法识别细菌或孢子的数量和形状特征。

上述步骤(C)具体包括以下步骤：

首先，对于获得的细菌或孢子图像经过边缘提取和噪声滤除后获得每个像素点的梯度方向和幅值大小，若梯度幅值小于门限则将其置零。

其次，对于边缘提取后的图像按照每个像素点的梯度方向和检测范围进行投影，并对投影结果进行加权统计。

之后，对于投影得到的图像经过低通平滑滤波和局部二值化处理，得到连通区域即为细菌或孢子所在区域。

这里也可以不使用计算得到的连通区域，而是直接按照前述步骤（6）的区域划分来计算。

最后，通过细菌或孢子所在的连通区域定位细菌或孢子的数量、位置以及尺寸。具体为：扫描每一个连通区域，然后，对每个区域进行编号，拟合出每个区域的中心位置，有效连通区域的数量即是细菌或孢子的数量，进一步通过图像特征获得细菌或孢子的位置和尺寸。

前述HSV分析中，通过统计纸片矩形区域内的色彩空间信息，采用HSV的阈值分割，滤除掉可能存在的网格线对形成图像的干扰，得到细菌或孢子所在的连通区域。

附图说明

图1是套板和计数纸配件的示意图。

图2是透明测定盘的示意图。出于示意清楚的关系，图2中透明测定盘略大，与实际尺寸无关。

附图标记对应关系为：圆形槽1，计数纸槽2，上卡槽3，下卡槽4，计数纸5，透明测定盘6，单位刻度7。

具体实施方式

实施例1

一种非接触式细菌显微测量辅助装置，其特征在于，组成如下：

由透明测定盘和套板，计数纸配件三部分组成；

透明测定盘由透明材料制成，其为圆形板状，具有一定厚度，从圆心向外绘有4条半径线，该若干条半径线均与接触圆周处的法线垂直，该若干条半径线上有垂直于该半径线自身的均匀刻度线，每条半径线上的均匀刻度线所对应的单位刻度均不同，每隔一定数量刻度线设置一个数值用于示意性读数，在每个半径线靠近圆心处都注以标示，以标明该半径线上的单位刻度为何种大小，这里的标示是符号α、β、γ、δ；

所述四条线上的单位刻度为1mm、0.5mm、0.2mm、0.1mm，每5个单位刻度给出示意性读数5，

套板为长方形，在其长度方向相对的两侧，一侧有用于放置透明测定盘的圆形槽，另一侧有放置计数纸配件的计数纸槽，计数纸槽为正方形，圆形槽的厚度与透明测定盘相当；圆形槽的深度与透明测定盘的厚度均为3mm，计数纸槽深度为5mm；

计数纸配件包括设在计数纸槽上下两端的上卡槽和下卡槽，以及由上卡槽和下卡槽共同夹持的计数纸若干张，上卡槽、下卡槽厚度均为1mm，计数纸每张高度0.05mm；

透明测定盘和套板的表面有一定摩擦性，透明测定盘和套板表面均平整，透明测定盘和套板上的用于放置透明测定盘的圆形槽大小相适应，透明测定盘刚好可以卡入转动并且不松动；

所夹持的计数纸可以为长方形，计数纸上印有计数格，计数纸可以适于普通笔书写，适于在有光源的情况下记录和观察；

前述的一种测量辅助装置，利用其进行的非接触式细菌显微测量方法，其特征在于；

       1）根据需要制备适合的装置：

按用于测量的培养皿直径10cm，选择适合的透明测定盘的大小也为10cm，并由此决定相配的套板和计数纸配件的尺寸：透明测定盘的尺寸可以比圆形槽尺寸小0.1mm。

三步灭菌：用环氧乙烷将透明测定盘、套板和计数纸槽中的上卡槽和下卡槽用环氧乙烷灭菌处理，并除去残留；再用高温蒸汽进行二次灭菌，干燥，然后将透明测定盘、套板和计数纸槽中的上卡槽和下卡槽和测定用的计数纸一起用紫外灯照射2-10min灭菌；

       将透明测定盘卡入圆形槽、将不多于10张的计数纸卡入上卡槽和下卡槽固定；圆形槽边缘可以设有3个沿圆形槽边缘均匀分布的卡扣以固定透明测定盘；

       2）利用显微镜针对培养皿上的细菌进行显微测定；

       3）根据培养皿或者培养平板上细菌处于靠上的位置，将测量辅助装置放置在培养皿或者培养平板之下，以便于测量；

       根据放置在培养皿或者培养平板之下，圆形槽向上面开，透明测定盘是从上向下放置；

       4）开启显微镜，将培养皿与叠合的测量辅助装置一并放置于载物台上，调节显微镜，在视野中观察寻找欲测量尺寸的种类的细菌；

       这里的细菌是革兰氏阳性菌，尺寸在60um-10um之间的；

       5）可借助外界光源辅助，调节显微镜视野内的光线强弱，针对视野中找到的欲测量尺寸的种类的细菌，调节显微镜，使得其清晰可辨，在此前提下，转动透明测定盘，将符合显微镜放大倍数观测需要的单位刻度的半径线转动到欲测量尺寸的种类的细菌附近，并依据该单位刻度及其上的标示将欲测量尺寸的种类的细菌的尺寸大致读出，用笔记载在计数纸上；

       6）在套板的圆形槽底部设置网格，或者是以圆形槽圆心处放射线与以该圆心为圆心的半径不同的圆形线，网格线有反光特性，网格给予编号，在步骤4中欲测量尺寸的种类的细菌清晰可辨的前提下，确认其处于的网格编号，在登记其尺寸时一并登记；

       在此，以圆形线和半径线切割成的区域，则以字母+数字来命名，半径线八条，例如最小圆与圆心之间切割成的扇形，最内圈区域以A1-A8编号，外一层用B1-B8编号，再外一层用C1-C8编号，依次类推，最外层为F1-F8；

       7）在透明测定盘重叠下的视野中逐个确认欲测量尺寸的种类的细菌，在登记了其尺寸、网格编号后，将培养皿或者培养平板与与其叠合的辅助测量装置保持原位置一并取出，将透明测定盘取下，用光学成像装置对其成像，并将该图像在PC端生成并截取在透明测定盘重叠下的视野中的圆形区域的图像；

       8）根据反光形成的网格线的形状，在PC端的图像处理软件中仅仅加载步骤6所得图像，根据预先登记了的网格的信息，对前述图像突出显示登记了的网格，并根据灰度测算程序，对图像中所有疑似为细菌和孢子的图像，用图像捕捉程序进行自动套取，以橙红色颜色突出显示；

       9）通过PC端软件对显示出的所有疑似为细菌和孢子的套取了的图像，进行手动点选，选中全部已测量并登记过的欲测量尺寸的种类的细菌，并向PC段程序输入确认信息，PC端的图像处理软件对确认过的属于测量并登记过的欲测量尺寸的种类的细菌，按图像进行大小尺寸的自动识别，仅仅关注60um-10um尺寸的细菌，并记录数据，完成显微测量。

本发明前述的非接触式细菌孢子显微测量方法，其还可以用另外一种全计算的方式对前面的结果进行验证，

还包括一种全自动计算验证方法，包括以下步骤：

(A)用高分辨率CCD相机获取整个感兴趣区域的图像，对高分辨率CCD相机获取的革兰氏阳性菌图像分析整张图片的形态，进行种类识别， 识别出是培养皿，并依照培养皿的边界自动提取识别区域。

(B)对识别区域进行色彩空间的HSV分析，自动判别出60um-10um的革兰氏阳性菌；

(C)在无人工干预以及无需人工设置参数的情况下，自适应的识别出细菌的数量以及形状特征，完成细菌的计数以及相关特征的统计，具体包括如下步骤：

首先，对于获得的细菌图像经过边缘提取和噪声滤除后获得每个像素点的梯度方向和幅值大小，若梯度幅值小于门限则将其置零。

其次，对于边缘提取后的图像按照每个像素点的梯度方向和检测范围进行投影，并对投影结果进行加权统计。

之后，对于投影得到的图像经过低通平滑滤波和局部二值化处理，得到连通区域即为细菌所在区域。

最后，通过细菌所在的连通区域定位细菌的数量、位置以及尺寸。具体为：扫描每一个连通区域，然后，对每个区域进行编号，拟合出每个区域的中心位置，有效连通区域的数量即是细菌的数量，进一步通过图像特征获得细菌的位置和尺寸。  

(D)通过分析步骤(3)得到的识别结果，将其与步骤9中记录的数据对比验证，确定显微测量结果。

实施例2

一种非接触式孢子显微测量辅助装置，其特征在于，组成如下：

由透明测定盘和套板，计数纸配件三部分组成；

透明测定盘由透明材料制成，其为圆形板状，具有一定厚度，从圆心向外绘有6条半径线，该若干条半径线均与接触圆周处的法线垂直，该若干条半径线上有垂直于该半径线自身的均匀刻度线，每条半径线上的均匀刻度线所对应的单位刻度均不同，每隔一定数量刻度线设置一个数值用于示意性读数，在每个半径线靠近圆心处都注以标示，以标明该半径线上的单位刻度为何种大小，这里的标示是符号α、β、γ、δ 、ε、ζ；

所述四条线上的单位刻度为1mm、0.5mm、0.2mm、0.1mm、0.05mm、0.02mm，每5个单位刻度给出示意性读数5，

套板为长方形，在其长度方向相对的两侧，一侧有用于放置透明测定盘的圆形槽，另一侧有放置计数纸配件的计数纸槽，计数纸槽为正方形，圆形槽的厚度与透明测定盘相当；圆形槽的深度与透明测定盘的厚度均为4mm，计数纸槽深度为6mm；

计数纸配件包括设在计数纸槽上下两端的上卡槽和下卡槽，以及由上卡槽和下卡槽共同夹持的计数纸若干张，上卡槽、下卡槽厚度均为1.5mm，计数纸每张高度0.03mm；

透明测定盘和套板的表面有一定摩擦性，透明测定盘和套板表面均平整，透明测定盘和套板上的用于放置透明测定盘的圆形槽大小相适应，透明测定盘刚好可以卡入转动并且不松动；

所夹持的计数纸可以为正方形，计数纸上印有计数格，计数纸可以适于荧光笔书写，适于在无光黑暗的情况下记录和观察；

前述的一种测量辅助装置，利用其进行的非接触式孢子显微测量方法，其特征在于；

       1）根据需要制备适合的装置：

按用于测量的培养皿直径10cm，选择适合的透明测定盘的大小也为10cm，并由此决定相配的套板和计数纸配件的尺寸：透明测定盘的尺寸可以比圆形槽尺寸小0.08mm。

三步灭菌：用环氧乙烷将透明测定盘、套板和计数纸槽中的上卡槽和下卡槽用环氧乙烷灭菌处理，并除去残留；再用高温蒸汽进行二次灭菌，干燥，然后将透明测定盘、套板和计数纸槽中的上卡槽和下卡槽和测定用的计数纸一起用紫外灯照射5-10min灭菌；

       将透明测定盘卡入圆形槽、将不多于10张的计数纸卡入上卡槽和下卡槽固定；圆形槽边缘可以设有2个沿圆形槽边缘均匀分布的卡扣以固定透明测定盘；

       2）利用显微镜针对培养皿上的孢子进行显微测定；

       3）根据培养皿或者培养平板上孢子处于靠上的位置，将测量辅助装置放置在培养皿或者培养平板之下，以便于测量；

       根据放置在培养皿或者培养平板之下，圆形槽向上面开，透明测定盘是从上向下放置；

       4）开启显微镜，将培养皿与叠合的测量辅助装置一并放置于载物台上，调节显微镜，在视野中观察寻找欲测量尺寸的种类的孢子；

       这里的孢子是植物病原真菌孢子，尺寸在10um-0.1um之间的；

       5）可借助外界光源辅助，调节显微镜视野内的光线强弱，针对视野中找到的欲测量尺寸的种类的孢子，调节显微镜，使得其清晰可辨，在此前提下，转动透明测定盘，将符合显微镜放大倍数观测需要的单位刻度的半径线转动到欲测量尺寸的种类的孢子附近，并依据该单位刻度及其上的标示将欲测量尺寸的种类的孢子的尺寸大致读出，用笔记载在计数纸上；

       6）在套板的圆形槽底部设置网格，或者是以圆形槽圆心处放射线与以该圆心为圆心的半径不同的圆形线，网格线有反光特性，网格给予编号，在步骤4中欲测量尺寸的种类的孢子清晰可辨的前提下，确认其处于的网格编号，在登记其尺寸时一并登记；

       在此，以纵线和横线切割成的区域，则以字母+数字来命名，横方向为字母，列为数字，一共有A1- F8的64个格子区域；

       7）在透明测定盘重叠下的视野中逐个确认欲测量尺寸的种类的孢子，在登记了其尺寸、网格编号后，将培养皿或者培养平板与与其叠合的辅助测量装置保持原位置一并取出，将透明测定盘取下，用光学成像装置对其成像，并将该图像在PC端生成并截取在透明测定盘重叠下的视野中的圆形区域的图像；

       8）根据反光形成的网格线的形状，在PC端的图像处理软件中仅仅加载步骤6所得图像，根据预先登记了的网格的信息，对前述图像突出显示登记了的网格，并根据灰度测算程序，对图像中所有疑似为孢子的图像，用图像捕捉程序进行自动套取，以紫色颜色突出显示；

       9）通过PC端软件对显示出的所有疑似为孢子的套取了的图像，进行手动点选，选中全部已测量并登记过的欲测量尺寸的种类的孢子，并向PC段程序输入确认信息，PC端的图像处理软件对确认过的属于测量并登记过的欲测量尺寸的种类的孢子，按图像进行大小尺寸的自动识别，仅仅关注10um-0.1um尺寸的孢子，并记录数据，完成显微测量。

本发明前述的非接触式孢子显微测量方法，其还可以用另外一种全计算的方式对前面的结果进行验证，

还包括一种全自动计算验证方法，包括以下步骤：

(A)用高分辨率CCD相机获取整个感兴趣区域的图像，对高分辨率CCD相机获取的植物病原真菌孢子图像分析整张图片的形态，进行种类识别， 识别出是培养皿，并依照培养皿的边界自动提取识别区域。

(B)对识别区域进行色彩空间的HSV分析，自动判别出10um-0.1um尺寸的孢子；

(C)在无人工干预以及无需人工设置参数的情况下，自适应的识别出孢子的数量以及形状特征，完成孢子的计数以及相关特征的统计，具体包括如下步骤：

首先，对于获得的孢子图像经过边缘提取和噪声滤除后获得每个像素点的梯度方向和幅值大小，若梯度幅值小于门限则将其置零。

其次，对于边缘提取后的图像按照每个像素点的梯度方向和检测范围进行投影，并对投影结果进行加权统计。

之后，对于投影得到的图像经过低通平滑滤波和局部二值化处理，得到连通区域即为孢子所在区域。

最后，通过孢子所在的连通区域定位孢子的数量、位置以及尺寸。具体为：扫描每一个连通区域，然后，对每个区域进行编号，拟合出每个区域的中心位置，有效连通区域的数量即是孢子的数量，进一步通过图像特征获得孢子的位置和尺寸。  

(D)通过分析步骤(3)得到的识别结果，将其与步骤9中记录的数据对比验证，确定显微测量结果。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.一种非接触式显微测量辅助装置，其特征在于，组成如下：

由透明测定盘和套板，计数纸配件三部分组成；

透明测定盘由透明材料制成，其为圆形板状，具有一定厚度，从圆心向外绘有若干条半径线，该若干条半径线均与接触圆周处的法线垂直，该若干条半径线上有垂直于该半径线自身的均匀刻度线，每条半径线上的均匀刻度线所对应的单位刻度均不同，每隔一定数量刻度线设置一个数值用于示意性读数，在每个半径线靠近圆心处都注以标示，以标明该半径线上的单位刻度为何种大小；

套板为长方形，在其长度方向相对的两侧，一侧有用于放置透明测定盘的圆形槽，另一侧有放置计数纸配件的计数纸槽，计数纸槽为正方形，圆形槽的厚度与透明测定盘相当；

计数纸配件包括设在计数纸槽上下两端的上卡槽和下卡槽，以及由上卡槽和下卡槽共同夹持的计数纸若干张，上卡槽、下卡槽、计数纸高度均低于技术纸槽的深度；

透明测定盘和套板的表面光滑或是有一定摩擦性，透明测定盘和套板表面均平整，透明测定盘和套板上的用于放置透明测定盘的圆形槽大小相适应，透明测定盘刚好卡入转动并不明显松动；

所夹持的计数纸为长方形或正方形，计数纸上印有计数格，计数纸适于普通笔书写或者适于荧光笔书写。

2.一种利用如权利要求1所述的测量辅助装置的非接触式显微测量方法，其特征在于，

    1）根据需要制备适合的装置：

按用于测量的培养皿或培养平板的情况，选择适合的透明测定盘的大小，并由此决定相配的套板和计数纸配件的尺寸；

    三步灭菌：用环氧乙烷将透明测定盘、套板和计数纸槽中的上卡槽和下卡槽用环氧乙烷灭菌处理，并除去残留；再用高温蒸汽进行二次灭菌，干燥，然后将透明测定盘、套板和计数纸槽中的上卡槽和下卡槽和测定勇敢计数纸一起用紫外灯照射2-10min灭菌；

    将透明测定盘卡入圆形槽、将所需数量的计数纸卡入上卡槽和下卡槽固定；即制得所需测量辅助装置；

    2）利用显微镜针对培养皿或者培养平板上的细菌进行显微测定，先选择合适的培养皿或者培养平板，然后根据使用的培养皿或者培养平板的规格或尺寸，选择或制备尺寸相符的测量辅助装置；

    3）根据培养皿或者培养平板上细菌处于靠上或靠下的位置，将测量辅助装置放置在培养皿或者培养平板之上或之下，以便于测量；

    4）开启显微镜，将培养皿或者培养平板与叠合的测量辅助装置一并放置于载物台上，调节显微镜，在视野中观察寻找欲测量尺寸的种类的细菌或孢子；

    5）借助外界光源辅助，调节显微镜视野内的光线强弱，针对视野中找到的欲测量尺寸的种类的细菌或孢子，调节显微镜，使得其清晰可辨，在此前提下，转动透明测定盘，将符合显微镜放大倍数观测需要的单位刻度的半径线转动到欲测量尺寸的种类的细菌或孢子附近，并依据该单位刻度及其上的标示将欲测量尺寸的种类的细菌或孢子的尺寸大致读出，用笔记载在计数纸上；

    6）在套板的圆形槽底部设置网格，网格线是水平垂直交叉的，或者是以圆形槽圆心处放射线与以该圆心为圆心的半径不同的圆形线，网格线有反光特性，网格给予编号，在步骤4中欲测量尺寸的种类的细菌或孢子清晰可辨的前提下，确认其处于的网格编号，在登记其尺寸时一并登记；

    7）在透明测定盘重叠下的视野中逐个确认欲测量尺寸的种类的细菌或孢子，在登记了其尺寸、网格编号后，将培养皿或者培养平板与与其叠合的辅助测量装置保持原位置一并取出，将透明测定盘取下，用光学成像装置对其成像，并将该图像在PC端生成并截取在透明测定盘重叠下的视野中的圆形区域的图像；

    8）根据反光形成的网格线的形状，在PC端的图像处理软件中仅仅加载步骤6所得图像，根据预先登记了的网格的信息，对前述图像突出显示登记了的网格，并根据灰度测算程序，对图像中所有疑似为细菌和孢子的图像进行自动套取，以特定鲜艳颜色突出显示；

    9）通过PC端软件对显示出的所有疑似为细菌和孢子的套取了的图像，进行手动点选，选中全部已测量并登记过的欲测量尺寸的种类的细菌或孢子，并向PC段程序输入确认信息，PC端的图像处理软件对确认过的属于测量并登记过的欲测量尺寸的种类的细菌或孢子，按图像进行大小尺寸的自动识别，并记录数据，完成显微测量。