CN114276201B - 具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆及其制备方法以及脲酶抑制作用的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆及其制备方法以及脲酶抑制作用的测定方法。具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆，将粉碎的植物秸秆放入旋转炉中，在炉温升至160~240℃、通入空气或氧气进行控氧氧化2~5h，出炉后得到的物质即为具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆。本发明官能化秸秆可以改变土壤生态环境，降低土壤中脲酶活性，延长氮肥在土壤中的存留时间，对土壤环境无破坏性，尤其能够培肥改良土壤，便于大规模应用，对于可持续发展的生态环境具有重要的现实意义。

Description

具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆及其制备方法以及脲酶 抑制作用的测定方法

技术领域

本发明涉及一种脲酶抑制剂，具体地说是一种具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆及其制备方法以及脲酶抑制作用的测定方法。

背景技术

尿素理论含氮量为46.65％，是目前含氮量最高的中性速效、氮含量与价格比值最高的氮肥。适用于作基肥和追肥，有时也用作种肥。因尿素含氮量高、用量大，在农业生产中有着举足轻重的地位。然而尿素是分子态的，不能被植物直接吸收，也不能被土壤吸附。普通尿素施入土壤后,只需数小时便会全部溶解，一小部分以分子态溶于土壤溶液中，通过氢键作用被土壤吸附，其他大部分在脲酶的作用下水解成碳酸氢铵（铵态氮），然后铵根离子能被植物吸收和土壤胶体吸附，碳酸氢根离子也能被植物吸收；或铵态氮在硝化酶的作用下转化为硝态氮,也能被作物吸收利用。

脲酶（又名尿素酞胺水解酶）是一种广泛存在于各种生物体内和生态环境中可以催化尿素水解为氨的酶，在自然条件下的氮循环中发挥着重要的作用。在自然条件下,尿素会缓慢的分解,产生氨气,但在脲酶存在的条件下,尿素的分解速度可增大10¹⁴倍。然而，在农业方面，脲酶活性过高会使尿素过快的水解成氨，若不能及时被植物吸收，导致氨的挥发以及土壤中的硝酸根离子、铵根离子蓄积过多，从而降低氨的利用率，尤其是碱性土壤上更为严重。因此，使用尿素时应防止随水流失或以气体挥发造成的利用率降低。在施用尿素的过程中,氮的大量流失,不仅影响农作物产量和品质,而且导致资源浪费,破坏生态环境,影响人类健康。随着日益重视生态环境保护,提高尿素肥效和利用率已成为业内普遍关注的重大课题。阻止其中氮损失的一种方法就是尿酶抑制剂的使用。

脲酶抑制剂是指能够直接或间接抑制脲酶活性的一类物质；因而能延缓尿素的水解生成氨的速度，减少铵态氮的挥发和硝化，也常作为肥料增效剂应用于农业生产中。脲酶抑制剂抑制尿素水解的机理主要有两个方面：一是由于-SH的氧化，降低了脲酶活性；二是争夺脲酶中镍离子的配位体，降低脲酶活性。如CN110590480 A公布的硫脲树脂作为脲酶抑制剂。目前,常用的脲酶抑制剂包括磷酸二酰胺、磷酸三酰胺、乙酰氧肟酸、苯醌等,主要运用在人类医学和土壤上,较少用于动物养殖业和农业化肥。其中含有氢醌、双氰胺等的缓释氮肥作为专用肥已有推广应用。氢醌作为一种酚类脲酶抑制剂,能有效地抑制脲酶活性,延缓尿素水解，与其它脲酶抑制剂相比,氢醌的经济性和少量施入后对土壤污染小的优点显得尤为突出,因而在调控尿素氮转化过程中受到了广泛关注。但由于氢醌易被氧化，不够稳定，大大影响了其应用前景。

农业方面的应用，为了提高脲酶抑制的稳定性，多侧重于与尿素、有机肥、微量元素进行混合，并与高分子材料环糊精、一聚谷氨酸、脲醛树脂、腐殖酸等、重金属铜盐、锌盐等络合包裹，与缓释肥料配合制备和使用；但这些稳定方法的材料来源不广泛，处理和制备过程较复杂，甚至会带来二次污染问题。尿酶抑制剂普遍存在稳定性差、价格昂贵,作用时间较短、毒副作用明显等缺点，在实际应用中具有一定的限制。显然，对于脲酶抑制剂的商业化要求的是热稳定和易储存，并且能够长期有效的抑制脲酶活性。因此，安全、高效、污染小的脲酶抑制剂的研发备受关注。将脲酶抑制剂做成缓释材料，提高尿素在土壤中的滞留时间，降低流失率，同时避免脲酶抑制剂在农业生产应用过程中的二次污染问题，是一种行之有效的办法。

发明内容

本发明的目的之一就是提供一种具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆，以解决现有尿酶抑制剂存在的稳定性差、价格昂贵、作用时间短和毒副作用明显的问题。

本发明的目的之二就是提供一种具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆的制备方法，以逐步实现具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆的量产。

本发明的目的之三就是提供一种官能化秸秆作为脲酶抑制剂的使用方法，以满足市场对脲酶活性剂的需求。

本发明的目的之四就是提供一种官能化秸秆的脲酶抑制作用的测定方法，以检测所制备的官能化秸秆产品对脲酶活性的抑制作用。

本发明的目的之一是这样实现的：一种具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆，将粉碎的植物秸秆放入旋转炉中，在炉温升至160~240℃、通入空气或氧气进行控氧氧化2~5h，出炉后得到的物质即为具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆。

进一步地，所用植物秸秆为芦苇秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、花生秸秆、姜秸秆和小麦秸秆中的至少一种。

进一步地，空气或氧气的通入量是按照秸秆重量（g）与氧气流量（mL/min）为100︰50~300的比例进行控制。

本发明的目的之二是这样实现的：一种具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆的制备方法，将植物秸秆粉碎至5mm以下，放入旋转炉中，炉温升至160~240℃，通入空气或氧气进行控氧氧化2~5h，出炉后即得具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆。

进一步地，所用植物秸秆为芦苇秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、花生秸秆、姜秸秆和小麦秸秆中的至少一种。

进一步地，空气或氧气的通入量是按照秸秆重量（g）与氧气流量（mL/min）为100︰50~300的比例进行控制。

本发明的目的之三是这样实现的：一种官能化秸秆作为脲酶抑制剂的使用方法，按官能化秸秆与尿素的重量比为1~20︰1的比例配合使用。官能化秸秆的具体添加量，应根据土地板结情况或者有机肥与无机肥的混配比符合行业标准规范的要求等因素来具体确定。

依据GB-T18877-2020 有机无机复混肥料中对技术指标的要求，按官能化秸秆作为脲酶抑制剂，其与尿素重量比为1~20︰1的比例配合使用（若不考虑标准限制，还可以提高官能化秸秆的用量），就可以对尿素中的脲酶具有很好的抑制作用。

本发明的目的之四是这样实现的：一种官能化秸秆的脲酶抑制作用的测定方法，包括以下步骤：

（1）将大豆以不产热的方式进行粉碎，过100目筛后成豆粉，放置备用；

（2）将0.5g的豆粉放入烧杯中，再注入20.00ml的蒸馏水，浸泡15小时；

（3）将1.000g的尿素与2.000g的官能化秸秆一起研磨混匀，转移到步骤（2）的烧杯中，混匀；

（4）在步骤（3）的烧杯中放入一个敞口小烧杯，敞口小烧杯的底部设置有白色橡胶塞，白色橡胶塞的底部有若干玻璃珠支撑，以使其与烧杯底保持间隙；

（5）向敞口小烧杯内加入1.0ml的盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂（变色点pH=5.1，酸色 酒红，碱色 蓝绿，变色点为灰色）；

（6）用封口膜封住烧杯的端口，放入30±0.5℃恒温水浴中，观察并记录指示剂变色所用的时间；

（7）当指示剂变色后，用注射器向敞口小烧杯内补充盐酸，使指示剂变回酒红色，然后继续观察、记录指示剂再次变色所用的时间；

（8）重复步骤（7），记录消耗盐酸的量随时间的变化，根据记录数据作图，再用直线拟合曲线，通过斜率计算释放氨气的速度，以每克大豆制品每分钟分解尿素所释放的氨的含量（mg/g.min）来表征大豆中脲酶的活性。

本发明所制备的官能化秸秆可作为一种尿酶抑制剂，使用在农业生产过程中。

本发明官能化秸秆可以改变土壤的生态环境，降低土壤中脲酶的活性。植物秸秆是一种十分丰富的可再生资源，以植物秸秆为原料经控氧氧化和活化而成的官能化秸秆，具有显著的脲酶活性抑制效果。若将其用于作为基质载体型缓释肥料的载体，则不仅成本低廉、能耗低、便于大规模应用，并且由于是对秸秆的综合利用，对土壤环境无破坏性，尤其能够培肥改良土壤，对于可持续发展的生态环境具有重要的现实意义。

具体实施方式

实施例：

以市售大豆作为脲酶原料；依据GB-T18877-2020 有机无机复混肥料中对氮含量要求>15%，按官能化秸秆作为脲酶抑制剂与尿素重量比为2∶1的比例配合使用；用过量盐酸吸收脲酶催化尿素水解所产生的氨，用溴甲酚绿-甲基红作指示剂，记录消耗盐酸的体积随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算释放氨气的速度，以每克大豆制品每分钟分解尿素所释放的氨的含量（mg/g.min）来表征大豆中脲酶的活性。

对比例1：

称取0.5g豆粉放入150ml烧杯中，加入20.00ml蒸馏水浸泡15小时后，加入1g尿素，搅拌均匀后放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，玻璃珠上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放一个40mm×25mm敞口小烧杯，在敞口小烧杯中加入1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂，然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向敞口小烧杯内补充1.0ml盐酸，使指示剂变回酒红色，继续观察、记录指示剂再次变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算释放氨气的速度，可得每克大豆制品每分钟分解尿素所释放的氨的量为0.46mg，表明大豆中脲酶的活性为0.46 mg/g.min。

对比例2：

称取粉碎后60-180目的麦秸与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.40 mg/g.min。与对比例1相比，由于麦秸的加入，大豆中脲酶的活性降低了13%。

实施例1：

将200g粉碎后60-180目的麦秸粉放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入200mL/min的氧气，加热旋转炉升温至240℃，恒温2h，制得产品90g（产率45%）、酸值为3.3mmol/g、pH 6.3的官能化麦秸240。

称取麦秸240与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.34 mg/g.min。与对比例1相比，由于麦秸的加入，大豆中脲酶的活性降低了26%。与对比例2相比，官能化麦秸较麦秸原料更有效地降低了大豆中脲酶的活性。

实施例2：

将200g粉碎后60-180目的麦秸粉放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入100mL/min的氧气，加热旋转炉升温至220℃，恒温3h，制得产品104g（产率52%）、酸值为3.3mmol/g、pH 4.8的官能化麦秸220。

称取麦秸220与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.32 mg/g.min。与对比例1相比，由于麦秸的加入，大豆中脲酶的活性降低了30%。和实施例2相比，官能化麦秸较麦秸原料更有效地降低了大豆中脲酶的活性。

实施例3：

将200g粉碎后60-180目的麦秸粉放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入600mL/min的氧气，加热旋转炉升温至180℃，恒温3h，制得产品146g（产率73%）、酸值为3.0mmol/g、pH 4.50的官能化麦秸180。

称取麦秸180与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.36 mg/g.min。与对比例1相比，由于麦秸的加入，大豆中脲酶的活性降低了约22%。与对比例2相比，官能化麦秸较麦秸原料更有效地降低了大豆中脲酶的活性。

对比例3：

称取粉碎后60-180目的水稻秸秆与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.43mg/g.min。与对比例1相比，由于水稻秸秆的加入大豆中脲酶的活性降低了6.5%。

实施例4：

将100g粉碎后60-180目的水稻秸秆粉放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入200mL/min的氧气，加热旋转炉升温至160℃，恒温5h，制得产品85g（产率85%）、酸值为2.66 mmol/g、pH 5.7的官能化稻秸160。

称取稻秸160与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.29 mg/g.min。与对比例1相比，由于稻秸160的加入大豆中脲酶的活性降低了约37%。与对比例3相比，官能化稻秸160较稻秸原料更有效地降低了大豆中脲酶的活性。

实施例5：

将200g粉碎后60-180目的水稻秸秆粉放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入200mL·min^-1的氧气，加热旋转炉升温至200℃，恒温3h，制得产品130g（产率65%）、酸值为2.78 mmol/g、pH 5.5的官能化稻秸200。

称取稻秸200与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.19 mg/g.min。与对比例1相比，由于稻秸200的加入大豆中脲酶的活性降低了约59%。与对比例3相比，官能化稻秸200较稻秸原料更有效地降低了大豆中脲酶的活性。

对比例4：

称取粉碎后60-180目的玉米秸秆与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.48mg/g.min。与对比例1相比，由于玉米秸秆的加入大豆中脲酶的活性提高了4%。

实施例6：

将100g粉碎后60-180目的玉米秸秆粉放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入500mL/min的空气，加热旋转炉升温至200℃，恒温4h，制得产品61g（产率61%）、酸值为2.85 mmol/g、pH 5.7的官能化玉米200。

称取官能化玉米200与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.38 mg/g.min。与对比例1相比，由于官能化玉米200的加入大豆中脲酶的活性降低了约17%。与对比例4相比，官能化玉米200降低了、而不是提高了大豆中脲酶的活性。

实施例7：

将150g粉碎后60-180目的玉米秸秆粉放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入500mL·min^-1的空气，加热旋转炉升温至220℃，恒温5h，制得产品78g（产率52%）、酸值为6.25mmol/g、pH 5.8的官能化玉米220。

称取官能化玉米220与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.36 mg/g.min。与对比例1相比，由于官能化玉米220的加入大豆中脲酶的活性降低了约22%。与对比例4相比，官能化玉米220降低了、而不是提高了大豆中脲酶的活性。

对比例5：

称取粉碎后60-180目的芦苇与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.44 mg/g.min。与对比例1相比，由于芦苇秸秆的加入大豆中脲酶的活性降低了4%。

实施例8：

将200g粉碎后60-180目的芦苇秸秆粉放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入200mL/min的氧气，加热旋转炉升温至210℃，恒温4h，制得产品130g（产率65%）、酸值为3.5 mmol/g、pH 5.2的官能化芦苇210。

称取官能化芦苇210与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.35mg/g.min。与对比例1相比，由于官能化芦苇210的加入大豆中脲酶的活性降低了约24%。与对比例5相比，官能化芦苇210较芦苇原料更有效地降低了大豆中脲酶的活性。

实施例9：

将300g粉碎后60-180目的芦苇秸秆粉放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入300mL/min的氧气，加热旋转炉升温至180℃，恒温4h，制得产品130g（产率65%）、酸值为3.2 mmol/g、pH 4.8的官能化芦苇180。

称取官能化芦苇180与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.30mg/g.min。与对比例1相比，由于官能化芦苇180的加入大豆中脲酶的活性降低了约35%。与对比例5相比，官能化芦苇180较芦苇原料更有效地降低了大豆中脲酶的活性。

对比例6：

称取粉碎后60-180目的花生秸秆与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.44mg/g.min。与对比例1相比，由于花生秸秆的加入大豆中脲酶的活性降低了4%。

实施例9：

将300g粉碎后60-180目的花生秸秆粉放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入300mL/min的氧气，加热旋转炉升温至190℃，恒温4h，制得产品130g（产率65%）、酸值为2.5 mmol/g、pH 4.8的官能化花生190。

称取官能化花生190与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.35mg/g.min。与对比例1相比，由于官能化花生190的加入大豆中脲酶的活性降低了约24%。与对比例6相比，官能化花生190较花生秸秆原料更有效地降低了大豆中脲酶的活性。

实施例9：

将100g粉碎后60-180目的花生秸秆粉放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入100mL/min的氧气，加热旋转炉升温至230℃，恒温4h，制得产品43g（产率43%）、酸值为2.3mmol/g、pH 5.3的官能化花生230。

称取官能化花生230与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.35mg/g.min。与对比例1相比，由于官能化花生230的加入大豆中脲酶的活性降低了约24%。与对比例6相比，官能化花生230较花生秸秆原料更有效地降低了大豆中脲酶的活性。

对比例7：

称取粉碎后60-180目的姜秸秆与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.40 mg/g.min。与对比例1相比，由于姜秸秆的加入大豆中脲酶的活性降低了13%。

实施例10：

将250g粉碎后60-180目的姜秸秆粉放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入300mL/min的氧气，加热旋转炉升温至200℃，恒温4h，制得产品160g（产率64%）、酸值为2.7mmol/g、pH 5.3的官能化姜200。

称取官能化姜200与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.25mg/g.min。与对比例1相比，由于官能化姜200的加入大豆中脲酶的活性降低了约46%。与对比例7相比，官能化姜200较姜秸秆原料更有效地降低了大豆中脲酶的活性。

实施例11：

将200g粉碎后60-180目的姜秸秆粉放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入200mL/min的氧气，加热旋转炉升温至220℃，恒温4h，制得产品104g（产率52%）、酸值为2.6mmol/g、pH 5.5的官能化姜220。

称取姜220与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.28mg/g.min。与对比例1相比，由于官能化姜220的加入大豆中脲酶的活性降低了约39%。与对比例7相比，官能化姜220较姜秸秆原料更有效地降低了大豆中脲酶的活性。

实施例12：

将60-180目的花生秸秆100g与玉米秸秆100g放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入200mL·min^-1的氧气，加热旋转炉升温至200℃，恒温4h，制得产品110g（产率55%）、酸值为2.8 mmol/g、pH 5.3的官能化HY200。

称取官能化HY200与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.35mg/g.min。与对比例1相比，由于官能化HY200的加入大豆中脲酶的活性降低了约24%。

实施例13：

将60-180目的花生秸秆100g与芦苇秸秆100g放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入200mL/min的氧气，加热旋转炉升温至210℃，恒温4h，制得产品110g（产率55%）、酸值为2.8 mmol/g、pH 5.3的官能化HL210。

称取官能化HL210与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.33mg/g.min。与对比例1相比，由于官能化HL210的加入大豆中脲酶的活性降低了约28%。

实施例14：

将60-180目的麦秸100g与芦苇秸秆100g放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入200mL/min的氧气，加热旋转炉升温至210℃，恒温3h，制得产品130g（产率65%）、酸值为3.1 mmol/g、pH 5.3的官能化ML210。

称取官能化ML210与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.36mg/g.min。与对比例1相比，由于官能化ML210的加入大豆中脲酶的活性降低了约22%。

实施例14：

将60-180目的麦秸100g与稻秸100g放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入200mL/min的氧气，加热旋转炉升温至200℃，恒温3h，制得产品120g（产率60%）、酸值为2.9mmol/g、pH 5.5的官能化MD200。

称取官能化MD200与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.27mg/g.min。与对比例1相比，由于官能化MD200的加入大豆中脲酶的活性降低了约41%。

实施例15：

将60-180目的芦苇100g与稻秸100g放入5L的实验室用旋转炉中，向旋转炉内通入200mL/min的氧气，加热旋转炉升温至200℃，恒温3h，制得产品122g（产率61%）、酸值为3.0mmol/g、pH 5.2的官能化LD200。

称取官能化LD200与尿素的重量比为2∶1的混合并研磨均匀的混合物3g，加入到0.5g豆粉在20.00ml蒸馏水中浸泡15小时的150ml烧杯中，搅拌混匀；放入5粒直径5mm左右的玻璃珠，上面支撑一个直径40mm的白色橡胶塞，橡胶塞上面放上加入了1.0ml盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂的40mm×25mm敞口小烧杯。然后迅速用封口膜封住150ml的烧杯，放入30±0.5℃恒温水浴中；观察、记录指示剂变色所用时间；待敞口小烧杯内的指示剂变色后，用2.5ml的一次性注射器向小烧杯内补充1.0ml盐酸，指示剂变回酒红色，继续观察、记录变色所用时间。重复加盐酸并观察指示剂变色的操作，记录消耗盐酸的量随时间的变化，作图，直线拟合，通过斜率计算可得大豆中脲酶的活性为0.28mg/g.min。与对比例1相比，由于官能化LD200的加入大豆中脲酶的活性降低了约39%。

Claims (3)

1.一种具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆作为脲酶抑制剂的使用方法，其特征是，将粉碎的植物秸秆放入旋转炉中，在炉温升至160~240℃、通入空气或氧气进行控氧氧化2~5h，出炉后得到的物质即为具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆；所述植物秸秆为芦苇秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、花生秸秆、姜秸秆和小麦秸秆中的至少一种；空气或氧气的通入量是按照秸秆重量（g）与氧气流量（mL/min）为100︰50~300的比例进行控制；按所述官能化秸秆与尿素的重量比为1~20︰1的比例配合，即可作为脲酶抑制剂使用。

2.一种具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆的脲酶抑制作用的测定方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）将大豆以不产热的方式进行粉碎，过100目筛后成豆粉，放置备用；

（2）将0.5g的豆粉放入烧杯中，再注入20.00ml的蒸馏水，浸泡15小时；

（3）将1.000g的尿素与2.000g的官能化秸秆一起研磨混匀，转移到步骤（2）的烧杯中，混匀；

（4）在步骤（3）的烧杯中放入一个敞口小烧杯，敞口小烧杯的底部设置有白色橡胶塞，白色橡胶塞的底部有若干玻璃珠支撑，以使其与烧杯底保持间隙；

（5）向敞口小烧杯内加入1.0ml的盐酸和2.0微升的溴甲酚绿-甲基红指示剂；

（6）用封口膜封住烧杯的端口，放入30±0.5℃恒温水浴中，观察并记录指示剂变色所用的时间；

（7）当指示剂变色后，用注射器向敞口小烧杯内补充盐酸，使指示剂变回酒红色，然后继续观察、记录指示剂再次变色所用的时间；

（8）重复步骤（7），记录消耗盐酸的量随时间的变化，根据记录数据作图，再用直线拟合图中的曲线，通过斜率计算释放氨气的速度，以每克大豆制品每分钟分解尿素所释放的氨的含量（mg/g.min）来表征大豆中脲酶的活性；

所述官能化秸秆是将粉碎的植物秸秆放入旋转炉中，在炉温升至160~240℃、通入空气或氧气进行控氧氧化2~5h，出炉后得到的物质即为具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆。

3.具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆在尿酶抑制剂中的应用，其特征是，所述官能化秸秆是将粉碎的植物秸秆放入旋转炉中，在炉温升至160~240℃、通入空气或氧气进行控氧氧化2~5h，出炉后得到的物质即为具有脲酶活性抑制作用的官能化秸秆。