CN114269913A - 胞嘧啶碱基编辑组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及胞嘧啶碱基编辑组合物，并且更具体地，涉及包含腺嘌呤脱氨酶和CRISPR相关蛋白9(Cas9)或其功能类似物的胞嘧啶碱基编辑组合物，其具有窄的编辑窗口，因此能够用其他碱基准确编辑靶序列中的胞嘧啶。本发明人已发现将包含腺嘌呤脱氨酶和Cas9或其功能类似物的胞嘧啶碱基编辑组合物应用于靶序列导致特定基序上的胞嘧啶被其他碱基替换，并且现有的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)不仅能够编辑腺嘌呤，还能够编辑胞嘧啶，并且能以比现有胞嘧啶碱基编辑器(CBE)更高的准确性发生所述替换。因此，根据本发明的胞嘧啶碱基编辑组合物预期有利地用于遗传疾病的治疗和遗传疾病的研究中。
Description
技术领域
本发明涉及胞嘧啶碱基编辑组合物，并且更具体地，涉及胞嘧啶碱基编辑组合物，其包含腺嘌呤脱氨酶和CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9，Cas9)蛋白或其功能类似物，并能够通过具有窄的编辑窗口范围，准确地将靶序列中的胞嘧啶编辑为其他碱基。
背景技术
当前的基因组编辑(基因组工程)是通过根据非同源末端连接(non-homologousend joining，NHEJ)机制的方法以及根据在附近同源DNA存在下发生的同源重组的方法进行的，所述非同源末端连接机制通过在待编辑的特定基因的特定位置处的双链断裂通过DNA修复中诱导的不完全修复来诱导插入-缺失(insertion-deletion，Indel)突变。
同时，最近，开发了能够在不切割DNA的情况下编辑基因组的碱基编辑器，其实例包括腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editors，ABE)和胞嘧啶碱基编辑器(cytosinebase editors，CBE)。CBE可以通过将天然胞嘧啶脱氨酶与dCas9或nCas9融合来构建，并在无基因切割或插入额外的供体DNA的情况下，将胞嘧啶编辑为胸腺嘧啶。另一方面，学术界有报道称，ABE是通过将靶向DNA而非RNA的人工修饰腺苷脱氨酶与Cas9变体融合构建的，因此能够将腺嘌呤编辑为鸟嘌呤。碱基编辑器作为推进难治性遗传疾病的研究和治疗的工具而受到关注，并且据报道，正在研究ABE的准确性以作为碱基编辑技术广泛使用。
然而，通常用于治疗难治性遗传疾病的ABE或CBE具有由于仅校正特定碱基(例如腺嘌呤或胞嘧啶)而降低效率和经济效率的问题。
公开内容
技术问题
本发明是为了解决上述问题而提供的，发明人首先通过将包含腺嘌呤脱氨酶和CRISPR相关蛋白9(Cas9)蛋白或其功能类似物的胞嘧啶碱基编辑组合物应用于靶序列来鉴定特定基序上的胞嘧啶被其他碱基替换。基于此，完成了本发明。
因此，本发明旨在提供胞嘧啶碱基编辑组合物，其包含腺嘌呤脱氨酶和Cas9蛋白或其功能类似物。
另外，本发明旨在提供胞嘧啶碱基编辑方法，该方法包括使胞嘧啶碱基编辑组合物与靶序列接触。
然而，本发明待解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域普通技术人员通过以下描述将充分理解本文未描述的其他问题。
技术方案
为实现上述目的，
本发明提供了胞嘧啶碱基编辑组合物，其包含腺嘌呤脱氨酶和Cas9蛋白或其功能类似物。
在本发明的一个实施方案中，碱基编辑组合物可用选自腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶的任一种碱基替换胞嘧啶。
在本发明的另一个实施方案中，碱基编辑组合物的编辑窗口可以在靶序列从5′端起第四位碱基(胞嘧啶)到第八位碱基(胞嘧啶)的范围内。
在本发明的另一个实施方案中，胞嘧啶可以是与位于靶序列5′方向的胸腺嘧啶直接相邻的胞嘧啶。
在本发明的另一个实施方案中，碱基编辑组合物可以是选自ABE6.3、ABE7.8、ABE7.9、ABE7.10和ABEmax中的任一种。
此外，本发明提供了胞嘧啶碱基编辑方法，其包括使碱基编辑组合物与靶序列接触。
有利效果
本发明鉴定了当将包含腺嘌呤脱氨酶和CRISPR相关蛋白9(Cas9)蛋白或其功能类似物的胞嘧啶碱基编辑组合物应用于靶序列时，特定基序上的胞嘧啶被其他碱基替换，并证实了常规的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)不仅可以编辑腺嘌呤，还可以编辑胞嘧啶，并且替换发生比常规胞嘧啶碱基编辑器(CBE)更准确。因此，预期根据本发明的胞嘧啶碱基编辑组合物可以有效地用于治疗和研究遗传疾病。
附图说明
图1是显示通过根据本发明的组合物进行碱基编辑的特异性的示意图。
图2示出了通过根据本发明的组合物在靶序列的预定编辑窗口范围内量化碱基替换率的结果。
图3示出了FANCF和RNF2基因靶区域中每个位置的核苷酸频率。在这里，预期的核苷酸频率用蓝色阴影表示，替换的核苷酸频率用橙色阴影表示，以及原间隔序列相邻基序(protospacer adjacent motif，PAM)序列用红色阴影表示。
图4示出了分析通过根据本发明的组合物(ABE6.3、ABE7.8、ABE7.9、ABE7.10形式)在FANCF和RNF2中的A4和C6位点诱导的碱基替换率的结果(*p＜0.1，**p＜0.001，(n＝3，±S.D.))。
图5示出了证实UGI对根据本发明的组合物的胞嘧啶替换率和替换产物比例的影响的结果(胞嘧啶替换率**p＜0.01。(n＝3，±S.D.)，替换产物的比例p＜0.001)。
图6示出了在碱基编辑中通过下一代测序(next-generation sequencing，NGS)证实序列基序的结果，其中C*位置固定在靶位点5′端下游的第6位。
图7示出了证实胞嘧啶(C*)的转换率与其直接相邻的上游碱基的依赖性的结果，其中C*位置固定在靶位点5′末端下游的第6位。
图8示出了证实胞嘧啶(C*)的转换率与其直接相邻的下游碱基的依赖性的结果，其中C*位置固定在靶位点5′末端下游的第6位。
图9示出了基于其中诱导胞嘧啶编辑的靶序列进行的从头基序分析数据，其中C*位置固定在靶位点5′端下游的第6位。
图10示出了证实BIRC7或ABHC12的靶序列中每个位置的碱基替换率的结果(*p＜0.1，**p＜0.001，(n＝3，±S.D.))。
图11示出了通过NGS证实胞嘧啶编辑窗口的结果。
图12示出了根据编辑窗口中的胞嘧啶位置证实胞嘧啶替换率的依赖性的结果。
图13示出了比较BE3和根据本发明的组合物的胞嘧啶编辑窗口的结果(*p＜0.05，(n＝2，±S.D)。
图14示出了在多种细胞系(HEK293T、HeLa、U-2OS和K-562)中证实根据本发明的组合物(ABEmax形式)的胞嘧啶编辑效率的结果(n＝3，±S.D.)。
图15示意性地示出了用于证实根据本发明的组合物是否在体外对靶序列进行胞嘧啶编辑的实验过程。
图16A和16B示出了用于证实根据本发明的组合物是否在体外对靶序列进行胞嘧啶编辑的第一次试验和第二次试验的结果。
发明方式
在下文中，将详细描述本发明。
发明人首先鉴定了ABE可以用于将特定基序上的不仅腺嘌呤还有胞嘧啶替换为其他碱基，并且与常规的CBE相比，替换发生的准确性更高，从而完成了本发明。
因此，本发明提供了胞嘧啶(C)碱基编辑组合物，其包含腺嘌呤脱氨酶和CRISPR相关蛋白9(Cas9)蛋白或其功能类似物。
术语“碱基编辑器(base editor，BE)”是单碱基编辑手段，并且更具体地，是通过将胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶与Cas9切口酶的N端融合而构建的，因此命名为胞嘧啶碱基编辑器(CBE)或腺嘌呤碱基编辑器(ABE)。BE不会导致双链断裂，ABE在特定位点将腺嘌呤编辑为鸟嘌呤，CBE在特定位点将胞嘧啶编辑为胸腺嘧啶。
术语“腺嘌呤碱基编辑器(ABE)”是通过将任何天然脱氨酶(ecTadA)和腺嘌呤脱氨酶变体(ecTadA*)融合到Cas9切口酶的N端以将腺嘌呤编辑为鸟嘌呤而构建的，而且ABE根据形式包括ABE6.3、ABE7.8、ABE7.9、ABE7.10和ABEmax，但本发明不限于此。根据本发明的“包含腺嘌呤脱氨酶和CRISPR相关蛋白9(Cas9)蛋白或其功能类似物的胞嘧啶(C)碱基编辑组合物”可以称为“ABE”。
根据本发明的“腺嘌呤脱氨酶”是参与氨基的去除和次黄嘌呤的产生的酶，而且据报道，这种酶很少在高等动物中发现，但少量存在于牛的肌肉、乳或大鼠的血液中，大量存在于鳌虾和昆虫的肠道中。腺嘌呤脱氨酶包括天然腺嘌呤脱氨酶例如ecTadA，但本发明不限于此。腺嘌呤脱氨酶包括其变体，例如ecTadA突变体(ecTadA*)，但本发明不限于此。
根据本发明的“CRISPR相关蛋白9(Cas9)蛋白”是在特定细菌针对DNA病毒的免疫防御中发挥重要作用的蛋白，并广泛用于基因工程应用。由于蛋白质的关键功能是DNA切割，因此该蛋白质可应用于修饰细胞的基因组。从技术上讲，Cas9是RNA向导DNA内切酶，与化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的聚集性规则间隔短回文重复序列(CRISPR)适应性免疫系统相关，解开外源DNA链以识别与向导RNA的20bp间隔区互补的位点，因此，当DNA与向导RNA互补时，被认为是侵入性DNA，并作为切割它的机制发挥作用。
碱基编辑组合物可以用选自腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶的任一种碱基替换胞嘧啶，优选用鸟嘌呤或胸腺嘧啶替换胞嘧啶。
碱基编辑组合物的编辑窗口可以是范围为位于靶序列5′端的第4位的胞嘧啶至位于第8位的胞嘧啶，优选地，位于其5′端的第5位的胞嘧啶至位于第7位的胞嘧啶，更优选地，位于其5′端第6位的胞嘧啶。
胞嘧啶可以是与位于靶序列上5′方向的胸腺嘧啶直接相邻的胞嘧啶。
碱基编辑组合物可以是选自ABE6.3、ABE7.8、ABE7.9、ABE7.10和ABEmax中的任一种，但本发明不限于此。
发明人证实，根据本发明的ABE根据具体实例在编辑窗口中将特定基序上的胞嘧啶编辑为其他碱基。
更具体地，在根据本发明的一个实施方案中，证实了根据本发明的组合物(ABE7.10、ABE6.3、ABE7.8和ABE7.9形式)通过胞嘧啶脱氨作用将胞嘧啶编辑为其他碱基(参见实施例2)。
在本发明的另一个实施方案中，就通过本发明的组合物诱导的胞嘧啶编辑而言，作为证实与胞嘧啶直接相邻的核苷酸的作用的结果，证实了在TC*N基序中胞嘧啶编辑效率高(参见实施例3)。
在本发明的另一个实施方案中，作为证实在编辑窗口中根据本发明的组合物诱导胞嘧啶脱氨作用的结果，胞嘧啶编辑在C6位以最高频率发生，证实胞嘧啶编辑窗口范围为C5至C7。因此，证实了根据本发明的组合物的胞嘧啶编辑窗口比CBE和常规ABE的编辑窗口更窄(参见实施例5)。
上述结果显示，常规已知靶向腺嘌呤进行编辑的根据本发明的组合物可以用于胞嘧啶编辑，并且更具体地显示，为了编辑胞嘧啶，根据本发明的组合物可通过识别组合物特异性结合的基序和编辑窗口用于胞嘧啶编辑。
因此，本发明的另一方面提供了胞嘧啶碱基编辑方法，其包括使根据本发明的组合物与靶序列接触。
在根据本发明的碱基编辑方法中，靶序列可包括待编辑的靶碱基，并且待编辑的靶碱基可以是这样的碱基，其中不包括胞嘧啶且与疾病或病症相关的碱基通过点突变转换为胞嘧啶，但本发明不限于此。
在下文中，为了帮助理解本发明，将提出示例性实施例。然而，提供以下实施例仅是为了更容易理解本发明，而不是限制本发明。
实施例
实施例1.实验方法
1-1.细胞培养条件
将HEK293T(ATCC CRL-11268)、HeLa(ATCC CLL-2)、U-2OS(ATCC HTB-96)和K-562(ATCC CCL-243)细胞维持在补充有10％FBS、100μg/mL链霉素、100单位/mL的青霉素和0.1mM非必需氨基酸的DMEM中。
1-2.转染条件
在转染之前一天接种1.0x105个HEK293T细胞。根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用表达ABE(750ng)和sgRNA质粒(250ng)的质粒转染细胞。
为了保持平行条件，使用4D核型样品(Lonza)用于HEK293T、HeLa、U-2OS和K-562细胞。根据制造商的方案，将ABEmax表达质粒(750ng)和sgRNA质粒(250ng)进行电穿孔至2.0×105个癌细胞中。
对于各自的细胞系，使用了合适的216个核仁程序(nucleolus program)(HEK293T的Nucleofector程序、CM-130程序，HeLa的CN-114程序，U-2OS的CM-104程序和K-562的FF-120程序)。在转染之后72小时分离基因组DNA。
1-3.UGI过表达
构建了基于pCMV-BE3(Addgene，221#73021)的pCMV-UGI质粒。为了过表达UGI以及ABE，使用Lipofectamine 2000转染ABE表达质粒(500ng)、sgRNA质粒(250ng)和pCMV-UGI(250ng)。对于阴性对照，转染等量的空pCMV载体代替pCMV-UGI。
1-4.ABE活性的体外测定
进行的体外脱氨作用测定如下。
将重组ABE蛋白(2000ng)和sgRNA(1500ng)在室温下预培养5分钟。
随后，将从HEK293T细胞中分离和纯化的基因组DNA(500ng)和2×缓冲液添加至ABE-sgRNA复合体。将所得混合物制备为含有50mM Tris-HCl、25mM KCl、2.5mM MgSO4、10％甘油、2mM DTT和10mM ZnCl2，最终体积为50μL。
之后，使用基因组DNA制备试剂盒(QIAGEN，目录号：69504)纯化通过在37℃下孵育混合物过夜而制备的产物，随后进行PCR扩增。
最后，使用靶向深度测序分析最终的PCR产物。
1-5.靶向深度测序
对于使用KAPA HiFi HotStart PCR试剂盒(KAPA Biosystems#：KK2501)进行的文库制备，扩增靶位点。使用带有TruSeq HT Dual Index系统的MiniSeq(Illumina)对该文库进行测序。
1-6.数据可用性
高通量测序数据以登记号PRJNA525294保藏在NCBI序列读取存档数据库(SRA；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)中。
实施例2.通过根据本发明的组合物证实胞嘧啶替换和脱氨作用
2-1.通过根据本发明的组合物的胞嘧啶替换
为了研究根据本发明的组合物是否编辑除腺嘌呤以外的碱基，鉴定了22个已知具有高Cas9核酸内切酶活性的人内源性DNA靶位点。
另外，本发明人假设通过根据本发明的组合物诱导的Cas9介导的碱基编辑以高水平发生在具有高Cas9核酸内切酶活性的DNA靶位点处。
将表达根据本发明的组合物的质粒和表达sgRNA的质粒转染至人HEK293T细胞中，并在转染之后3天，分离基因组DNA。
之后，扩增根据本发明的组合物的靶位点，然后用通过靶向深度测序扩增的扩增子处理。
最后，在5′末端靶位点的sgRNA结合区域中，在N3至N9范围内分析了每个核苷酸处由组合物诱导的所有碱基编辑，该N3至N9范围是使用BE分析仪预确定的“编辑窗口”。
结果是，如图2所示，证实了编辑窗口范围内的腺嘌呤被编辑，平均频率为40％。
另外，如图3所示，在FANCF和RNF2基因的两个靶位点处诱导非标准胞嘧啶碱基编辑，并且通过对其进行分析所获得的深度测序数据显示，FANCF和RNF2靶位点中的10.9％和10.2％的胞嘧啶分别通过根据本发明的组合物被转换为其他碱基。
同时，为了证实非标准胞嘧啶编辑是否根据根据本发明的组合物中Cas9变体的突变而变化，使用除ABE7.10之外的ABE6.3、ABE7.8和ABE7.9形式(这些形式是根据本发明的组合物)(每种形式均代表腺嘌呤脱氨酶TadA*酶中的不同突变)重复该实验。
结果是，如图4所示，证实了根据本发明的所有组合物在两个靶位点处诱导了非标准胞嘧啶碱基编辑。
2-2.通过根据本发明的组合物的腺嘌呤脱氨酶(TadA*)的胞嘧啶脱氨作用的证实
如上所述，根据本发明的组合物将胞嘧啶编辑为多种碱基，例如鸟嘌呤和胸腺嘧啶。
同时，当根据本发明的组合物的胞嘧啶脱氨作用活性引起U：G错配时，i)通过错配碱基对的DNA复制将胞嘧啶替换为胸腺嘧啶，或ii)通过尿苷切割其中尿嘧啶被切割然后连接其他碱基进行DNA修复。
因此，发明人假设根据本发明的组合物的腺嘌呤脱氨酶(TadA*)不仅使腺嘌呤脱氨，而且使胞嘧啶脱氨，并且为了证明该假设，通过过表达抑制尿嘧啶切割的尿嘧啶糖基化酶抑制剂(下文，UGI)，并将根据本发明的组合物应用到其上来进行胸腺嘧啶对胞嘧啶的诱导替换。
结果是，如图5所示，证实了在过表达的UGI条件下，几乎所有的胞嘧啶都转换为胸腺嘧啶。这意味着根据本发明的组合物的腺嘌呤脱氨酶直接将胞嘧啶脱氨，并且可以看出该结果支持上述假设。
实施例3.根据本发明的组合物的DNA靶基序的证实
在通过根据本发明的组合物诱导的胞嘧啶转换方面，为了研究与胞嘧啶直接相邻的核苷酸的作用，还鉴定了编辑窗口范围内含有NC*序列的内源靶位点。
首先，使用Cas-OFFinder，选择位于编辑窗口中心附近的包括NC*序列的蛋白质编码基因外显子中28个内源性靶位点，并进行实验以证实根据位于胞嘧啶上游并与胞嘧啶直接相邻的核苷酸之类型对胞嘧啶转换的作用。
如图7所示，结果表明，与位于序列5′方向的胸腺嘧啶直接相邻的胞嘧啶被根据本发明的组合物有效地转换。该结果与和位于5′方向的其他核苷酸直接相邻的胞嘧啶的转换率形成鲜明对比。
此外，还证实了23个具有与上述相似的标准的内源性靶位点。将位于5′方向的直接相邻核苷酸固定为胸腺嘧啶，然后根据胞嘧啶3′方向直接相邻的核苷酸之类型进行实验，以证实胸腺嘧啶对胞嘧啶转换的作用。
如图8所示，结果显示在TC*N序列中位于3′方向的嘧啶直接相邻的胞嘧啶被最有效地转换，但在大多数情况下，无论在3′方向直接相邻的核苷酸类型如何，碱基转换都被诱导至可测量的水平。
上述结果表明，由根据本发明的组合物诱导的胞嘧啶碱基编辑的DNA靶基序是TC*N。该结果与从头基序数据一致(参见图9)。
实施例4.通过根据本发明的组合物的胞嘧啶脱氨作用的独立性的证实
为了证实根据本发明的胞嘧啶碱基编辑是否受到相邻腺嘌呤脱氨作用的影响，鉴定了包括TC*N基序而非腺嘌呤的两个内源性靶位点，进行实验以证实通过根据本发明的组合物诱导的胞嘧啶脱氨作用是否独立于腺嘌呤脱氨作用而被诱导。
如图10所示，即使在胞嘧啶附近没有腺嘌呤的情况下，通过本发明的组合物也诱导了胞嘧啶脱氨作用，导致编辑发生。
该结果表明，通过根据本发明的组合物诱导的胞嘧啶脱氨作用是独立进行的，而不是作为在腺嘌呤脱氨作用之后发生的副作用而进行。
实施例5.根据本发明的组合物的编辑窗口的证实
发明人假设对于由根据本发明的组合物诱导的胞嘧啶脱氨作用，优选的靶窗口可以不同于为腺嘌呤脱氨预确定的编辑窗口。
为了确定有效胞嘧啶脱氨作用的编辑窗口，如图11所示，从sgRNA结合区C4至C9区域中的不同位置选择了包括TC*N基序在内的总共29个内源性靶位点。
如图12所示，通过根据本发明的组合物诱导的胞嘧啶编辑在C6位出现频率最高，因此确定胞嘧啶脱氨作用的编辑窗口为C5至C7范围。此范围比CBE编辑窗口和常规的ABE编辑窗口更窄。这证实了根据本发明的组合物与CBE相比可以更准确地编辑胞嘧啶。
此外，在两个相同的靶位点处，将根据本发明的组合物的胞嘧啶编辑活性与常规CBE的胞嘧啶编辑活性进行比较。
如图13所示，结果显示，虽然CBE表现出更高的总体胞嘧啶编辑效率，但根据本发明的组合物在更窄的编辑窗口中更特异性地编辑胞嘧啶。
另外，为了证实通过本发明的组合物诱导的胞嘧啶编辑是否在除HEK293T细胞系之外的几种其他人细胞系中被诱导，用HeLa、U-2OS和K-562细胞系重复该实验。
更具体地，为了证实用表达根据本发明的组合物的质粒处理的细胞系中四个基因(ABLIM3、CSRNP3、FANCF和RNF2)中靶窗口的A4和C6位置的腺嘌呤和胞嘧啶替换率，使用靶向深度测序测量了每个核苷酸的替换率。
结果是，如图14所示，证实了在每个细胞系中，胞嘧啶碱基编辑以与HEK293T细胞系中胞嘧啶碱基编辑相似的水平被诱导。
本领域普通技术人员应当理解，以上对本发明的描述是示例性的，在不脱离本发明的技术精神或本质特征的情况下，本文公开的示例性实施方案可以容易地修改为其他具体形式。因此，上述示例性实施方案应被解释为说明性的而不是在任何方面中的限制。
工业适用性
根据本发明，由于先前已知仅编辑腺嘌呤的ABE也可以应用于胞嘧啶，因此不仅可以增加ABE编辑靶标，而且还可以以与常规CBE相比更高的准确性进行替换。因此，ABE可用于难以用常规CBE进行准确编辑的情况，或者可以用于必需编辑腺嘌呤以及胞嘧啶的情况。因此，预期根据本发明的胞嘧啶碱基编辑组合物将有效地用于多种遗传疾病的治疗和研究。
Claims (6)
1.胞嘧啶(C)碱基编辑组合物，其包含：
腺嘌呤脱氨酶；和
CRISPR相关蛋白9(Cas9)蛋白或其功能类似物。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述碱基编辑组合物用选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)中的任一种碱基替换胞嘧啶(C)。
3.权利要求1所述的组合物，其中所述碱基编辑组合物的编辑窗口范围为从靶序列5′端起第4位的胞嘧啶(C)至第8位的胞嘧啶(C)。
4.权利要求3所述的组合物，其中所述胞嘧啶(C)是与位于所述靶序列上5′方向的胸腺嘧啶(T)直接相邻的胞嘧啶(C)。
5.权利要求1所述的组合物，其中所述碱基编辑组合物是选自ABE6.3、ABE7.8、ABE7.9、ABE7.10和ABEmax中的任一种。
6.胞嘧啶(C)碱基编辑方法，其包括：
使权利要求1至5中任一项所述的组合物与靶序列接触。
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Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN113215193B (zh) * | 2021-03-18 | 2023-07-18 | 温州医科大学 | 小分子化合物提高基因敲除和碱基编辑系统活性的方法及其应用方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109021111A (zh) * | 2018-02-23 | 2018-12-18 | 上海科技大学 | 一种基因碱基编辑器 |
| CN109517841A (zh) * | 2018-12-05 | 2019-03-26 | 华东师范大学 | 一种用于核苷酸序列修饰的组合物、方法与应用 |
| KR20190044157A (ko) * | 2017-10-20 | 2019-04-30 | 경상대학교산학협력단 | 아데닌 또는 아데노신 탈아미노효소를 유효성분으로 포함하는 단일 염기 편집용 조성물 및 이의 용도 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7231935B2 (ja) * | 2016-08-03 | 2023-03-08 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | アデノシン核酸塩基編集因子およびそれらの使用 |
| KR102210700B1 (ko) * | 2018-01-25 | 2021-02-02 | 주식회사 툴젠 | 아데노신 디아미나아제를 이용한 염기 교정 확인 방법 |
-
2019
- 2019-07-31 KR KR1020190093518A patent/KR102258713B1/ko active IP Right Grant
-
2020
- 2020-07-29 WO PCT/KR2020/010020 patent/WO2021020884A2/ko unknown
- 2020-07-29 EP EP20848144.0A patent/EP4006157A4/en active Pending
- 2020-07-29 CN CN202080055843.5A patent/CN114269913A/zh active Pending
- 2020-07-29 US US17/630,774 patent/US20220315915A1/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190044157A (ko) * | 2017-10-20 | 2019-04-30 | 경상대학교산학협력단 | 아데닌 또는 아데노신 탈아미노효소를 유효성분으로 포함하는 단일 염기 편집용 조성물 및 이의 용도 |
| CN109021111A (zh) * | 2018-02-23 | 2018-12-18 | 上海科技大学 | 一种基因碱基编辑器 |
| CN109517841A (zh) * | 2018-12-05 | 2019-03-26 | 华东师范大学 | 一种用于核苷酸序列修饰的组合物、方法与应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| HEON SEOK KIM等: "Adenine base editors catalyze cytosine conversions in human cells", 《NATURE BIOTECHNOLOGY》, vol. 37, pages 1145, XP036897240, DOI: 10.1038/s41587-019-0254-4 * |
| HOLLY A. REES等: "Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells", 《NAT REV GENE》, vol. 19, no. 12, pages 770 * |
| ZHEN LIU等: "Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing", 《NATURE COMMUNICATIONS》, vol. 9, pages 2 * |
| 刘佳慧等: "单碱基基因编辑系统的研究进展", 《世界科技研究与发展》, no. 06, pages 3 - 8 * |
Also Published As
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