CN114269396A - 作为临时栓塞剂的基于藻酸盐的颗粒 - Google Patents
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- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/36—Materials or treatment for tissue regeneration for embolization or occlusion, e.g. vaso-occlusive compositions or devices
Abstract
本公开提供包括自降解藻酸盐颗粒的组合物,所述颗粒包含藻酸盐、藻酸盐裂解酶和二价金属离子。本公开还提供制备包括自降解藻酸盐颗粒的组合物的方法,所述颗粒包含藻酸盐、藻酸盐裂解酶和二价金属离子。本公开还提供在其中的受试者中诱导栓塞的方法,以及含有本公开的组合物的用于其方法的注射器。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求于2019年8月27日提交的美国临时申请号62/892,097的权益,其特此通过参考以其全部结合用于所有目的。
背景
可使用器官中的栓塞或血管的人工阻塞,例如以(a) 控制由外伤引起的出血,(b)防止血液流入异常血管比如动脉瘤,和/或(c) 治疗器官(例如切除肿瘤、用于移植或用于手术)。在许多情况下,不需要永久的血管栓塞。对于这种医学干预,期望使用临时和生物可吸收的栓塞剂。例如,大小在10 μm-80 μm范围内的IMP/CS (亚胺培南/西司他丁(Ciliastatin))抗生素颗粒已被用作临时栓塞剂,然而这种材料可能需要近一个月才能完全被吸收(参见例如Okuno等人; “Midterm Clinical Outcomes and MR Imaging Changesafter Transcatheter Arterial Embolization as a Treatment for Mild to ModerateRadiographic Knee Osteoarthritis Resistant to Conservative Treatment”, J.Vasc. Interv. Radiol. 2017;28:995-1002)。类似地,其他栓塞剂比如Gelfoam®、胶原蛋白和凝血酶也已被使用(参见例如Vaidya等人; “An overview of embolic agents”,Semin. Intervent. Radiol. 2008;25:204-15)。然而,现有药物具有许多缺点,比如不可预测的溶解速率、缺乏选择性地降解上述基质的药物和/或导致非特异性闭塞的栓塞剂迁移(参见例如美国专利申请公开号20130211249)。此外,一些栓塞剂在其体内使用之前需要处理或准备步骤。例如,Gelfoam必须切碎到纱布中或浆状化。
因此,需要可选择性地降解上述基质和/或表现出可预测的溶解速率而不在体内产生任何非特异性闭塞的栓塞剂。
通过参考结合
本文中的所有出版物、专利和专利申请均通过参考结合至如同每个单个出版物、专利或专利申请被具体且单独地指明通过参考结合的程度相同的程度。如果在本文中的术语与结合的参考文献中的术语之间发生冲突,则以本文中的术语为准。
简要概述
在一些方面,本公开提供自降解藻酸盐颗粒。在一些实施方案中,自降解藻酸盐颗粒包含藻酸盐分子。在一些实施方案中,藻酸盐分子具有以下中的一种或两种:(i) 预定分子量,和(ii) β-D-甘露糖醛酸(M)嵌段与α-L-古洛糖醛酸(G)嵌段的预定比率。在一些实施方案中,自降解藻酸盐颗粒包含藻酸盐裂解酶。在一些实施方案中,自降解藻酸盐颗粒包含金属离子。在一些实施方案中,金属离子交联藻酸盐分子。在一些实施方案中,金属离子交联藻酸盐分子以形成藻酸盐基质。
在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过以下中的一种或多种进行控制:藻酸盐分子的预定分子量、M与G嵌段的预定比率、藻酸盐裂解酶的浓度、金属离子的浓度和金属离子的结合亲和力。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过藻酸盐分子的预定分子量进行控制。在一些实施方案中,预定分子量大于约100千道尔顿(kD)。在一些实施方案中,预定分子量大于约200千道尔顿(kD)。在一些实施方案中,预定分子量大于约800千道尔顿(kD)。
在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过M与G嵌段的预定比率进行控制。在一些实施方案中,M与G嵌段的预定比率为约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10或约95:5。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在少于约5天的时间段内降解。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在大于约2天的时间段内降解。在一些实施方案中,M与G嵌段的预定比率为约50:50、约45:55、约40:60、约35:65、约30:70、约25:75、约20:80、约15:85、约10:90或约5:95。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在约5天-约30天之间的时间段内降解。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的降解通过藻酸盐裂解酶的浓度进行控制。
在一些实施方案中,藻酸盐裂解酶的活性在每颗粒约0.05 mU (毫单位)-约2.5mU之间。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在少于约5天的时间段内降解。在一些实施方案中,藻酸盐裂解酶在每颗粒约0.05 nU (纳单位)-约0.05 mU之间。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在约5天-约30天之间的时间段内降解。在一些实施方案中,藻酸盐裂解酶的活性小于约每颗粒0.05 nU。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在大于约30天的时间段内降解。
在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的降解通过金属离子的结合亲和力进行控制。在一些实施方案中,金属离子为阳离子。在一些实施方案中,阳离子选自Cu2+、Ba2+、Sr2+、Ca2+、Co2+、Ni2+、Mn2+和Mg2+。在一些实施方案中,阳离子为Ba2+。在一些实施方案中,阳离子为Ca2+。
在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的直径在约40微米(μm)-约2000 μm之间。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的直径在约40 μm-约1000 μm之间。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的直径在约40 μm-约200 μm之间。在一些实施方案中,自降解藻酸盐颗粒进一步包含一种或多种藻酸盐裂解酶抑制剂。在一些实施方案中,一种或多种藻酸盐裂解酶抑制剂独立地选自Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ca2+和Mg2+。在一些实施方案中,自降解藻酸盐颗粒进一步包含冷冻保护剂。在一些实施方案中,冷冻保护剂选自蔗糖、甘油、乙二醇、山梨醇、海藻糖和丙二醇。
在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的球形度为至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9、至少约0.95或至少约0.99。在一些实施方案中,藻酸盐分子包括氧化的藻酸盐分子。在一些实施方案中,自降解藻酸盐颗粒进一步包含治疗有效量的活性成分。在一些实施方案中,金属离子包括二价金属离子或三价金属离子。在一些实施方案中,藻酸盐裂解酶被交联的藻酸盐分子包埋。
在一些方面,本公开提供在需要它的受试者中诱导自降解栓塞的方法。在一些实施方案中,该方法包括将多个本公开的藻酸盐颗粒给予到受试者的血管中。在一些实施方案中,血管为膝状动脉。
在一些方面,本公开提供一种注射器。在一些实施方案中,注射器包括第一腔室。在一些实施方案中,第一腔室含有干燥的本公开的藻酸盐颗粒。在一些实施方案中,注射器包括第二腔室。在一些实施方案中,第二腔室设置于第一腔室的轴向上。在一些实施方案中,第二腔室含有重构介质。在一些实施方案中,注射器包括柱塞。在一些实施方案中,柱塞被配置成在压下时使干燥的藻酸盐颗粒暴露于重构介质,从而重构干燥的藻酸盐颗粒。
在一些实施方案中,注射器进一步包括将第一腔室和第二腔室隔开的易破膜,其中当压下柱塞时,易破膜破裂以使干燥的藻酸盐颗粒暴露于重构介质,从而重构干燥的藻酸盐颗粒。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过以下中的一种或多种进行控制:藻酸盐分子的预定分子量、M与G嵌段的预定比率、藻酸盐裂解酶的浓度、金属离子的浓度和金属离子的结合亲和力。
在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过藻酸盐分子的预定分子量进行控制。在一些实施方案中,预定分子量大于约100千道尔顿(kD)。在一些实施方案中,预定分子量大于约200千道尔顿(kD)。在一些实施方案中,预定分子量大于约800千道尔顿(kD)。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过M与G嵌段的预定比率进行控制。在一些实施方案中,M与G嵌段的预定比率为约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10或约95:5。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在少于约5天的时间段内降解。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在大于约2天的时间段内降解。在一些实施方案中,M与G嵌段的预定比率为约50:50、约45:55、约40:60、约35:65、约30:70、约25:75、约20:80、约15:85、约10:90或约5:95。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在约5天-约30天之间的时间段内降解。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的降解通过藻酸盐裂解酶的浓度进行控制。
在一些实施方案中,藻酸盐裂解酶的活性在每颗粒约0.05 mU-约2.5 mU之间。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在少于约5天的时间段内降解。在一些实施方案中,藻酸盐裂解酶的活性在每颗粒约0.05 nU-0.05 mU之间。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在约5天-约30天之间的时间段内降解。在一些实施方案中,藻酸盐裂解酶的活性小于约每颗粒0.05nU。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在大于约30天的时间段内降解。
在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的降解通过金属离子的结合亲和力进行控制。在一些实施方案中,金属离子为阳离子。在一些实施方案中,阳离子选自Cu2+、Ba2+、Sr2+、Ca2+、Co2+、Ni2+、Mn2+和Mg2+。在一些实施方案中,阳离子为Ba2+。在一些实施方案中,阳离子为Ca2+。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的直径在约40微米(μm)-约2000 μm之间。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的直径在约40 μm-约1000 μm之间。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的直径在约40 μm-约200 μm之间。在一些实施方案中,干燥的藻酸盐颗粒进一步包含独立地选自以下的一种或多种藻酸盐裂解酶抑制剂:Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ca2+和Mg2+。在一些实施方案中,干燥的藻酸盐微球进一步包含冷冻保护剂。在一些实施方案中,冷冻保护剂选自蔗糖、甘油、乙二醇、山梨醇、海藻糖和丙二醇。
在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的球形度为至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9、至少约0.95或至少约0.99。在一些实施方案中,藻酸盐分子包括氧化的藻酸盐分子。在一些实施方案中,干燥的藻酸盐颗粒进一步包含治疗有效量的活性成分。在一些实施方案中,金属离子包括二价金属离子或三价金属离子。在一些实施方案中,干燥的藻酸盐颗粒包含被交联的藻酸盐分子包埋的藻酸盐裂解酶。
在一些方面,本公开提供制备自降解藻酸盐颗粒的方法。在一些实施方案中,该方法包括获得包含藻酸盐微球的第一组合物。在一些实施方案中,藻酸盐微球包含具有以下中的一种或两种的藻酸盐分子:(i) 预定分子量,和(ii) β-D-甘露糖醛酸(M)嵌段与α-L-古洛糖醛酸(G)嵌段的预定比率。在一些实施方案中,该方法包括将第一组合物与第二组合物混合。在一些实施方案中,第二组合物包含藻酸盐裂解酶和金属离子,从而产生混合物。在一些实施方案中,该方法包括从混合物制备自降解藻酸盐颗粒。
在一些实施方案中,该方法进一步包括通过以下一项或两项来抑制混合物中藻酸盐分子的降解:(i) 将混合物的pH保持在小于约6.5;和(ii) 将混合物的温度保持在低于约10摄氏度(℃)。在一些实施方案中,混合物的pH保持在约3-约6.5之间。在一些实施方案中,混合物的温度保持在约4℃-约10℃之间。在一些实施方案中,制备包括进行油包水乳化技术或液滴技术。在一些实施方案中,该方法进一步包括在pH介于约6.8-约7.5之间的溶液中重构自降解藻酸盐颗粒。
在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过以下中的一种或多种进行控制:藻酸盐分子的预定分子量、M与G嵌段的预定比率、藻酸盐裂解酶的浓度、金属离子的浓度和金属离子的结合亲和力。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过藻酸盐分子的预定分子量进行控制。在一些实施方案中,预定分子量大于约100千道尔顿(kD)。在一些实施方案中,预定分子量大于约200千道尔顿(kD)。在一些实施方案中,预定分子量大于约800千道尔顿(kD)。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过M与G嵌段的预定比率进行控制。在一些实施方案中,M与G嵌段的预定比率为约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10或约95:5。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在少于约5天的时间段内降解。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在大于约2天的时间段内降解。在一些实施方案中,M与G嵌段的预定比率为约50:50、约45:55、约40:60、约35:65、约30:70、约25:75、约20:80、约15:85、约10:90或约5:95。
在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在约5天-约30天之间的时间段内降解。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的降解通过藻酸盐裂解酶的浓度进行控制。在一些实施方案中,藻酸盐裂解酶的活性在每颗粒0.05 mU-2.5 mU之间。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在少于约5天的时间段内降解。在一些实施方案中,藻酸盐裂解酶的浓度在每颗粒约0.05 nU-0.05 mU之间。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在约5天-约30天之间的时间段内降解。在一些实施方案中,藻酸盐裂解酶的活性小于约每颗粒0.05 nU。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒在大于约30天的时间段内降解。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的降解通过金属离子的结合亲和力进行控制。在一些实施方案中,金属离子为阳离子。在一些实施方案中,阳离子选自Cu2+、Ba2+、Sr2+、Ca2+、Co2+、Ni2+、Mn2+和Mg2+。在一些实施方案中,阳离子为Ba2+。
在一些实施方案中,阳离子为Ca2+。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的直径在约100微米(μm)-约2000 μm之间。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的直径在约100 μm-约1000 μm之间。在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的直径在约100 μm-约200 μm之间。
在一些实施方案中,藻酸盐颗粒进一步包含独立地选自以下的一种或多种藻酸盐裂解酶抑制剂:Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ca2+和Mg2+。
在一些实施方案中,藻酸盐颗粒进一步包含冷冻保护剂。在一些实施方案中,方法进一步包括在将藻酸盐颗粒冻干之前将冷冻保护剂添加至藻酸盐颗粒中。在一些实施方案中,冷冻保护剂选自蔗糖、甘油、乙二醇、山梨醇、海藻糖和丙二醇。
在一些实施方案中,藻酸盐颗粒的球形度为至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9、至少约0.95或至少约0.99。在一些实施方案中,藻酸盐分子包括氧化的藻酸盐分子。在一些实施方案中,自降解藻酸盐颗粒包含治疗有效量的活性成分。在一些实施方案中,金属离子包括二价金属离子或三价金属离子。在一些实施方案中,在将第一组合物与第二组合物混合之后,金属离子交联藻酸盐分子,并且藻酸盐裂解酶被交联的藻酸盐分子包埋。
在一些方面,本公开提供通过临时栓塞血管来治疗需要它的受试者的方法。在一些实施方案中,该方法包括将多个本公开的藻酸盐颗粒给予到受试者的血管中。在一些实施方案中,血管位于膝状动脉中。在一些实施方案中,受试者患有选自以下的病症:膝痛、关节炎、粘连性囊炎引起的肩痛、肾脏病变、肝脏病变、子宫肌瘤、良性前列腺增生、动静脉畸形、鼻咽血管纤维瘤、脑动脉瘤、胃肠出血、精索静脉曲张、手术出血、脾破裂、脾肿大、肥胖和实体肿瘤。在一些实施方案中,
附图的几个视图的简述
当结合示例性实施方案的附图阅读时,将更好地理解前述概述以及以下对组合物和流体递送装置的实施方案的详述。然而,应当理解,本公开的实施方案不限于所示的精确布置和手段。
图1A说明本公开的示例性微球的制备和特性定制。藻酸盐和藻酸盐裂解酶溶解于水性介质中。通过常规方法制备微球,以通过阳离子交联来胶凝藻酸盐+裂解酶液滴;
图1B说明本公开的示例性微球的制备和特性定制。将微球与任选的冻干保护剂冻干以去除水分并“冻结”酶活性,防止在储存期间过早降解。以这种形式将微球灭菌;
图1C说明本公开的示例性微球的制备和特性定制。降解特性可通过变化裂解酶和藻酸盐参数及制备条件进行控制,以根据待治疗的适应症产生具有从数天到数月不等的降解速率的颗粒;
图2A说明示例性的颗粒后制备过程和使用方法。制备冻干的藻酸盐颗粒以去除水分和冻结酶活性。冷冻保护剂保护酶和微球结构,以使得能够在水合后恢复形状;
图2B说明示例性的颗粒后制备过程和使用方法。颗粒在使用时于水性介质中重构,这使颗粒水合并使裂解酶具有催化活性;
图2C说明示例性的颗粒后制备过程和使用方法。颗粒以适当的悬浮液进行制备,用于指定的栓塞程序(例如子宫肌瘤栓塞)的动脉内递送。当在体内时,酶活性增强和藻酸盐链裂解,这使阳离子、聚合物链片段和裂解酶被释放到体内,在那里它们可被再吸收或排出;
图3A说明酶浓度依赖性藻酸盐颗粒降解。提供伴随不同酶浓度的藻酸盐颗粒随时间推移降解的折线图;
图3B说明酶浓度依赖性藻酸盐颗粒降解。降解期之后的颗粒图像,以及具有不同酶浓度的样品;
图4说明载有藻酸盐裂解酶的钙离子藻酸盐颗粒的体外生物相容性;
图5A说明在肝脏模型中于0小时时载有藻酸盐裂解酶的钙离子络合的藻酸盐颗粒的离体降解研究;
图5B说明在肝脏模型中于24小时时载有藻酸盐裂解酶的钙离子络合的藻酸盐颗粒的离体降解研究;
图5C说明在肝脏模型中于48小时时载有藻酸盐裂解酶的钙离子络合的藻酸盐颗粒的离体降解研究;
图6说明酶构象/活性的pH依赖性调控;和
图7说明一种示例性注射器,其显示用于悬浮介质和干燥的藻酸盐微球的隔室。可通过对柱塞施加压力在注射器内部撕裂分隔膜,从而在含有氯化钙溶液的悬浮介质中重构干燥的藻酸盐微球。
详述
概述
一般而言,本公开提供用于制备含有藻酸盐裂解酶以控制其降解的二价金属离子络合的藻酸盐颗粒用于栓塞应用的方法。在某些实施方案中,本公开涉及聚合物化学、生物化学、免疫学领域,并且特别是涉及用于微创血管内和非血管治疗的组合物领域。
基于藻酸盐的液体栓塞剂已认为是一种有前途的栓塞工具。纯净形式的藻酸盐具有高度生物相容性,并且其胶凝特性可被控制。它们为在各种海藻中常见的天然存在的多糖共聚物,由具有不同M:G比率的随机1-4连接的β-D-甘露糖醛酸(M-嵌段)-α-L-古洛糖醛酸(G嵌段)组成。将藻酸盐溶解于造影剂碘海醇中(例如以赋予射线不透性)并胶凝成水凝胶弹簧圈(hydrocoil)形式,其在存在氯化钙溶液的情况下由于多糖残基的羧酸根与Ca2+的离子交联而硬化。所有这些成分在治疗部位同时混合以产生原位凝胶块(例如EmboGel)。该凝胶随后可被溶解(例如使用混合物比如EmboClear,其为藻酸盐裂解酶和乙二胺四乙酸(EDTA)的混合物)。该酶经β-消除机制在糖苷键处裂解多糖链,并且EDTA通过经螯合清除Ca2+使离子交联解络合。在栓子部位处给予该溶解剂以在几分钟内清除闭塞的血管。然而,这些现有方法具有如下所述的一些缺点。
首先,使用EmboClear溶液降解EmboGel的程序会给患者带来另外的风险,因为他们必须接受另外的栓塞后手术。此外,根据栓子形成与其溶解之间期望的时间间隔,患者可能需要第二次就诊,从而产生重新导管插入手术的相关费用。其次,在某些情况下,比如脑动脉瘤治疗,藻酸盐凝胶可在注射期间或栓塞后手术之后迁移到载瘤动脉,这可能导致非特异性血管闭塞(例如参见Barnett等人, “A selectively dissolvable radiopaquehydrogel for embolic applications”;和美国专利号9,220,761)。在后者情况下,发生降解/崩解的藻酸盐凝胶非特异性向身体其他部位的迁移主要是由于EmboClear对EmboGel的瞬间的/不受控制的降解/崩解,这导致产生各种大小的颗粒,并且这些颗粒在其分布到EmboClear由于稀释而变得失效的脱靶远端位置之前无法被重吸收。如果EmboGel载有生物活性剂/药物,则可能需要单独给予EmboClear溶解剂以提供降解控制的释放动力学。
此外,Kunjukunju等人报道了使用硫酸铵的各种大小(10-300 µm)和形状的藻酸盐裂解酶聚集体(参见例如Kunjukunju等人, “Cross-linked enzyme aggregates ofalginate lyase: A systematic engineered approach to controlled degradation ofalginate hydrogel." International Journal of Biological Macromolecules 115(2018): 176-184)。这些聚集体使用戊二醛进行交联以产生不溶性催化活性的藻酸盐裂解酶聚集体。将所得的交联聚集体包封于藻酸盐的水凝胶中以实现其受控降解。然而,该报告中描述的方法可能不适合于实现制备基于藻酸盐的临时栓塞剂本身。
首先,不可能产生期望大小的藻酸盐颗粒,因为该大小和多分散性的所述酶聚集体不能被包封。其次,概述的方法描述了将酶聚集体与戊二醛交联,戊二醛为一种在制备旨在用于人体的组合物时应避免的毒性剂。第三,作者没有报告任何其他控制藻酸盐降解的方法,比如藻酸钠的分子量或粘度、使用改性剂(金属离子)或其他理化参数(比如pH和温度)对酶进行预处理或提高藻酸盐裂解酶的包封效率。最后,没有进行任何工作来实现藻酸盐聚集体的储存和保质期。
在某些实施方案中,本公开提出用于栓塞应用的载有藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒的原位受控降解。由于酶可均匀地分布于藻酸盐颗粒中,因此该策略具有超过现有的临时栓塞剂和现有技术的基于藻酸盐的系统的一个或多个以下优点。
藻酸盐裂解酶的催化活性可使用改性剂(刺激性或抑制性)进行控制。另外,加载于藻酸盐颗粒中的酶的量可用于将颗粒的降解控制在从几小时到数周的范围内。这种策略可提供可预测的藻酸盐颗粒降解速率,这对于栓塞治疗的某些应用可为最重要的。对于现有的临时栓塞剂(例如EmboGel)尚未观察到栓塞剂的这种受控降解。
由于基质的受控降解,副产物或颗粒可被重吸收并通过肾脏排出。因此,非特异性血管闭塞的风险是最小的。
由于载有藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒经历原位降解,因此临床医师不需要栓塞后手术来溶解栓塞颗粒,并且患者并不面临另外的手术相关风险。
在现有技术的基于藻酸盐的系统中,液体溶解剂的组合物包含大量的藻酸盐裂解酶,以瞬间溶解二价金属离子交联的藻酸盐凝胶。相反,在某些实施方案中,本公开提出通过将藻酸盐裂解酶加载到颗粒中来控制二价金属离子络合的藻酸盐颗粒的降解。将藻酸盐裂解酶加载到颗粒中可提高酶的可回收效率。当与现有技术的基于藻酸盐的栓塞剂相比较,这减少了藻酸盐降解所需的酶的量。
这些可生物降解的栓塞颗粒也可载有可通过藻酸盐基质的降解速率来控制的用于在靶部位处递送的药物。
定义
如本文使用的,术语“一个(a)”、“一种(an)”或“该(the)”通常被解释为涵盖单数和复数形式两者。
如本文使用的,术语“约”通常是指在如本领域普通技术人员确定的可接受误差范围内的特定数值,这将部分地取决于数值如何测量或确定,即测量系统的局限性。例如,“约”可指代给定数值的±20%、±10%或±5%的范围。
如本文使用的,术语“基本上”可指代大多数或大部分,如至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%、99.99%或至少约99.999%或者更多。
如本文使用的,“载体”或“媒介物”是指适合于给药的载体材料。可用于本文的载体和媒介物包括本领域已知的任何这种材料,例如任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂、表面活性剂等,它们为非毒性的并且不与组合物中的其他组分以有害方式相互作用。
术语“治疗有效量”通常可指代当给予需要这种化合物或其他治疗的受试者时最低限度地足以预防、减轻、治疗或消除病症或其风险的化合物或其他治疗的量(或剂量)。在某些情况下,术语“治疗有效量”可指代当给予受试者时足以具有预防效果的化合物或其他治疗的那种量。治疗有效量可以变化;例如,其可根据受试者的状况、受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、给予方式(例如皮下递送)等而变化,其全部均可由本领域的普通技术人员确定。
如本文使用的,“治疗(treating)”或“治疗(treat)”包括:(i) 防止病理状况发生(例如预防);(ii) 抑制病理状况或阻止其发展;(iii) 缓解病理状况;和/或(iv) 减轻与病理状况相关的症状。
短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内,适用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或者其他问题或并发症的与合理的收益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。将这种介质和试剂用于药用活性物质为本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容,否则考虑其在本公开治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可掺入到组合物中。
术语“药学上可接受的赋形剂”旨在包括能够与化合物共同给予以促进其预期功能的执行的媒介物和载体。将这种介质用于药用活性物质为本领域众所周知的。这种媒介物和载体的实例包括溶液、溶剂、分散介质、延迟剂、乳液等。适用于多重结合化合物的任何其他常规载体也落入本公开的范围内。
组合物和使用方法
本公开涉及将藻酸盐裂解酶加载于藻酸钠中,它们在存在二价金属离子的情况下一起胶凝以形成可生物降解的载有藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒。在一些实施方案中,本公开提供藻酸盐颗粒。在某些实施方案中,本公开提供能够进行受控自降解的藻酸盐颗粒。在某些实施方案中,本公开提供具有受控降解特性的自降解藻酸盐颗粒。
加载于藻酸盐颗粒中的酶的量和使用改性剂对酶进行的预处理被用于调节藻酸盐颗粒的降解速率。这涉及将天然或修饰的藻酸盐裂解酶与藻酸钠以不同比例混合。此后对藻酸盐裂解酶-藻酸钠溶液进行预处理,以防止其在颗粒制造期间降解。这些颗粒为通过产生在二价金属离子浴中胶凝的藻酸盐裂解酶-藻酸钠溶液的均匀液滴来制备,该二价金属离子浴任选地含有一种或多种冷冻保护剂以在颗粒冻干期间保护组合物。藻酸盐的化学特性随着分子量和M (β-D-甘露糖醛酸)和G (α-L-古洛糖醛酸)嵌段的比率(M/G)而变化(Ramos等人, “Effect of alginate molecular weight and M/G ratio in beadsproperties foreseeing the protection of probiotics”, Food Hydrocoll. 2018;77:8-16)。特别是,由于羧酸根残基的几何形状,与M嵌段相比较,G嵌段对二价阳离子具有更高的亲和力。藻酸盐含有变化较大的M和G含量,并且还具有变化的序列结构(G嵌段、M嵌段和MG嵌段)。一般而言,当与阳离子交联时,相对于M含量具有较高G含量(M/G比率较低)的藻酸盐会产生具有低渗透性的机械上稳固的结构/胶囊。
另一方面,相对于M含量具有较低G含量(M/G比率较高)的藻酸盐会产生具有高渗透性基质的较弱强度的凝胶。据Ramos等人报道,低M/G比率和较低分子量的藻酸盐产生了与钙离子交联的渗透性较低且更强的藻酸盐珠粒。提高藻酸盐稳固性的其他因素为二价离子的选择和藻酸盐的分子量/粘度。通常,对于血管内手术,藻酸盐颗粒使用通过三通旋塞连接的两个注射器混合成均匀的悬浮液,并通过微导管在体内递送,在此期间它们可能会受到机械力。因此,颗粒的机械稳固性应足以在常规使用期间保持其完整性。
为了实现载有藻酸盐裂解酶的二价金属离子络合的藻酸盐颗粒的快速降解(≥2天至≤5天),可使用具有低分子量/低粘度的较低G-含量的藻酸盐(例如较高的M:G比率)。在某些实施方案中,纯化的藻酸盐含有超过50%的M含量(β-D-甘露糖醛酸)。纯化的藻酸盐中M含量的百分比可为50%和80%、55%-75%和60%-80%。为了获得中等(>5天至≤30天)或缓慢(>30天)的降解期,可使用具有高分子量/粘度的较高G含量的藻酸盐(例如较低的M:G比率)。在某些实施方案中,纯化的藻酸盐含有超过50%的G含量(α-L-古洛糖醛酸)。纯化的藻酸盐中G含量的百分比可为50%和80%、55%-75%和60%-80%。
藻酸盐的分子量或粘度也影响藻酸盐颗粒的机械特性(Farrés等人, “Formationkinetics and rheology of alginate fluid gels produced by in-situ calciumrelease”, Food Hydrocolloids 40 (2014): 76-84)。藻酸盐聚合物的平均分子量可为>100 kD,优选地为>200 kD,和最优选地为>30 kD。用于制备快速和缓慢降解的载有藻酸盐裂解酶的二价藻酸盐颗粒的1%藻酸盐溶液在20℃下的粘度范围可为> 25 mPa-s,优选地为<1000 mPa-s。
纯化的藻酸盐或氧化形式的藻酸盐的浓度也可影响二价络合的藻酸盐珠粒的孔径和稳固性。用于制备快速(≥2天至≤5天)和缓慢(>5天至≤30天)降解的载有藻酸盐裂解酶的二价藻酸盐颗粒的藻酸盐的浓度可为约0.05%重量比体积(w/v)、0.10% w/v、0.15% w/v、0.20% w/v、0.25% w/v、0.30% w/v、0.35% w/v、0.40% w/v、0.45% w/v、0.50% w/v、0.60%w/v、0.70% w/v、0.80% w/v、0.90% w/v、1.0% w/v、1.25% w/v、1.5% w/v、1.75% w/v、2.0%w/v、2.25% w/v、2.5% w/v、2.75% w/v、3.0% w/v、3.25% w/v、3.5% w/v、3.75% w/v、4% w/v、4.25% w/v、4.5% w/v、4.75% w/v、5.0% w/v、5.25% w/v、5.5% w/v、5.75% w/v、6.0% w/v或大于约6.0% w/v。
另外,藻酸盐颗粒在金属离子浴内交联期间的胶凝时间也会影响二价金属离子络合的藻酸盐颗粒的大小、球形度和物理稳固性。通常,术语“球形度”可指代物体的形状与完美球体的性状密切相似程度的量度。可注射物质的圆度可为重要的,例如,由于形状异常的物质可能难以通过血管,这导致血管阻塞,从而阻塞血液流向身体的各个部位。胶凝时间可为少于约1分钟、少于约2分钟、少于约3分钟、少于约4分钟、少于约5分钟、少于约6分钟、少于约7分钟、少于约8分钟、少于约9分钟、少于约10分钟、少于约11分钟、少于约12分钟、少于约13分钟、少于约14分钟、少于约15分钟、少于约20分钟、少于约25分钟或少于约30分钟。
为了实现载有藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒期望的降解期,可变化与优选的藻酸盐混合的酶的量。对于制备快速(≥2天至≤5天)、中等(>5天至≤30天)或缓慢(>30天)降解的二价络合的藻酸盐颗粒,与藻酸盐混合的藻酸盐裂解酶的量从<1单位至50单位/ml的藻酸钠不等。为了清楚起见,在酶学中,1单位(U)为每分钟催化1 μmol底物反应的酶的量。加载到二价络合的藻酸盐颗粒中的酶的量还取决于藻酸钠的分子量或粘度。
在某些实施方案中,藻酸盐裂解酶的活性为约0.001纳单位(nU)/颗粒、约0.01nU/颗粒、约0.10 nU/颗粒、约0.50 nU/颗粒、约0.001毫单位(mU)/颗粒、约0.01 mU/颗粒、约0.05 mU/颗粒、约0.10 mU/颗粒、约0.25 mU/颗粒、约0.50 mU/颗粒、约0.75 mU/颗粒、约1.0 mU/颗粒、约1.25 mU/颗粒、约1.5 mU/颗粒、约1.75 mU/颗粒、约2.0 mU/颗粒、约2.25mU/颗粒、约2.5 mU/颗粒、约2.75 mU/颗粒、约3.0 mU/颗粒、约3.25 mU/颗粒、约3.5 mU/颗粒、约3.75 mU/颗粒、约4.0 mU/颗粒或其任何两个值之间的范围。在某些实施方案中,藻酸盐裂解酶的活性在约0.001 mU-4.0 mU/颗粒之间。在某些实施方案中,藻酸盐裂解酶的活性在约0.01 mU-3 mU/颗粒之间。在某些实施方案中,藻酸盐裂解酶的活性在约0.05 mU-2.5 mU/颗粒之间。在某些实施方案中,藻酸盐裂解酶的活性在约0.05 mU-0.5 mU/颗粒之间。在某些实施方案中,藻酸盐裂解酶的活性在约0.5 mU-1.0 mU/颗粒之间。在某些实施方案中,藻酸盐裂解酶的活性在约1.0 mU-1.5 mU/颗粒之间。在某些实施方案中,藻酸盐裂解酶的活性在约1.5 mU-2.0 mU/颗粒之间。在某些实施方案中,藻酸盐裂解酶的活性在约2.0mU-2.5 mU/颗粒之间。藻酸盐裂解酶的每颗粒活性可确定为用于产生X数量个颗粒的藻酸盐的量和用于制备X个颗粒的酶的量的函数。例如,基于含有约1-约50单位之间的酶的转化为20,000个颗粒的100 mg藻酸盐,藻酸盐裂解酶的每颗粒活性可确定为在约0.05 mU-2.5mU/颗粒之间。
此外,还可通过调控藻酸盐裂解酶的活性来控制载有酶的藻酸盐颗粒的降解。为了控制藻酸盐裂解酶的催化降解活性,酶可用<1 mM的Cu2+、Zn2+和Fe3+金属离子进行络合或预处理。这些金属离子可抑制约90%的酶活性。其他金属离子比如1 mM浓度的Mg2+和Ca2+分别使活性降低20%-50%。游离或未结合的金属离子可通过渗析从溶液中去除。这些金属离子可抑制酶的活性,并且可被认为对酶有害(Inoue等人, “Functional identification ofalginate lyase from the brown alga Saccharina japonica”, Sci. Rep. 2019; 9:1-11)。相反,在本公开的某些实施方案中采用相同的概念来调控载有藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒的降解。重要的是,这种酶在生理温度和pH下显示出最佳酶活性。因此,在体内条件下,酶活性可单独使用这些金属离子进行调控,以实现快速(≥2天至≤5天)和更长(>5天至≤30天或>30天)持续时间的降解颗粒。
通常,可将酶固定到惰性或不溶性基质中。这提供对影响酶促反应的生理因素(比如pH或温度)的抵抗力,并且还增加反应速率。其还将酶定位于某个地方(例如颗粒内部、装饰的表面等)。在本公开的某些实施方案中,将修饰或天然的藻酸盐裂解酶固定/包封至其藻酸钠底物(反应性而不是惰性基质)。因此,另一个重要方面为避免在从藻酸盐裂解酶-藻酸钠前体溶液制造载有藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒期间的初始降解。为了克服这个问题,提出了用于本公开某些实施方案的以下方法。
酶可用金属离子抑制剂比如Cu2+、Zn2+、Fe3+、Mg2+和Ca2+进行预处理。这些处于最佳浓度而不影响颗粒的物理稳固性的金属离子可通过部分地抑制酶活性来减少颗粒的降解。
另一种方法为将藻酸盐裂解酶-藻酸钠前体溶液的温度从环境温度降低至4-10℃范围内的温度。这将降低或停止藻酸盐裂解酶的催化活性,从而防止藻酸钠的降解。另外,二价金属离子胶凝浴的温度也可降低至4-10℃的范围内。该金属离子浴用于使藻酸钠-藻酸盐裂解酶溶液的液滴胶凝,以形成二价金属离子络合的载有藻酸盐裂解酶的藻酸钠颗粒。
藻酸盐裂解酶的催化活性也可通过变化藻酸盐裂解酶-藻酸钠和胶凝浴溶液的pH来调控。在6.8-7.5范围内的pH下观察到该酶的最佳催化活性(参见例如Farrés等人,“Formation kinetics and rheology of alginate fluid gels produced by in-situcalcium release”, Food Hydrocolloids 40 (2014): 76-84)。为了防止藻酸钠在载有藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒制备期间的初始降解,可将藻酸盐裂解酶-藻酸钠溶液的pH降低至3.0。为了进行该过程,离子强度<1 M,优选地<0.1 M,和最优选地<0.01 M的乙酸钠-乙酸缓冲液具有3.7-5.6的pH范围。另外,还可使用氢氧化钠(>1 M至<0.01 M)或盐酸(>1 M至<0.01 M)来实现溶液期望的pH (pH 6.5-3.0)。这导致藻酸盐裂解酶催化活性的降低或停止。这种催化活性的调控可归因于藻酸盐裂解酶3D构象的展开。藻酸盐裂解酶停止的催化活性可通过使载有藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒暴露于pH 6.5-7.5的水性环境来逆转/激活。逆转藻酸盐裂解酶活性的优选缓冲液为磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液的优选离子强度为0.01 M,在20℃下pH范围为6.5-7.5。使用氢氧化钠(>1 M至<0.01 M)或盐酸(>1 M至<0.01 M)也可实现溶液期望的pH (pH 6.5-7.5)。另外,还可使用pH在6.5-7.5之间的盐水或去离子水或水溶液。
因此,上述方法的组合可有效地用于将藻酸盐裂解酶包封或加载到用二价金属离子络合/胶凝的藻酸盐颗粒中而不降解藻酸盐基质。
在适当的条件(低温和pH)下的前体藻酸盐裂解酶-藻酸钠溶液需要在含有一种或多种冷冻保护剂的二价金属离子浴中胶凝。胶凝浴的组成和条件对于制备期望的基于藻酸盐的栓塞颗粒是重要的。胶凝浴组合物的二价金属离子组分可选自Cu2+、Ba2+、Sr2+、Ca2+、Co2 +、Ni2+、Mn2+和Mg2+ (Lee等人, "Alginate: properties and biomedical applications,"Progress in polymer science 37, no. 1 (2012): 106-126; 和Brus等人, “Structureand dynamics of alginate gels cross-linked by polyvalent ions probed viasolid state NMR spectroscopy," Biomacromolecules 18, no. 8 (2017): 2478-2488)。二价阳离子的选择也可影响藻酸盐基质的交联。二价金属离子与藻酸盐的结合强度按降序排列Cu2+> Ba2+> Sr2+> Ca2+> Co2+> Ni2+> Mn2+> Mg2+给出。优选的金属阳离子为Ba2+和Ca2+。这些金属离子可以0.1% w/v-10% w/v范围内的不同浓度使用。在胶凝浴中添加冷冻保护剂在两个方面是重要的:(a) 其助于在冻干过程期间保持载有藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒的球形度和机械稳固性,和(b) 其还保持酶在极低温度和冷冻循环中的3D构象,从而保持酶活性。
在许多情况下,观察到在不添加冷冻保护剂/冷冻保存介质的情况下进行酶的冻干时,酶的残留活性显著降低(Tamiya等人, "Freeze denaturation of enzymes and itsprevention with additives," Cryobiology 22, no. 5 (1985): 446-456; 和Porter等人, “Effects of freezing on particulate enzymes of rat liver," J. biol. Chem205 (1953): 883-891)。冷冻保护剂组分可包括本领域已知的那些,比如蔗糖、甘油、乙二醇、山梨醇、海藻糖、丙二醇或专有/市售的冷冻保护剂。当将这些冷冻保护剂添加到胶凝浴中时,其被包封或被均匀地分布于藻酸钠颗粒的基质中(Chan等人, “Effects of starchfiller on the physical properties of lyophilized calcium-alginate beads andthe viability of encapsulated cells,” Carbohydrate polymers 83, no. 1 (2011):225-232)。
另外,冷冻保护剂也可在制备冷冻干燥的载有藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒的后处理阶段中使用,而不是在这些颗粒的制造过程期间添加于含有二价金属离子的胶凝浴中。在该过程中,将前体藻酸盐裂解酶-藻酸钠溶液的液滴加入到仅含有二价金属离子的胶凝浴中,以形成载有藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒。在将这些颗粒从胶凝浴中分离出来后,可将其浸泡于合适的冷冻保护剂中并进行冷冻干燥过程。在冷冻干燥条件下,其可通过经填充当水从基质升华出来时形成的孔隙来防止凝胶结构的塌陷而防止酶的冷冻变性以及提供无缺陷的载有藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒。粒径可为> 40 µm、< 200 µm但< 2000 µm。而且,该方法可用于制备具有不同形态(比如微纤维、核壳颗粒、Janus颗粒或胶囊)的基于藻酸盐的栓塞剂。
此外,在某些实施方案中,本公开提供既不透射线又载有药物的藻酸盐裂解酶加载的藻酸盐颗粒的制备。为了实现这一点,建议在胶凝浴中使用含有Ca2+离子和以下X射线造影金属离子(比如钡、钆和钽金属离子)之一的二价金属离子的组合物(Yu等人, “Metal-based X-ray contrast media," Chemical reviews 99, no. 9 (1999): 2353-2378)。另一种建议的方法为用市售的不透射线试剂重构载有藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒,当藻酸盐基质在水性介质中膨胀时,所述试剂会变为被临时吸收到基质中。将药物/生物活性剂(抗癌剂和成骨剂)加载到载有藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒中的建议方法涉及使这些颗粒暴露于药物2-3小时。药物在体内的递送将通过载有藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒的原位降解机制来促进。
在某些实施方案中,载有酶的藻酸盐微球可在延长的时间段中储存。在某些实施方案中,将金属离子络合的酶固定到其底物中。据考虑,基质的缓慢降解在储存条件期间开始。这种降解可通过将微球悬浮于低于5.5的pH中来停止。除了将操作温度降低至低于10℃以防止藻酸盐微球降解外,备选方法为冷冻或真空干燥这些微球。这可阻止藻酸盐微球的降解。在某些实施方案中,可将干燥的球体加载到专门设计的注射器中。
图7说明用于重构和/或给予微球的建议的注射器设计。注射器可包含柱塞701,其可处于锁定或解锁位置。注射器还可包括包含悬浮介质的第一腔室702、包含干燥的微球的第二腔室703。通常,注射器可进行构建和布置,使得注射器每个腔室的内容物为分开的(例如流体地),直至向柱塞施加压力,从而混合每个腔室的内容物(例如重构微球)。据考虑,可使用本领域已知的任何多腔室冻干注射器。在某些实施方案中,注射器可包括将第一腔室701和第二腔室702隔开的易破膜704。当向柱塞701施加压力时,易破膜破裂并且第一腔室的内容物与第二腔室703的干燥微球接触以重构微球。在其他实施方案中,注射器包括液体旁路管道。在仍然另一个实施方案中,将注射器的第一腔室和第二腔室隔开的屏障可包括单向阀。当向柱塞701施加压力时,单向阀被强制打开并且第一腔室的内容物与第二腔室的干燥微球接触以重构微球。在一些实施方案中,重构介质可为注射用水(WFI)。一旦重构,重构的微球现在便准备好使用了。注射器可包括快速连接器705 (例如鲁尔锁连接器),用于连接管线等以将重构的微球给予受试者。
受试者
通过本文所述的任何方法或组合物治疗的患者可具有任何年龄并且可为成人、婴儿或儿童。在某些情况下,患者为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99岁,或在其中的范围内(例如2-20岁之间、20-40岁之间或40-90岁之间)。患者可为人类或非人类受试者。
本文公开的任何组合物可给予非人类受试者,比如实验室或农场动物。非人类受试者的非限制性实例包括实验室或研究动物、狗、山羊、豚鼠、仓鼠、小鼠、猪、非人灵长类动物(例如大猩猩、猿猴、猩猩、狐猴或狒狒)、大鼠、绵羊或牛。
添加剂和赋形剂
在某些情况下,本文所述的藻酸盐颗粒或微球可包含赋形剂,其可提供长期的保存、使含有有效活性成分的制剂膨胀、促进药物吸收、降低粘度或者增强藻酸盐颗粒或微球的溶解度。本公开的藻酸盐颗粒或微球可包含按重量或按体积计约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或大于约50%的赋形剂。
在某些实施方案中,本公开的藻酸盐颗粒或微球可包含一种或多种增溶剂。如本文使用的,“增溶剂”包括化合物比如三醋精、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、月桂基硫酸钠、多库酯钠、维生素E TPGS、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆汁盐、聚乙二醇200-600、四氢呋喃聚乙二醇醚、二甘醇单乙醚、丙二醇和二甲基异山梨酯等。本公开的藻酸盐颗粒或微球可包含按重量或按体积计约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或大于约50%的增溶剂。
在一些实施方案中,本文所述的组合物包括其他医药或药用试剂、载体、佐剂(比如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂)、溶液促进剂和用于调控藻酸盐颗粒或微球的渗透压、同渗浓摩和/或同渗重摩的盐。在一些实施方案中,组合物包含稳定剂。在一些实施方案中,稳定剂选自例如脂肪酸、脂肪醇、醇类、长链脂肪酸酯、长链醚、脂肪酸的亲水性衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醚、聚乙烯醇、烃类、疏水性聚合物、吸湿聚合物及其组合。在一些实施方案中,还使用稳定剂的酰胺类似物。
在一些实施方案中,组合物包含悬浮剂。有用的悬浮剂仅包括例如化合物比如聚乙烯吡咯烷酮(例如聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630))、聚乙二醇(例如聚乙二醇可具有约300-约6000,或约3350-约4000,或约7000-约5400的分子量)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、醋酸羟甲基纤维素硬脂酸酯、聚山梨酯-80、羟乙基纤维素、藻酸钠、树胶(比如黄蓍胶和阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶类,包括黄原胶)、糖类、纤维素制品(比如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素)、聚山梨酯-80、藻酸钠、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮等。
在一些实施方案中,组合物包含另外的表面活性剂(助表面活性剂)和/或缓冲剂和/或溶剂。在一些实施方案中,表面活性剂和/或缓冲剂和/或溶剂为a) 天然和合成的亲脂性试剂,例如磷脂、胆固醇和胆固醇脂肪酸酯及其衍生物;b) 非离子表面活性剂,其包括例如聚氧乙烯脂肪醇酯、失水山梨醇脂肪酸酯(Span)、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯(吐温80)、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单硬脂酸酯(吐温60)、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯(吐温20)和其他吐温类)、失水山梨醇酯类、甘油酯类(例如Myrj和甘油三乙酸酯(三醋精))、聚乙二醇类、鲸蜡醇、鲸蜡硬脂醇、硬脂醇、聚山梨酯80、泊洛沙姆类、泊洛沙胺类、聚氧乙烯蓖麻油衍生物(例如Cremophor® RH40、Cremphor A25、Cremophor A20、Cremophor® EL)和其他Cremophor类、磺基琥珀酸酯类、烷基硫酸酯类(SLS);PEG甘油脂肪酸酯类,比如PEG-8甘油辛酸酯/癸酸酯(Labrasol)、PEG-4甘油辛酸酯/癸酸酯(Labrafac Hydro WL 1219)、PEG-32甘油月桂酸酯(Gelucire 444/14)、PEG-6甘油单油酸酯(Labrafil M 1944 CS)、PEG-6甘油亚油酸酯(Labrafil M 2125CS);丙二醇单-和二-脂肪酸酯类,比如丙二醇月桂酸酯、丙二醇辛酸酯/癸酸酯;Brij ®700、抗坏血酸-6-棕榈酸酯、硬脂胺、月桂基硫酸钠、聚氧乙烯甘油三蓖麻油酸酯,及其任何组合或混合物;c) 阴离子表面活性剂,包括但不限于羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、磺基琥珀酸钠、二辛基、藻酸钠、烷基聚氧乙烯硫酸盐、月桂基硫酸钠、三乙醇胺硬脂酸酯、月桂酸钾、胆汁盐及其任何组合或混合物;和d) 阳离子表面活性剂,比如季铵化合物类、苯扎氯铵、鲸蜡基三甲基溴化铵和月桂基二甲基苄基氯化铵。据考虑,可在考虑到预期受试者的情况下选择溶剂。
在一些实施方案中,本文公开的组合物包含防腐剂。用于本文所述组合物的合适的防腐剂包括但不限于苯甲酸、硼酸、对羟基苯甲酸酯类、酚类、氯化酚类化合物、醇类、季化合物、季铵化合物(例如苯扎氯铵、鲸蜡基三甲基溴化铵或氯化鲸蜡基吡啶)、稳定性二氧化氯、汞制剂(例如硼酸苯汞或硫柳汞)或其混合物。
其他实施方案和等同物
本文使用的章节标题仅用于组织目的,并且将不被解释为限制所描述的主题。
应当理解,本文所述的方法不限于本文所述的特定方法、方案、受试者和测序技术,并因此可能会有所不同。还应当理解,本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的,并且不旨在限制本文所述的方法和组合物的范围,其仅受所附权利要求的限制。尽管在本文中已经显示和描述了本公开的一些实施方案,但是对于本领域技术人员显而易见的是,这种实施方案仅作为实例提供。本领域的技术人员现将想到许多不背离本公开的改变、变化和取代。应当理解,在实践本公开时可采用本文所述公开的实施方案的各种备选方案。据预期,以下权利要求限定本公开的范围,并且从而涵盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。
为了说明,参考实例应用对几个方面进行描述。除非另外指明,否则任何实施方案均可与任何其他实施方案组合。应当理解,阐述了许多具体细节、关系和方法以提供对本文所述的特征的全面理解。然而,技术人员将易于认识到,本文所述的特征可在没有其中一个或多个具体细节的情况下实践或用其他方法来实践。本文所述的特征不受所示的动作或事件排序的限制,因为一些动作可按不同顺序发生和/或与其他动作或事件同时发生。此外,并非所有所示的动作或事件均需要根据本文所述的特征来实施方法。进一步地,在本公开的方法不依赖于本文阐述的特定步骤顺序的程度上,步骤的特定顺序不应被解释为对权利要求的限制。针对本公开方法的任何权利要求不应限于按书写的顺序执行其步骤,并且本领域的技术人员可易于意识到,步骤可以变化并且仍然在本公开的精神和范围内。
尽管本文已经显示和描述了一些实施方案,但是对于本领域技术人员而言显而易见的是,这种实施方案仅作为实例提供。本公开的实施方案并不预期受到说明书内提供的具体实例的限制。尽管本公开的某些实施方案已经参照前述说明书进行了描述,但本文中实施方案的描述和说明并不意味着以限制性意义进行解释。本领域的技术人员现在将想到许多不背离本公开的改变、变化和取代。
此外,应当理解,本公开实施方案的所有方面不限于本文阐述的具体描绘、配置或相对比例,其取决于多种条件和变量。应当理解,在实践本发明时可采用本文所述公开的实施方案的各种备选方案。因此,据考虑,本公开还应涵盖任何这种备选方案、修改、变化或等同物。据预期,以下权利要求至少部分地定义本发明的范围,并且从而涵盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。
本领域的技术人员将意识到,可对以上显示和描述的示例性实施方案进行变化而不背离其宽泛的发明概念。因此,应当理解,本公开不限于所显示和描述的示例性实施方案,而是旨在涵盖在如权利要求所限定的本公开的精神和范围内的修改。例如,示例性实施方案的具体特征可为或可不为要求保护的发明的一部分,并且所公开实施方案的各种特征可进行组合。词语“右”、“左”、“下”和“上”指明所参考的附图中的方向。词语“向内”和“向外”分别是指朝向和远离流体递送装置的几何中心的方向。除非本文中具体阐述,否则术语“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”不限于一个/种要素,而是应被解读为“至少一个/种”的意思。
本文所述的范围被理解为该范围内所有值的简写,包括所述端点。例如,1-50的范围被理解为包括来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的任何数字、数字的组合或子范围。
应当理解,已简化本公开的至少一些附图和描述以集中于与清楚地理解本公开相关的要素,同时为了清楚起见,消除了本领域普通技术人员将意识到的也可构成本公开的一部分的其他要素。然而,由于这种要素为本领域众所周知的,并且由于它们不一定有助于更好地理解本公开,因此本文不提供对这种要素的描述。
实施例
实施例1:藻酸盐颗粒的藻酸盐裂解酶浓度依赖性降解
用于制备藻酸盐颗粒的示意图如图1所示。将具有粘度(5-40 cps,条件为在25℃下在水中1% w/v)的藻酸钠溶解于去离子水中以制备浓度为4% w/v的储备溶液。同样,通过使5 mg酶粉(相当于50 U)溶解于1 ml DI水中来制备浓度为50 U/ml的藻酸盐裂解酶的储备溶液。为了制备最终浓度为5 U/ml或0.5 U/ml的藻酸盐裂解酶和2% w/v的藻酸钠的藻酸盐裂解酶-藻酸钠前体溶液,将0.1 ml或0.01 ml的藻酸盐裂解酶与0.5 ml 4% w/v的藻酸钠混合,并用去离子水定容至1 ml。
将前体藻酸盐裂解酶-藻酸钠溶液在恒定搅拌下滴加到含有10% w/v氯化钙的胶凝浴中持续5分钟,以获得载有藻酸盐裂解酶的二价络合的藻酸盐颗粒。然后,通过筛分或离心分离颗粒并用去离子水将其洗涤3次,每次1分钟,以去除过量的氯化钙。将洗涤过的载有藻酸盐裂解酶的二价络合的藻酸盐颗粒分散于10 mM磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中,并在37℃下以期望的持续时间进行温育,以评估藻酸盐颗粒的降解。载有5单位(U)和0.5 U藻酸盐裂解酶的钙离子络合的藻酸盐颗粒的降解如图3(a)所示。载有5 U酶的藻酸盐颗粒在12小时内快速降解,而载有0.5 U酶的颗粒以较慢速率降解,并且在36小时之后无法达到与载有5 U的藻酸盐颗粒相似的吸光度水平。从图3(b)可以看出,载有5 U的载有藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒在12小时内完全降解,而载有0.5 U的藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒样品在36小时内显示部分降解的颗粒。在对照样品(不含酶)中,钙离子络合的藻酸盐颗粒保持完整。这些结果证明了藻酸盐颗粒的藻酸盐裂解酶浓度依赖性降解。
实施例2:藻酸盐颗粒的体外生物相容性
制备载有1 U和5 U藻酸盐裂解酶的两种不同的钙离子络合的藻酸盐颗粒。为了评估颗粒的生物相容性,通过光学显微镜观察细胞的形态和活力,如图4所示。将细胞以细胞密度为104个细胞/ml接种于24孔板中。在含有10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素的α-MEM中,在37℃、5% CO2和95%相对湿度下培养细胞。在24孔板中加入至少10个大小为2-3 mm的颗粒并温育24小时。在对照样品中,可观察到完整颗粒,对成骨细胞的活力和形态没有有害影响。载有5 U藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒完全降解(由降解的藻酸盐颗粒的碎片指示),而载有1 U藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒形状不规则。细胞为可存活的,在降解的颗粒下方具有扁平形态。该数据证明了载有藻酸盐裂解酶的钙络合的藻酸盐颗粒的体外生物相容性。
实施例3:载有藻酸盐裂解酶的二价金属离子络合的藻酸盐颗粒的离体降解
在该测试中,将5 U的藻酸盐裂解酶加载到钙离子络合的藻酸盐颗粒和对照颗粒(不含酶)中,并将其置于浸入盐水中的肝脏(牛)上。为了评估颗粒的降解,将肝脏保持在温度设置为37±1℃的烘箱中,并观察颗粒的形态变化持续48小时。从图5可以看出,载有藻酸盐裂解酶的藻酸盐颗粒在48小时内失去形状,并且可观察到白色残留物的薄膜。另一方面,对照颗粒保持形状48小时。可观察到对照颗粒上的黑色薄膜,这可能是生物膜的形成。
实施例4:藻酸盐裂解酶构象/活性的pH依赖性调控
为了研究裂解酶构象/活性的pH依赖性调控,使藻酸盐裂解酶暴露于不同的pH并进行荧光光谱分析。通常,酶的开放构象使酶的催化活性失活或降低,而天然结构的进一步稳定提高酶的催化活性。从图6可以看出,当与在pH 7.0 (10 mM,磷酸盐缓冲液)下的天然酶相比较,天然酶(1 U/ml)在酸性pH 4.6 (乙酸盐缓冲液)中的荧光处于较低水平。酸性pH中荧光的减少表明酶的开放构象。当酶溶液的pH变为pH 4.6到7.0时,发现恢复或增强的荧光处于与天然酶在pH 7.0下时相似的水平。这证明了藻酸盐裂解酶的可逆构象,其响应于溶液pH的变化,伴随酶活性的重新激活。因此,通过改变藻酸盐裂解酶-藻酸盐前体或胶凝浴溶液的pH,在载有藻酸盐裂解酶的二价金属离子颗粒的制造过程期间颗粒的初始降解。在具有中性pH (6.5-7.5)的水溶液中重构载有藻酸盐裂解酶的二价金属离子络合的藻酸盐颗粒时,藻酸盐裂解酶的活性可以恢复以获得藻酸盐颗粒的定制降解。
Claims (117)
1.自降解藻酸盐颗粒,其包含:
具有以下中的一种或两种的藻酸盐分子:(i) 预定分子量,和(ii) β-D-甘露糖醛酸(M)嵌段与α-L-古洛糖醛酸(G)嵌段的预定比率;
藻酸盐裂解酶;和
交联所述藻酸盐分子的金属离子。
2.权利要求1的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过以下中的一种或多种进行控制:所述藻酸盐分子的预定分子量、所述M与G嵌段的预定比率、所述藻酸盐裂解酶的浓度、所述金属离子的浓度和所述金属离子的结合亲和力。
3.权利要求2的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过所述藻酸盐分子的预定分子量进行控制。
4.权利要求1-3中任何一项的藻酸盐颗粒,其中所述预定分子量大于约100千道尔顿(kD)。
5.权利要求4的藻酸盐颗粒,其中所述预定分子量大于约200千道尔顿(kD)。
6.权利要求5的藻酸盐颗粒,其中所述预定分子量大于约800千道尔顿(kD)。
7.权利要求1-6中任何一项的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过所述M与G嵌段的预定比率进行控制。
8.权利要求1-7中任何一项的藻酸盐颗粒,其中所述M与G嵌段的预定比率为约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10或约95:5。
9.权利要求8的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐颗粒在少于约5天的时间段内降解。
10.权利要求8或9的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐颗粒在大于约2天的时间段内降解。
11.权利要求1-7中任何一项的藻酸盐颗粒,其中所述M与G嵌段的预定比率为约50:50、约45:55、约40:60、约35:65、约30:70、约25:75、约20:80、约15:85、约10:90或约5:95。
12.权利要求11的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐颗粒在约5天-约30天之间的时间段内降解。
13.权利要求1-12中任何一项的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐颗粒的降解通过所述藻酸盐裂解酶的浓度进行控制。
14.权利要求1-13中任何一项的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐裂解酶的活性在每颗粒约0.05 mU (毫单位)-约2.5 mU之间。
15.权利要求14的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐颗粒在少于约5天的时间段内降解。
16.权利要求1-13的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐裂解酶的活性在每颗粒约0.05 nU(纳单位)-约0.05 mU之间。
17.权利要求16的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐颗粒在约5天-约30天之间的时间段内降解。
18.权利要求1-13中任何一项的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐裂解酶的活性小于约每颗粒0.05 nU。
19.权利要求18的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐颗粒在大于约30天的时间段内降解。
20.权利要求1-19中任何一项的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐颗粒的降解通过所述金属离子的结合亲和力进行控制。
21.权利要求1-20中任何一项的藻酸盐颗粒,其中所述金属离子为阳离子。
22.权利要求21的藻酸盐颗粒,其中所述阳离子选自Cu2+、Ba2+、Sr2+、Ca2+、Co2+、Ni2+、Mn2+和Mg2+。
23.权利要求21的藻酸盐颗粒,其中所述阳离子为Ba2+。
24.权利要求21的藻酸盐颗粒,其中所述阳离子为Ca2+。
25.权利要求1-24中任何一项的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐颗粒的直径在约40微米(μm)-约2000 μm之间。
26.权利要求25的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐颗粒的直径在约40 μm-约1000 μm之间。
27.权利要求26的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐颗粒的直径在约40 μm-约200 μm之间。
28.权利要求1-27中任何一项的藻酸盐颗粒,其进一步包含独立地选自以下的一种或多种藻酸盐裂解酶抑制剂:Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ca2+和Mg2+。
29.权利要求1-28中任何一项的藻酸盐颗粒,其进一步包含冷冻保护剂。
30.权利要求1-29中任何一项的藻酸盐颗粒,其中所述冷冻保护剂选自蔗糖、甘油、乙二醇、山梨醇、海藻糖和丙二醇。
31.权利要求1-30中任何一项的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐颗粒的球形度为至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9、至少约0.95或至少约0.99。
32.权利要求1-31中任何一项的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐分子包括氧化的藻酸盐分子。
33.权利要求1-32中任何一项的藻酸盐颗粒,其进一步包含治疗有效量的活性成分。
34.在需要它的受试者中诱导自降解栓塞的方法,包括将多个权利要求1-33、112和113中任何一项的藻酸盐颗粒给予到所述受试者的血管中。
35.权利要求34的方法,其中所述血管为膝状动脉。
36.一种注射器,其包括:
包含干燥的权利要求1-33、112和113中任何一项的藻酸盐颗粒的第一腔室;
设置于第一腔室轴向上的第二腔室,所述第二腔室包含重构介质;和
被配置成在压下时使所述干燥的藻酸盐颗粒暴露于所述重构介质,从而重构所述干燥的藻酸盐颗粒的柱塞。
37.权利要求36的注射器,其进一步包括将第一腔室和第二腔室隔开的易破膜,其中当压下所述柱塞时,所述易破膜破裂以使所述干燥的藻酸盐颗粒暴露于所述重构介质,从而重构所述干燥的藻酸盐颗粒。
38.权利要求36或37的注射器,其中所述藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过以下中的一种或多种进行控制:所述藻酸盐分子的预定分子量、所述M与G嵌段的预定比率、所述藻酸盐裂解酶的浓度、所述金属离子的浓度和所述金属离子的结合亲和力。
39.权利要求38的注射器,其中所述藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过所述藻酸盐分子的预定分子量进行控制。
40.权利要求36-39中任何一项的注射器,其中所述预定分子量大于约100千道尔顿(kD)。
41.权利要求40的注射器,其中所述预定分子量大于约200千道尔顿(kD)。
42.权利要求41的注射器,其中所述预定分子量大于约800千道尔顿(kD)。
43.权利要求36-42中任何一项的注射器,其中所述藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过所述M与G嵌段的预定比率进行控制。
44.权利要求36-43中任何一项的注射器,其中所述M与G嵌段的预定比率为约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10或约95:5。
45.权利要求44的注射器,其中所述藻酸盐颗粒在少于约5天的时间段内降解。
46.权利要求44或45的注射器,其中所述藻酸盐颗粒在大于约2天的时间段内降解。
47.权利要求36-42中任何一项的注射器,其中所述M与G嵌段的预定比率为约50:50、约45:55、约40:60、约35:65、约30:70、约25:75、约20:80、约15:85、约10:90或约5:95。
48.权利要求47的注射器,其中所述藻酸盐颗粒在约5天-约30天之间的时间段内降解。
49.权利要求36-48中任何一项的注射器,其中所述藻酸盐颗粒的降解通过所述藻酸盐裂解酶的浓度进行控制。
50.权利要求36-49中任何一项的注射器,其中所述藻酸盐裂解酶的活性在每颗粒约0.05 mU-约2.5 mU之间。
51.权利要求50的注射器,其中所述藻酸盐颗粒在少于约5天的时间段内降解。
52.权利要求36-49中任何一项的注射器,其中所述藻酸盐裂解酶的活性在每颗粒约0.05 nU-0.05 mU之间。
53.权利要求52的注射器,其中所述藻酸盐颗粒在约5天-约30天之间的时间段内降解。
54.权利要求36-45中任何一项的注射器,其中所述藻酸盐裂解酶的活性小于约每颗粒0.05 nU。
55.权利要求54的注射器,其中所述藻酸盐颗粒在大于约30天的时间段内降解。
56.权利要求36-55中任何一项的注射器,其中所述藻酸盐颗粒的降解通过所述金属离子的结合亲和力进行控制。
57.权利要求36-56中任何一项的注射器,其中所述金属离子为阳离子。
58.权利要求57的注射器,其中所述阳离子选自Cu2+、Ba2+、Sr2+、Ca2+、Co2+、Ni2+、Mn2+和Mg2+。
59.权利要求57的注射器,其中所述阳离子为Ba2+。
60.权利要求57的注射器,其中所述阳离子为Ca2+。
61.权利要求36-60中任何一项的注射器,其中所述藻酸盐颗粒的直径在约40微米(μm)-约2000 μm之间。
62.权利要求61的注射器,其中所述藻酸盐颗粒的直径在约40 μm-约1000 μm之间。
63.权利要求62的注射器,其中所述藻酸盐颗粒的直径在约40 μm-约200 μm之间。
64.权利要求36-63中任何一项的注射器,其进一步包含独立地选自以下的一种或多种藻酸盐裂解酶抑制剂:Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ca2+和Mg2+。
65.权利要求36-64中任何一项的注射器,其进一步包含冷冻保护剂。
66.权利要求36-65中任何一项的注射器,其中所述冷冻保护剂选自蔗糖、甘油、乙二醇、山梨醇、海藻糖和丙二醇。
67.权利要求36-66中任何一项的注射器,其中所述藻酸盐颗粒的球形度为至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9、至少约0.95或至少约0.99。
68.权利要求36-67中任何一项的注射器,其中所述藻酸盐分子包括氧化的藻酸盐分子。
69.权利要求36-68中任何一项的注射器,其中所述干燥的藻酸盐颗粒进一步包含治疗有效量的活性成分。
70.制备自降解藻酸盐颗粒的方法,所述方法包括:
获得包含藻酸盐微球的第一组合物,所述藻酸盐微球包含具有以下中的一种或两种的藻酸盐分子:(i) 预定分子量,和(ii) β-D-甘露糖醛酸(M)嵌段与α-L-古洛糖醛酸(G)嵌段的预定比率;
将第一组合物与包含藻酸盐裂解酶和金属离子的第二组合物混合,从而产生混合物;和
从所述混合物制备自降解藻酸盐颗粒。
71.权利要求70的方法,其进一步包括:
通过以下一项或两项来抑制所述混合物中所述藻酸盐分子的降解:
(i) 将所述混合物的pH保持在小于约6.5;和
(ii) 将所述混合物的温度保持在低于约10摄氏度(℃)。
72.权利要求71的方法,其中所述混合物的pH保持在约3-约6.5之间。
73.权利要求71或72的方法,其中所述混合物的温度保持在约4℃-约10℃之间。
74.权利要求70-73中任何一项的方法,其中所述制备包括进行油包水乳化技术或液滴技术。
75.权利要求70-74中任何一项的方法,其进一步包括在pH介于约6.8-约7.5之间的溶液中重构所述自降解藻酸盐颗粒。
76.权利要求70-75中任何一项的方法,其中所述藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过以下中的一种或多种进行控制:所述藻酸盐分子的预定分子量、所述M与G嵌段的预定比率、所述藻酸盐裂解酶的浓度、所述金属离子的浓度和所述金属离子的结合亲和力。
77.权利要求76的方法,其中所述藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过所述藻酸盐分子的预定分子量进行控制。
78.权利要求70-77中任何一项的方法,其中所述预定分子量大于约100千道尔顿(kD)。
79.权利要求78的方法,其中所述预定分子量大于约200千道尔顿(kD)。
80.权利要求79的方法,其中所述预定分子量大于约800千道尔顿(kD)。
81.权利要求70-80中任何一项的方法,其中所述藻酸盐颗粒在体内或体外的降解通过所述M与G嵌段的预定比率进行控制。
82.权利要求70-81中任何一项的方法,其中所述M与G嵌段的预定比率为约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10或约95:5。
83.权利要求82的方法,其中所述藻酸盐颗粒在少于约5天的时间段内降解。
84.权利要求82或83的方法,其中所述藻酸盐颗粒在大于约2天的时间段内降解。
85.权利要求70-81中任何一项的方法,其中所述M与G嵌段的预定比率为约50:50、约45:55、约40:60、约35:65、约30:70、约25:75、约20:80、约15:85、约10:90或约5:95。
86.权利要求85的方法,其中所述藻酸盐颗粒在约5天-约30天之间的时间段内降解。
87.权利要求70-86中任何一项的方法,其中所述藻酸盐颗粒的降解通过所述藻酸盐裂解酶的浓度进行控制。
88.权利要求70-87中任何一项的方法,其中所述藻酸盐裂解酶的活性在每颗粒0.05mU-2.5 mU之间。
89.权利要求88的方法,其中所述藻酸盐颗粒在少于约5天的时间段内降解。
90.权利要求70-89的方法,其中所述藻酸盐裂解酶的浓度在每颗粒约0.05 nU-0.05mU之间。
91.权利要求90的方法,其中所述藻酸盐颗粒在约5天-约30天之间的时间段内降解。
92.权利要求70-89中任何一项的方法,其中所述藻酸盐裂解酶的活性小于约每颗粒0.05 nU。
93.权利要求92的方法,其中所述藻酸盐颗粒在大于约30天的时间段内降解。
94.权利要求70-93中任何一项的方法,其中所述藻酸盐颗粒的降解通过所述金属离子的结合亲和力进行控制。
95.权利要求70-94中任何一项的方法,其中所述金属离子为阳离子。
96.权利要求95的方法,其中所述阳离子选自Cu2+、Ba2+、Sr2+、Ca2+、Co2+、Ni2+、Mn2+和Mg2+。
97.权利要求95的方法,其中所述阳离子为Ba2+。
98.权利要求95的方法,其中所述阳离子为Ca2+。
99.权利要求70-98中任何一项的方法,其中所述藻酸盐颗粒的直径在约100微米(μm)-约2000 μm之间。
100.权利要求99的方法,其中所述藻酸盐颗粒的直径在约100 μm-约1000 μm之间。
101.权利要求100的方法,其中所述藻酸盐颗粒的直径在约100 μm-约200 μm之间。
102.权利要求70-101中任何一项的方法,其中所述藻酸盐颗粒进一步包含独立地选自以下的一种或多种藻酸盐裂解酶抑制剂:Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ca2+和Mg2+。
103.权利要求70-102中任何一项的方法,其中所述藻酸盐颗粒进一步包含冷冻保护剂。
104.权利要求103的方法,其进一步包括在将所述藻酸盐颗粒冻干之前将所述冷冻保护剂添加至所述藻酸盐颗粒中。
105.权利要求70-104中任何一项的方法,其中所述冷冻保护剂选自蔗糖、甘油、乙二醇、山梨醇、海藻糖和丙二醇。
106.权利要求70-105中任何一项的方法,其中所述藻酸盐颗粒的球形度为至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9、至少约0.95或至少约0.99。
107.权利要求70-106中任何一项的方法,其中所述藻酸盐分子包括氧化的藻酸盐分子。
108.权利要求70-107中任何一项的方法,其中所述自降解藻酸盐颗粒包含治疗有效量的活性成分。
109.通过临时栓塞血管来治疗需要它的受试者的方法,所述方法包括:
将多个权利要求1-33、112和113中任何一项的藻酸盐颗粒给予到所述受试者的血管中。
110.权利要求109的方法,其中所述血管位于膝状动脉中。
111.权利要求109或权利要求110的方法,其中所述受试者患有选自以下的病症:膝痛、关节炎、粘连性囊炎引起的肩痛、肾脏病变、肝脏病变、子宫肌瘤、良性前列腺增生、动静脉畸形、鼻咽血管纤维瘤、脑动脉瘤、胃肠出血、精索静脉曲张、手术出血、脾破裂、脾肿大、肥胖和实体肿瘤。
112.权利要求1-33中任何一项的藻酸盐颗粒,其中所述金属离子包括二价金属离子或三价金属离子。
113.权利要求1-33和112中任何一项的藻酸盐颗粒,其中所述藻酸盐裂解酶被所述交联的藻酸盐分子包埋。
114.权利要求36-69中任何一项的注射器,其中所述金属离子包括二价金属离子或三价金属离子。
115.权利要求36-69和114中任何一项的注射器,其中所述干燥的藻酸盐颗粒包含被交联的藻酸盐分子包埋的藻酸盐裂解酶。
116.权利要求70-108中任何一项的方法,其中所述金属离子包括二价金属离子或三价金属离子。
117.权利要求70-108和116中任何一项的方法,其中在将第一组合物与第二组合物混合之后,所述金属离子交联所述藻酸盐分子,并且所述藻酸盐裂解酶被所述交联的藻酸盐分子包埋。
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