CN114250221A - SARS-CoV-2 RBD中和核酸适体的筛选方法及核酸适体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种SARS‑CoV‑2 RBD中和核酸适体的筛选方法及核酸适体，其包括如下序列中的至少一种：SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:15。本发明的核酸适体更容易与RBD蛋白结合并“击垮”RBD蛋白与受体ACE2之间的相互作用，其对SARS‑CoV‑2具有很强的中和效应以及高度的结合亲和力，能够有效地抑制病毒对细胞的侵染。由于本发明的核酸适体特有的生产周期短、生产成本低、免疫原性低等优点，使其在检测、预防和治疗新冠病毒方面很好地节约了时间成本，对于目前新冠病毒的防治具有重要意义，并且在临床上亦有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种SARS-CoV-2 RBD中和核酸适体及筛选方法。
背景技术
冠状病毒属的病毒是具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，在自然界中广泛存在。2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2或2019 nCoV)是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒。SARS-CoV-2的蔓延趋势正以一种前所未有的方式改变着世界。使世界人民的经济生活、社会生活和精神生活都受到了巨大冲击。自疫情发生以来，全球已有超过2300万人感染了新冠病毒，并导致81.6万余人死亡。但疫情的发展不会就此而止步，在未来的一段时间内，病毒还会继续缓慢传播，并且世界也会处于大流行状态，对世界公共卫生有着巨大威胁，迫切需要新的预防和治疗策略
在病毒治疗方面，主要使用一些抗病毒药物，根据患者肺部严重程度，有时也使用抗炎症药物进行辅助治疗。目前尚无特异性药品用于新冠病毒的治疗。新冠肺炎疫情中使用的血浆疗法，通过提取新冠肺炎康复者血浆，并给患者人为地补给抗体。此种方法虽然能够取得一定的成效，但由于每个病人的免疫反应不同，血浆中含有的中和抗体的浓度和强度也不同，且受限于新冠肺炎患者数量庞大，康复者的血浆有限，因此并不适用于大范围内推广使用。抗体疗法除血清疗法外，单克隆抗体和基因工程抗体也被应用于一些疾病的治疗中。后两者虽可以实现大规模批量生产，但技术复杂、研制的实验周期较长、成本昂贵、且需要人源化过程，不同人群的诊疗结果大相径庭。因此，难以将其应用到疫情防控的前期主战场。
为了节约时间成本，研发具有生产周期短的核酸适体新型抑制剂十分必要。核酸适体是一种经体外筛选技术得到的结构化的寡核苷酸系列，与靶标分子有严格的识别能力和高度的结合亲和力。其具有分子量小、特异性强、免疫原性低，生产成本低等优点。但至今未见制备可用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)肺炎治疗的中和适体的报道。因此，研发核酸适体抑制剂，对SARS-CoV-2的研究和治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一，在于提供一种SARS-CoV-2 RBD中和核酸适体的筛选方法，包括如下步骤：
1)化学合成一个60-120个碱基的DNA初始文库；取初始文库溶于结合缓冲液中，进行变性处理；
2)将至少两种源表达的重组SARS-CoV-2 RBD蛋白作为适体筛选的交叉靶标；
3)将预处理的DNA文库与第一种源表达的重组SARS-CoV-2 RBD蛋白共孵育；产物进行PCR扩增；PCR产物用于筛选；
4)先通过SELEX方法以保证第一种源表达的SARS-CoV-2 RBD蛋白与DNA链的多个拷贝结合；
5)从步骤4)筛选之后，使用至少第二种源表达的SARS-CoV-2 RBD蛋白与DNA孵育，以获得与至少两种源表达的RBD都能结合的序列；
6)引入ACE2竞争；之后收集与ACE2竞争的序列。
在本发明中，交叉靶标来源可以为多种，包括但不限于人源表达的重组SARS-CoV-2 RBD蛋白以及通过昆虫表达的重组SARS-CoV-2 RBD蛋白。
在本发明的优选实施例中，步骤4)，在SELEX方法筛选过程中，采用反筛靶标，反筛压力逐轮增加。
在本发明的优选实施例中，步骤5)中，利用His-tag RBD修饰的Ni琼脂糖微球来监测富集的过程。
本发明的另一目的，在于提供所述的一种SARS-CoV-2 RBD中和核酸适体的筛选方法筛选得到的序列。
本发明的再一目的，在于提供SARS-CoV-2 RBD中和核酸适体。其包括如下序列中的至少一种：SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15。
本发明以上15条核酸适体，均具备和SARS-CoV-2核酸中和的能力，能够用于新冠病毒SARS-CoV-2感染的检测试剂。
进一步，本发明的另一目的，在于提供以下两条核酸适体中的至少一种：
1)17-13：ATCCAGAGTGACGCAGCACCCAAGAACAAGGACTGCTTAGGATTGCGATAGGTTCGGGGGAC ACGGTGGCTTAGTA；
2)17-13C3：CGCAGCACCCAAGAACAAGGACTGCTTAGGATTGCGATAGGTTCGG。
以上的两条核酸适体，不仅能够用于新冠病毒SARS-CoV-2感染的检测试剂，由于发现其进一步具有蛋白水平上的中和能力，IC50的数值分别为199.9nM和41.6nM。因此，17-13及17-13C3能够用于新冠治疗。
因此，本发明的另一目的，在于提供所述的两条SARS-CoV-2 RBD中和核酸适体在制备预防新冠病毒SARS-CoV-2感染药物中的用途。
本发明的另一目的，在于提供所述的两条SARS-CoV-2 RBD中和核酸适体在制备治疗新冠病毒SARS-CoV-2感染药物中的用途。
本发明的另一目的，在于提供所述的SARS-CoV-2 RBD中和核酸适体在用于中和环境中的新冠病毒SARS-CoV-2中的用途。本发明中所述的环境，包括室内环境和室外环境。室内环境例如宾馆、家庭、学校等，室外例如菜市场、下水道等。可以将核酸适体放于空调、换气风扇等处，或是制成消毒液，用于中和室内和室外环境中的新冠病毒。
本发明还提供SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15所示序列的突变体或截短序列。
优选地，所述的突变体，为和SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15所示序列具有80％以上同源性的序列。
进一步优选，所述的突变体，为和SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15所示序列具有90％以上同源性的序列。
本发明还提供过所述的SARS-CoV-2 RBD中和核酸适体在制备新冠病毒SARS-CoV-2感染的检测试剂、预防形病毒感染药物或治疗药物、或中和环境中的新冠病毒中的用途。
本技术方案与背景技术相比，具有如下优点：
1.本发明的方法，1)采用了两种以上源表达的SARS-CoV-2 RBD蛋白，因此，可获得对不同表达体系产生的SARS-CoV-2 RBD蛋白均有结合核酸适体，尽可能地更接近病毒表达的SARS-CoV-2 RBD蛋白；2)采用了ACE2竞争，因此，针对性地获得ACE2与SARS-CoV-2 RBD相互作为结合位点相同/相近的核酸适体；本发明的筛选方法可获得因蛋白表达系统不同的不同糖基化修饰的SARS-CoV-2 RBD蛋白均有结合的核酸适体，并且在满足核酸适体的结合SARS-CoV-2 RBD蛋白需求以外，还可以针对性地结合在SARS-CoV-2 RBD蛋白与ACE2相互作用的位点上。
2.本发明筛选得到的15条核酸适体，均可用于新冠核酸检测。
3.本发明筛选出来的两条序列17-13与17-13C3具有蛋白水平上的中和能力，IC50的数值分别为199.9nM(图4C)和41.6nM(图4D)。因此，17-13及17-13C3进一步能够作为新冠治疗或预防的中和试剂。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为His-tag RBD修饰的Ni琼脂糖微球来监测富集的过程，随着筛选轮数的增加库与RBD-Ni-beads结合的荧光强度明显增加(图1A)，然而，Ni-beads荧光强度未增加(图1B)。
图2为筛选出的FAM标记的核酸适体、17-13的截短序列和随机DNA序列与RBD-Ni琼脂糖微球结合的荧光强度。表明了同浓度的核酸适体虽对RBD的结合能力不同，但均对RBD有结合；17-13的截短序列也能保持良好的结合能力。
图3为17-13及其截短序列可在与RBD预孵育情况下，抑制ACE2对RBD的结合，起到预防病毒感染的作用(图3A)；也可与ACE2同时竞争RBD上的结合位点，应对感染性状还未有体现的“窗口期”(图3B)；还可中和已结合在RBD上的ACE2(图3C)。对应地，17-13及其截短序列对RBD-ACE2结合的阻断抑制率、竞争抑制率以及中和抑制率分别体现在图3D-F中。其中，17-13C3的阻断抑制率、竞争抑制率以及中和抑制率均在45％以上。
图4为17-13及其截短序列17-13C3与RBD的结合解离常数(Kd)分别为84.6±10.6nM(图4A)和44.7±9.9nM(图4B)。并利用ACE2-Ni–beads模拟人体中表面表达ACE2的细胞，评估了17-13与17-13C3在蛋白水平上的中和能力，IC50的数值分别为199.9nM(图4C)和41.6nM(图4D)。
具体实施方式
新型冠状病毒感染人体细胞的关键在于冠状病毒表面的刺突糖蛋白(S蛋白)，它以三聚体的形式嵌在包膜表面，是决定病毒毒力和宿主范围的关键部分。它能够与人体上皮细胞的血管紧张素转化酶(ACE2)结合。确切地说，是S蛋白“劫持”了原本控制血压的ACE2，通过与它的结合继而侵入人体。因此，申请人将“击垮”病毒的靶点主要集中在病毒的S蛋白和细胞表面受体间的相互作用上。本发明的新型核酸适体抑制剂更容易与S蛋白强有力地结合并“击垮”S蛋白与受体ACE2之间的相互作用。
本发明技术方案如下：
1)化学合成一个76个碱基的DNA初始文库，DNA初始文库的两端为固定序列，其中包括中间为40个碱基的随机序列，即为5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA-40N-TGGACACGGTGGCTTAGT-3’，库容量为1015以上。取5nmol DNA初始文库溶于结合缓冲液(12mmol/L PBS，pH 7.4，150mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，0.55mmol/L MgCl2)中，进行变性处理：95℃10min，冰上10min，然后在室温下放置10min。
2)将通过人源(293T细胞)表达的重组SARS-CoV-2 RBD蛋白(刺突糖蛋白受体结合域，即S蛋白结构域，购买自Sino Biological)以及通过昆虫表达的重组SARS-CoV-2 RBD蛋白作为适体筛选的交叉靶标。其中，将293T细胞表达的SARS-CoV-2 RBD蛋白修饰于ProteinA乳胶微球，昆虫表达的重组SARS-CoV-2 RBD蛋白(购买自Sino Biological)修饰于Ni琼脂糖微球。
3)将预处理的DNA文库与RBD-Protein A-beads或RBD-Ni-beads于25℃下孵育30min；去除上清液回收微球，用结合缓冲液清洗两次，回收的RBD-Protein A-beads/RBD-Ni-beads加入到包含正向引物(5’-FAM-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3')、反向引物(5’-Biotin-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3')、dNTPs、Taq DNA聚合酶及PCR缓冲液的PCR混合物中，扩增目标的序列(94℃预变性5min，94℃30s，53℃30s，72℃30s，扩增10个循环，最后72℃延伸5min)。为获得单链的文库，PCR产物与链霉亲和素琼脂糖凝胶微球孵育10min，用0.1M NaOH处理1min变性。使用3K超滤管脱盐后，产物可用于下一轮筛选。正筛压力逐轮减小。
4)前7轮筛选通过经典的SELEX方法(指数富集配体系统进化技术，SystematicEvolution of Legends by Exponential Enrichment)以保证人源表达的SARS-CoV-2 RBD蛋白与DNA链的多个拷贝结合。从第3轮开始protein A乳胶微球和IgG修饰的protein A乳胶微球用作反筛的靶标，以排除与IgG或者protein A结合的序列。反筛压力逐轮增加。
5)从第8轮筛选开始使用昆虫表达的SARS-CoV-2 RBD蛋白与DNA孵育，以获得与不同糖基化表达的RBD都能结合的序列。8轮筛选结束后，在接下来的5轮筛选中引入5μg ACE2竞争以用来模拟感染过程，有利于与ACE2有同样结合位点的适配体与RBD的结合。将DNA文库与RBD-Ni-Beads孵育后，上清中未结合或者弱结合的序列被去除，然后加入ACE2并与RBD-Ni-beads孵育，以收集与ACE2竞争的序列。
6)利用His-tag RBD修饰的Ni琼脂糖微球来监测富集的过程。流式的结果表明，随着筛选轮数的增加DNA文库与RBD-Ni-beads结合的荧光强度明显增加(图1A)，然而，Ni-beads荧光强度未增加(图1B)，表明通过13轮筛选，成功地富集了SARS-CoV-2 RBD蛋白的识别序列。
通过高通量测序并优化筛选得到一系列适配体序列(表1)，并表征了其与RBD蛋白结合(图2)。
其中，17-13C1-C3是根据17-13与RBD分子对接结果分析，保留有效结合碱基情况下的截短序列。通过分子对接辅助分析显示能与RBD较好结合的17-13可结合在RBD与ACE2相互作用的反应界面附近(Gln474以及Phe486)。17-13及其截短序列17-13C3可在与RBD预孵育情况下，抑制ACE2对RBD的结合，起到预防病毒感染的作用；也可与ACE2同时竞争RBD上的结合位点，应对感染性状还未有体现的“窗口期”；还可中和已结合在RBD上的ACE2(图3)。17-13及其截短序列17-13C3与RBD的结合解离常数分别为84.6±10.6nM(图4A)和44.7±9.9nM(图4B)。并利用ACE2-Ni–beads模拟人体中表面表达ACE2的细胞，评估了17-13与17-13C3在蛋白水平上的中和能力，IC50的数值分别为199.9nM(图4C)和41.6nM(图4D)。17-13及17-13C3能够作为新冠治疗的中和试剂。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门大学
<120> SARS-CoV-2 RBD中和核酸适体的筛选方法及核酸适体
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atccagagtg acgcagcaat gggctggctg ttgggtgggg agtttctccg ggcgttgtgg 60
acacggtggc ttagta 76
<210> 2
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atccagagtg acgcagcacg gttcactggt ctcgattccg aggtcactca agggcggcgg 60
acacggtggc ttagta 76
<210> 3
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atccagagtg acgcagcagt gactaaaaac gggcggggcg cggcggcgtg tctacagagg 60
acacggtggc ttagta 76
<210> 4
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atccagagtg acgcagcagg gatgggctcc gggctactgg cgaggcttcg gaacaaccgg 60
acacggtggc ttagta 76
<210> 5
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atccagagtg acgcagcatg gtgggtgggt gggtggattg ctgcagagcg aatcccgcgg 60
acacggtggc ttagta 76
<210> 6
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atccagagtg acgcagcact gcaccgggtt tggcaccggg cctggcgggg tacaggagga 60
cacggtggct tagta 75
<210> 7
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atccagagtg acgcagcagg cggctggtgg ggggcaggcc ggatattggg cttgattggg 60
acacggtggc ttagta 76
<210> 8
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atccagagtg acgcagcaac gatcgggggc tgctcgggat tgcggatgtt cgttgcgagg 60
acacggtggc ttagta 76
<210> 9
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atccagagtg acgcagcaga agtgcggggg actgctcggg attgcggatc gttctcgcgg 60
acacggtggc ttagta 76
<210> 10
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atccagagtg acgcagcacc caagaacaag gactgcttag gattgcgata ggttcggggg 60
acacggtggc ttagta 76
<210> 11
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atccagagtg acgcagcagg gatgggctct gggcctggca tgagagtagt cagtcgttgg 60
acacggtggc ttagta 76
<210> 12
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atccagagtg acgcagcact gagtacatgt gtctctttag gtcggattgc tattcactgg 60
acacggtggc ttagta 76
<210> 13
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgcagcaccc aagaacaagg actgcttagg attgcgatag gttcggggga cacggtggct 60
tagta 65
<210> 14
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atccagagtg acgcagcacc caagaacaag gactgcttag gattgcgata ggttcgg 57
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgcagcaccc aagaacaagg actgcttagg attgcgatag gttcgg 46
Claims (14)
1.一种SARS-CoV-2RBD中和核酸适体的筛选方法，包括如下步骤：
1)化学合成一个60-120个碱基的DNA初始文库；取初始文库溶于结合缓冲液中，进行变性处理；
2)将至少两种源表达的重组SARS-CoV-2RBD蛋白作为适体筛选的交叉靶标；
3)将预处理的DNA文库与第一种源表达的重组SARS-CoV-2RBD蛋白共孵育；产物进行PCR扩增；PCR产物用于筛选；
4)先通过SELEX方法以保证第一种源表达的SARS-CoV-2RBD蛋白与DNA链的多个拷贝结合；
5)从步骤4)筛选之后，使用至少第二种源表达的SARS-CoV-2RBD蛋白与DNA孵育，以获得与至少两种源表达的RBD都能结合的序列；
6)引入ACE2竞争；之后收集与ACE2竞争的序列。
2.根据权利要求1所述的一种SARS-CoV-2RBD中和核酸适体的筛选方法，其特征在于：
交叉靶标包括人源表达的重组SARS-CoV-2RBD蛋白以及通过昆虫表达的重组SARS-CoV-2RBD蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种SARS-CoV-2RBD中和核酸适体的筛选方法，其特征在于：
步骤4)，在SELEX方法筛选过程中，采用反筛靶标，反筛压力逐轮增加。
4.根据权利要求1所述的一种SARS-CoV-2RBD中和核酸适体的筛选方法，其特征在于：
步骤5)中，利用His-tag RBD修饰的Ni琼脂糖微球来监测富集的过程。
5.根据权利要求1至4任一项所述的一种SARS-CoV-2RBD中和核酸适体的筛选方法筛选得到的序列。
6.SARS-CoV-2RBD中和核酸适体，其特征在于：其包括如下序列中的至少一种：
SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15。
7.根据权利要求6所述的SARS-CoV-2RBD中和核酸适体在制备新冠病毒SARS-CoV-2感染的检测试剂、预防形病毒感染药物或治疗药物中的用途。
8.根据权利要求6所述的SARS-CoV-2RBD中和核酸适体在用于中和环境中的新冠病毒SARS-CoV-2中的用途。
9.根据权利要求6所述的SARS-CoV-2RBD中和核酸适体，其特征在于：其包括如下序列中的至少一种：
1)17-13：ATCCAGAGTGACGCAGCACCCAAGAACAAGGACTGCTTAGGATTGCGATAGGTTCGGGGGACACGGTGGCTTAGTA；
2)17-13C3：CGCAGCACCCAAGAACAAGGACTGCTTAGGATTGCGATAGGTTCGG。
10.根据权利要求9所述的SARS-CoV-2RBD中和核酸适体在制备预防和/或治疗新冠病毒SARS-CoV-2感染药物中的用途。
11.SARS-CoV-2RBD中和核酸适体，其特征在于：为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15所示序列的突变体或截短序列。
12.如权利要求11所述的SARS-CoV-2RBD中和核酸适体，其特征在于：所述的突变体，为和SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15所示序列具有80％以上同源性的序列。
13.如权利要求11所述的SARS-CoV-2RBD中和核酸适体，其特征在于：所述的突变体，为和SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15所示序列具有90％以上同源性的序列。
14.根据权利要求11至13任一项所述的SARS-CoV-2RBD中和核酸适体在制备新冠病毒SARS-CoV-2感染的检测试剂、预防形病毒感染药物或治疗药物、或中和环境中的新冠病毒中的用途。
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