CN114246339A - 组合物及其在制备提高肠道免疫能力的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品技术领域,尤其涉及组合物及其在制备提高肠道免疫能力的产品中的应用。本发明提供了含有母乳低聚糖和鼠李糖乳杆菌的组合物,该组合物中两种组分相互配合,产生增效协同作用,有效提高了肠道免疫能力。实验表明,本发明提供的组合物具有良好的抑制致病菌吸附能力、提升肠道屏障能力和/或抑制炎症因子水平。
Description
技术领域
本发明涉及食品技术领域,尤其涉及组合物及其在制备提高肠道免疫能力的产品中的应用。
背景技术
人体最庞大的正常菌群在肠道,它的构成相当复杂,人们发现,光细菌的种类就在1000种以上。这些肠道细菌及其代谢产物包含了大量免疫刺激物质,如抗原、毒素等,而肠道免疫屏障对来自粘膜表面的各种抗原作出正确反映,即对无害抗原如食物及正常菌群的抗原表现为免疫耐受以保证食物的吸收和微生态的稳定,不会因对无害抗原起反应而耗竭免疫排斥。近年来人研究发现,肠道菌群与肠道免疫之间的关系在炎症性肠炎、食物过敏、多器官功能衰竭、细胞移位等疾病的发生发展中起了重要作用。若肠道免疫系统失去对正常菌群某些抗原的耐受,在肠道局部可产生炎症反应,诱发炎症性肠炎。在全身,由于机体与细菌存在交叉抗原,可诱发全身性炎症反应,参与某些自身免疫性疾病的发病机制。现有很多临床资料表明,利用肠道正常菌群,如乳酸杆菌、双歧杆菌、非致病性大肠杆菌,治疗炎症性肠炎、婴幼儿湿疹、食物过敏取得了类似于糖皮质激素样的效果,而且无副作用,疗效更持久。
对于婴幼儿而言,在出生后婴儿肠道结构和消化功能还未发育成熟,肠道黏膜屏障功能和免疫功能都比较弱,容易发生肠道炎症性和感染性疾病。在出生后几周内,新生儿的肠道经历了一个迅速的成熟过程,肠道菌群迅速建立。通常认为,该过程受到暴露与母体的细菌和环境细菌的影响,进一步受到新生儿膳食的影响。研究表明,与配方乳喂养婴儿相比,人乳喂养婴儿肠道相关疾病的发病率明显偏低。
与其他大多数哺乳动物的乳汁不同,人乳含有非常高浓度的低聚糖。人乳低聚寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)是一种低度聚合糖,其作用被归为三大类:一是作为益生元,改变微生物的组成和功能以使宿主受益;二是作为抗黏附剂或受体诱饵,阻碍病原体在胃肠道内定殖;三是作为免疫调节剂,对胃肠道上皮直接作用,调节宿主对胃肠道微生物的免疫应答。大量研究表明,HMOs不仅能够满足新生儿在物质和能量上的需求,而且对于消化系统的早期发育、出生后免疫系统的完善记忆体内生态平衡的建立等比不可少,是母乳替代品所无法比拟的。但是,由于HMOs组成复杂,且随着人体状态的不同,HMOs的组成发生变化,目前对于HMOs的研究仍存在不足,如何使HMOs更好的与益生菌配合,提高肠道免疫能力仍是需要解决的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供组合物及其在制备提高肠道免疫能力的产品中的应用。
本发明提供的组合物包括母乳低聚糖和鼠李糖乳杆菌。
本发明中,所述母乳低聚糖由2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸基乳糖、6’-唾液酸基乳糖和乳糖-N-四糖中至少一种组成。
本发明中,所述母乳低聚糖中,2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-四糖、3’-唾液酸基乳糖与6’-唾液酸基乳糖的质量比为(0~10):(4~8):(3~6):(1~4):(0~1)。
一些实施例中,所述母乳低聚糖为2’-岩藻糖基乳糖;
或者由如下质量份的组分组成:2’-岩藻糖基乳糖10份、3-岩藻糖基乳糖4份、乳糖-N-四糖3份、3’-唾液酸基乳糖1份和6’-唾液酸基乳糖1份;
或者由如下质量份的组分组成:2’-岩藻糖基乳糖6份、3-岩藻糖基乳糖4.5份、乳糖-N-四糖3份、3’-唾液酸基乳糖1份和6’-唾液酸基乳糖1份;
或者由如下质量份的组分组成:2’-岩藻糖基乳糖10份、3-岩藻糖基乳糖4份、乳糖-N-四糖3份和3’-唾液酸基乳糖2份;
或者由如下质量份的组分组成:2’-岩藻糖基乳糖9份、3-岩藻糖基乳糖6份、乳糖-N-四糖3份和3’-唾液酸基乳糖2份;
或者由如下质量份的组分组成:3-岩藻糖基乳糖8份、乳糖-N-四糖6份和3’-唾液酸基乳糖4份。
本发明中,所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌HN001或鼠李糖乳杆菌LGG。
其中,所述母乳低聚糖与鼠李糖乳杆菌的比例为5mg:(1×103CFU~1×1012CFU);优选为5mg:(1×106CFU~1×1010CFU)。一些具体实施例中,所述母乳低聚糖与鼠李糖乳杆菌的比例为5mg:1×108CFU。
一些具体实施例中,本发明所述组合物由鼠李糖乳杆菌HN001和2’-岩藻糖基乳糖组成;其中鼠李糖乳杆菌HN001和2’-岩藻糖基乳糖比例为1×1011CFU:5g。
另一些具体实施例中,本发明所述组合物由鼠李糖乳杆菌HN001和母乳低聚糖组成;其中鼠李糖乳杆菌HN001和母乳低聚糖的比例为1×1011CFU:5g;所述母乳低聚糖由2’-岩藻糖基乳糖10质量份、3-岩藻糖基乳糖4质量份、乳糖-N-四糖3质量份、3’-唾液酸基乳糖1质量份和6’-唾液酸基乳糖1质量份组成。
另一些具体实施例中,本发明所述组合物由鼠李糖乳杆菌HN001和母乳低聚糖组成;其中鼠李糖乳杆菌HN001和母乳低聚糖的比例为1×1011CFU:5g;所述母乳低聚糖由2’-岩藻糖基乳糖6质量份、3-岩藻糖基乳糖4.5质量份、乳糖-N-四糖3质量份、3’-唾液酸基乳糖1质量份和6’-唾液酸基乳糖1质量份组成。
另一些具体实施例中,本发明所述组合物由鼠李糖乳杆菌HN001和母乳低聚糖组成;其中鼠李糖乳杆菌HN001和母乳低聚糖的比例为1×1011CFU:5g;所述母乳低聚糖由2’-岩藻糖基乳糖10质量份、3-岩藻糖基乳糖4质量份、乳糖-N-四糖3质量份和3’-唾液酸基乳糖2质量份组成。
另一些具体实施例中,本发明所述组合物由鼠李糖乳杆菌HN001和母乳低聚糖组成;其中鼠李糖乳杆菌HN001和母乳低聚糖的比例为1×1011CFU:5g;所述母乳低聚糖由2’-岩藻糖基乳糖9质量份、3-岩藻糖基乳糖6质量份、乳糖-N-四糖3质量份和3’-唾液酸基乳糖2质量份组成。
另一些具体实施例中,本发明所述组合物由鼠李糖乳杆菌HN001和母乳低聚糖组成;其中鼠李糖乳杆菌HN001和母乳低聚糖的比例为1×1011CFU:5g;所述母乳低聚糖由3-岩藻糖基乳糖8质量份、乳糖-N-四糖6质量份和3’-唾液酸基乳糖4质量份组成。
另一些具体实施例中,本发明所述组合物由鼠李糖乳杆菌LGG和2’-岩藻糖基乳糖组成;其中鼠李糖乳杆菌LGG和2’-岩藻糖基乳糖比例为1×1011CFU:5g。
另一些具体实施例中,本发明所述组合物由鼠李糖乳杆菌LGG和母乳低聚糖组成;其中鼠李糖乳杆菌LGG和母乳低聚糖的比例为1×1011CFU:5g;所述母乳低聚糖由2’-岩藻糖基乳糖10质量份、3-岩藻糖基乳糖4质量份、乳糖-N-四糖3质量份、3’-唾液酸基乳糖1质量份和6’-唾液酸基乳糖1质量份组成。
另一些具体实施例中,本发明所述组合物由鼠李糖乳杆菌LGG和母乳低聚糖组成;其中鼠李糖乳杆菌LGG和母乳低聚糖的比例为1×1011CFU:5g;所述母乳低聚糖由2’-岩藻糖基乳糖6质量份、3-岩藻糖基乳糖4.5质量份、乳糖-N-四糖3质量份、3’-唾液酸基乳糖1质量份和6’-唾液酸基乳糖1质量份组成。另一些具体实施例中,本发明所述组合物由鼠李糖乳杆菌LGG和母乳低聚糖组成;其中鼠李糖乳杆菌LGG和母乳低聚糖的比例为1×1011CFU:5g;所述母乳低聚糖由2’-岩藻糖基乳糖10质量份、3-岩藻糖基乳糖4质量份、乳糖-N-四糖3质量份和3’-唾液酸基乳糖2质量份组成。
另一些具体实施例中,本发明所述组合物由鼠李糖乳杆菌LGG和母乳低聚糖组成;其中鼠李糖乳杆菌LGG和母乳低聚糖的比例为1×1011CFU:5g;所述母乳低聚糖由2’-岩藻糖基乳糖9质量份、3-岩藻糖基乳糖6质量份、乳糖-N-四糖3质量份和3’-唾液酸基乳糖2质量份组成。
另一些具体实施例中,本发明所述组合物由鼠李糖乳杆菌LGG和母乳低聚糖组成;其中鼠李糖乳杆菌LGG和母乳低聚糖的比例为1×1011CFU:5g;所述母乳低聚糖由3-岩藻糖基乳糖8质量份、乳糖-N-四糖6质量份和3’-唾液酸基乳糖4质量份组成。
本发明所述的组合物在制备提高肠道免疫能力的产品中的应用。
所述提高肠道免疫能力包括:抑制致病菌吸附能力、提高跨膜电阻水平和/或抑制炎症因子水平。
一些实施例中,所述提高肠道免疫能力包括:在肠道系统中抵御致病菌侵入、提升肠道细胞的屏障作用、降低肠道细胞释放炎症因子IL-8与IP-10。
具体的,所述抑制致病菌吸附能力是指抑制致病菌ETEC作用于肠道细胞的粘附作用。所述提高跨膜电阻水平是指提高肠道细胞对致病菌ETEC的屏障作用。所述抑制炎症因子水平是指抑制致病菌ETEC作用下,肠道细胞分泌IL-8和IP-10的水平。
本发明所述提高肠道免疫能力包括提高婴幼儿的肠道免疫能力,也包括提高3岁以上儿童、青少年和/或成人的肠道免疫能力。因此,本发明所述的组合物能够应用于婴幼儿食品(例如,婴幼儿配方粉、辅食、营养补充剂),以及3岁以上儿童、青少年和成人的营养补充剂或食品中。
本发明还提供了含有所述组合物的产品。所述产品为食品或保健品。所述食品包括液体饮料、固体饮料或其他奶制品;所述保健品的剂型为口服液、片剂或胶囊。
所述液态饮料包括液态乳制品或乳饮料,所述液态乳制品包括动物基乳制品和植物基乳制品,所述动物基乳制品包括:纯奶、发酵乳、乳酸菌饮料等,所述植物基乳制品包括:豆奶、花生奶、杏仁奶等。
所述固态饮料包括乳粉;所述乳粉包括:全脂乳粉、脱脂乳粉、部分脱脂乳粉、调制乳粉或牛初乳粉;所述其他奶制品包括:炼乳、奶油、乳酪或冰淇淋。
本发明还提供了一种乳粉,其制备原料包括:生牛乳、本发明所述的组合物、乳糖、食用植物调和油、脱盐乳清粉、乳清蛋白粉、低聚半乳糖、磷脂、无水奶油、复合维生素、复合矿物质、复合氯化胆碱、二十二碳六烯酸粉、花生四烯酸油脂粉和核苷酸。
一些具体实施例中,所述乳粉的原料包括如下质量份的:
生牛乳1700份;乳糖300份;食用植物调和油200份;脱盐乳清粉175份;母乳低聚糖17份;鼠李糖乳杆菌0.09份;乳清蛋白粉50份;低聚半乳糖30份;磷脂4份;无水奶油2份;复合维生素2.5份;复合矿物质13.7份;复合氯化胆碱1份;二十二碳六烯酸粉8.6份;花生四烯酸油脂粉11份;核苷酸0.6份。
本发明所述乳粉的制备方法采用本领域的常规方法。其中,所述母乳低聚糖的组成如前所述,所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌HN001或鼠李糖乳杆菌LGG。
本发明中,所述食用植物调和油中含有1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯。所述脱盐乳清粉为脱盐乳清粉(D90)。
本发明所述的保健品的剂型为片剂、丸剂、口服液剂、胶囊剂、糖浆剂、滴丸剂或颗粒剂。其中,所述胶囊剂为硬胶囊剂或软胶囊剂。所述片剂为口服片剂或口腔片剂。所述口服片剂为普通压制片、分散片、泡腾片、咀嚼片、包衣片或缓控释片。所述保健品中可接受的辅料为水果粉、食用香精、甜味剂、酸味剂、填充剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、食用色素、稀释剂、乳化剂、崩解剂或增塑剂中的一种或两者以上的混合物。
本发明提供了含有母乳低聚糖和鼠李糖乳杆菌的组合物,该组合物中两种组分相互配合,产生增效协同作用,有效提高了肠道免疫能力。实验表明,本发明提供的组合物具有良好的抑制致病菌吸附能力、提高跨膜电阻水平和/或抑制炎症因子水平。
附图说明
图1示各受试物对致病菌ETEC作用于肠道细胞Caco-2的粘附实验结果;
图2示各受试物对跨膜电阻(TEER)的影响;
图3示在加入大肠杆菌共培养时,各受试物对肠道细胞分泌炎症因子IL-8与IP-10的影响。
具体实施方式
本发明提供了组合物及其在制备提高肠道免疫能力的产品中的应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose),为岩藻糖与乳糖形成的三糖结构,该物质经微生物发酵法制备,与人乳中发现的寡糖具有相同结构。3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose),为岩藻糖与乳糖形成的三糖结构,与2’-岩藻糖基乳糖互为同分异构体。该物质经微生物发酵法制备,与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
3’-唾液酸基乳糖(3’-sialyllactose),为唾液酸与乳糖形成的三糖结构,该物质经微生物发酵法制备,与人乳中发现的寡糖具有相同结构。6’-唾液酸基乳糖(6’-sialyllactose),为唾液酸与乳糖形成的三糖结构,与3’-唾液酸基乳糖互为同分异构体。该物质经微生物发酵法制备,与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
乳糖-N-四糖(lacto-N-tetraose),为乳糖与四糖形成的六糖结构,该物质经微生物发酵法制备,与人乳中发现的寡糖具有相同结构。
本发明采用的试材皆为普通市售品,皆可于市场购得。其中,鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)HN001菌株,由杜邦丹尼斯克公司提供受试样品。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LGG菌株,由科汉森公司提供受试样品。而作为实验参照组的嗜酸性乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM,由杜邦丹尼斯克公司提供受试样品,此外另一参照组的发酵性乳杆菌(Lactobacillusfermentum)LC40由Biosearch Life公司提供受试样品。
本发明的营养组合物可用于制备各种健康食品及保健食品等。具体地,所述食品可以为液体饮料、固体饮料、口服液、奶制品、片剂或胶囊等,例如可以是用于添加在婴幼儿食品(包括婴幼儿配方粉、辅食、营养补充剂),以及3岁以上儿童、青少年和成人的营养补充剂或食品中,具有广阔的应用前景。优选地,所述鼠李糖乳杆菌在食品中的添加量为1×103CFU/天~1×1012CFU/天,进一步优选为1×106CFU/天~1×1011CFU/天。优选地,所述鼠李糖乳杆菌在食品中的添加量为1×103CFU/天~1×1012CFU/天,进一步优选为1×106CFU/天~1×1011CFU/天。母乳低聚糖在食品中的添加量可为1mg/天~15g/天。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1组合物制备
1.实验准备步骤
1.1培养基配置与受试益生元的储存和配置
含有益生元(益生元种类参见表1)和益生菌的培养基在每次实验当天于无菌环境中新鲜配置,并预热到37℃。受试的益生元/HMOs被储存在干燥避光的室温环境中。实验中使用的浓度为5g/L。
表1益生元种类
1.2益生菌培养、生长曲线绘制与活性鉴别
涉及益生菌菌种包括:鼠李糖乳杆菌HN001、鼠李糖乳杆菌LGG、嗜酸性乳杆菌NCFM、发酵型乳杆菌LC-40。
益生菌粉在实验前以冷冻干燥的状态送到实验室。益生菌被接种到MRS-琼脂平板上,取单菌落用于16S rDNA鉴定,且用来制备甘油原液(储存在-80℃)。在每次实验前,从甘油原液中取出益生菌接种在MRS平板上,于37℃静置培养,并在实验前用MEM培养基冲洗。在益生菌受试前,用荧光激活细胞分拣系统测量益生菌活性与细胞数。实验中使用的益生菌浓度为1×108CFU/mL。
在37℃厌氧条件下培养鼠李糖乳杆菌HN001或LGG,以及作为实验参照的其他受试益生菌,比如嗜酸性乳杆菌NCFM和发酵型乳杆菌LC-40。在实验前绘制生长曲线。在收到益生菌原料并在所有实验开始前,用流式细胞仪测试益生菌株的活性。16S测序被用来测定菌株身份。在益生菌具体各项实验的受试前,用荧光激活细胞分拣系统测量益生菌活性与细胞数。
1.3不同组合益生元和益生菌的配制
组合中包括益生元和益生菌,每5mg受试益生元与1×108CFU的益生菌混合。其中益生菌为鼠李糖乳杆菌HN001、鼠李糖乳杆菌LGG、嗜酸性乳杆菌NCFM或发酵型乳杆菌LC-40。所述益生元设置如下组合,各组益生元中组分的质量比如表2:
表2母乳低聚糖中各组分质量比
2’-FL | 3-FL | LNT | 3’-SL | 6’-SL | |
Mix | 10 | 4 | 3 | 1 | 1 |
本发明试验表明,相对于缺少组分或配比不当的母乳低聚糖而言,表2所示质量比的母乳低聚糖组合物,能够与益生菌起到最佳的增效协同作用。
将益生菌菌粉与母乳低聚糖粉末按比例混合,制备获得各组组合物。或者,将益生菌与母乳低聚糖按比例以溶液重悬。
实施例2功效验证
1、实施例1各组合物对致病菌ETEC于肠道粘附实验结果
Caco-2细胞培养:从DSMZ(德国不伦瑞克)公司购得人结肠肿瘤细胞系(Caco-2),并在有5%CO2,37℃一定湿度条件下培养。第40-44代Caco-2细胞被用于实验。培养基为MEM培养基,其中添加20vol%胎牛血清(FBS),1%的非必需氨基酸,1%的Glutamax,1%的丙酮酸钠,添加或未添加1%的青霉素-链霉素溶液,以及50μg/mL的庆大霉素(均从荷兰布雷达的Invitrogen公司购得)。细胞在T75培养瓶中长到80%融合,用胰蛋白酶消化后收集细胞。
致病菌ETEC的培养:用BHI-B培养基(美国纽约默克公司)培养ETEC细胞株H10407(ATCC35401)。在37℃厌氧条件下过夜培养后,致病菌在感染前被再次培养,以达到对数中期。离心收集细胞,冲洗并在实验前用PBS再悬浮。
检测组合物对于大肠杆菌的活性的影响:与抗粘附测试平行的,将大肠杆菌(终浓度为)107CFU/mL添加到1mL受试的组合物中,并在37℃共培养1小时以测量活性。培养后,从每个样品离心收集大肠杆菌,再悬浮于PBS中,并在琼脂平板上接种。在37℃琼脂平板上培养过夜后,统计细菌的CFU菌落数以衡量致病菌吸附。统计生长中的大肠杆菌菌落数并记录为CFU/mL。结果表明,本发明提供的组合物对于大肠杆菌的活性并无抑制作用。
抗粘附测试:在24孔板上培养Caco-2细胞。在试验当天,用预热的PBS冲洗Caco-2细胞。依据添加的受试物不同,细胞被分为如下几组:
Neg.control组:阴性对照组,Caco-2细胞在培养基中仅与致病菌一起培养。
ZnO组:因被报道为可减少致病菌吸附,1mM氧化锌(ZnO)被用作阳性对照。
Mix组:以Mix作为受试物。
LGG组:以鼠李糖乳杆菌LGG为受试物,密度为1×108CFU/mL。
LGG+Mix组:受试物为鼠李糖乳杆菌LGG 1×108CFU/mL+Mix 5g/L。
HN001组:以鼠李糖乳杆菌HN001为受试物,密度为1×108CFU/mL。
HN001+Mix组:受试物为鼠李糖乳杆菌HN001 1×108CFU/mL+Mix 5g/L。
NCFM组:以嗜酸性乳杆菌NCFM为受试物,密度为1×108CFU/mL。
NCFM+Mix组:受试物为嗜酸性乳杆菌NCFM 1×108CFU/mL+Mix 5g/L。
LC40组:以发酵性乳杆菌LC40为受试物,密度为1×108CFU/mL。
LC40+Mix组:受试物为发酵性乳杆菌LC40 1×108CFU/mL+Mix 5g/L。
每组设三个平行,受试物质被加入Caco-2细胞培养体系中,培养细胞1小时。接着加入致病菌大肠杆菌ETEC,以感染倍数(MOI)50:1加入(最终浓度为107CFU/mL),与受试物质在37℃共培养1小时。在培养后,冲洗Caco-2细胞并使其裂解,未能附着于Caco-2细胞表面的致病菌将会被冲洗掉,而被裂解的细胞随着粘附在原细胞表面的致病菌被接种在固体培养基上。细胞因为被裂解掉无法在琼脂平板生长,只有致病菌能生长。在37℃,培养过夜后,统计平板上的大肠杆菌菌落数,单位为CFU/mL。
数据分析:如有可能,用三次重复(有时候可用六次重复)来进行每个单独测试的统计分析。抗粘附数据用10log转化。对于10log转化后的抗粘附数据和表皮信号传导数据用one-way ANOVA来进行统计分析。用Dunnett’s posthoc测试来鉴定受试组与阴性对照,或者用大肠杆菌刺激条件下的统计差异。p<0.05被认为有显著性差异,并用一个星号表示;两个星号表示p<0.01;三个星号表示p<0.001;四个星号表示p<0.0001。因Dunnett’sposthoc测试用了ANOVA MS Residual用作差异的pooled评估,且用了修改的显著性数值用来调整比较的数目,所以同样的结果在一个图表中可能显著,而另一个图表中可能不显著。对肠道屏障测试,用two-way ANOVA并随后采用Dunnett’s posthoc测试进行多次比较来分析组间是否有显著性差异。
检测结果:如前通过常见致腹泻菌株(ETEC)研究了益生菌和益生元组合物阻止致病菌吸附到小肠上皮细胞的保护作用。结果如图1和表3
表3组合物对致病菌作用于肠道细胞Caco-2的粘附实验结果(CFU/mL)
Neg.control | ZnO | Mix | LGG | LGG+Mix | HN001 | HN001+Mix | NCFM | NCFM+Mix | LC40 | LC40+Mix |
3750000 | 73833 | 2083333 | 766667 | 616667 | 883333 | 716667 | 1825000 | 1900000 | 483333 | 400000 |
测试前,致病菌ETEC的存活率测试发现,受试物质均不会影响致病菌的存活率,可见受试物质并不会直接杀菌。结果表明(图1),单独的母乳低聚糖组合物(图1所示Mix)对于致病菌大肠杆菌对肠道细胞Caco-2的粘附作用与阴性对照相比无显著差异,而阳性对照氧化锌可显著的降低致病菌对肠道细胞的吸附(p<0.0001)。单独的益生菌LGG对于致病菌大肠杆菌ETEC对肠道细胞Caco-2的粘附作用与阴性对照相比有显著降低(p<0.05)。但当益生元即母乳低聚糖Mix,与益生菌一同作为处理组受试物质,二者更有效地降低了致病菌ETEC吸附到肠道细胞(p<0.01),呈现出协同效应。
另一株受试的鼠李糖乳杆菌HN001也与LGG呈现出类似趋势,即益生菌与HMO混合物的组合,降低大肠杆菌粘附的效果,比单独益生菌更显著。而其他两株受试的益生菌,嗜酸性乳杆菌NCFM和发酵性乳杆菌LC40,前者无论是单独益生菌还是益生菌与HMO的组合物,都无法降低致病菌对肠道细胞的粘附,而后者虽然能降低致病菌对肠道细胞的粘附,但是益生菌与HMO的组合并未体现出比单独益生菌更优越的协同效应。
2、肠道屏障完整性测试即组合物对跨膜电阻(TEER)影响的实验结果
理想的小肠上皮屏障功能是保护宿主免受致病菌侵入和/或致病菌来源毒素的先决条件。在此研究中,体外的屏障完整性通过测定肠道细胞层的跨表皮的电阻(TEER)体现。食物成分可能具有保护感染后肠道屏障功能下降的功能(减轻感染后TEER的下降)。为了研究益生元和益生菌对于感染的作用,测定了TEER在大肠杆菌感染前和感染后随时间变化的情况。
检测方法包括:Caco-2细胞被接种到Transwell聚碳酸酯细胞培养插入物中,平均孔径为0.4μm,面积为0.33cm2直至完全分化(±1000Ω)。用世界精准仪器购入的EVOM2表皮伏特测量器测量跨上皮细胞电阻(TEER)以衡量屏障完整性。
依据添加的受试物不同,细胞被分为如下几组:
Neg.control组:阴性对照组,Caco-2细胞在培养基中仅与致病菌ETEC一起培养。
Mix组:以Mix作为受试物。
LGG组:以鼠李糖乳杆菌LGG为受试物,密度为1×108CFU/mL。
LGG+Mix组:受试物为鼠李糖乳杆菌LGG 1×108CFU/mL+Mix 5g/L。
HN001组:以鼠李糖乳杆菌HN001为受试物,密度为1×108CFU/mL。
HN001+Mix组:受试物为鼠李糖乳杆菌HN001 1×108CFU/mL+Mix5g/L。
Blank为不接触ETEC也不添加组合物的对照组。
在测试当天,细胞被冲洗,并在37℃下用不含抗生素和血清,但含有受试物质的培养基中培养1小时。紧接着加入大肠杆菌到受试物质之上(感染倍数MOI为200:1),并培养4小时。在实验开始前(t=-1),受试物质暴露1小时后及添加致病菌前(t=0),并在致病菌接触后1小时、2小时、3小时、4小时分别测定TEER。在与致病菌接触后单独条件下的TEER值与其各自在t=0时的TEER值相关,且被表述成ΔTEER(Ω.cm2)。阴性对照(只加入大肠杆菌)与未接触致病菌或受试物质的阳性对照也在实验组别中。所有条件重复测定三次,一些对照组被重复测定6次。
受试鼠李糖乳杆菌HN001和LGG有正常的生长曲线如图2。如图所示,在不同的时间点测试了受试物质对于跨膜电阻的影响,单独的母乳低聚糖组合(比例参见Mix)或益生菌LGG对于跨膜电阻TEER的下降基本无作用,与阴性对照组接近,而益生菌LGG与母乳低聚糖混合物(比例参见Mix)的组合,可在多个时间点,于一定程度上有提升跨膜电阻TEER值使其更接近空白组的趋势。类似的,单独的母乳低聚糖组合(比例参见Mix)或益生菌HN001对于跨膜电阻TEER的下降基本无作用,与阴性对照组接近,而益生菌HN001与母乳低聚糖混合物(比例参见Mix)的组合,可在多个时间点,于一定程度上有提升跨膜电阻TEER值使其更接近空白组的趋势。
3、组合物对肠道细胞分泌炎症因子IL-8与IP-10的影响
益生元和益生菌能具有免疫调节(促进或者抗炎症)作用,能增加对于感染的抵抗力或者促进肠道健康。益生元益生菌的免疫调节作用可在存在或不存在促炎症刺激的情况下,测定小肠上皮细胞的细胞因子/趋化因子产生来衡量。用大肠杆菌菌株刺激Caco-2细胞并测定上清液中IL-8和IP-10的产生,可筛选益生元和益生菌对于趋化因子/细胞因子的产生的影响。IL-8对于紧急的自身免疫反应很重要,可以导致中性粒细胞的聚集。IP-10在免疫的二级应答中很重要。它可以吸引单核细胞和巨噬细胞,也包括Th1细胞,这些对于清除感染有重要作用。促炎症的益生元和益生菌可以增加IL-8和/或IP-10的生成,而抗炎症的益生元和益生菌可以减少IL-8和/或IP-10的生成。
测试前,为了测试Caco-2细胞是否会对大肠杆菌的刺激有应答,用其他已知的炎症因子对于细胞的响应做了测试:用含有Rec TNFα(10ng/mL)以及Rec IFNγ(5ng/mL)(均从英国阿宾顿的R&D systems购入)的混合物培养液刺激细胞。刺激24小时候收集上清液并储存于-20℃。按照生产商的使用指导,用Bio-Plex试剂盒(美国加州BioRad公司)测试IL-8,IP-10。结果表明,Caco-2细胞可以对炎症因子的刺激产生响应。
接下来进行正式的检测,首先,依据添加的受试物不同,细胞被分为如下几组:
Blank组为不接触ETEC也不添加组合物的对照组。
ETEC组为仅接触ETEC的对照组。
Mix组:以Mix作为受试物。
LGG组:以鼠李糖乳杆菌LGG为受试物,密度为1×108CFU/mL。
LGG+Mix组:受试物为鼠李糖乳杆菌LGG 1×108CFU/mL+Mix 5g/L。
HN001组:以鼠李糖乳杆菌HN001为受试物,密度为1×108CFU/mL。
HN001+Mix组:受试物为鼠李糖乳杆菌HN001 1×108CFU/mL+Mix5g/L。
实验方法包括:
将Caco-2细胞在96孔板养到适合的丰度。在实验最初,用不含抗生素的培养基冲洗细胞一次。根据如上分组方式,每组设三个平行。将单层细胞与各组受试物质在37℃下在不含抗生素的培养基中共培养1小时,然后加入大肠杆菌ETEC刺激细胞(MOI 200:1)。在这1小时的培养结束后,对单层细胞与致病菌共培养的物质做如下处理:用含有受试物质和50μg/mL庆大霉素的培养液冲洗和培养过夜。作为空白对照,只用了培养液而没用大肠杆菌刺激。用大肠杆菌刺激但没用受试物质的培养液被用作大肠杆菌应答的对照。。数据统计分析方法同前,以ETEC中炎症因子水平为100,计算各组炎症因子的相对水平。结果如表4和图3:
表4
Blank | ETEC | Mix | LGG | LGG+Mix | HN001 | HN001+Mix | |
IL-8 | 4.91 | 100 | 126.50 | 17.52 | 13.84 | 43.83 | 31.62 |
IP10 | 25.56 | 100 | 85.32 | 5.83 | 5.460 | 7.96 | 5.98 |
如图3和表4所示,在与致病菌ETEC共培养的情况下,单独的母乳低聚糖混合物(比例参见Mix)并没有降低炎症因子IL-8的作用,但鼠李糖乳杆菌HN001与母乳低聚糖Mix的组合与未加入受试物质的组别ETEC相比,其释放IL-8因子的水平显著降低(p<0.0001)。且HN001与HMO混合物的组合,降低炎症因子的能力比单独的益生菌HN001更低,差异显著,体现了协同效应。类似的,鼠李糖乳杆菌LGG与母乳低聚糖Mix的组合与未加入受试物质的组别ETEC相比,其释放IL-8因子的水平也显著降低(p<0.0001)。
在另一个炎症因子IP-10的释放方面,单独的母乳低聚糖Mix有降低IP-10释放的作用(p<0.05),但与益生菌LGG或HN001形成组合物后,鼠李糖乳杆菌与Mix的组合可显著降低IP-10的水平(p<0.0001)。说明鼠李糖乳杆菌+HMOs的营养组合物对于炎症因子的释放有一定调控作用。
实施例3乳粉配方
以吨粉计:生牛乳:1700kg;乳糖:300kg;食用植物调和油(含1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯):200kg;脱盐乳清粉(D90):175kg;母乳低聚糖(其中含2’-岩藻糖基乳糖6份、3-岩藻糖基乳糖4.5份、乳糖-N-四糖3份、3’-唾液酸基乳糖1份和6’-唾液酸基乳糖1份):17kg;鼠李糖乳杆菌HN001 0.09kg;乳清蛋白粉50kg;低聚半乳糖:30kg;磷脂:4kg;无水奶油:2kg;复合维生素:2.5kg;复合矿物质:13.7kg;复合氯化胆碱:1kg;二十二碳六烯酸粉:8.6kg;花生四烯酸油脂粉:11kg;核苷酸:0.6kg。其中:复合维生素、复合矿物质、复合氯化胆碱的组成见表5~7:
表5复合维生素组成
表6复合矿物质组成
表7复合氯化胆碱组成
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.组合物,其特征在于,包括母乳低聚糖和鼠李糖乳杆菌。
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述母乳低聚糖由2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸基乳糖、6’-唾液酸基乳糖和乳糖-N-四糖中至少一种组成。
3.根据权利要求2所述的组合物,其特征在于,所述母乳低聚糖中,2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-四糖、3’-唾液酸基乳糖与6’-唾液酸基乳糖的质量比为(0~10):(4~8):(3~6):(1~4):(0~1)。
4.根据权利要求3所述的组合物,其特征在于,
所述母乳低聚糖为2’-岩藻糖基乳糖;
或者由如下质量份的组分组成:2’-岩藻糖基乳糖10份、3-岩藻糖基乳糖4份、乳糖-N-四糖3份、3’-唾液酸基乳糖1份和6’-唾液酸基乳糖1份;
或者由如下质量份的组分组成:2’-岩藻糖基乳糖6份、3-岩藻糖基乳糖4.5份、乳糖-N-四糖3份、3’-唾液酸基乳糖1份和6’-唾液酸基乳糖1份;
或者由如下质量份的组分组成:2’-岩藻糖基乳糖10份、3-岩藻糖基乳糖4份、乳糖-N-四糖3份和3’-唾液酸基乳糖2份;
或者由如下质量份的组分组成:2’-岩藻糖基乳糖9份、3-岩藻糖基乳糖6份、乳糖-N-四糖3份和3’-唾液酸基乳糖2份;
或者由如下质量份的组分组成:3-岩藻糖基乳糖8份、乳糖-N-四糖6份和3’-唾液酸基乳糖4份。
5.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌HN001或鼠李糖乳杆菌LGG。
6.根据权利要求1~5任一项所述的组合物,其特征在于,所述母乳低聚糖与鼠李糖乳杆菌的比例为5mg:(1×103CFU~1×1012CFU);优选为5mg:(1×106CFU~1×1010CFU)。
7.权利要求1~6任一项所述的组合物在制备提高肠道免疫能力的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述提高肠道免疫能力包括:抑制致病菌吸附能力、提高跨膜电阻水平和/或抑制炎症因子水平。
9.含有权利要求1~6任一项所述组合物的产品。
10.一种乳粉,其特征在于,其制备原料包括:生牛乳、权利要求1~6任一项所述的组合物、乳糖、食用植物调和油、脱盐乳清粉、乳清蛋白粉、低聚半乳糖、磷脂、无水奶油、复合维生素、复合矿物质、复合氯化胆碱、二十二碳六烯酸粉、花生四烯酸油脂粉和核苷酸。
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