CN114245746A - 用于制备包含蛋白d多肽的组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于制备免疫原性组合物的方法。更特别地，本发明涉及一种用于制备蛋白D多肽的液体组合物的方法及其在制备包含蛋白D多肽的免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物可用于治疗或预防受试者(例如人)的慢性阻塞性肺病急性加重(AECOPD)。

Description

用于制备包含蛋白D多肽的组合物的方法
技术领域
本发明涉及一种用于制备免疫原性组合物的方法。更特别地，本发明涉及一种用于制备蛋白D多肽的液体组合物的方法及其在制备包含蛋白D多肽的免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物可用于治疗或预防受试者(例如人)的慢性阻塞性肺病急性加重(AECOPD)。
发明背景
慢性阻塞性肺病(COPD)是一种慢性炎性病症，其由于吸入烟草烟雾或其它刺激物而导致肺功能的不可逆衰退。慢性阻塞性肺病(COPD)被认为涵盖几种经常共存的病症(气流阻塞、慢性支气管炎、细支气管炎或小气道疾病和肺气肿)(Wilson et al.,Eur.Respir.J.2001；17:995–1007)。患者遭受其病情加重通常与气喘增加有关，并且经常具有可能产生粘液或脓痰的咳嗽增加(Wilson,Eur Respir J 200117:995-1007)。COPD在生理学上定义为在患有慢性支气管炎和/或肺气肿的患者中存在不可逆或部分可逆的气道阻塞(慢性阻塞性肺病患者的诊断和护理标准：American Thoracic Society.Am J RespirCrit Care Med.1995Nov；152(5Pt 2):S77-121)。
COPD是全世界发病率和死亡率的主要原因。2005年，在美国20例死亡中的约一人具有COPD作为根本原因(Drugs and Aging26:985-999(2009))。据推测，在2020年，COPD将上升到残疾调整寿命年(disability adjusted life years)，慢性无效疾病的第五个主要原因，和死亡率的第三个重要原因(Lancet 349:1498-1504(1997))。COPD病程的特征在于气流受限的渐进性加重和肺功能的下降。COPD可能由于频繁和复发的急性加重(AE)而复杂化，急性加重与巨大的健康护理支出和高发病率相关(Proceedings of the AmericanThoracic Society 4:554–564(2007))。一项研究表明COPD中约50％的急性症状加重是由未分型的(non-typeable)流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginos)引起的(Drugs and Aging 26:985-999(2009))。在20-30％的COPD加重中发现流感嗜血杆菌(H.influenzae)；在10-15％的COPD加重中发现肺炎链球菌；和在10-15％的COPD加重中发现卡他莫拉菌(New England Journal of Medicine 359:2355-2365(2008))。在香港、韩国和菲律宾，流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和卡他莫拉菌已经显示是支气管炎急性加重的主要致病菌，而在其他亚洲国家/地区，包括印尼、泰国、马来西亚和台湾，克雷伯氏杆菌属(Klebsiella spp.)、铜绿假单胞菌和不动杆菌属(Acinetobacter spp.)占致病菌的一大部分(Respirology,(2011)16,532-539；doi:10.1111/j.1440.1843.2011.01943.x)。在孟加拉国，20％的患有COPD的患者对假单胞菌、克雷伯氏杆菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌显示阳性痰培养，而65％的患有AECOPD(COPD急性加重)的患者对假单胞菌、克雷伯氏杆菌、不动杆菌、肠杆菌属、卡他莫拉菌及其组合显示阳性培养(Mymensingh Medical Journal 19:576-585(2010))。然而，已经提出预防COPD加重的两个最重要的措施是主动免疫和长期维持药物治疗(Proceedings of the AmericanThoracic Society 4:554–564(2007))。
治疗和控制COPD的困难之一是该复杂疾病在严重性、进展、运动耐受性和症状性质方面的异质性(heterogeneity)。这种复杂性在COPD急性加重(AECOPD)中也是明显的，所述急性加重是需要额外的医学治疗并且经常住院的增加COPD症状的短暂且明显随机的时期(Sethi et al.,N Eng J Med 2008；359:2355-65)。已知的加重亚型由关键触发因素(包括细菌或病毒感染，和/或高嗜酸性粒细胞水平)的性质定义，并且这些事件通常用抗生素和类固醇的组合以非特异性方式处理(Bafadhel et al.,Am J Respir Crit Care Med2011；184:662)。提出将来自流感嗜血菌的蛋白D多肽与PE-PilA融合蛋白和来自卡他莫拉菌的UspA2多肽一起作为疫苗用于治疗或预防COPD急性加重(AECOPD)，如WO2015125118A1中所述。
存在用于制备免疫原性组合物的改进方法的需要。特别地，存在用于制备免疫原性组合物的改进方法以帮助维持蛋白抗原的结构和功能的需要。这些需要考虑事项包括但不限于免疫原性组合物的化学稳定性(例如，蛋白质的蛋白水解或裂解)、免疫原性组合物的物理/热稳定性(例如，聚集、沉淀、吸附)、免疫原性组合物与容器/密封系统的相容性、免疫原性组合物与非活性成分(例如，缓冲剂、盐、赋形剂、冷冻保护剂)之间的相互作用、制备方法、剂型(例如，冻干的液体)、运输、储存和处理期间遇到的环境条件(例如，温度、湿度、剪切力)以及制备与使用之间的持续时间。
一个特别的问题是在液体组合物中形成可见颗粒。颗粒的存在取决于制备方法和制备环境(设计、鉴定、证实、执行)以及生产后处理、存储条件、运输和最终用户的处理。这包括主要包装组分的选择和加工，以及制剂的设计和稳定性，特别是对于生物技术产品。欧洲和美国的监管专著要求肠胃外给药的药品分别“几乎不含”或“基本不含”可见颗粒。(Serge Mathonet et al.PDA J Pharm Sci and Tech 2016,70:392-408)。
本发明解决了对制备用于制备免疫原性组合物的蛋白D多肽的液体组合物的改进方法的需要。根据本发明，已经鉴定了蛋白质D多肽的液体组合物中的可见颗粒的外观，并且提供了提高稳定性的改进方法和包含提高稳定性的蛋白质D多肽的液体组合物。
发明简述
根据本发明，已经发现蛋白D多肽易于形成可见颗粒，特别是当蛋白D多肽保持在液体组合物中时。例如，在将包含蛋白D多肽的液体组合物与其它抗原混合之前，可以将蛋白D多肽保持在液体组合物中(作为中间存储步骤，例如当测量液体组合物中蛋白D多肽的含量时)。以前不知道D蛋白多肽易于聚集，因此观察到可见颗粒是令人惊奇的。本发明提供一种减少蛋白D多肽的可见颗粒形成的方法，因而有助于维持免疫原性组合物中蛋白抗原的结构和功能。本发明的方法包括用包含蔗糖和泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)的溶液稀释蛋白D多肽。根据本发明，已经发现将蔗糖和泊洛沙姆加入到液体蛋白D多肽组合物中减少了颗粒形成，同时稳定了蛋白D多肽的结构。
因此，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽(任选的SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)的液体组合物的方法，其中所述方法包括混合蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆。
本发明还提供一种包含蛋白D多肽、蔗糖和泊洛沙姆的液体组合物。
本发明还提供一种免疫原性组合物，其中蛋白D多肽是使用本发明的方法制备的。
本发明还提供本发明的免疫原性组合物，其用于治疗或预防受试者(例如人)的COPD急性加重(AECOPD)。
本发明还提供本发明的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防受试者(例如人)的COPD急性加重(AECOPD)的药物中的用途。
本发明还提供一种治疗处于发展COPD急性加重(AECOPD)的风险中的受试者(例如人)的COPD急性加重(AECOPD)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的免疫原性组合物。
本发明还提供一种预防处于发展COPD急性加重(AECOPD)的风险中的受试者(例如人)的COPD急性加重(AECOPD)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的免疫原性组合物。
详细说明
定义
如本文使用的“佐剂”指当与疫苗、免疫治疗剂或其它含抗原或免疫原的组合物一起施用于受试者时，增加或增强受试者对所施用的抗原或免疫原的免疫应答(与不存在佐剂时获得的免疫应答相比)的化合物或物质。
如本文使用的术语“免疫原性片段”是比整体更小的抗原的一部分，其能够在宿主动物(例如人)中引发对该片段特异性的体液和/或细胞免疫应答。因此，例如基因组序列的片段不包括基因组序列本身，蛋白质片段不包括全长蛋白质序列本身。蛋白质片段可以使用本领域已知的技术产生，例如重组、通过蛋白水解消化或通过化学合成。多肽的内部或末端片段可以通过从编码多肽的核酸的一端(对于末端片段)或两端(对于内部片段)去除一个或多个核苷酸来产生。本发明的免疫原性片段可以来源于与参考序列(例如，本发明的SEQ ID NO：1至58)具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述参考序列已经通过一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸)的缺失和/或添加和/或取代进行修饰。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。在一个方面，氨基酸取代是保守的。取代、缺失、添加或其任何组合可以在单个变体中组合，只要该变体是免疫原性多肽。例如，免疫原性片段可以通过缺失信号肽而衍生。
如本文使用的术语“保守氨基酸取代”包括用非天然残基取代天然氨基酸残基，使得对该位置的氨基酸残基的大小、极性、电荷、疏水性或亲水性几乎没有或没有影响，并且不会导致免疫原性降低。例如，这些可以是以下基团内的取代：缬氨酸、甘氨酸；甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。对多肽序列的保守氨基酸修饰(和对编码核苷酸的相应修饰)可产生具有与参照多肽类似的功能和化学特征的多肽。
如本文使用的“信号肽”指存在于前体蛋白(通常在N端)上的短的(少于60个氨基酸，例如3-60个氨基酸)多肽，并且其通常不存在于成熟蛋白中。信号肽(SP)通常富含疏水性氨基酸。信号肽指导翻译的蛋白质穿过膜的转运和/或分泌。信号肽也可以被称为靶向信号、转运肽、定位信号或信号序列。例如，信号序列可以是共翻译或翻译后信号肽。
如本文使用的“受试者”是哺乳动物，包括人、非人灵长类和非灵长类哺乳动物，例如啮齿类动物属成员(包括，但不限于小鼠和大鼠)和兔形目成员(包括但不限于兔)。在特定的实施方案中，受试者是人。
如下文进一步描述的，COPD急性加重(AECOPD)是特征在于超出正常的日常变化的患者呼吸症状恶化的急性事件。通常，AECOPD引起药物的改变。
如本文使用的术语“治疗COPD急性加重(AECOPD)”指改善、稳定、减轻或消除增加的症状，所述增加的症状是受试者(例如人)急性加重的特征。
如本文使用的短语“预防COPD急性加重(AECOPD)”指预防受试者(例如人)的将来急性加重、降低其发病率或频率、或降低其严重性(例如，气流阻塞、慢性支气管炎、细支气管炎或小气道疾病和肺气肿)。
如本文使用的术语“治疗由流感嗜血杆菌和/或卡他莫拉菌引起的疾病”指改善、稳定、减轻或消除作为受试者(例如人)的由流感嗜血杆菌和/或卡他莫拉菌引起的细菌感染的特征的症状增加。
如本文使用的短语“预防由流感嗜血杆菌和/或卡他莫拉菌引起的疾病”指预防受试者(例如人)中由流感嗜血杆菌和/或卡他莫拉菌引起的将来细菌感染、降低其发病率或频率、或降低其其严重性。
如本文使用的术语“细菌感染”指在常规培养(流感嗜血杆菌或卡他莫拉菌)或总好氧性CFU计数大于或等于107个细胞时对细菌性病原体的阳性测试。在特定的实施方案中，细菌感染与以下的有关：
a)流感嗜血杆菌(例如，未分型的流感嗜血杆菌(NTHi))；
b)卡他莫拉菌；或
c)流感嗜血杆菌(例如，未分型的流感嗜血杆菌(NTHi))和卡他莫拉菌。
在向受试者施用本发明的免疫原性组合物或疫苗的上下文中，如本文使用的，术语“有效量”指具有预防和/或治疗效果的免疫原性组合物或疫苗的量。
如本文使用的“w/v”指制剂的重量/体积。
多肽之间的同一性可以通过各种算法计算。通常，当计算同一性百分比时，将待比较的两个序列进行比对以给出序列之间的最大相关性。这可以包括在一个或两个序列中插入“缺口”，以增强比对的程度。例如，可以使用用于整体比对的Needleman Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970，J.Mol.Biol.48:443-453)或用于局部比对的Smith Waterman算法(Smith和Waterman1981，J.Mol.Biol.147:195-197)，例如使用缺省参数(SmithWaterman使用BLOSUM 62评分矩阵，缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为1)。Dufresne等在2002年的Nature Biotechnology(第20卷，第1269-71页)中描述了一种优选的算法，并且该算法用于GenePAST软件(Genome Quest Life Sciences Inc.，Boston，MA)。GenePAST“同一性百分比”算法找到查询序列和主题序列之间的最佳匹配，并将比对表达为精确的百分比。GenePAST不是基于查询序列和主题序列之间的生物学相关性的考虑进行比对评分调整。两个序列之间的同一性是在两个序列的整个长度上计算的，并表示为参考序列(例如本发明的SEQ ID NO.1至58)的百分比。对于片段，参考序列是最长的序列。
如本文使用的术语“颗粒”指“可见颗粒”和“亚可见颗粒”。在一个实施方案中，颗粒具有35至70μm的平均直径。
如本文使用的术语“可见颗粒”指在液体组合物例如水溶液中的不溶的或部分可溶的固体，其对人眼是可见的。在一个实施方案中，可见颗粒具有至少50μm的平均直径。在另一个实施方案中，可见颗粒具有50-1000μm的平均直径。在另一个实施方案中，可见颗粒具有75-1000μm的平均直径。在另一个实施方案中，可见颗粒具有100-1000μm的平均直径。在一个实施方案中，当通过欧洲药典5.0，2.9.20节所述的方法检测时，可见颗粒是可见的。如本文使用的“基本上不含可见颗粒”指根据欧洲药典5.0，2.9.20节所述方法不含可见颗粒的液体组合物。
如本文使用的“亚可见颗粒”是指通过美国药典<788>中所述的光遮蔽颗粒计数测试(Light Obscuration Particle Count Test)可检测的颗粒物质。在一个实施方案中，亚可见颗粒具有2-175μm的平均直径。在一个实施方案中，亚可见颗粒具有2-125μm的平均直径。在另一个实施方案中，亚可见颗粒具有小于50μm的平均直径。在另一个实施方案中，亚可见颗粒具有2-50μm的平均直径。
如本文使用的“稳定的”指当储存在容器或小瓶中时，在指定的时间段内不显示可见颗粒数目的显著增加的组合物。在一个实施方案中，当储存在容器或小瓶中时，所述组合物在特定的时间段内也不显示亚可见颗粒数目的显著增加。在一些实施方案中，组合物稳定至少1、2、3、4、5、6、7或14天(即，指定的时间段为至少1、2、3、4、5、6、7或14天)。
附图说明
图1:目视检查图示；-、+和++分别描绘为0、5和10。
图2:第1天，35至70微米的可见颗粒的总和：观察到蔗糖和NaCl之间显著的相互作用。
图3:第7天，35至70微米的总和：蔗糖的显著影响。
图4:第7天，35至70微米的总和：NaCl的显著影响。
图5:第7天，观察到的可见颗粒的平均值：观察到泊洛沙姆188和pH之间显著的相互作用。
图6:第7天，观察到的可见颗粒的平均值：观察到蔗糖的显著影响。
图7:优化方法的流程图：蛋白D稀释和过滤流程图(在150mM NaCl，10％w/v蔗糖，1％w/v泊洛沙姆188，磷酸盐缓冲液12.5mM PO4 3-KH2 PO4/K2HPO4，pH6.8中1mg/ml)。
图8:参考方法的流程图。
图9:Occhio颗粒计数：代表对于优化的液体组合物和参比样品，在3个时间点(1、7和14天)通过Occhio检测到的50至1000μm的颗粒的总和。
图10:对于蛋白D参照样品(在150mM NaCl中1mg/ml)由Occhio捕获的可见颗粒照片的实例。
图11:代表考虑了光遮蔽和Occhio测量的整个范围的多变量分析(PCA)。
图12:代表来自黑&白岗位进行目视检查的观察者对3个不同批次的平均得分。
图13:远UV圆二色性。
图14:远UV圆二色性差示光谱。
用于稀释蛋白D多肽的组合物
本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法。本发明是基于蔗糖和/或泊洛沙姆在稀释蛋白D多肽中以减少蛋白D多肽颗粒形成的用途。如实施例中所述，已经令人惊讶地发现，向包含蛋白D多肽的液体组合物中加入蔗糖和/或泊洛沙姆减少了液体组合物中形成的可见颗粒和亚可见颗粒的数目。将蛋白D多肽与包含蔗糖和/或泊洛沙姆的溶液混合，形成液体组合物。因此，本发明提供一种用于制备减少颗粒形成的蛋白D多肽的液体组合物的改进方法。本发明还提供一种具有改善的稳定性的蛋白D多肽的液体组合物。本发明提供一种蛋白D多肽的液体组合物，与不用蔗糖和泊洛沙姆配制的蛋白D多肽的液体组合物相比，其具有改善的稳定性。任选地，所述方法包括将蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆混合。因此，用于制备包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)的液体组合物的方法包括将蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)混合。在一个实施方案中，用于制备包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)的液体组合物的方法包括将蛋白D多肽与蔗糖、泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)和盐(例如NaCl)混合。在另一个实施方案中，用于制备包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)的液体组合物的方法包括将蛋白D多肽与蔗糖、泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)，盐(例如NaCl)和缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)混合。在另一个实施方案中，所述方法包括在将蛋白D多肽与其它抗原混合之前，将蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆混合。
蛋白D
如本文使用的“蛋白D”、和“PD”指来自流感嗜血杆菌的蛋白D。来自流感嗜血杆菌的蛋白D(PD)描述在WO91/18926和EP0594610中。来自流感嗜血杆菌的蛋白D可以是EP0594610(SEQ ID NO：1)的图9(图9a和9b，共364个氨基酸)的蛋白D序列。蛋白D多肽可以是全长蛋白D或其免疫原性片段(例如，蛋白D多肽描述在WO00/56360中)。例如，蛋白D多肽可以包含EP0594610中描述的蛋白D片段(或由其组成)，其起始于序列SSHSSNMANT(SerSerHisSerSerAsnMetAlaAsnThr)(SEQ ID NO：3)，并且缺少EP0594610的图9中的19个N-末端氨基酸，任选地添加了来自与所述蛋白D片段(348个氨基酸)(即SEQ ID NO：2)融合的NS1的三肽MDP。因此，在一个实施方案中，蛋白D多肽可包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列(或由其组成)。在一个实施方案中，蛋白D多肽不与多糖(例如来自肺炎链球菌的多糖)缀合。在一个实施方案中，蛋白D多肽不与来自肺炎链球菌的多糖缀合。在一个实施方案中，蛋白D多肽是游离蛋白(例如未缀合的)。在一个实施方案中，蛋白D多肽是未脂化的。
SEQ ID NO 1:蛋白D(364个氨基酸)
MetLysLeuLysThrLeuAlaLeuSerLeuLeuAlaAlaGlyValLeuAlaGlyCysSerSerHisSerSerAsnMetAlaAsnThrGlnMetLysSerAspLysIleIleIleAlaHisArgGlyAlaSerGlyTyrLeuProGluHisThrLeuGluSerLysAlaLeuAlaPheAlaGlnGlnAlaAspTyrLeuGluGlnAspLeuAlaMetThrLysAspGlyArgLeuValValIleHisAspHisPheLeuAspGlyLeuThrAspValAlaLysLysPheProHisArgHisArgLysAspGlyArgTyrTyrValIleAspPheThrLeuLysGluIleGlnSerLeuGluMetThrGluAsnPheGluThrLysAspGlyLysGlnAlaGlnValTyrProAsnArgPheProLeuTrpLysSerHisPheArgIleHisThrPheGluAspGluIleGluPheIleGlnGlyLeuGluLysSerThrGlyLysLysValGlyIleTyrProGluIleLysAlaProTrpPheHisHisGlnAsnGlyLysAspIleAlaAlaGluThrLeuLysValLeuLysLysTyrGlyTyrAspLysLysThrAspMetValTyrLeuGlnThrPheAspPheAsnGluLeuLysArgIleLysThrGluLeuLeuProGlnMetGlyMetAspLeuLysLeuValGlnLeuIleAlaTyrThrAspTrpLysGluThrGlnGluLysAspProLysGlyTyrTrpValAsnTyrAsnTyrAspTrpMetPheLysProGlyAlaMetAlaGluValValLysTyrAlaAspGlyValGlyProGlyTrpTyrMetLeuValAsnLysGluGluSerLysProAspAsnIleValTyrThrProLeuValLysGluLeuAlaGlnTyrAsnValGluValHisProTyrThrValArgLysAspAlaLeuProGluPhePheThrAspValAsnGlnMetTyrAspAlaLeuLeuAsnLysSerGlyAlaThrGlyValPheThrAspPheProAspThrGlyValGluPheLeuLysGlyIleLys。
SEQ ID NO:2:含有来自NS1的MDP三肽的蛋白D片段(348个氨基酸)
MetAspProSerSerHisSerSerAsnMetAlaAsnThrGlnMetLysSerAspLysIleIleIleAlaHisArgGlyAlaSerGlyTyrLeuProGluHisThrLeuGluSerLysAlaLeuAlaPheAlaGlnGlnAlaAspTyrLeuGluGlnAspLeuAlaMetThrLysAspGlyArgLeuValValIleHisAspHisPheLeuAspGlyLeuThrAspValAlaLysLysPheProHisArgHisArgLysAspGlyArgTyrTyrValIleAspPheThrLeuLysGluIleGlnSerLeuGluMetThrGluAsnPheGluThrLysAspGlyLysGlnAlaGlnValTyrProAsnArgPheProLeuTrpLysSerHisPheArgIleHisThrPheGluAspGluIleGluPheIleGlnGlyLeuGluLysSerThrGlyLysLysValGlyIleTyrProGluIleLysAlaProTrpPheHisHisGlnAsnGlyLysAspIleAlaAlaGluThrLeuLysValLeuLysLysTyrGlyTyrAspLysLysThrAspMetValTyrLeuGlnThrPheAspPheAsnGluLeuLysArgIleLysThrGluLeuLeuProGlnMetGlyMetAspLeuLysLeuValGlnLeuIleAlaTyrThrAspTrpLysGluThrGlnGluLysAspProLysGlyTyrTrpValAsnTyrAsnTyrAspTrpMetPheLysProGlyAlaMetAlaGluValValLysTyrAlaAspGlyValGlyProGlyTrpTyrMetLeuValAsnLysGluGluSerLysProAspAsnIleValTyrThrProLeuValLysGluLeuAlaGlnTyrAsnValGluValHisProTyrThrValArgLysAspAlaLeuProGluPhePheThrAspValAsnGlnMetTyrAspAlaLeuLeuAsnLysSerGlyAlaThrGlyValPheThrAspPheProAspThrGlyValGluPheLeuLysGlyIleLys。
因此，用于本发明的蛋白D多肽序列可以经修饰，例如通过截短N-末端或C-末端残基(例如，缺失N-末端19个氨基酸残基)，通过添加氨基酸残基(例如，添加三肽MDP)，或通过保守氨基酸取代。在一个实施方案中，蛋白D多肽与SEQ ID NO：1具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。蛋白D的免疫原性片段可包含SEQ ID NO：1的至少7、10、15、20、25、30或50个连续氨基酸的免疫原性片段。例如，蛋白D的免疫原性片段可以包含SEQ ID NO：1的至少7、10、15、20、25、30、50、100、200或300个连续氨基酸，SEQ ID NO：1的至多363个连续氨基酸的免疫原性片段。蛋白D多肽序列(例如，SEQ ID NO：1)可以通过一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸)的缺失和/或添加和/或取代进行修饰。所述免疫原性片段可以引发能够结合SEQ ID NO：1的抗体。在另一个实施方案中，蛋白D多肽与SEQ ID NO：2具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。蛋白D的免疫原性片段可以包含SEQ ID NO：2的至少7、10、15、20、25、30或50个连续氨基酸。例如，蛋白D的免疫原性片段可以包含SEQ ID NO：2的至少7、10、15、20、25、30、50、100、200或300个连续氨基酸，SEQ ID NO：2的至多347个连续氨基酸的免疫原性片段。蛋白D的免疫原性片段可以包含SEQ ID NO：2的100、200、300、310、320、330或340个连续氨基酸。蛋白D多肽序列(例如SEQ ID NO：2)可以通过一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸)的缺失和/或添加和/或取代进行修饰。免疫原性片段可引发能结合SEQ ID NO：2的抗体。
在一个实施方案中，所述方法包括将蛋白D多肽混合至液体组合物中蛋白D多肽的浓度为0.025至20mg/ml、0.5至10mg/ml或0.5至1mg/ml。特别地，蛋白D多肽的浓度可以是0.5mg/ml或1mg/ml。为了达到这些目标浓度，可以通过合适的技术，例如RP-UPLC分析蛋白D多肽的含量，并相应地稀释。
蔗糖
本发明部分基于蔗糖在蛋白D多肽的液体制剂中减少颗粒形成的用途。在一个实施方案中，所述方法包括将蛋白D多肽与蔗糖混合至浓度为5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)蔗糖。特别地，蔗糖的浓度可以为5％、10％、15％或20％(w/v)。为了达到这些目标浓度，在稀释过程中应当使用更高浓度的蔗糖溶液。例如，为了达到浓度为10％(w/v)蔗糖，15.75％(w/v)的蔗糖溶液可以与蛋白D多肽混合，但是本领域技术人员应当理解变化是可能的。在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽(例如，SEQID NO：2的蛋白D多肽)的液体组合物的方法，其中所述方法包括将蛋白D多肽与包含蔗糖的溶液混合。在另一个实施方案中，所述方法包括将蛋白D多肽与包含蔗糖的溶液混合至浓度为例如5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)。
泊洛沙姆
本发明部分基于泊洛沙姆在蛋白D多肽的液体制剂中减少颗粒形成的用途。泊洛沙姆是由聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链侧接两个聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链组成的非离子三嵌段线性共聚物。聚合物的长度可以变化。泊洛沙姆的分子量可以在7,500至15,000或7,500至10,000的范围内。合适地，泊洛沙姆选自泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407。在一个实施方案中，泊洛沙姆为泊洛沙姆188(PX188)。
Figure BDA0003496582780000131
泊洛沙姆188具有7680至9510Da的分子量。Khan等(European Journal ofPharmaceutics and Biopharmaceutics，97(2015)60-67)一般性地描述了非离子表面活性剂在治疗制剂中的应用。
在一个实施方案中，所述方法包括将蛋白D多肽与泊洛沙姆混合至浓度为0.1至1％(w/v)或0.5至1％(w/v)泊洛沙姆。特别地，泊洛沙姆的浓度可以为0.5％或1％(w/v)。为了达到这些目标浓度，在稀释过程中应当使用更高浓度的泊洛沙姆溶液。例如，为了达到1％泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)的浓度，10％泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)的溶液可以与蛋白D多肽混合，但是本领域技术人员应当理解变化是可能的。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)的液体组合物的方法，其中所述方法包括混合蛋白D多肽与包含泊洛沙姆的溶液，例如至浓度为0.1至1％(w/v)、0.5至1％(w/v)或1％(w/v)。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)的液体组合物的方法，其中所述方法包括混合蛋白D多肽与包含蔗糖和泊洛沙姆的溶液。在另一个实施方案中，所述方法包括混合蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖，例如至浓度为5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)，和(b)泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)，例如至浓度为0.1至1％(w/v)、0.5至1％(w/v)或1％(w/v)。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其中所述方法包括混合蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖至浓度为5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)，和(b)泊洛沙姆(任选泊洛沙姆188)至浓度为0.1至1％(w/v)、0.5至1％(w/v)或1％(w/v)。
盐
如实施例中所述，已经发现，向包含蛋白D多肽的液体组合物中加入盐也减少了液体组合物中形成的颗粒的数目(基于35至70微米的总和)。在一个实施方案中，用于制备包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)的液体组合物的方法包括混合蛋白D多肽与蔗糖、泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)和盐(例如NaCl)。因此，在一个实施方案中，将蛋白D多肽与蔗糖、泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)和盐(例如NaCl)混合。盐可以是例如氯化钠、氯化钙或磷酸钠。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含NaCl(氯化钠)。
可以加入盐(例如NaCl)至浓度为1至200mM，合适地为10至200mM、50至200mM、100至200mM或125至1755mM。特别地，盐(例如NaCl)的浓度可以为150mM。为了达到这些目标浓度，在稀释过程中应当使用较高浓度的盐(例如NaCl)溶液。例如，为了达到150mM盐(例如NaCl)的浓度，1160mM的盐(例如NaCl)的溶液可以与蛋白D多肽混合，但是本领域技术人员应当理解变化是可能的。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽(任选地，SEQ IDNO：2的蛋白D多肽)的液体组合物的方法，其中所述方法包括混合蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖、(b)泊洛沙姆(任选地，泊洛沙姆188)和(c)盐(任选地，NaCl)。在另一个实施方案中，所述方法包括混合蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖，例如至浓度为5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)，和(b)泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，例如至浓度为0.1至1％(w/v)、0.5至1％(w/v)或1％(w/v)，和(c)盐，例如NaCl。
缓冲液
在另一个实施方案中，用于制备包含蛋白D多肽(例如SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)的液体组合物的方法包括混合蛋白D多肽与蔗糖、泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)、盐(例如NaCl)和缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)。在一个实施方案中，所述缓冲液具有约3.5至约7.5的pKa。在一些实施方案中，缓冲液是磷酸盐、琥珀酸盐、组氨酸或柠檬酸盐缓冲液。在某些实施方案中，缓冲液是磷酸盐缓冲液，合适地是磷酸钾(例如KH2PO4/K2HPO4)。
缓冲液可以加入至浓度为5至50mM，合适地为10至40mM、10至30mM、10至20mM或10至15mM。特别地，缓冲液的浓度可以是10.5mM、11.0mM、11.5mM、12.0mM、12.5mM、13.0mM、13.5mM、14.5mM或15.0mM。为了达到这些目标浓度，在稀释过程中应当使用较高浓度的缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)溶液。例如，为了达到12.5mM缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)的浓度，100mM的缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)的溶液可以与蛋白D多肽混合，但是本领域技术人员应当理解变化是可能的。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽(任选地，SEQ IDNO：2的蛋白D多肽)的液体组合物的方法，其中所述方法包括混合蛋白D多肽包含以下的溶液：(a)蔗糖、(b)泊洛沙姆(任选地，泊洛沙姆188)，(c)盐(任选地，NaCl)，和(d)缓冲液(任选地，磷酸盐缓冲液)。在另一个实施方案中，所述方法包括混合蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖，例如至浓度为5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)，和(b)泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，例如至浓度为0.1至1％(w/v)、0.5至1％(w/v)或1％(w/v)，和(c)盐，例如NaCl，和(d)缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。
pH
在一个实施方案中，可以将液体组合物的pH调节至pH 5.5至8.5、pH 6.0至8.0、pH6.4至7.7、pH 6.4至7.4、pH 6.4至6.9、pH 6.5至7.7、pH 6.5至7.4、pH 6.5至6.9、pH 6.8至7.7、pH 6.8至7.4或pH6.8至6.9。特别地，本发明的液体组合物的pH可以调节至pH6.4、pH6.5、pH6.6、pH6.7、pH6.8、pH6.9、pH7.0、pH7.1、pH7.2、pH7.3、pH7.4、pH7.5、pH7.6或pH7.7。为了达到目标pH，在稀释过程中可以使用较高pH的溶液。调节pH以达到目标pH在本领域技术人员的范围内。例如，为了达到pH6.8，可以将pH6.9的溶液与包含蛋白D多肽的液体组合物混合，但是本领域技术人员应当理解变化是可能的。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽(任选地，SEQ IDNO：2的蛋白D多肽)的液体组合物的方法，其中所述方法包括混合蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖、(b)泊洛沙姆(任选地，泊洛沙姆188)，(c)盐(任选地，NaCl)，和(d)缓冲液(任选地，磷酸盐缓冲液)，以达到pH 6.4至7.7，例如pH6.8。在另一个实施方案中，所述方法包括混合蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖，例如至浓度为5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)，和(b)泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，例如至浓度为0.1至1％(w/v)、0.5至1％(w/v)或1％(w/v)，和(c)盐，例如NaCl，和(d)缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)，以达到pH 6.4至7.7，例如pH6.8。
解冻蛋白D多肽
蛋白D多肽通常以冷冻形式(例如在-45℃，pH6.8)储存，并且必须在配制前解冻。解冻是从冷冻状态到液态或半液态的变化。本发明的方法合适地包括解冻蛋白D多肽。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：(i)解冻蛋白D多肽，和(ii)混合所述蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆。这形成了包含蛋白D多肽的液体组合物。在另一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：(i)解冻所述蛋白D多肽，和(ii)混合所述蛋白D多肽与蔗糖、泊洛沙姆和盐。在另一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：(i)解冻蛋白D多肽，和(ii)混合所述蛋白D多肽与蔗糖、泊洛沙姆、盐和缓冲液。在另一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：(i)解冻蛋白D多肽，和(ii)混合所述蛋白D多肽与：(a)蔗糖，例如至浓度为5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)和(b)泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，例如至浓度为0.1至1％(w/v)、0.5至1％(w/v)或1％(w/v)。在另一个实施方案中，步骤(ii)包括混合蛋白D多肽与：(a)蔗糖，例如至浓度为5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)，和(b)泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，例如至浓度为0.1至1％(w/v)、0.5至1％(w/v)或1％(w/v)，和(c)盐，例如NaCl。在另一个实施方案中，步骤(ii)包括混合蛋白D多肽与：(a)蔗糖，例如至浓度为5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)，和(b)泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，例如至浓度为0.1至1％(w/v)、0.5至1％(w/v)或1％(w/v)，和(c)盐，例如NaCl，和(d)缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。在一个实施方案中，进行步骤(ii)以达到pH6.4至7.7，合适地pH6.8(即，混合后组合物的pH)。
步骤(i)和(ii)可以同时或顺序进行。在一个实施方案中，步骤(i)和(ii)同时发生。在另一个实施方案中，步骤(i)和(ii)顺序发生，步骤(i)之后是步骤(ii)。例如，步骤(i)可以通过升高蛋白D多肽的温度，例如通过升高大气温度来进行。合适地，步骤(i)静态进行。合适地，步骤(i)在培养箱中进行。在一个实施方案中，步骤(i)在1至35℃下进行。例如，步骤(i)可以在2至35℃、10至35℃、20至35℃、2至30℃、10至30℃、20至30℃、2至25℃或23至27℃下进行。特别地，步骤(i)可以在室温下进行，例如25℃下进行。在一个实施方案中，步骤(i)在1至35℃，例如在2至35℃，或10至35℃，或15至30℃下，合适地在室温(例如25℃)下进行。在一个实施方式中，步骤(i)在1至35℃下进行，接着是步骤(ii)。
步骤(i)也可包括蛋白D多肽的均质化。在一个实施方案中，步骤(i)包括解冻蛋白D多肽并均质化。例如，蛋白D多肽可以通过以100至200RPM，例如150RPM搅拌(例如，用磁棒)均质化，合适地搅拌5至10分钟，例如5分钟。
步骤(ii)包括混合蛋白D多肽与：(a)蔗糖，例如至浓度为5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)，和(b)泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，例如至浓度为0.1至1％(w/v)、0.5至1％(w/v)或1％(w/v)。在一个实施方案中，步骤(ii)将蛋白D多肽在液体组合物中稀释至所需浓度(如本领域技术人员确定的)。在一个实施方案中，步骤(ii)包括搅拌，任选地在2至25℃。例如，所述方法包括混合蛋白质D多肽至液体组合物中蛋白质D多肽的浓度为0.025至20mg/ml、0.5至10mg/ml或0.5至1mg/ml。特别地，蛋白D多肽的浓度可以为0.5mg/ml或1mg/ml。在混合前，可以通过移液管或量筒玻璃加入包含蔗糖和泊洛沙姆(和任选的盐和缓冲剂)的溶液。在一个实施方案中，单独加入蔗糖和泊洛沙姆(和任选的盐和缓冲剂)的单独溶液。在另一个实施方案中，同时加入蔗糖和泊洛沙姆(和任选的盐和缓冲剂)的单独溶液。在另一个实施方案中，加入蔗糖和泊洛沙姆(和任选的盐和缓冲剂)的单一(组合)溶液。
因此，如本文使用的术语“溶液”指单独的溶液或单一(组合)溶液。例如，在用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法中，其中所述方法包括混合蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖和(b)泊洛沙姆，(a)蔗糖和(b)泊洛沙姆的单独溶液可以与蛋白D多肽混合，或者蔗糖和泊洛沙姆的单一(组合)溶液可以与蛋白D多肽混合。合适地，可以混合(a)蔗糖和(b)泊洛沙姆的单一(组合)溶液与蛋白D多肽。例如，在用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法中，其中所述方法包括混合蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖，(b)泊洛沙姆和(c)盐，(a)蔗糖、(b)泊洛沙姆和(c)盐的单独溶液可以与蛋白D多肽混合，或者蔗糖、泊洛沙姆和盐的单一(组合)溶液可以与蛋白D多肽混合。合适地，可以将(a)蔗糖、(b)泊洛沙姆和(c)盐的单一(组合)溶液与蛋白D多肽混合。例如，在用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法中，其中所述方法包括混合蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖，(b)泊洛沙姆，(c)盐，和(d)缓冲液，(a)蔗糖、(b)泊洛沙姆、(c)盐和(d)缓冲液的单独溶液可以与蛋白D多肽混合，或者蔗糖、泊洛沙姆、盐和缓冲液的单一(组合)溶液可以与蛋白D多肽混合。合适地，(a)蔗糖、(b)泊洛沙姆、(c)盐和(D)缓冲液的单一(组合)溶液可以与蛋白D多肽混合。
过滤
在一个实施方案中，本发明的方法包括过滤蛋白D多肽液体组合物。因此，本发明提供用于制备包含如上所述蛋白D多肽的液体组合物的方法，随后包括过滤步骤，例如使用0.22μm PVDF膜。合适地，过滤从蛋白D多肽的液体组合物中减少或除去蛋白D多肽的颗粒。在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其包括步骤(i)和(ii)，随后包括过滤步骤(任选地使用0.22μmPVDF膜)，以获得在滤液中包含蛋白D多肽的液体组合物。例如，蛋白D多肽可以通过使用
Figure BDA0003496582780000191
47过滤器(0.22μm
Figure BDA0003496582780000192
PVDF膜17.7cm2-聚丙烯柱)和蠕动泵(流速0.7ml/min/cm2)过滤。也可以使用本领域技术人员已知的其它合适的膜，例如PES(聚醚砜)、纤维素。因此，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其在混合蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆的步骤之后包括过滤步骤(任选地使用0.22μm PVDF膜)以获得在滤液中包含蛋白D多肽的液体组合物。因此，本发明的方法可以包括以下步骤(以连续顺序)：(i)解冻蛋白D多肽，和(ii)混合所述蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆，随后进行过滤步骤。
储存
本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，所述液体组合物减少蛋白D多肽可见颗粒(和任选的亚可见颗粒)的形成，特别是在储存期间(蛋白D多肽保持在液体组合物中的时间段)。因此，本发明提供用于制备包含如上所述蛋白D多肽的液体组合物的方法，随后包括储存包含蛋白D多肽的液体组合物的步骤。在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其包括步骤(i)和(ii)(任选地过滤)，随后包括储存包含蛋白D多肽的液体组合物的步骤。合适地，包含蛋白D多肽的液体组合物储存至少1天、至少7天或至少14天。在一些实施方案中，将包含蛋白D多肽的液体组合物储存至少1、2、3、4、5、6、7或14天。例如，包含蛋白D多肽的液体组合物可以储存至少1天，合适地至多7天(例如1至7天之间)，或至多14天(例如1至14天之间)。本发明的液体组合物可以储存在+2至+8℃下。在作为液体组合物储存期间，可以测量液体组合物中蛋白质D多肽的含量。因此，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其在混合蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆的步骤(和任选地过滤步骤)之后包括储存包含蛋白D多肽的液体组合物的步骤。因此，本发明的方法可以包括以下步骤(以连续顺序)：(i)解冻蛋白D多肽，(ii)混合所述蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆(以及任选地过滤步骤)，和(iii)储存包含所述蛋白D多肽的液体组合物。
用于减少颗粒蛋白D多肽颗粒的形成的方法
本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其减少了液体组合物中蛋白D多肽颗粒的形成。特别地，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其减少了蛋白D多肽可见颗粒的形成。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其减少了蛋白D多肽可见和亚可见的颗粒的形成。本发明还提供一种减少液体组合物中蛋白D多肽微粒形成的方法，所述方法包括本发明的方法。本发明还提供一种用于制备稳定的包含蛋白D多肽的液体组合物的方法。在一个实施方案中，当液体组合物储存至少1天时，所述方法减少蛋白质D多肽可见颗粒(和任选的，亚可见的颗粒)的形成。在另一个实施方案中，当液体组合物储存至少7天时，所述方法减少蛋白质D多肽可见颗粒(和任选的，亚可见的颗粒)的形成。在另一个实施方案中，当液体组合物储存至少14天时，所述方法减少蛋白质D多肽可见颗粒(和任选的，亚可见的颗粒)的形成。
组合物中可见颗粒的检测可以通过本领域普通技术人员认为合适的任何技术来确定。例如，可见颗粒可以通过欧洲药典5.0，2.9.20节中规定的方法检测。组合物中的亚可见颗粒的检测可以通过本领域普通技术人员认为合适的任何技术来确定。例如，可见颗粒可以通过如美国药典<788>中所述的光遮蔽颗粒数测试来检测。
在一个实施方案中，与没有向蛋白D多肽组合物中加入蔗糖和泊洛沙姆的方法相比，本发明的方法减少了蛋白D多肽可见颗粒(和任选的，亚可见颗粒)的形成。在一个实施方式中，与没有向包含蛋白D多肽的液体组合物中加入蔗糖和泊洛沙姆的方法相比，本发明的方法在包含蛋白D多肽的液体组合物的后续储存期间减少蛋白D多肽可见颗粒(和任选的，亚可见的颗粒)的形成至少1、2、3、4、5、6、7或14天。如本文使用的“可见颗粒”指液体组合物(例如，水溶液)中不溶的或部分可溶的固体，其是人眼可见的。在一个实施方案中，可见颗粒具有的平均直径为至少50μm。在另一个实施方案中，可见颗粒具有的平均直径为50-1000μm。在另一个实施方案中，可见颗粒具有的平均直径为75-1000μm。在一个实施方案中，可见颗粒具有的平均直径为100-1000μm。在一个实施方案中，当通过欧洲药典5.0，2.9.20节所述的方法检测时，可见颗粒是可见的。如本文使用的“亚可见颗粒”指通过美国药典<788>中所述的光遮蔽颗粒计数测试可检测的颗粒物质。在一个实施方案中，亚可见颗粒具有的平均直径为2-175μm。在另一个实施方案中，亚可见颗粒具有的平均直径为2-125μm。在另一个实施方案中，亚可见颗粒具有的平均直径小于50μm。在另一个实施方案中，亚可见颗粒具有的平均直径为2-50μm。
混合包含蛋白D多肽的液体组合物与其它抗原
本发明提供一种用于制备包含如上所述蛋白D多肽的液体组合物，和随后包括混合包含蛋白D多肽的液体组合物与其它抗原的步骤的方法。在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其包括步骤(i)、(ii)和(iii)，并且随后包括步骤：(iv)混合含有蛋白D多肽的滤液与其它抗原。在一个实施方案中，其它抗原包括来自流感嗜血杆菌的蛋白E或其免疫原性片段、来自流感嗜血杆菌的PilA或其免疫原性片段和UspA2多肽。在另一个实施方案中，其它抗原包含PE-PilA融合蛋白和UspA2多肽。该液体组合物可用于制备免疫原性组合物。因此，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其在混合蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆的步骤(和任选地，过滤步骤)和储存包含蛋白D多肽的液体组合物的步骤之后，包括混合包含蛋白D多肽的液体组合物与其它抗原混合的步骤。因此，本发明的方法可以包括以下步骤(以连续顺序)：(i)解冻蛋白D多肽，(ii)混合所述蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆(以及任选地，过滤步骤)，(iii)储存包含所述蛋白D多肽的液体组合物，以及(iv)混合包含所述蛋白D多肽的液体组合物与其他抗原。
蛋白E
蛋白E(PE)是一种具有粘附性质的外膜脂蛋白。其在未分型的流感嗜血杆菌(NTHi)对上皮细胞的粘附/侵入中起作用。(J.Immunology183:2593-2601(2009)；TheJournal of Infectious Diseases 199:522-531(2009),Microbes and Infection 10:87-96(2008))。其在包囊的流感嗜血杆菌和未分型的流感嗜血杆菌中都是高度保守的，并且具有保守的上皮结合结构域(The Journal of Infectious Diseases 201:414-419(2010))。当与作为参照菌株的流感嗜血杆菌Rd比较时，在不同的嗜血杆菌种中描述了十三个不同的点突变。在对数生长期和稳定期细菌中都观察到其表达。(WO2007/084053)。蛋白E还通过结合玻连蛋白参与人补体抗性。(Immunology183:2593-2601(2009))。PE结合玻连蛋白，玻连蛋白是末端补体途径的重要抑制剂。(J.Immunology 183:2593-2601(2009))。
如本文使用的“蛋白E”、“prot E”和“PE”指来自流感嗜血杆菌的蛋白E。蛋白E可包含SEQ ID NO：4(对应于WO2012/139225A1的SEQ ID NO：4)的氨基酸序列(或由其组成)：(MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDAVVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTLYNAAQIICAN YGEAFSVDKK)。
在特定的实施方案中，来自流感嗜血杆菌的蛋白E或其免疫原性片段合适地与SEQID NO：4具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一个实施方案中，来自流感嗜血杆菌的蛋白E是免疫原性片段。在另一个实施方案中，来自流感嗜血杆菌的蛋白E的免疫原性片段合适地与SEQ ID NO：4具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。例如，蛋白E的免疫原性片段可以包含SEQ ID NO：4的至少7、10、15、20、25、30或50个连续氨基酸。例如，蛋白E的免疫原性片段可以包含SEQ ID NO：4的至少7、10、15、20、25、30、50、100或150个连续氨基酸，SEQ ID NO：4的至多159个连续氨基酸。免疫原性片段可引发能结合SEQ ID NO：4的抗体。
在另一个实施方案中，来自流感嗜血杆菌的蛋白E或其免疫原性片段与SEQ IDNO：5(对应于WO2012/139225A1的SEQ ID NO：125)具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性：
SEQ ID NO:5：蛋白E的氨基酸20-160
I QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYVYPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICANYGEAFSVDKK。
在一个实施方案中，来自流感嗜血杆菌的蛋白E的免疫原性片段合适地与SEQ IDNO：5(对应于WO2012/139225A1的SEQ ID NO：125)具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、9125％、95％、96％、97％、98％或100％的同一性。在另一个实施方案中，来自流感嗜血杆菌的蛋白E的免疫原性片段包含SEQ ID NO：5对应于(WO2012/139225A1的SEQ IDNO：125)的氨基酸序列(或由其组成)。
PilA
Pilin A(PilA)可能是参与蹭行运动的IV型流感嗜血杆菌Pilus(Tfp)的主要菌毛蛋白亚基(Infection and Immunity，73:1635-1643(2005))。NTHi PilA是一种体内表达的保守粘附素。已显示其参与NTHi粘附、定植和生物膜形成(Molecular Microbiology 65:1288-1299(2007))。
如本文使用的“PilA”指来自流感嗜血杆菌的菌毛蛋白A。PilA可包含SEQ ID NO：6(对应于WO2012/139225A1的SEQ ID NO：58)的蛋白质序列(或由其组成)：(MKLTTQQTLKKGFTLIELMI VIAIIAILAT IAIPSYQNYT KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIAADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ)。
在特定的实施方案中，来自流感嗜血杆菌的PilA或其免疫原性片段合适地与SEQID NO：6具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、96％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一个实施方案中，来自流感嗜血杆菌的PilA是免疫原性片段。在另一个实施方案中，来自流感嗜血杆菌的PilA的免疫原性片段合适地与SEQ ID NO:6具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、96％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。例如，PilA的免疫原性片段可以包含SEQ ID NO:6的至少7、10、15、20、25、30或50个连续氨基酸。例如，PilA的免疫原性片段可以包含SEQ ID NO:6的至少7、10、15、20、25、30、50、100或150个连续氨基酸，SEQ ID NO：6的至多148个连续氨基酸。免疫原性片段可引发能结合SEQ ID NO：：6的抗体。
在另一个实施方案中，来自流感嗜血杆菌的PilA或其免疫原性片段与SEQ ID NO：7(对应于WO2012/139225A1的SEQ ID NO：127)具有至少70％、80％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、97％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性：
SEQ ID NO：7来自流感嗜血杆菌菌株86-028NP的PilA的氨基酸40-149
T KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAITVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ。
在另一个实施方案中，PilA的免疫原性片段合适地与SEQ ID NO：7(对应于WO2012/139225A1的SEQ ID NO：127)具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在另一个实施方案中，来自流感嗜血杆菌的PilA的免疫原性片段包含SEQ ID NO：7(对应于WO2012/139225A1的SEQ ID NO：127)的氨基酸序列(或由其组成)。
PE-PilA融合蛋白
来自流感嗜血杆菌的蛋白E或其免疫原性片段和来自流感嗜血杆菌的PilA或其免疫原性片段可以作为融合蛋白存在。因此，来自流感嗜血杆菌的蛋白E或其免疫原性片段和来自流感嗜血杆菌的PilA或其免疫原性片段作为融合蛋白存在。合适地，融合蛋白可以包含在融合蛋白(PE-PilA融合蛋白)的N-末端的来自流感嗜血杆菌的蛋白E或其免疫原性片段和在C-末端的来自流感嗜血杆菌的PilA或其的免疫原性片段。特别地，PE-PilA融合蛋白可以包含在N末端的来自流感嗜血杆菌的免疫原性片段蛋白E和在C末端的来自流感嗜血杆菌的免疫原性片段PilA。在一个实施方案中，PE-PilA融合蛋白与SEQ ID NO：8(LVL-735，对应于WO2012/139225A1的SEQ ID NO：194)具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
SEQ ID NO:8:LVL735(蛋白)：(pelB sp)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40-149):
Figure BDA0003496582780000261
在一个实施方案中，PE-PilA融合蛋白包含SEQ ID NO：8(LVL-735，对应于WO2012/139225A1的SEQ ID NO：194)的氨基酸序列(或由其组成)。
在另一个实施方案中，PE-PilA融合蛋白与SEQ ID NO：9(LVL-735，其中信号肽已被除去，对应于WO2012/139225A1的SEQ ID NO：219)具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
SEQ ID NO:9：无信号肽的PE-PilA融合蛋白
Figure BDA0003496582780000262
在一个实施方案中，PE-PilA融合蛋白包含SEQ ID NO：9(LVL-735，其中信号肽已被除去，对应于WO2012/139225A1的SEQ ID NO：219)的氨基酸序列(或由其组成)。
蛋白E(PE)和菌毛蛋白A(PilA)的免疫原性片段的免疫原性可以如WO2012/139225A1中所述进行测量。
UspA2
遍在表面蛋白A2(UspA2)是在电子显微照片中以棒棒糖共享结构出现的三聚体自转运蛋白(Hoiczyk等，EMBO J.19:5989-5999(2000))。其由N-末端头部、随后的以两亲性螺旋终止的茎和C-末端膜结构域构成。(Hoiczyk et al.EMBO J.19:5989-5999(2000))。UspA2含有一个非常保守的结构域(Aebi等，Infection&Immunity 65(11)4367-4377(1997))，其被单克隆抗体识别，所述单克隆抗体在小鼠卡他莫拉菌攻击模型中被动转移时显示出保护性(Helminnen et al.J Infect Dis.170(4):867-72(1994))。已经表明UspA2与宿主结构和细胞外基质蛋白如纤连蛋白(Tan等，J Infect Dis.192(6)：1029-38(2005))和层粘连蛋白(Tan等，J Infect Dis.194(4)：493-7(2006))相互作用，表明其可以在卡他莫拉菌感染的早期起作用。UspA2似乎还参与卡他莫拉菌抵抗正常人血清的杀菌活性的能力。(Attia AS et al.Infect Immun 73(4):2400-2410(2005))。其(i)结合补体抑制剂C4bp，使卡他莫拉菌能够抑制经典的补体系统，(ii)通过从血清吸收C3防止替代补体途径的激活，和(iii)通过结合补体调节蛋白玻连蛋白干扰补体系统膜攻击复合体(MAC)的末期。(de Vries et al.,Microbiol Mol Biol Rev.73(3):389-406(2009))。
如本文使用的“UspA2”指卡他莫拉菌的遍在表面蛋白A2。UspA2可包含来自ATCC25238的SEQ ID NO：10(对应于WO2015/125118A1的SEQ ID NO：1)的氨基酸序列(或由其组成)：
MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT
ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE
AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD
FGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSG
RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA
NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA
LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN
IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL
ITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK
VNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAA
LGGYGSKSAVAIGAGYRV
NPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF(SEQ ID NO:10)。以及在全长上与SEQ ID NO：10具有至少或恰好63％、66％、70％、72％、74％、75％、77％、80％、84％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的序列。
UspA2多肽可以是全长UspA2或其免疫原性片段。在特定的实施方案中，UspA2多肽与SEQ ID NO：10具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在另一个实施方案中，UspA2多肽是来自卡他莫拉菌的UspA2的免疫原性片段，其与SEQ ID NO：10具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。例如，UspA2的免疫原性片段可以包含SEQ IDNO：10的至少7、10、15、20、25、30或50个连续氨基酸。例如，UspA2的免疫原性片段可以包含SEQ ID NO：10的至少7、10、15、20、25、30、50、100、200、300、400、500或600个连续氨基酸，SEQ ID NO：10的至多629个连续氨基酸。所述免疫原性片段可引发能结合SEQ ID NO：10的抗体。
如SEQ ID NO：10中描述的UspA2含有信号肽(例如，SEQ ID NO：10的氨基酸1至29)、层粘连蛋白结合结构域(例如，SEQ ID NO：10的氨基酸30至177)、纤连蛋白结合结构域(例如，SEQ ID NO：10的氨基酸165至318)(Tan等，JID 192:1029-38(2005))、C3结合结构域(例如，SEQ ID NO：10的氨基酸30至539(WO2007/018463)、或SEQ ID NO：10的氨基酸30至539的片段，例如，SEQ ID NO：1的氨基酸165至318(
Figure BDA0003496582780000291
T等，J.Immunol.186:3120-3129(2011))、两亲性螺旋(例如，SEQ ID NO：10的氨基酸519至564或SEQ ID NO：10的氨基酸520-559，使用不同的预测方法鉴定)和C端锚结构域(例如，SEQ ID NO：10的氨基酸576至630)(Brooks等，Infection&Immunity，76(11)，5330-5340(2008))。在一个实施方案中，UspA2多肽含有层粘连蛋白结合结构域和纤连蛋白结合结构域。在另一个实施方案中，UspA2的免疫原性片段含有层粘连蛋白结合结构域、纤连蛋白结合结构域和C3结合结构域。在一个进一步的实施方案中，UspA2多肽含有层粘连蛋白结合结构域、纤连蛋白结合结构域、C3结合结构域和两亲性螺旋。
已经描述了用于各种卡他莫拉菌种的UspA2氨基酸差异。参见例如，JBacteriology 181(13):4026-34(1999),Infection and Immunity76(11):5330-40(2008)和PLoS One 7(9):e45452(2012)。UspA2多肽可以包含在选自以下的任一个或多个氨基酸处不同于SEQ ID NO：10的氨基酸序列(或由其组成)：AA(氨基酸)30-298、AA 299-302、AA303-333、AA 334-339、AA 349、AA 352-354、AA 368-403、AA 441、AA 451-471、AA 472、AA474-483、AA 487、AA 490、AA 493、AA 529、AA 532或AA 543。UspA2多肽可以包含不同于SEQID NO：10的氨基酸序列(或由其组成)，其中与SEQ ID NO：10相比其含有氨基酸插入。UspA2可以包含在SEQ ID NO：22至SEQ ID NO：58中任一个氨基酸差异处不同于SEQ ID NO：10的氨基酸序列(或由其组成)。例如，SEQ ID NO：10在第70位氨基酸处可以含有K而不是Q，在第135位氨基酸处可以含有Q而不是G，和/或在第216位氨基酸处可以含有D而不是N。
UspA2可以为来自下述的UspA2：卡他莫拉菌菌株ATCC(US注册商标)25238TM、American 2933、American 2912、American 2908、Finnish 307、Finnish 353、Finnish358、Finnish 216、Dutch H2、Dutch F10、Norwegian 1、Norwegian 13、Norwegian 20、Norwegian 25、Norwegian 27、Norwegian 36、BC5SV、Norwegian 14、Norwegian 3、Finish414、Japanese Z7476、Belgium Z7530、German Z8063、American O12E、Greek MC317、American V1122、American P44、American V1171、American TTA24、American O35E、American SP12-6、American SP12-5、Swedish BC5、American 7169、Finnish FIN2344、American V1118、American V1145或American V1156。UspA2可以是如SEQ ID NO：10或SEQID NO：22-SEQ ID NO：38中任一所示的UspA2。UspA2可以是来自另一个来源的UspA2，其对应于SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：22-SEQ ID NO：58中任一的UspA2序列。相应的UspA2序列可以由本领域技术人员使用各种算法来确定。例如，GAP程序或Needle程序可以用于确定对应于SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：22-SEQ ID NO：58中的任一个的UspA2序列。
UspA2可以是在全长上与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：22-SEQ ID NO：58中的任一个具有至少95％同一性的序列。在特定的实施方案中，UspA2可以是如选自下述的氨基酸序列中所述的序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：22至SEQID NO：58的任何子集。
UspA2的免疫原性片段包含下述的免疫原性片段：SEQ ID NO:10的至少450个连续氨基酸、SEQ ID NO：10的490个连续氨基酸(例如，MC-004或MC-005的UspA2片段)、SEQ IDNO：10的511个连续氨基酸(例如，构建体MC-001、MC-002、MC-003或MC-004的UspA2片段)、SEQ ID NO：10的534个连续氨基酸(例如，MC-009或MC-011的UspA2片段)或SEQ ID NO：10的535个连续氨基酸(例如，MC-007、MC-008或MC-010的UspA2片段)。免疫原性片段可引发能结合SEQ ID NO：10的抗体。
UspA2的免疫原性片段可以包含SEQ ID NO：10的至少450、490、511、534或535个连续氨基酸的免疫原性片段。例如，UspA2的免疫原性片段可以包含SEQ ID NO：10的至少450、490、511、534或535个连续氨基酸，SEQ ID NO：10的至多629个氨基酸的免疫原性片段。UspA2的免疫原性片段可以包含UspA2的免疫原性片段，例如UspA2构建体MC-001(SEQ IDNO：11)、MC-002(SEQ ID NO:12)、MC-003(SEQ ID NO:13)、MC-004(SEQ ID NO:14)、MC-005(SEQ ID NO:15)、MC-006(SEQ ID NO:16)、MC-007(SEQ ID NO:17)、MC-008(SEQ ID NO:18)、MC-009(SEQ ID NO:19)、MC-010(SEQ ID NO:20)或MC-011(SEQ ID NO:21)中的任一种。免疫原性片段可引发可结合所述片段来源于其的全长序列的抗体。
在另一个实施方案中，UspA2多肽与选自下述的多肽具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或100％的同一性：MC-001(SEQ ID NO:11)、MC-002(SEQ ID NO:12)、MC-003(SEQ ID NO:13)、MC-004(SEQ ID NO:14)、MC-005(SEQID NO:15)、MC-006(SEQ ID NO:16)、MC-007(SEQ ID NO:17)、MC-008(SEQ ID NO:18)、MC-009(SEQ ID NO:19)、MC-010(SEQ ID NO:20)或MC-011(SEQ ID NO:21)。例如，UspA2多肽与MC009 SEQ ID NO：19(对应于WO2015/125118A1的SEQ ID NO：69)具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
SEQ ID NO:19MC-009(蛋白)–(M)(UspA2 31-564)(HH)
MAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAAHH。
在一个实施方案中，UspA2多肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列(对应于WO2015/125118A1的SEQ ID NO：69)(或由其组成)。
UspA2多肽的免疫原性可以如WO2015/125118A1中所述测量。
冷冻干燥
可以随后将根据本发明方法制备的蛋白D多肽的液体组合物冷冻干燥。因此，本发明提供了一种方法，其包括制备包含如上所述的蛋白D多肽的液体组合物，随后冷冻干燥包含蛋白D多肽的液体组合物。在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其包括步骤(i)、(ii)、(iii)、(iv)，并且随后包括以下步骤：(v)冷冻干燥包含蛋白D多肽的液体组合物。“冷冻干燥”指将悬浮液冷冻，然后通过升华除去水的方法。升华是物质物理性质的变化，其中物质中的溶剂(例如水)直接从固体(冷冻)状态变为气态而不会变成液体。冷冻干燥是一种低温脱水方法，其包括将制剂(例如水性制剂)冷冻至低于三相点(材料的固相、液相和气相可以共存的最低温度)，降低压力并在初次干燥步骤中通过升华除去冰(固体溶剂)，并在二次干燥步骤中除去剩余的水。在干燥之前可以任选地使用退火以通过升高和降低温度来增加冰晶的尺寸。冻干通常用于疫苗制造。在一个实施方案中，免疫原性组合物是冻干的。冻干是在产品冷冻并放置在真空下之后从产品中除去水的过程，允许冰直接从固体变成蒸汽而不会通过液相。
在一个实施方案中，使用以下步骤进行冻干：
-冷冻步骤(低于三相点)
-任选地，退火步骤
-初次干燥步骤
-二次干燥步骤。
冻干在称为低温浓缩的过程中提高制剂组分的浓度。
因此，本发明提供一种用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其在混合蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆的步骤(和任选地，过滤步骤)、储存包含蛋白D多肽的液体组合物的步骤和混合包含蛋白D多肽的液体组合物与其它抗原混合的步骤之后，包括冷冻干燥包含蛋白D多肽的液体组合物。因此，本发明的方法可以包括以下步骤(以连续顺序)：(i)解冻蛋白D多肽，(ii)混合所述蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆(以及任选地，过滤步骤)，(iii)储存包含所述蛋白D多肽的液体组合物，(iv)混合包含所述蛋白D多肽的液体组合物与其他抗原，以及(v)冷冻干燥包含所述蛋白D多肽的液体组合物。
蛋白D多肽的液体组合物
本发明提供一种液体组合物，其包含蛋白D多肽(任选地，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(任选地或，泊洛沙姆188)。在一个实施方案中，本发明提供一种液体组合物，其包含任选地0.025至20mg/ml、0.5至10mg/ml、0.5至1mg/ml或1mg/ml的量的蛋白D多肽(例如SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)；任选地5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)的量的蔗糖；和任选地0.1至1％(w/v)、0.5至1％(w/v)或1％(w/v)的量的泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。在另一个实施方案中，本发明提供一种液体组合物，其包含任选地0.025至20mg/ml、0.5至10mg/ml、0.5至1mg/ml或1mg/ml的量的蛋白D多肽(任选地，SEQ IDNO：2的蛋白D多肽)；任选地5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)的量的蔗糖；任选地0.1至1％(w/v)、0.5至1％(w/v)或1％(w/v)的量的泊洛沙姆(任选地，泊洛沙姆188)；和盐(任选地，NaCl)。在另一个实施方案中，本发明提供一种液体组合物，其包含任选地0.025至20mg/ml、0.5至10mg/ml、0.5至1mg/ml或1mg/ml的量的蛋白D多肽(任选地，SEQ IDNO：2的蛋白D多肽)；任选地5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)的量的蔗糖；任选地0.1至1％(w/v)、0.5至1％(w/v)或1％(w/v)的量的泊洛沙姆(任选地，泊洛沙姆188)；缓冲液(任选地，磷酸盐缓冲液)；和盐(任选地，NaCl)。
可以将上述用量范围的蛋白D多肽、蔗糖和泊洛沙姆组合。例如，本发明提供一种包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)的液体组合物，其包含：0.025-20mg/ml的量的蛋白D多肽；5至20％(w/v)的量的蔗糖；0.1至1％(w/v)的量的泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。例如，本发明提供一种包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)的液体组合物，其包含：0.5-10mg/ml的量的蛋白D多肽；5至20％(w/v)的量的蔗糖；0.1至1％(w/v)的量的泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。例如，本发明提供一种包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)的液体组合物，其包含：0.025至20mg/ml的量的蛋白D多肽；10至20％(w/v)的量的蔗糖；0.1至1％(w/v)的量的泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。例如，本发明提供一种包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)的液体组合物，其包含：0.5至10mg/ml的量的蛋白D多肽；10至20％(w/v)的量的蔗糖；0.5至1％(w/v)的量的泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。例如，本发明提供一种包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)的液体组合物，其包含：0.5至1mg/ml的量的蛋白D多肽；10至15％(w/v)的量的蔗糖；0.5至1％(w/v)的量的泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)。例如，本发明提供一种包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)的液体组合物，其包含：0.025至20mg/ml的量的蛋白D多肽；5至20％(w/v)的量的蔗糖；0.1至1％(w/v)的量的泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。例如，本发明提供一种包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)的液体组合物，其包含：0.5至10mg/ml的量的蛋白D多肽；5至20％(w/v)的量的蔗糖；0.1至1％(w/v)的量的泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。例如，本发明提供一种包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)的液体组合物，其包含：0.025至20mg/ml的量的蛋白D多肽；10至20％(w/v)的量的蔗糖；0.1至1％(w/v)的量的泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。例如，本发明提供一种包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)的液体组合物，其包含：0.5至10mg/ml的量的蛋白D多肽；10至20％(w/v)的量的蔗糖；0.5至1％(w/v)的量的泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。例如，本发明提供一种包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)的液体组合物，其包含：0.5至1mg/ml的量的蛋白D多肽；10至15％(w/v)的量的蔗糖；0.5至1％(w/v)的量的泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。例如，本发明提供一种包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)的液体组合物，其包含：0.025至20mg/ml的量的蛋白D多肽；5至20％(w/v)的量的蔗糖；0.1至1％(w/v)的量的泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)和盐(例如，NaCl)。例如，本发明提供一种包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)的液体组合物，其包含：0.5至10mg/ml的量的蛋白D多肽；5至20％(w/v)的量的蔗糖；0.1至1％(w/v)的量的泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)和盐(例如，NaCl)。例如，本发明提供一种包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)的液体组合物，其包含：0.025至20mg/ml的量的蛋白D多肽；10至20％(w/v)的量的蔗糖；0.1至1％(w/v)的量的泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)和盐(例如，NaCl)。例如，本发明提供一种包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)的液体组合物，其包含：0.5至10mg/ml的量的蛋白D多肽；10至20％(w/v)的量的蔗糖；0.5至1％(w/v)的量的泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)和盐(例如，NaCl)。例如，本发明提供一种包含蛋白D多肽(例如，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)的液体组合物，其包含：0.5至1mg/ml的10的蛋白D多肽；10至15％(w/v)的里量的蔗糖；0.5至1％(w/v)的量的泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)，缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)和盐(例如，NaCl)。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含通过本发明方法制备的蛋白D多肽(例如SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)和蔗糖的液体组合物。在一个实施方案中，本发明提供一种包含稳定的蛋白D多肽的液体组合物。合适地，包含蛋白D多肽的液体组合物稳定至少1天、至少7天或至少14天。在一些实施方案中，包含蛋白D多肽的液体组合物稳定至少1、2、3、4、5、6、7或14天。例如，包含蛋白D多肽的液体组合物可以稳定至少1天，合适地至多7天(例如1至7天之间)，或至多14天(例如1至14天之间)。在一个实施方案中，本发明提供一种包含蛋白D多肽、泊洛沙姆和蔗糖的液体组合物，当作为液体组合物保存至少1、2、3、4、5、6、7或14天时，与包含蛋白D多肽而不含泊洛沙姆且不含蔗糖的液体组合物相比，其具有更少的可见颗粒。
在一个实施方案中，包含本发明的蛋白D多肽的液体组合物不含可见颗粒。在一个实施方案中，当作为液体组合物维持至少1天时，包含本发明的蛋白D多肽的液体组合物不含可见颗粒。在一个实施方案中，当作为液体组合物维持至少7天时，包含本发明的蛋白D多肽的液体组合物不含可见颗粒。在一个实施方案中，当作为液体组合物保存至少14天时，包含本发明的蛋白D多肽的液体组合物不含可见颗粒。例如，当作为液体组合物维持至少1天，合适地至多7天(例如1至7天之间)，或至多14天(例如1至14天之间)时，包含蛋白D多肽的液体组合物不含可见颗粒。在一个实施方案中，根据流式照相机(Occhio)颗粒计数(如本文所述)，包含本发明的蛋白D多肽的液体组合物含有少于100个在50至1000μm尺寸范围内的颗粒。在一个实施方案中，当作为液体组合物维持至少1天时，包含蛋白D多肽的液体组合物含有少于100个根据Occhio颗粒计数在50至1000μm尺寸范围内的颗粒。在一个实施方案中，当以液体组合物维持至少7天时，包含蛋白D多肽的液体组合物含有少于100个根据Occhio颗粒计数在50至1000μm尺寸范围内的颗粒。在一个实施方案中，当以液体组合物维持至少14天时，包含蛋白D多肽的液体组合物含有少于100个根据Occhio颗粒计数在50至1000μm尺寸范围内的颗粒。在一个实施方案中，当以液体组合物维持至少1天，合适地至多7天(例如1-7天)或至多14天(例如1-14天)时，包含蛋白D多肽的液体组合物含有少于100个根据Occhio颗粒计数在50至1000μm尺寸范围内的颗粒。
用途以及治疗和预防的方法
本发明还提供一种免疫原性组合物，其中蛋白D多肽是使用本发明的方法制备的。所述免疫原性组合物还可以包含来自流感嗜血菌的蛋白E或其免疫原性片段、来自流感嗜血菌的PilA或其免疫原性片段和来自卡他莫拉菌的UspA2多肽。在另一个实施方案中，免疫原性组合物可以进一步包含PE-PilA融合蛋白和UspA2多肽。所述免疫原性组合物可用于治疗或预防由流感嗜血杆菌和/或卡他莫拉菌引起的疾病或用于治疗或预防受试者(例如人)的COPD急性加重(AECOPD)的用途。
本发明的免疫原性组合物可以进一步包含可药用佐剂。合适的佐剂包括铝盐，例如氢氧化铝凝胶或磷酸铝或明矾，但也可以是钙、镁、铁或锌的盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生的糖或聚磷腈的不溶性悬浮液。在特定的实施方案中，蛋白抗原可以被吸附到磷酸铝上。在另一个实施方案中，蛋白抗原可以被吸附到氢氧化铝上。促进主要Th1应答的合适佐剂系统还包括：脂质A、单磷酰脂质A(MPL)或其衍生物，特别是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)的无毒衍生物(其制备参见GB2220211A)；和单磷酰脂质A，例如3-脱氧-酰化单磷酰脂质A，与铝盐(例如磷酸铝或氢氧化铝)或水包油乳液的混合物。在这些组合中，抗原和3D-MPL包含在相同的颗粒结构中，从而允许更有效地递送抗原和免疫刺激信号。研究表明3D-MPL能进一步增强吸附明矾的抗原的免疫原性(Tholen等，Vaccine(1998)16:708-14；EP689454-B1)。例如，可药用佐剂可以是AS01。AS01是一种含有MPL(3-O-脱酰基-4'-单磷酰脂质A)、QS21((Quillaja saponaria Molina，级分21)Antigenics，New York，NY，USA)和脂质体的佐剂系统。AS01B是一种含有MPL、QS21和脂质体(50μg MPL和50μg QS21)的佐剂系统。AS01E是一种含有MPL、QS21和脂质体(25μg MPL和25μg QS21)的佐剂系统。本发明的免疫原性组合物或疫苗可包含AS01，例如AS01B或AS01E。
因此，本发明提供一种用于治疗或预防由流感嗜血杆菌和/或卡他莫拉菌引起的疾病的免疫原性组合物。本发明还提供本发明的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防由流感嗜血菌和/或卡他莫拉菌引起的疾病的药物中的用途。另外，本发明提供一种用于治疗或预防处于风险中的受试者(例如人)的由流感嗜血杆菌和/或卡他莫拉菌引起的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的免疫原性组合物。另外，本发明提供一种预防由处于风险中的受试者(例如人)的流感嗜血杆菌和/或卡他莫拉菌引起的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的免疫原性组合物。另外，本发明提供一种治疗由处于风险中的受试者(例如人)的流感嗜血杆菌和/或卡他莫拉菌引起的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的免疫原性组合物。另外，本发明提供一种诱导对受试者(例如人)的流感嗜血杆菌和/或卡他莫拉菌的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的免疫原性组合物。
本发明提供本发明的免疫原性组合物，用于治疗或预防受试者(例如人)的COPD急性加重(AECOPD)。本发明还提供本发明的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防COPD急性加重(AECOPD)的药物中的用途。此外，本发明提供一种治疗或预防处于发展COPD急性加重(AECOPD)的风险的受试者(例如人)中COPD急性加重(AECOPD)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的免疫原性组合物。此外，本发明提供一种预防处于发展COPD急性加重(AECOPD)的风险的受试者(例如人)中COPD急性加重(AECOPD)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的免疫原性组合物。此外，本发明提供一种治疗处于发展COPD急性加重(AECOPD)的风险的受试者(例如人)中COPD急性加重(AECOPD)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的免疫原性组合物。
慢性阻塞性肺病(COPD)是特征在于肺气流的长期阻塞的肺病，肺气流的长期阻塞干扰正常呼吸并且不是完全可逆的。COPD诊断通过称为肺活量测定法的简单测试来确认，肺活量测定法测量人可以呼吸多深以及空气可以多快地移入和移出肺。在具有咳嗽、痰液产生或呼吸困难(呼吸困难或吃力)症状和/或暴露于疾病危险因素史的任何患者中应当考虑这样的诊断。在肺活量测定不可用的情况下，应当使用所有可用的工具进行COPD的诊断。临床症状和体征，例如呼吸短促异常和用力呼气时间增加，可以用于帮助诊断。低峰值流量与COPD一致，但可能不是COPD特异性的，因为其可能由其它肺部疾病和由测试期间的不良表现引起。慢性咳嗽和痰液产生通常在气流受限发展之前出现多年，尽管不是所有咳嗽和痰液产生的个体都继续发展为COPD。
COPD急性加重(AECOPD)是特征在于患者呼吸症状恶化超过正常的日常变化的急性事件。通常AECOPD导致药物的改变。急性加重和共病导致个体COPD患者的总体疾病严重性。COPD急性加重(AECOPD)是一种急性事件，其特征在于患者呼吸症状的恶化超过正常的日常变化并导致药物的改变[Perez AC,Murphy TF.Potential impact of a Moraxellacatarrhalis vaccine in COPD.Vaccine.2017]。AECOPD增加发病率和死亡率，导致肺功能的下降更快，功能状态更差[Sapey E,Stockley RA.COPD exacerbations.2:aetiology.Thorax.2006；61(3):250-8)]。已知肺定殖有不同种类的细菌[Erb-DownwardJR,et al.PLoS One.2011；6(2):e16384 and Wilkinson TMA,et al.Thorax.2017；72(10):919-27]。在COPD患者中，新细菌菌株的采集被认为是AECOPD的重要原因[Sethi S,etal.N Engl J Med.2002；347(7):465-71]。尽管估计值变化很大，但是未分型的流感嗜血菌(NTHi)似乎是与AECOPD(11-38％)相关的主要细菌病原体，其次是卡他莫拉菌(3-25％)和肺炎链球菌(4-9％)[Alamoudi OS.et al.Respirology.2007；12(2):283-7,Bandi V,etal.FEMS Immunol Med Microbiol.2003；37(1):69-75,Beasley V,et al.Int JChronObstruct Pulmon Dis.2012；7:555-69]。
在一个实施方案中，慢性阻塞性肺病急性加重(AECOPD)与受试者中的细菌感染有关，例如流感嗜血杆菌(例如未分型的流感嗜血杆菌(NTHi))和/或卡他莫拉氏菌的细菌感染。在另一个实施方案中，细菌感染存在于受试者(例如人)的肺中。在另一个实施方案中，受试者(例如人)处于发展由细菌感染引起的慢性阻塞性肺病急性加重(AECOPD)的风险中。
呈递
在某些实施方案中，免疫原性组合物包含在容器工具例如小瓶或注射器内，包括预填充注射器。在某些实施例中，容器工具是硅化的。当本发明的免疫原性组合物在小瓶中呈递时，小瓶合适地由玻璃或塑料材料制成。优选在将组合物加入小瓶之前对小瓶进行灭菌。小瓶可以包括单剂量疫苗，或者其可以包括多于一个剂量(“多剂量”小瓶)，例如10个剂量。当使用多剂量小瓶时，应当在严格的无菌条件下用无菌针和注射器抽取每个剂量，小心避免污染小瓶内容物。小瓶可具有盖子(例如，Luer锁)，其适于使得预填充的注射器可插入盖子中，注射器的内容物可被挤出到小瓶中(例如，用于重构其中的冻干材料)，并且小瓶的内容物可被移回注射器中。在从小瓶中移除注射器之后，然后可以连接针头，并且可以将组合物施用给患者。盖子优选地位于密封件或盖内部，使得在可以进入该盖子之前必须移除该密封件或盖。
本发明的免疫原性组合物可适于通过适当途径，例如通过肌内途径施用。
在另一个实施方案中，本发明提供一种包含本发明的免疫原性组合物的疫苗。
本发明的实施方案在随后编号的段落中进一步描述：
1.一种用于制备包含蛋白D多肽(任选的SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)的液体组合物的方法，其中所述方法包括混合蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆。
2.根据段落1用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其中所述方法包括在混合蛋白D多肽与其它抗原之前，混合蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆。
3.根据段落1或段落2的用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其中所述方法包括混合蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖至浓度为5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)，和(b)泊洛沙姆(任选泊洛沙姆188)至浓度为0.1至1％(w/v)、0.5至1％(w/v)或1％(w/v)。
4.根据段落1至3中任一项用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其中所述方法包括混合蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖、(b)泊洛沙姆(任选地，泊洛沙姆188)和(c)盐(任选地，NaCl)。
5.根据段落1至3中任一项用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其中所述方法包括混合蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖、(b)泊洛沙姆(任选地，泊洛沙姆188)，(c)盐(任选地，NaCl)，和(d)缓冲液(任选地，磷酸盐缓冲液)。
6.根据段落1至3中任一项用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其中所述方法包括混合蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖、(b)泊洛沙姆(任选地，泊洛沙姆188)，(c)盐(任选地，NaCl)，和(d)缓冲液(任选地，磷酸盐缓冲液)，以达到pH6.4至7.7(例如pH6.8)。
7.一种用于制备包含根据段落1至6中任一项的蛋白D多肽的液体组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：(i)解冻所述蛋白D多肽，和(ii)混合蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆。
8.根据段落1至7中任一项用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其随后包括过滤步骤(任选地使用0.22μm PVDF膜)，以获得在滤液中包含蛋白D多肽的液体组合物。
9.根据段落1至8中任一项用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，随后包括储存包含蛋白D多肽的液体组合物的步骤。
10.根据段落1至9中任一项用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，随后包括混合包含蛋白D多肽的液体组合物与其它抗原的步骤。
11.根据段落10用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其中所述其它抗原包含PE-PilA融合蛋白和UspA2多肽。
12.根据段落1至11中任一项用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其减少了蛋白D多肽可见颗粒的形成。
13.一种方法，其包括根据段落1至12中任一项的方法制备包含蛋白D多肽的液体组合物，随后冷冻干燥所述包含蛋白D多肽的液体组合物。
14.一种液体组合物，其包含蛋白D多肽(任选地，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(任选地，泊洛沙姆188)。
15.根据段落14的液体组合物，其包含任选地0.025至20mg/ml、0.5至10mg/ml、0.5至1mg/ml或1mg/ml的量的蛋白D多肽(任选地，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)；任选地5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)的量的蔗糖；任选地0.1至1％(w/v)、0.5至1％(w/v)或1％(w/v)的量的泊洛沙姆(任选地，泊洛沙姆188)；缓冲液(任选地，磷酸盐缓冲液)；和盐(任选地，NaCl)。
为了更好地理解本发明，给出以下实施例。这些实施例仅用于说明的目的，不应当被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
分析技术
光遮蔽
光遮蔽是药典(Ph.Eur.2.9.19和USP(美国药典)<788>)中列出的用于分析肠胃外产品中的亚可见颗粒的药典选择方法。颗粒尺寸的检测范围在2和175μm之间。需要体积为约5ml。为了确保通过光遮蔽检测到的颗粒不是来自培养基，在第1天通过光遮蔽以其最大浓度分析培养基，即10％蔗糖、泊洛沙姆188 1％、NaCl 150mM和PO4缓冲液12.5mM。使用的设备是APS-2000(Automated Parenteral Sampling System)
APSS-2000的硬件组件由两个中心组件组成：
·粒子计数器模型
Figure BDA0003496582780000431
E20P
·注射器采样器模型SLS-1000
LiQuilaz-E20P颗粒计数器使用消光来测量和分类颗粒。当粒子穿过光源(激光二极管)时，其产生光的瞬间遮蔽。这种光的遮蔽被转换成电信号，其可以与瞬态粒子的尺寸直接相关。使用预设算法，可以定义粒子的分布。使用注射器采样器以预定且固定的流速将样品拉过光学室。
用于分析的参数是：
·1毫升样品分析4次(共4毫升)(将第一次测量弃掉)
·流速10ml/min
Occhio
Occhio是一种新兴技术，其被开发用于监测、测量和可视化亚可见微粒和可见微粒。其将数字显微术、微流体学和图像处理集成到单个仪器中，用于自动分析悬浮在液体中的颗粒或细胞。其通过在样品通过流动池的感测区时从样品捕获图像来操作。分析每个图像中的每个颗粒以产生颗粒计数、尺寸、透明度和形态(或形状)的数据库。为了立即进行视觉验证，图像被实时显示在系统监视器上。颗粒尺寸的检测范围在0.4和1000μm之间。测试约2ml的体积。选择Occhio(IPAC2)分析纤维聚集体，采用优化的以下主要参数硬件配置：
-400μm池
-1ml注射器
-4x变焦
通过RP UPLC测定蛋白D含量
通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)方法，使用Zorbax300SBC34.6x50mm3.5μm柱，保护柱4.6x12.5mm与设定在215nm的UV检测器偶联，评价特异性抗原含量。在约9分钟时洗脱蛋白D。
圆二色性(CD)光谱
FAR-UV CD：基于左旋圆偏振光(L-CPL)和右旋圆偏振光(R-CPL)的吸收的差异计算的椭圆率(mdeg)在200和265nm之间测量，其对应于肽连接的吸收区域。因此，获得的信号与抗原的二级结构组成如α-螺旋和β折叠有关。FAR-UV CD用于检测二级结构(α螺旋，β折叠…)的修饰。
Near-UV CD：需要检测与芳香族氨基酸的环境变化相关的蛋白质三级结构的修饰。
ATR-FTIR
ATR-FTIR方法是基于反射率。将IR辐射导向与样品接触的具有高折射率的晶体。光束在被引导到检测器之前在晶体内被反射。当光束撞击反射表面时，它被部分吸收，并且记录入射光束。
蛋白质的红外光谱含有来自肽酰胺基的贡献，称为酰胺I、II等…和来自氨基酸侧链的相对较弱的贡献。酰胺II带(1550-1450cm-1)主要归属为肽键的δN-H。在1700-1600cm-1中，酰胺I带，归属于肽键的υC＝O，迄今为止对蛋白质二级结构最敏感。因为存在于每个二级结构内的氢键的强度是不同的，所以每个二级结构在酰胺I区域内的不同波长处吸收。已经基于理论和实验数据指定了每个二级结构的频率极限(Goormaghtigh et al,2006,Evaluation of the Information Content in Infrared Spectra for ProteinSecondary Structure Determination；Biophysical Journal,90(8)2946–2957)：α-螺旋1662-1645cm-1，β-折叠1689-1682cm-1，无规1644-1637cm-1和β-转角1682-1662。
固有荧光
蛋白质的荧光发射(A.U.)与其芳香族氨基酸含量有关，主要与色氨酸和酪氨酸残基的贡献有关。将获得的信号与这些发色团的更大或更小的极性环境关联，从而与它们在蛋白质中的位置关联。然后，荧光光谱形状以其最大值与蛋白质的三级结构相关。
实施例1：赋形剂的筛选及其对液体储存期间颗粒形成的影响(部分1)
研究目标是鉴定对2-8℃下液态蛋白质D的胶体稳定性具有积极影响的赋形剂和/或参数。进行全面析因筛选研究以便确定对可见颗粒的外观具有正面或负面影响的参数。研究的参数为：
-蛋白D浓度(2个水平)
o 0.5mg/ml
o 1mg/ml
-pH(2个水平)
o 6.8
o 7.7
-蔗糖的存在(2个水平)
o 0％m/v蔗糖
o 10％m/v蔗糖
-泊洛沙姆188的存在(2个水平)
o 0％
o 0.5％
-NaCl的存在(2个水平)
o 0mM
o 150mM
将冷冻的蛋白D在25℃下于培养箱中解冻(1h30)。解冻后，将蛋白D在150mM NaCl中稀释至20mg/ml，然后在0.22μm Millipore MillexTM无菌针筒式过滤器(SLGV033RS)上过滤。然后，用
Figure BDA0003496582780000461
制定37种条件。这些条件对应于全析因研究(32个样品，参见表1)，具有另外3次的中心点(0.75mg/ml蛋白质D，75mM NaCl，5％蔗糖，0.25％泊洛沙姆188和pH7.4)和2次的实际过程(1mg/ml PD，在150mM NaCl中)。在PEN玻璃容器(未硅化)中进行配制(每次配制2×10ml)。将两个PEN容器合并在单个Duran Schott容器(未硅化的)(20ml)中，在2-8℃下储存不同的时间点(1天、7天、14天和21天)。
对于时间点7天和14天，将没有可见颗粒的对照加入到光遮蔽测量中。这个对照是当天期间过滤的参照(实际过程：在150mM NaCl中1mg/ml的蛋白D)。21天后，没有分析不含可见颗粒的对照，因为在时间点7天和14天产生了足够的数据。
目视检查
所有的目视检查都是由同一人在每个时间点(第1、7、14和21天)进行的(参见表1)。目视检查在实验室中进行，而不是在黑白目视检查站中进行。目的是定义允许减少或消除可见颗粒(±50μm)出现的条件。
表1：在四个时间点(T1天、T7天、T14天和T21天)进行目视检查。-指没有颗粒，+指几乎没有颗粒，++指大量颗粒(这种分类是进行目视检查的人鉴别的)
Figure BDA0003496582780000471
Figure BDA0003496582780000481
如上表1所看到的，在2/8℃下储存24小时后，一些样品中存在可见颗粒。在2/8℃下储存7天后，仅20％的样品不含可见的颗粒。对于时间点14天和21天，目视检查在100％的样品中检测到可见颗粒。对于所有样品，观察到绒毛数量随时间推移增加。
进行统计分析，并对目视检查进行分级(＝0，+＝5和++＝10)。基于该分级，描述了目视检查(参见图1)。进行该统计分析以确认目测观察。如在下图1中可见，图左侧的值(不含泊洛沙姆188的样品)总是大于右侧的值(含有0.5％泊洛沙姆188的样品)。基于目前的目视检查结果，泊洛沙姆188似乎具有影响。在目视检查中没有蔗糖或NaCl影响的明确证据。
光遮蔽
在每个时间点(T1天、7天、14天和21天)进行光遮蔽测量。在生成数据之后，进行两个决策以用于数据的统计分析。第一种是仅考虑大于35μm的颗粒(肉眼可见50μm的颗粒)。第二个是将可见颗粒加和。这个决定有助于标准化数据。
在第1天，观察到单独的蔗糖和单独的NaCl的显著效果(参见图2)：与没有NaCl和没有蔗糖相比，在加入蔗糖(有或没有NaCl)或加入NaCl的情况下观察到较少可见的颗粒。除了蔗糖之外NaCl的存在不会对可见颗粒的减少带来更大的影响。
在第7天，观察到蔗糖和NaCl的显著作用(参见图3和图4)。对于两者，在它们的存在下观察到较少可见的颗粒。
结论：
该评价证明：
·根据可见颗粒的光遮蔽结果(基于35-70微米的总和)，加入NaCl是有利的。
·根据可见颗粒的光遮蔽结果(基于35-70微米的总和)，加入10％m/v的蔗糖是有利的。
·对于蛋白D浓度在0.5至1mg/ml之间没有观察到影响。
·对于0％m/v至0.5％m/v之间的泊洛沙姆188，从光遮蔽结果观察到对亚可见的颗粒(小于25微米)的影响，但对可见颗粒没有影响。然而，泊洛沙姆188可能具有来自目视检查的影响。
·由于理论和测量的pH之间的差异，对于pH而言没有可学习的经验。
实施例2：赋形剂的筛选及其对液体储存期间颗粒形成的影响(部分2)
在本研究中，对2批蛋白D研究了以下参数：
-pH(2个水平)
o 6,4
o 7,4
-蔗糖(2个水平)
o 10％m/v蔗糖
o 20％m/v蔗糖
-泊洛沙姆188(2个水平)
o 0％
o 1％
-NaCl(1个水平)
o 150mM
-蛋白D浓度(1个水平)
o 1mg/ml
将两批冷冻的蛋白D在25℃(空气)下于培养箱中解冻(1h30)。解冻后，将蛋白D在150mM NaCl中稀释至20mg/ml，然后在0.22μm Millipore MillexTM无菌针筒式滤器(SLGV033RS)上过滤。然后，通过使用Tecan机器人由
Figure BDA0003496582780000501
制定28种条件。
表2：除了6个面中心点和2次目前过程之外，DoE全析因(在150mM NaCl中1mg/ml PD)
Figure BDA0003496582780000502
Figure BDA0003496582780000511
目视检查
所有的目视检查都是在黑白目视检查站(仅使用黑色背景)中由五人进行1天时间点，由七人进行7天和14天时间点。所有样品使用5个水平的等级(0、-、+、++&+++)进行分类。分别为无颗粒、少许颗粒、一些颗粒、许多颗粒和大量颗粒。进行统计分析，并对目视检查进行分级(0＝0、-＝1、+＝2、++＝3和+++＝4)。
如实施例1，在2/8℃下储存24h后，一些样品中存在可见颗粒。对于所有样品，观察到可见颗粒的数量随时间推移增加。进行统计分析，并对目视检查进行分级(0＝0、-＝1、+＝2、++＝3和+++＝4)。基于该分级，描述目视检查。然后，在统计分析中处理该引证以确认视觉观察结果。结果进行排序，首先在时间点1、7和14天按照泊洛沙姆188、蔗糖或pH进行分选。
考虑到所有观察者在第1、7和14天评分的平均值，在泊洛沙姆188存在下观察到泊洛沙姆188具有较低(即可见颗粒减少)评分的显著影响。
考虑到所有观察者的评分的平均值，当pH增加时，观察到评分较低(即可见颗粒减少)的趋势。但是仅在第7天观察到显著影响(p-值＝0,0129)，在pH6.9下得分较低。在第7天，也观察到泊洛沙姆188和pH之间的显著相互作用(参见图5)。实际上，当没有泊洛沙姆188时，pH具有重要影响。随着pH值的升高，可见颗粒的数目减少。
考虑到第1天所有观察者的评分的平均值，没有观察到显著影响。在第7天，观察到蔗糖的轻微但显著影响(p值＝0,0179)(参见图6)，在20％蔗糖存在下具有较低(即可见颗粒减少)评分。在第14天，观察到蔗糖影响(p值＝0，08)，在20％蔗糖存在下具有较低(即可见颗粒减少)评分。
考虑到三个时间点(第1、7和14天)，泊洛沙姆188的存在有利于减少可见颗粒的数目。蔗糖水平最高(20％m/v)时，这种减少可能略有改善(见图5)。但是，尽管对于蔗糖观察到统计学相关的影响，但实际相关性被认为是有限的。
光遮蔽
在每个时间点(T1天，7天和14天)进行光遮蔽测量。仅考虑大于或等于35μm的颗粒(50μm的颗粒对肉眼是可见的)。基于35μm至70μm之间的颗粒的总和进行统计分析。
样品18COP02003(无泊洛沙姆，pH为6,4；蔗糖为20％m/v)在整个颗粒范围(2至125μm)内均检测到是非典型的。没有发现解释这种非典型结果的原因。
进行统计分析。在时间点1、7和14天按照泊洛沙姆188、蔗糖或pH进行分选分析结果。基于测量的平均值分析结果。通过分析四次1毫升产品获得每次的光遮蔽测量。将在第一毫升中获得的第一个值弃去，并且仅用于冲洗设备。
考虑到在第1、7和14天对35微米至70微米的颗粒总和的3次测量的平均值，对于所测试的每种配置，在泊洛沙姆的存在下颗粒的数目较低。当去除非典型结果(配置：无泊洛沙姆，pH为6.4，蔗糖为20％m/v)时也是如此。
结论：
该评价证明：
·无论通过光遮蔽还是通过目视检查或通过Occhio，泊洛沙姆188的加入在减少可见颗粒方面具有显著效果。这与实施例1中观察到的多至0.5％m/v的结果一致。观察到的减少在1％m/v和0.5％m/v下几乎类似。
·蔗糖从10％m/v增加到20％m/v,在可见颗粒的减少方面没有实际的显著影响。蔗糖的增加使得熔化温度和开始聚集温度升高。从目视检查的观点来看，这种增加略微改善了可见颗粒的减少，但是该观察结果与10％m/v蔗糖有利于光遮蔽不相关。
实施例3：用于蛋白D的解冻、稀释和过滤的优化方法
对于第一步，在25℃下，在培养箱中静态解冻蛋白D(4.5ml Nunc容器)。一旦解冻，通过用磁棒搅拌将蛋白D均质化。随后，遵循以下流程图(图1)，将蛋白D在Duran Schott玻璃容器中在150mM NaCl，10％w/v蔗糖，1％w/v泊洛沙姆188，12.5mM PO4 3-KH2PO4/K2HPO4磷酸盐缓冲液pH6.8中稀释至1mg/ml。通过移液管或量筒玻璃进行添加。为了达到这些目标浓度，使用15.75％w/v蔗糖溶液、100mM KH2PO4/K2HPO4 1160mM NaCl pH6.9缓冲液和10％w/v泊洛沙姆188溶液。基于通过RP-UPLC测定的蛋白质D含量进行蛋白质D稀释，所述蛋白D含量是在相同的三个药物材料批次的其它等分试样上预先获得的。一旦稀释，通过使用
Figure BDA0003496582780000531
47过滤器(0.22μm
Figure BDA0003496582780000532
PVDF膜17.7cm2-聚丙烯柱)和蠕动泵(流速0.7ml/min/cm2)过滤蛋白D。
实施例4：蛋白D稀释过程的比较
Figure BDA0003496582780000533
优化方法：
根据实施例3和图7的流程图提供的方法(优化方法)进行蛋白D的稀释。
参考方法：
根据图8的流程图提供的方法(参考方法)进行蛋白D的稀释。如下解冻冷冻的PD药物材料(贮存在-45℃，pH6.8)：
–2-4g的等分试样：在2-8℃下最少7h-最大72h，或在25±1℃下最少1h-最大2h(水浴)
–18g的等分试样：在2-8℃下最少24h-最大72h，或在25±1℃下最少2h-最大3h(水浴)
一旦解冻，将PD用150mM NaCl稀释到～1mg/ml，并在0.22μm上过滤。过滤器特征：Millex(0.45-)0.22μm PVDF，最佳蛋白质负载与面积比：90mg prot/cm2(例如，20ml PD，20mg/ml，在Millex GV33 mm0.22μm 4.5cm2上过滤)。
评价了三种不同的蛋白D药物材料批次(APDOAPA024、APDOBPA027&APDOBPA029)。对于每批，进行1mg/ml蛋白D的八次稀释：4次优化的配置(10％m/v蔗糖，1％m/v泊洛沙姆188，150mM NaCl，1mg/ml蛋白D，12.5mM磷酸盐缓冲液K2HPO4/KH2PO4，pH6.8)和四次目前方法作为参照(NaCl 150mM，pH6.8)。1mg/ml的目标蛋白D浓度是基于Lowry值。
使用以下分析技术(如上所述)比较优化的和参考的蛋白D稀释方法：
·通过光遮蔽、Occhio(Flow cam)和目视检查进行颗粒检测
·通过固有荧光、FTIR&远UV圆二色性测定的二级和三级结构
·通过RP-UPLC测定的蛋白D含量。
在每个时间点，所有的目视检查都是在黑白目视检查站(仅使用黑色背景)中由十一个人进行的，而不是由所有人进行的。将所有样品分类，得出0(无颗粒)至6(完全可见颗粒)的得分。仅仅所有观察者在三个时间点(第1、7和14天)的平均得分的图显示在图12中。
使用PCA法进行多变量分析(主要成分分析)。多变量分析旨在将来自若干变量的信息合成为二维，以更好地解释它。
结果：
·图9代表对于优化的液体组合物&参考样品，在3个时间点(1、7&14天)由Occhio检测到的50至1000μm的颗粒总和。对于参考方法观察到颗粒数量的明显演变，对于优化组合物，数量保持更稳定。
·图10提供对于蛋白D参照样品(在150mM NaCl中1mg/ml)由Occhio捕获的可见颗粒的照片的实例
·图11代表考虑到光遮蔽和Occhio测量结果的整个范围的多变量分析(PCA)。在优化的样品和参考样品之间观察到明显的区别。优化的样品比参考样品更均匀。水平轴总结了整个范围内的颗粒数量：在光遮蔽和Occhio的整个测量范围内，对于参考样品测量了更多的颗粒。垂直轴对于参考样品更有辨别力(对于优化的样品，没有观察到在垂直轴上的扩展)。顶部样品的特征在于可见颗粒数量较高且不可见颗粒数量较底。可以推断，优化的方法重现性更好。
·图12代表来自对3个不同批次在黑白岗位进行目视检查的观察者的平均得分。无论哪天还是蛋白D批次，优化的样品的得分都较低。
·图13和14代表远UV CD光谱和显示208nm和222nm区域的微小差异的差示光谱。这反映了二级结构的略微改变(α-螺旋含量的增加)。
结论：
对蛋白D进行的所有评价证实：
当加入到液体蛋白D中时，可见颗粒数目的显著减少：
1％w/v泊洛沙姆188
150mM NaCl
10％w/v蔗糖
12.5mM K2HPO4/KH2PO4缓冲液pH 6,8
对于蛋白D的分布、大小和摩尔质量没有影响
对于PD含量和抗原性没有重大影响
二级和三级结构有略微差异(在该优化组合物中蛋白D折叠稍微更多)。
此外，用新组合物稀释后对蛋白D进行过滤显示没有含量损失。
序列：
SEQ ID NO 1:蛋白D(364个氨基酸)
MetLysLeuLysThrLeuAlaLeuSerLeuLeuAlaAlaGlyValLeuAlaGlyCysSerSerHisSerSerAsnMetAlaAsnThrGlnMetLysSerAspLysIleIleIleAlaHisArgGlyAlaSerGlyTyrLeuProGluHisThrLeuGluSerLysAlaLeuAlaPheAlaGlnGlnAlaAspTyrLeuGluGlnAspLeuAlaMetThrLysAspGlyArgLeuValValIleHisAspHisPheLeuAspGlyLeuThrAspValAlaLysLysPheProHisArgHisArgLysAspGlyArgTyrTyrValIleAspPheThrLeuLysGluIleGlnSerLeuGluMetThrGluAsnPheGluThrLysAspGlyLysGlnAlaGlnValTyrProAsnArgPheProLeuTrpLysSerHisPheArgIleHisThrPheGluAspGluIleGluPheIleGlnGlyLeuGluLysSerThrGlyLysLysValGlyIleTyrProGluIleLysAlaProTrpPheHisHisGlnAsnGlyLysAspIleAlaAlaGluThrLeuLysValLeuLysLysTyrGlyTyrAspLysLysThrAspMetValTyrLeuGlnThrPheAspPheAsnGluLeuLysArgIleLysThrGluLeuLeuProGlnMetGlyMetAspLeuLysLeuValGlnLeuIleAlaTyrThrAspTrpLysGluThrGlnGluLysAspProLysGlyTyrTrpValAsnTyrAsnTyrAspTrpMetPheLysProGlyAlaMetAlaGluValValLysTyrAlaAspGlyValGlyProGlyTrpTyrMetLeuValAsnLysGluGluSerLysProAspAsnIleValTyrThrProLeuValLysGluLeuAlaGlnTyrAsnValGluValHisProTyrThrValArgLysAspAlaLeuProGluPhePheThrAspValAsnGlnMetTyrAspAlaLeuLeuAsnLysSerGlyAlaThrGlyValPheThrAspPheProAspThrGlyValGluPheLeuLysGlyIleLys
SEQ ID NO:2:含有来自NS1的MDP三肽的蛋白D片段(348个氨基酸)MetAspProSerSerHisSerSerAsnMetAlaAsnThrGlnMetLysSerAspLysIleIleIleAlaHisArgGlyAlaSerGlyTyrLeuProGluHisThrLeuGluSerLysAlaLeuAlaPheAlaGlnGlnAlaAspTyrLeuGluGlnAspLeuAlaMetThrLysAspGlyArgLeuValValIleHisAspHisPheLeuAspGlyLeuThrAspValAlaLysLysPheProHisArgHisArgLysAspGlyArgTyrTyrValIleAspPheThrLeuLysGluIleGlnSerLeuGluMetThrGluAsnPheGluThrLysAspGlyLysGlnAlaGlnValTyrProAsnArgPheProLeuTrpLysSerHisPheArgIleHisThrPheGluAspGluIleGluPheIleGlnGlyLeuGluLysSerThrGlyLysLysValGlyIleTyrProGluIleLysAlaProTrpPheHisHisGlnAsnGlyLysAspIleAlaAlaGluThrLeuLysValLeuLysLysTyrGlyTyrAspLysLysThrAspMetValTyrLeuGlnThrPheAspPheAsnGluLeuLysArgIleLysThrGluLeuLeuProGlnMetGlyMetAspLeuLysLeuValGlnLeuIleAlaTyrThrAspTrpLysGluThrGlnGluLysAspProLysGlyTyrTrpValAsnTyrAsnTyrAspTrpMetPheLysProGlyAlaMetAlaGluValValLysTyrAlaAspGlyValGlyProGlyTrpTyrMetLeuValAsnLysGluGluSerLysProAspAsnIleValTyrThrProLeuValLysGluLeuAlaGlnTyrAsnValGluValHisProTyrThrValArgLysAspAlaLeuProGluPhePheThrAspValAsnGlnMetTyrAspAlaLeuLeuAsnLysSerGlyAlaThrGlyValPheThrAspPheProAspThrGlyValGluPheLeuLysGlyIleLys
SEQ ID NO:3:SerSerHisSerSerAsnMetAlaAsnThr
SEQ ID NO:4:来自流感嗜血杆菌的蛋白E
Figure BDA0003496582780000571
SEQ ID NO:5:蛋白E的氨基酸20-160
Figure BDA0003496582780000572
Figure BDA0003496582780000581
SEQ ID NO:6来自流感嗜血杆菌的PilA
Figure BDA0003496582780000582
SEQ ID NO:7来自流感嗜血杆菌菌株86-028NP的PilA的氨基酸40-149
Figure BDA0003496582780000583
SEQ ID NO:8:LVL735(蛋白):(pelB sp)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40-149)
Figure BDA0003496582780000584
SEQ ID NO:9:无信号肽的PE-PilA融合蛋白
Figure BDA0003496582780000585
Figure BDA0003496582780000591
SEQ ID NO:10:来自ATCC 25238的UspA2
MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDIT
ALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGE
AIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYD
FGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSG
RLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQA
NIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDA
LNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINN
IYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKL
ITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK
VNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:11:MC-001(蛋白)–(M)(UspA2氨基酸30-540)(ASHHHHHH)
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKASHHHHHH
SEQ ID NO:12 MC-002(蛋白)–(M)(UspA2氨基酸30-540)
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTK
SEQ ID NO:13 MC-003(蛋白)–(M)(UspA2氨基酸30-540)(H)MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKH
SEQ ID NO:14 MC-004(蛋白)–(M)(UspA2氨基酸30-540)(HH)
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKHH
SEQ ID NO:15 MC-005(蛋白)–(M)(UspA2氨基酸30-519)(ASHHHHHH)
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSASHHHHHH
SEQ ID NO:16 MC-006(蛋白)–(M)(UspA2氨基酸30-519)
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKS
SEQ ID NO:17 MC-007(蛋白)–(M)(UspA2氨基酸30-564)(ASHHHHHH)
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAAASHHHHHH
SEQ ID NO:18 MC-008(蛋白)–(M)(UspA2 30-564)(HH)
MQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAAHH
SEQ ID NO:19 MC-009(蛋白)–(M)(UspA2 31-564)(HH)
MAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAAHH
SEQ ID NO:20 MC-010(蛋白)–(M)(UspA2氨基酸30-564)
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SEQ ID NO:21 MC-011(蛋白)–(M)(UspA2氨基酸31-540)(ASHHHHHH)
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SEQ ID NO:22 UspA2 American 2933(613 aa)
MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQSRDRSLEDIQDSISKLVQDDINTLKQDQQKMNKYLLLNQLANTLITDELNNNVIKNTNSIEALGDEIGWLENDIADLEEGVEELTKNQNTLIEKDEEHDRLIAQNQADIQTLENNVVEELFNLSGRLIDQEADIAKNNASIEELYDFDNEVAERIGEIHAYTEEVNKTLENLITNSVKNTDNIDKNKADIDNNINHIYELAQQQDQHSSDIKTLKNNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTNRIATAELGIAENKKDAQIAKAQANANKTAIDENKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:23 UspA2 American 2912(644 aa)
MKTMKLLPLKIAVTSALIIGLGAASTANAQQQLQTETFLPNFLSNDNYDLTDPFYHNMILGDTALLDKQDGSQPQLKFYSNDKDSVPDSLLFSKLLHEQQLNGFKKGDTIIPLDKDGKPVYQVDYKLDGKGKKQKRRQVYSVTTKTATDDDVNSAYSRGILGKVDDLDDEMNFLNHDITSLYDVTANQQDAIKDLKKGVKGLNKELKELDKEVGVLSRDIGSLNDDVAQNNESIEDLYDFSQEVADSIGEIHAHNKAQNETLQDLITNSVENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADLTKDIKTLESNVEEGLLELSGHLIDQKADIAKNQADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDENKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:24 UspA2 American 2908(591 aa)
MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQLVERFFPNIFLDKPLAKQHYHNVVVGDTSIVSDLQSNSDQLKFYSDDEGLVPDSLLFNKMLHEQLLNGFKEGDTIIPLDENGKPVYKVDYKLDGKEPRKVYSVTTKIATAEDVATSSYANGIQKDIDDLYDFDHQVTERLTQHGKTIYRNGERILANEESVQYLNKEVQNNIEHIYELAQQQDQHSSDIKTLESNVEKGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLESNVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIKTLESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTNRIATAELGIAENKKDAQIAKAQANANKTAIDENKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:25 UspA2 Finnish 307(687 aa)
MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQQQQQQQQQQQSRTEIFFPNIFFNENHDELDDAYHNIILGDTALLDKQDGSQPQLKFYSNDKDSVPDSLLFSKLLHEQQLNGFKKGDTIIPLDKDGKPVYQVDYKLDGKGKKQKRRQVYSVTTKTATDDDVNSAYSRGILGKVDDLDDEMNFLNHDITSLYDVTANQQDAIKGLKKGVKGLNKELKELDKEVGVLSRDIGSLNDDVAQNNESIEDLYDFSQEVADSIGEIHAHNKAQNETLQDLITNSVENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADLTKDIKTLESNVEEGLLELSGHLIDQKADIAKNQADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDENKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDAFDGRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:26 UspA2 Finnish 353(683个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMIVGLGMASTANAQQQKSPKTETFLPNIFFNEYADDLDTLYHNMILGDTAITHDDQYKFYADDATEVPDSLFFNKILHDQLLYGFKEGDKIIPLDENGKPVYKLDKRLENGVQKTVYSVTTKTATADDVNSAYSRGIQGDIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNREVQNNIENIHELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEKDLLDLSGRLIAQKEDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNHIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:27 UspA2 Finnish 358(684个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMMVGLGMASTANAQQQKSPKTEIFLPNLFDNDNTELTDPLYHNMILGNTALLTQENQYKFYADDGNGVPDSLLFNKILHDQLLHGFKEGGTIIPLDENGKPVYKLDSIVEQGKTKTVYSVTTKTATADDVNSAYSRGIQGDIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNREVQNNIENIHELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEKDLLDLSGRLIAQKEDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNHIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:28 UspA2 Finnish 216(684个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQQQQKTKTEVFLPNLFDNDYYDLTDPLYHSMILGDTATLFDQQDNSKSQLKFYSNDKDSVPDSLLFSKLLHEQQLNGFKAGDTIIPLDKDGKPVYTQDTRTKDGKVETVYSVTTKIATQDDVEQSAYSRGIQGDIDDLYDINREVNEYLKATHDYNERQTEAIDALNKASSANTDRIDTAEERIDKNEYDIKALESNVGKDLLDLSGRLIAQKEDIDNNINHIYELAQQQDQHSSDIKTLKNNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKVSAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:29 UspA2 Dutch H2(684个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMMVGLGMASTANAQQQKSPKTEIFLPNLFDNDNTELTDPLYHNMILGNTALLTQENQYKFYADDGNGVPDSLLFNKILHDQLLHGFKKGDTIIPLDENGKPVYKLDSIVEQGKTKTVYSVTTKTATADDVNSAYSRGIQGDIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNREVQNNIENIYELVQQQDQHSSDIKTLKKNVEKDLLDLSGRLIAQKEDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNHIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:30 UspA2 Dutch F10(574个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQLAEQFFPNIFSNHAPVKQHYHNVVVGDTSIVENLQDSDDTQLKFYSNDEYSVPDSLLFNKMLHEQQLNGFKKGDTIIPLDENGKPVYKVDYKLDGQEPRRVYSVTTKIATQDDVDNSPYSRGIQGDIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNKEVQNNIENIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLESNVEEGLLELSGHLIDQKADIAKNQADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDAFDGRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:31 UspA2 Norwegian 1(678个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQQQPQTETFFPNIFFNENHDALDDVYHNMILGDTAITQDNQYKFYADAISEVPDSLLFNKILHDQQLNGFKEGDTIIPLDENGKPVYKLDEKVENGVKKSVYSVTTKTATRADVEQSAYSRGIQGDIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNKEVQNNIENIHELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDAFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:32 UspA2 Norwegian 13(678个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMIVGLGAASTANAQQQQQPRTETFFPNIFFNENHDALDDVYHNMILGDTAITQDNQYKFYADAISEVPDSLLFNKILHDQQLNGFKEGDTIIPLDENGKPVYKLDEKVENGVKKSVYSVTTKTATRADVEQSAYSRGIQGDIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNREVQNNIENIHELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEKDLLDLSGRLIAQKEDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNHIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDTNKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:33 UspA2 Norwegian 33(587个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQLVERFFPNIFLDKPLAKQHYHNVVVGDTSIVSDLQSNSDQLKFYSDDEGLVPDSLLFNKMLHEQLLNGFKEGDTIIPLDENGKPVYKVDYKLDGKEPRKVYSVTTKIATAEDVATSSYANGIQKDIDDLYDFDHQVTERLTQHGKTIYRNGERILANEESVQYLNKEVQNNIEHIYELAQQQDQHSSDIKTLESNVEKGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLENNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDTNKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:34 UspA2 Norwegian 25(678个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMIVGLGAASTANAQQQQQPRTETFFPNIFFNENHDALDDVYHNMILGDTAITQDNQYKFYADAISEVPDSLLFNKILHDQQLNGFKEGDTIIPLDENGKPVYKLDEKVENGVKKSVYSVTTKTATRADVEQSAYSRGIQGDIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNREVQNNIENIHELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEKDLLDLSGRLIAQKEDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNHIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDTNKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:35 UspA2 Norwegian 27(616个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQVRDKSLEDIEALLGKIDISKLEKEKKQQTELQKYLLLSQYANVLTMEELNKNVEKNTNSIEALGYEIGWLENDIADLEEGVEELTKNQNTLIEKDEEHDRLIAQNQADIKTLENNVVEELFNLSDRLIDQEADIAKNNASIEELYDFDNEVAERIGEIHAYTEEVNKTLEKLITNSVKNTDNIDKNKADIQALENNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAKNQADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKVSAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:36 UspA2 Norwegian 36(676个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQATETFLPNLFDNDYTETTDPLYHGMILGNTAITQDTQYKFYAENGNEVPDSLFFNKILHDQQLNGFKEGDTIIPLDENGKPVYKLDEITENGVKRKVYSVTTKTATREDVEQSAYSRGIQGDIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNKEVQNNIENIHELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAKNQADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:37 UspA2 BC5SV(629个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQNGTSTKLKNLKEYAQYLDNYAQYLDDDIDDLDKEVGELSQNIAKNQANIKDLNKKLSRDIDSLREDVYDNQYEIVNNQADIEKNQDDIKELENNVGKELLNLSGRLLDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKSDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDAFDGRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:38 UspA2 Norwegian 14(683个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMIVGLGMASTANAQQQRSPKTETFLPNIFFNEYADDLDTLYHNMILGDTAITHDDQYKFYADDATEVPDSLFFNKILHDQLLYGFKEGDKIIPLDENGKPVYKLDKRLDNGVQKTVYSVTTKTATADDVNSAYSRGIQGDIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNKEVQNNIENIHELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNRIKALENNIEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:39 UspA2 Norwegian 3(700个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMIVGLGAASTANAQAQSNRSLDQVQALLRGIDETKIKKEIQQSQQPELNKYLTFNQLANALNIEELNNNVQKNTQRLDSAATLYGDLSKTVPKSIKENKESIKENKESIKENKESIKENKESIKENKESIKENKESITTLTRKSFQNQVDIVRNNASIEDLYAYGQEVAKSIGEIHAYTEEVNKTLENLITNSVENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTVIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:40 UspA2 Finnish 414(676个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQATETFLPNLFDNDYIETTDPLYHGMILGNTAITQDTQYKFYAENGNEVPDSLFFNKILHDQQLNGFKEGDTIIPLDENGKPVYKLDEITENGVKRKVYSVTTKTATREDVEQSAYSRGIQGDIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNKEVQNNIENIHELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLENNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAKNQADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:41 UspA2 Japanese Z7476(678个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQLAEQFFPNIFSNHAPVKQHYHNVVVGDTSIVENLQDSDDTQLKFYSNDEYSVPDSLLFNKMLHEQQLNGFKKGDTIIPLDENGKPVYKVDYKLDGQEPRRVYSVTTKIATQDDVDNSPYSRGIQGDIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNKEVQNNIENIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKVSAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:42 UspA2 Belgian Z7530(613个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQSRDRSLEDIQDSISKLVQDDINTLKQDQQKMNKYLLLNQLANTLITDELNNNVIKNTNSIEALGDEIGWLENDIADLEEGVEELTKNQNTLIEKDEEHDRLIAQNQADIQTLENNVVEELFNLSGRLIDQEADIAKNNASIEELYDFDNEVAERIGEIHAYTEEVNKTLENLITNSVKNTDNIDKNKADIDNNINHIYELAQQQDQHSSDIKTLKNNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTNRIATAELGIAENKKDAQIAKAQANANKTAIDENKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:43 German Z8063(589个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQATNKDITLEDVLKSIEEIDPYELRDYIEYPTAIERFLLLSQYGNTLTLEEFDNDIELLDQDVEDLEESVTELAKNQNSLIEQGEAIKEDLQGLADFVERQEDKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAKSIGEIHAHNEAQNETLKDLITNSVKNTDNITKNKADIQALESNVEKGLLELSGHLIDQKADIDNNINNIHELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKSDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:44UspA2 American O12E(684个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMMVGLGMASTANAQQQKSPKTEIFLPNLFD
NDNTELTDPLYHNMILGNTALLTQENQYKFYADDGNGVPDSLLFNKI
LHDQLLHGFKEGDTIIPLDENGKPVYKLDSIVEQGKTKTVYSVTTKT
ATADDVNSAYSRGIQGDIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQ
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SEQ ID NO:45 UspA2 Greek MC317(650个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQQQQKTKTEVFLPNLFYNDYIEETDLLYHNMILGDTAALVDRQNYSNSQLKFYSNDEESVPDSLLFSKMLNNQQLNGFKAGDIIIPVDANGQVIYQKDTRVEGGKTRTVLSVTTKIATQQDVDSAYSRGIQGKVNDLDDEMNFLNHDITSLYDVTANQQDDIKGLKKGVKDLKKGVKGLNKELKELDKEVGVLSRDIGSLNDDVAQNNESIEDLYDFSQEVADSIGEIHAHNKAQNETLQDLITNSVENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADLTKDIKTLESNVEEGLLELSGHLIDQKADIAKNQADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDENKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:46 UspA2 American V1122(616个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAVSTTNAQAQSRSLDQIQTKLADLAGKIAAGKNGGGQNNQNNQNDINKYLFLSQYANILTMEELNNNVVKNSSSIETLETDFGWLENDVADLEDGVEELTKNQNTLIEKDEEHDRLIAQNQADIQTLENNVVEELFNLSDRLIDQKADIAKNQADIAQNNESIEELYDFDNEVAEKIGEIHAYTEEVNKTLQDLITNSVKNTDNIDKNKADIDNNINHIYELAQQQDQHSSDIKTLKNNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLENNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDENKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:47 UspA2 American P44(668个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGTASTANAQVASPANQKIQQKIKKVRKELRQDIKSLRNDIDSNTADIGSLNDDVADNQDDILDNQADIAKNQDDIEKNQADIKELDKEVGVLSREIGSLNDDIADNYTDIIDNYTDIIDNQANIAKNQDDIEKNQADIKELDKEVGVLSREIGSLNDDVADNQDDIAKNQADIQTLENNVEEGLLELSGHLLDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQEQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNRIKALESNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLELSGHLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKVSADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDAFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:48 UspA2 American V1171(674个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMIVGLGATSTVNAQVVEQFFPNIFFNENHDELDDAYHNMILGDTAIVSNSQDNSTQLKFYSNDEDSVPDSLLFSKLLHEQQLNGFKAGDTIIPLDKDGKPVYTKDTRTKDGKVETVYSVTTKIATQDDVEQSAYSRGIQGDIDDLYDINREVNEYLKATHDYNERQTEAIDALNKASSANTDRIDTAEERIDKNEYDIKALESNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:49 UspA2 American TTA24(613个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQSRDRSLEDIQDSISKLVQDDIDTLKQDQQKMNKYLLLNQLANTLITDELNNNVIKNTNSIEALGDEIGWLENDIADLEEGVEELTKNQNTLIEKDEEHDRLIAQNQADIQTLENNVVEELFNLSGRLIDQEADIAKNNASIEELYDFDNEVAERIGEIHAYTEEVNKTLENLITNSVKNTDNIDKNKADIDNNINHIYELAQQQDQHSSDIKTLKNNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTNRIATAELGIAENKKDAQIAKAQANANKTAIDENKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:50 UspA2 American O35E(576个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMIVGLGATSTVNAQVVEQFFPNIFFNENHDELDDAYHNMILGDTAIVSNSQDNSTQLKFYSNDEDSVPDSLLFSKLLHEQQLNGFKAGDTIIPLDKDGKPVYTKDTRTKDGKVETVYSVTTKIATQDDVEQSAYSRGIQGDIDDLYDINREVNEYLKATHDYNERQTEAIDALNKASSANTDRIDTAEERIDKNEYDIKALESNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAKNQADIAQNQTDIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:51 UspA2 American SP12-6(684个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMMVGLGMASTANAQQQKSPKTEIFLPNLFDNDNTELTDPLYHNMILGNTALLTQENQYKFYADDGNGVPDSLLFNKILHDQLLHGFKEGDTIIPLDENGKPVYKLDSIVEQGKTKTVYSVTTKTATADDVNSAYSRGIQGDIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNREVQNNIENIHELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEKDLLDLSGRLIAQKEDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNHIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:52 UspA2 American SP12-5(686个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQATETFLPNLFDNDYTETTDPLYHGMILGNTAITQDTQYKFYAENGNEVPDSLFFNKILHDQQLNGFKEGDTIIPLDENGKPVYKLDEITENGVKRKVYSVTTKTATREDVEQSAYSRGIQGDIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNKEVQNNIENIHELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGRLIAQKEDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNHIKTLENNIEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAKNQADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:53 UspA2 Swedish BC5(630个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQAKNDITLEDLPYLIKKIDQNELEADIGDITALEKYLALSQYGNILALEELNKALEELDEDVGWNQNDIANLEDDVETLTKNQNALAEQGEAIKEDLQGLADFVEGQEGKILQNETSIKKNTQRNLVNGFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAHNEAQNETLKGLITNSIENTNNITKNKADIQALENNVVEELFNLSGRLIDQKADIDNNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKTDIAQNQANIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:54 UspA2 American 7169(616个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQAQDRSLEQIQDKLANLVEKIEQAKSQNGQSQKDINQYLLLSQYANVLTMEELNNNVVKNSSSIETLDNDIAWLNDDLIDLDKEVGVLSRDIGSLHDDVAQNQADIKTLKNNVVEELFNLSDRLIDQEADIAQNNESIEDLYDFGREVAESIGEIHAHNEAQNETLKDLITNSVKNTDNITKNKADIQALENDVGKELLNLSGRLIDQKADIDNNINHIYELAQQQDQHSSDIKTLKNNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:55 UspA2 Finnish FIN2344(614个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSAMIIGLGATSTVNAQVVEQFFPNIFFNENHDELDDAYHNMILGDTAIVSNSQDNSTQLKFYSNDEDSVPDSLLFSKLLHEQQLNGFKAGDTIIPLDKDGKPVYTKDTRTKDGKVETVYSVTTKIATQDDVEQSAYSRGIQGDIDDLYDINREVNEYLKATHDYNERQTEAIDALNKASSANTDRIDTAEERIDKNEYDIKALESNVGKDLLDLSGRLIAQKEDIDNNINHIYELAQQQDQHSSDIKTLKNNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKTLESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKVSAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:56 UspA2 American V1118(679个氨基酸)
MKTMKLPPLKIAVTSAMIIGLGAASTANAQTTETFLPNLFDNDYTETTDPLYHGMILGDTAITQDTQYKFYAENGNEVPDSLFFNKILHDQLLNGFKAGDTIIPLDENGKPVYKLDERTENGVKRKVYSVTTKTATQADVEQSAYSRGIQGDIDDLYEANKENVNRLIEHGDKIFANEESVQYLNREVQNNIENIHELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEKDLLDLSGRLIAQKEDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIAKNSNHIKTLENNIEECLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLIDQKADIAQNQANIQDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDGRVTALDTKVNALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:57 UspA2 American V1145(724个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQETLEEVLESIKQINEQDLQDDIGYNSALDRYLVLSQYGNLLIAKELNENVEKNSNSIAKNSNSIADLEADVGYLAENQNTLIEQNETINQELEGITHELESFIAYAHAQDQKNLVNEFEIEKNKDAIAKNNESIEDLYDFGHEVAESIGEIHAYTEEVNKTLENLITNSVKNTDNITKNKADIQALESNVEKELLNLSGRLIDQKADIDNNINHIYELAQQQDQHSSDIKTLKKNVEEGLLELSGHLIDQKSDIAQNQTDIQDLATYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKASAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF
SEQ ID NO:58 UspA2 American V1156(611个氨基酸)
MKTMKLLPLKIAVTSALIVGLGAASTANAQAQARDRSLEDIQALIGNIDVDKIRSQKQKNPEIFQYLLLNQLSNTLITDELNNNVIKNTNSIETLDNDIAWLNDDLIDLDKEVGVLSRDIGSLHDDVAQNQADIKTLENNVVEELFNLSDRLIDQEAEIAQNNESIEDLYDFGREVAESIGEIHAHNEAQNETLKDLITNSVKNTDNIDKNKADIQALENNVEEGLLELSGHLIDQKADLTKDIKALESNVEEGLLDLSGRLLDQKADIAKNQADIAQNQTDIQDLAAYNELQDQYAQKQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIEDLAAYNELQDAYAKQQTEAIDALNKASSENTQNIAKNQADIANNINNIYELAQQQDQHSSDIKTLAKVSAANTDRIAKNKADADASFETLTKNQNTLIEKDKEHDKLITANKTAIDANKASADTKFAATADAITKNGNAITKNAKSITDLGTKVDGFDSRVTALDTKVNAFDGRITALDSKVENGMAAQAALSGLFQPYSVGKFNATAALGGYGSKSAVAIGAGYRVNPNLAFKAGAAINTSGNKKGSYNIGVNYEF。
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Claims (15)

1.一种用于制备包含蛋白D多肽(任选地，其中所述蛋白D多肽与SEQ ID NO：2具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，例如SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)的液体组合物的方法，其中所述方法包括混合蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆。
2.根据权利要求1的用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其中所述方法包括在混合所述蛋白D多肽与其它抗原之前，混合所述蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆。
3.根据权利要求1或权利要求2的用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其中所述方法包括混合蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖至浓度为5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)，和(b)泊洛沙姆(任选地，泊洛沙姆188)至浓度为0.1至1％(w/v)、0.5至1％(w/v)或1％(w/v)。
4.根据权利要求1至3中任一项用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其中所述方法包括混合所述蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖、(b)泊洛沙姆(任选地，泊洛沙姆188)和(c)盐(任选地，NaCl)。
5.根据权利要求1至3中任一项用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其中所述方法包括混合所述蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖、(b)泊洛沙姆(任选地，泊洛沙姆188)，(c)盐(任选地，NaCl)和(d)缓冲液(任选地，磷酸盐缓冲液)。
6.根据权利要求1至3中任一项用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其中所述方法包括混合所述蛋白D多肽与包含以下的溶液：(a)蔗糖，(b)泊洛沙姆(任选地，泊洛沙姆188)，(c)盐，任选地NaCl，和(d)缓冲液(任选地，磷酸盐缓冲液)，以达到pH6.4至7.7(例如，pH6.8)。
7.根据权利要求1至6中任一项用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：(i)解冻所述蛋白D多肽，和(ii)混合所述蛋白D多肽与蔗糖和泊洛沙姆。
8.根据权利要求1至7中任一项用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，随后包括过滤步骤(任选地，使用0.22μm PVDF膜)，以获得在滤液中包含蛋白D多肽的液体组合物。
9.根据权利要求1至8中任一项用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，随后包括储存包含蛋白D多肽的液体组合物的步骤。
10.根据权利要求1至9中任一项用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，随后包括混合包含所述蛋白D多肽的液体组合物与其它抗原的步骤。
11.根据权利要求10的用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，其中所述其它抗原包含PE-PilA融合蛋白和UspA2多肽。
12.根据权利要求1至11中任一项用于制备包含蛋白D多肽的液体组合物的方法，与没有向蛋白多肽组合物中加入蔗糖和泊洛沙姆的方法相比，其减少了蛋白D多肽可见颗粒的形成。
13.一种方法，其包括根据权利要求1至12中任一项的方法制备包含蛋白D多肽的液体组合物，随后冷冻干燥所述包含蛋白D多肽的液体组合物。
14.一种液体组合物，其包含蛋白D多肽(任选地，SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)、蔗糖和泊洛沙姆(任选地，泊洛沙姆188)。
15.根据权利要求14的液体组合物，其包含任选地0.025至20mg/ml、0.5至10mg/ml、0.5至1mg/ml或1mg/ml的量的蛋白D多肽(任选地，其中所述蛋白D多肽与SEQ ID NO：2具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，例如SEQ ID NO：2的蛋白D多肽)；任选地5至20％(w/v)、10至20％(w/v)或10至15％(w/v)的量的蔗糖；任选地0.1至1％(w/v)、0.5至1％(w/v)或1％(w/v)的量的泊洛沙姆(任选地，泊洛沙姆188)；缓冲液(任选地，磷酸盐缓冲液)；和盐(任选地，NaCl)。
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