CN114231530B - 一种基于核酸核酶与环状向导RNA调控的Cas12a-CcrRNA系统及其应用 - Google Patents
一种基于核酸核酶与环状向导RNA调控的Cas12a-CcrRNA系统及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于核酸核酶与环状向导RNA调控的Cas12a‑CcrRNA系统及其应用，属于分析检测技术领域。本发明首次发现酶促连接反应合成的CcrRNA可以降低Cas12a对双链DNA特异性切割(顺式)和对单链DNA非特异性切割(反式)的活性，当核酸酶(NAzyme)对CcrRNA进行切割时，释放出的LcrRNA可恢复Cas12a的活性，构建了核酸核酶激活的Cas12‑CcrRNA系统(NA3C)，本发明还设计了一种用于ATP和致病菌(大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌)的高特异性检测方法，其检出限分别低至500nM和102CFU/mL；进一步将构建的NA3C系统用于大肠杆菌临床评估，结果显示其诊断灵敏度可达100％，特异性为90％，表明NA3C具有用于临床诊断的潜力。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种基于核酸核酶与环状向导RNA调控的Cas12a-CcrRNA系统及其在生物传感方面的应用。
背景技术
分子生物传感对于临床诊断、生物安全、食品安全和环境监测至关重要。目前，CRISPR-Cas系统作为信号放大工具已被广泛用于生物传感领域。研究人员基于CRISPR-Cas体系已建立了许多核酸检测方法，广泛用于传染性或非传染性疾病的诊断。然而，对于非核酸类生物标志物(例如小分子、蛋白质和金属离子)的传感方法数量非常有限，急需拓展。
在自然界中，共价闭合环状RNA(circRNAs)广泛存在于类病毒、拟病毒中以及真核生物、细菌和古细菌拼接的内含子或外显子中。circRNAs可以通过化学或酶促连接反应制备，是可用于各种功能设备的一类独特的核酸纳米结构。目前，已建立的基于CRISPR-Cas的生物传感系统均利用线状向导RNA(LcrRNA)引导Cas蛋白识别特定核酸序列，从而激活Cas蛋白对单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA)信号报告分子进行切割。由于circRNAs与线状RNA(LRNA)相比表现出不同的结构和功能，导致其很少用于CRISPR生物传感系统的开发。
迄今为止，研究人员设计了多种可以切割RNA的核酸核酶(NAzymes)，例如核糖核酶(Ribozyme)、脱氧核酶(DNAzymes)和适体核酶(Aptazymes)。这些核酸核酶能够识别各种非核酸类的生物标志物，例如金属离子、小分子、寡核苷酸、蛋白质和致病细菌等。然而，利用核酸核酶对环状向导RNA(CcrRNA)切割来释放LcrRNA激活Cas12a体系的相关研究还未见报道，这对拓展基于CRISPR-Cas的非核酸类靶标检测具有重要意义。
发明内容
鉴于此，本发明首次将CcrRNA用于CRISPR-Cas12a体系，证明CcrRNA可以降低Cas12a的切割活性，当NAzyme对CcrRNA进行切割时，释放出的LcrRNA可恢复Cas12a的活性；此外，本发明构建了核酸核酶激活的Cas12-CcrRNA系统(NA3C)，实现了对小分子5'-三磷酸腺苷(ATP)和两种致病菌(大肠杆菌和肺炎克雷伯菌)的实时、灵敏检测。从而，证明了本发明对非核酸类目标物检测的通用性，拓展了CRISPR-Cas技术在生物传感和临床诊断领域的应用。
本发明提供如下技术方案：
一种环状CcrRNA，所述的CcrRNA通过线性LcrRNA模板和RNA连接模板连接环化获得。
进一步地，所述的LcrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-7所示；所述的RNA连接模板的核苷酸序列如SEQ ID NO：8-13所示。
本发明提供一种基于核酸核酶与CcrRNA调控Cas12a的NA3C系统，所述的系统包括Cas12a、上述的CcrRNA和核酸核酶。
基于以上技术方案，进一步地，所述的核酸核酶包括核苷酸序列如SEQ ID NO：14-20所示的核酸核酶。
基于以上技术方案，进一步地，所述的系统包括顺式切割底物dsDNA和反式切割底物ssDNA。
基于以上技术方案，进一步地，dsDNA的核苷酸序列由SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22连接构成或者由SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24连接构成；ssDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO：25所示。
基于以上技术方案，进一步地，所述的ssDNA序列的两端分别修饰FAM荧光基团和Dabcyl猝灭基团，Cas12切割ssDNA后，使得荧光基团与荧光猝灭基团分离，产生荧光信号。
基于以上技术方案，进一步地，所述的系统包括缓冲溶液、RNase抑制剂、氯化镁溶液。
基于以上技术方案，进一步地，所述的缓冲溶液包括Tris-HCl和Cas12a切割缓冲液，Cas12a切割缓冲液组成为：20mM Tris盐酸，100mM氯化钾，5mM氯化镁，1mM DTT，5％丙三醇，50μg/mL肝素钠，pH 7.5。
本发明一方面提供上述的NA3C系统在生物传感和临床诊断方面中的应用。
本发明另一方面提供一种基于上述的NA3C系统检测ATP或致病菌的方法，包括以下步骤：
(1)在目标物存在的情况下，ATP或致病菌响应的核酸核酶切割CcrRNA，释放出LcrRNA；
(2)将步骤(1)中释放的LcrRNA与Cas12a、顺式切割底物dsDNA混合后，再加入反式切割底物ssDNA后，检测荧光信号。
基于以上技术方案，进一步地，检测ATP时，所述核酸核酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示。
基于以上技术方案，进一步地，所述的致病菌包括大肠杆菌和肺炎克雷伯菌。
基于以上技术方案，进一步地，检测大肠杆菌时，所述核酸核酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。
基于以上技术方案，进一步地，检测肺炎克雷伯菌时，所述核酸核酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
本发明还提供一种应用上述的NA3C系统检测临床尿液样本中大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
(1)细胞收集：离心收集待检样品中的细菌细胞；
(2)细胞裂解：使用缓冲液洗涤步骤(1)得到的细菌细胞1次以上，将细胞沉淀悬浮于缓冲液中，超声破碎细胞，然后离心收集大肠杆菌的胞内混合物(CIM)；
(3)NA3C检测：将步骤(2)得到的胞内混合物、CcrRNA、核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的核酸核酶孵育10～60min，取所得混合液与Cas12a和dsDNA混合20～40min，加入反式切割底物ssDNA后，检测荧光信号。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明首次利用CcrRNA组建CRISPR-Cas12a系统，发现CcrRNA能够降低Cas12a的活性，利用核酸核酶对CcrRNA切割，释放出LcrRNA，释放的LcrRNA能够恢复Cas12a的活性。基于上述原理，构建的ATP和致病菌的生物传感器具有特异性好，灵敏度高，抗干扰性强的优点。经分析测试得到，该传感器对缓冲液中的ATP、大肠杆菌(或肺炎克雷伯菌)的检出限分别为500nM和102CFUs/mL。将本发明构建的大肠杆菌生物传感器用于检测40个临床患者的尿液样本，同时与“金标准”的生物培养法的培养结果进行比对，证明本发明的诊断灵敏度为100％，特异性为90％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1为基于核酸核酶与CcrRNA调控CRISPR-Cas12a(NA3C)系统的原理图。
图2为实施例2中CcrRNA对Cas12a功能的调控，其中，a为Cas12a对dsDNA切割动力学，b为Cas12a对ssDNA切割动力学。
图3为实施例3中CcrRNA与Cas12a相互作用的亲和力表征；其中，a为点印记实验，b为荧光各向异性分析。
图4为实施例4所构建的NA3C系统；其中，a、c为基于核糖核酶(HH15)激活的Cas12a系统，b、d为基于脱氧核酶(10-23DNAzyme)激活的Cas12a系统。
图5为实施例5所构建的NA3C系统检测缓冲液中的ATP和大肠杆菌；其中a为基于ATP适体核酶(ClassⅠ(a))切割CcrRNA的序列示意图，b为基于大肠杆菌适体核酶(EC1)切割CcrRNA的序列示意图，c、d分别为ATP和大肠杆菌检测的灵敏度分析，e、f为ATP和大肠杆菌检测的特异性分析。
图6为为实施例5所构建的NA3C系统检测缓冲液中的肺炎克雷伯氏菌；其中a为肺炎克雷伯氏菌检测的灵敏度分析，b为肺炎克雷伯氏菌检测的特异性分析。
图7为实施例6所制备的胱氨酸-乳糖-电解质缺乏琼脂平板对临床尿液进行培养。
图8为实施例6所构建的NA3C系统检测临床尿液中的大肠杆菌；图中，a为大肠杆菌从样品到结果的检测流程示意图，b为检测的尿液样本的荧光信号，c为临床诊断的灵敏度、特异性分析，d为受试者工作特征(ROC)曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的DNA杂交缓冲液(1×HB)：20mM Tris盐酸，100mM氯化钾，5mM氯化镁，pH 7.5。
下述实施例中的EC1反应缓冲液(1×ERB)：50mM HEPES,100mM NaCl,15mM MgCl2,pH 7.5。
下述实施例中的Cas12a切割缓冲液(1×CCB)：20mM Tris盐酸，100mM氯化钾，5mM氯化镁，1mM DTT，5％丙三醇，50μg/mL肝素钠，pH 7.5。
下述实施例中的Cas12a-crRNA结合缓冲液(1×BB)：20mM Tris盐酸，100mM氯化钾，5mM氯化镁，1mM DTT，5％丙三醇，50μg/mL肝素钠，50μg/mL BSA,0.01％(v/v)IGEPALCA-630，pH 7.5。
下述实施例中的洗脱缓冲液(1×WB)：50mM HEPES，100mM氯化钾，5mM氯化镁，0.01％(v/v)IGEPAL CA-630，pH 7.5。
表1：本实施例中使用的核酸序列
实施例1基于核酸核酶与环状向导RNA调控的Cas12a系统并构建生物传感器的技术路线
本申请基于核酸核酶与环状向导RNA调控的Cas12a系统并构建生物传感器的技术路线主要包括以下步骤：(1)CcrRNA对Cas12a系统的调控可行性验证，探究CcrRNA对Cas12a蛋白顺式切割和反式切割动力学的影响；(2)Cas12a-crRNA结合亲和力表征；(3)构建基于核酸核酶激活的Cas12a系统；(4)构建ATP和两种致病菌的生物传感器，探究该传感器对目标物检测的灵敏度、选择性，并用于实际临床样本的诊断，探究用于临床诊断的灵敏度和特异性。
实施例2探究CcrRNA对Cas12a功能的调控
本发明构建的基于核酸核酶与CcrRNA调控Cas12a系统的原理图如图1所示，是基于CcrRNA可以降低Cas12a对DNA的切割活性，因此本发明首先探究CcrRNA对Cas12a功能的调控影响，主要包括CcrRNA对Cas12a顺式切割dsDNA的反应动力学以及反式切割ssDNA的反应动力学影响。
(1)CcrRNAii的制备：5’磷酸化LcrRNA(如LcrRNAi、LcrRNAii，100pmol)首先与连接模板(如LTi、LTii，110pmol)和10μL 10×T4 RNA Ligase2(T4RL2)缓冲液(500mM Tris盐酸，20mM氯化镁，10mM DTT,4mM ATP)混合，加热至90℃2分钟，然后在室温(RT)下冷却15分钟；向该混合物中加入50U的T4RL2、100U的RNase抑制剂和无核酸酶的水，使总体积为100μL，37℃反应2小时后，所得CcrRNAii分子通过乙醇沉淀浓缩，10％dPAGE(8M尿素)纯化。
(2)制备顺式切割底物双链DNA：在50μL的1×HB缓冲液中，NTS(500pmol)与TS(100pmol)在95℃下变性5分钟，然后梯度冷却(1℃/min)至RT。
(3)CcrRNA对Cas12a顺式切割dsDNA的动力学：5’标记FAM的TSii和NTSii用于制备dsDNAii。Cas12a(5pmol)在室温下与CcrRNAii(41nt)或LcrRNAii(2.5pmol)在50μL含有1U/μLRNase抑制剂的1×CCB中预组装10分钟。将1.25μL 2μM FAM标记的dsDNAii添加到混合物中，并分别在37℃下孵育5、10、20、40和60分钟，然后在90℃下加热10分钟以灭活Cas12a。通过15％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析反应混合物。
(4)CcrRNA对Cas12a反式切割ssDNA的动力学：Cas12a(10pmol)首先与dsDNAii(10pmol)、CcrRNAii或LcrRNAii(10pmol)在37℃下50μL含有1U/μL RNase抑制剂的1×CCB中预组装30分钟。添加3.75μL 10μM的FQ-ssDNA报告基因，然后使用Cary Eclipse荧光分光光度计在37℃下实时测量荧光强度60分钟，每30秒进行一次荧光测量(λex：495nm；λem：520nm)。
实验结果如图2所示，CcrRNA可使Cas12a对dsDNA的切割活性降低5倍，对ssDNA的非特异性切割活性降低30倍。
实施例3CcrRNA与Cas12a的亲和力表征
(1)点印迹实验
通过喷蜡打印机(Xerox ColourQube 8570N)在硝化纤维膜(Millipore HF120)上打印直径为4mm的圆形测试区，120℃加热2min使蜡融进膜，形成疏水屏障。将1μL的Cas12a(148ng/uL)点样在每个测试区。室温干燥10分钟后，用10μL含有1％BSA的1×BB溶液封闭30分钟。用20μL 1×WB洗涤两次后，加入10μL 100nM FAM标记的LcrRNAii或CcrRNAii，孵育30分钟。将纸板置于2mL 1×WB的槽中洗涤5分钟，干燥后，利用荧光成像仪扫描成像。
通过点印迹实验的定性分析，图3a显示LcrRNAii与Cas12a结合的亲和力明显较好，而与CcrRNAii的结合亲和力较差。
(2)荧光各向异性分析
结合反应在100μL 1×BB中进行，缓冲液中含有5nM的FAM标记的LcrRNAii(或CcrRNAii)、不同浓度的Cas12a和1U/μL RNase抑制剂。RT孵育30分钟后，在激发波长485nm和发射波长520nm的条件下，用酶标仪测量荧光各向异性值。
通过荧光各向异性的定量分析，图3b显示LcrRNAii与Cas12a结合Kd值为42±8nM；CcrRNAii与Cas12a结合Kd值为260±20nM，表明CcrRNAii与Cas12a的亲和力和CcrRNAii与Cas12a的亲和力LcrRNAii相比，下降了6倍。
实施例4构建核酸核酶激活的CcrRNA的Cas12a系统(NA3C)
实施例4主要包括基于核糖核酶(HH15)激活的Cas12a系统以及基于脱氧核酶(10-23DNAzyme)激活的Cas12a系统，具体实验步骤如下：
(1)HH15(或10-23DNAzyme)对CcrRNAi(或CcrRNAii)的切割：将1.25μL 2μMCcrRNAi(或CcrRNAii)、1.25μL 100μM HH15(或10-23DNAzyme)、2μL 500mM Tris-HCl(pH 7.5)和5μL无核酸酶水混合，并在90℃下加热3分钟，冷却至室温。然后加入10μL 100mM氯化镁溶液和0.5μL RNase抑制剂(40U/μL)，使总体积为20μL。然后将反应混合物在室温下孵育60分钟。所得混合物用于以下分析。
(2)CcrRNA切割产物的dPAGE分析：将10μL上述切割混合物与10μL 2×RNA上样缓冲液(95％(v/v)甲酰胺、0.02％(w/v)SDS、0.02％(w/v)溴酚蓝、0.01％(w/v)二甲苯氰醇、1mM EDTA)混合。利用20％dPAGE凝胶分离混合物，然后在室温下用1×SYBR Gold染色10分钟，荧光成像仪扫描成像。利用Image Quant软件计算HH15(或10-23DNAzyme)切割产生的条带的荧光强度。
(3)FQ-ssDNA切割的动力学分析：将20μL上述切割混合物与5μL 10×CCB、1.25μLRNase抑制剂(40U/μL)、1μL 10μM Cas12a和1μL 10μM dsDNAi(或dsDNAii)混合。在37℃下孵育30分钟后，加入18μL无核酸酶水和3.75μL 10μM FQ-ssDNA(总体积：50μL)。然后使用Cary Eclipse荧光分光光度计在37℃下实时测量荧光强度60分钟，每30秒进行一次荧光测量(λex：495nm；λem：520nm)。
图4显示HH15(或10-23DNAzyme)可以切割CcrRNAi(或CcrRNAii)释放出LcrRNAi(或LcrRNAii)，且释放出来的LcrRNAi(或LcrRNAii)能够激活Cas12a的切割活性，对FQ-ssDNA信号分子进行反式切割，恢复荧光。
实施例5基于NA3C系统生物传感器检测ATP和两种致病菌(大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌)
(1)ATP检测：ATP适体核酶(ClassⅠ(a))对CcrRNAa的切割实验除了使用FAM标记的CcrRNAa，其余步骤与实施例4(1)相同。在ATP检测实验中，1.25μL 2μM FAM标记的CcrRNAa、2μL 500mM Tris盐酸(pH 7.5)、1.25μL 100μM Class I(a)和12μL无核酸酶水在90℃下变性3分钟。冷却至室温后，分别加入2μL不同浓度的ATP(0、1、5、10、100、500、1000、5000和10000μM)、1μL 100mM氯化镁和0.5μL RNase抑制剂(40U/μL)，在室温下孵育60分钟；分别取20μL上述切割混合物与5μL10×CCB、1.25μL RNase抑制剂(40U/μL)、1μL 10μM Cas12a和1μL 10μM dsDNAi混合，在37℃下孵育30分钟后，加入18μL无核酸酶水和3.75μL 10μM FQ-ssDNA(总体积：50μL)，在37℃下测量荧光强度60分钟。
同时分别使用1mM UTP、CTP和GTP进行上述的实验，探究ATP检测的特异性，结果如图5e所示。
图5显示，NA3C系统释放的荧光强度与ATP的浓度成正比，检出限低至500nM，同时对UTP、GTP、CTP没有响应，对ATP具有良好的选择性。
(2)致病菌检测：大肠杆菌(CICC 23796)、铜绿假单胞菌(ATCC 9027)和唐菖蒲伯克霍尔德菌(CICC 10574)在5mL Luria Bertani(LB)中生长过夜；肺炎克雷伯菌(ATCC13883)在5mL胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中过夜生长，并在37℃培养箱下连续摇动，直到培养物的OD600达到～1。取1mL培养物在4℃下以11,000g离心10分钟。在0℃下将细胞沉淀悬浮在100μL 1×ERB中。将细菌细胞超声1分钟，然后在4℃下以11,000g离心10分钟。得到的胞内混合物(CIM)用于以下实验。
检测大肠杆菌时：将10μL 2×ERB、1.25μL 2μM CcrRNAb、1.25μL 100μM EC1(SEQID NO：19)和1μL无核酸酶水混合，在90℃下加热3分钟，冷却至室温。随后加入1.5μL RNase抑制剂(40U/μL)和5μL不同浓度的大肠杆菌CIM(107、106、105、104、103、102和0CFU/mL)，将反应混合物在室温下温育30分钟。将20μL上述反应混合物与5μL 10×CCB、1.25μL RNase抑制剂(40U/μL)、1μL 10μM Cas12a和1μL 10μM dsDNAii混合。在37℃下孵育30分钟后，加入18μL无核酸酶水和3.75μL 10μM FQ-ssDNA(总体积：50μL)。将反应混合物在37℃下测量荧光强度60分钟。探究特异性时，使用106CFU/mL浓度的铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、唐菖蒲伯克霍尔德菌的CIM进行上述实验。检测肺炎克雷伯菌时，所用到的环状向导RNA为CcrRNAb，核酸核酶序列为KP6(SEQ ID NO：20)，除此之外实验步骤与检测大肠杆菌相同。
通过NA3C对两种致病菌(大肠杆菌、肺炎克雷伯菌)的检测性能结果如图5和图6所示，荧光强度与大肠杆菌或肺炎克雷伯菌的浓度均成正比，对两种致病菌的检出限均低至102CFU/mL，同时对干扰菌没有响应，具有很高的特异性。
实施例6利用NA3C检测临床尿液中的大肠杆菌
NA3C检测临床尿液中大肠杆菌的具体流程如图8a所示，包括大肠杆菌细胞收集，细胞裂解，NA3C反应等过程，具体操作如下：
(1)细胞收集：11000g离心10分钟收集样品(1mL)中的细菌细胞。
(2)细胞裂解：1×WB洗涤两次后，将细胞沉淀悬浮于500μL 1×ERB中，0℃，超声1min。然后将细胞悬液在4℃下以11,000g离心5分钟以获得CIM-EC。
(4)NA3C：将5μL CIM-EC、10μL 2×ERB、1.25μL 2μM CcrRNAb、1.25μL 100μM EC1、1μL无核酸酶水、1.5μL RNase抑制剂(40U/μL)在室温下孵育30分钟。然后将20μL上述反应混合物与5μL 10×CCB、1.25μL RNase抑制剂(40U/μL)、1μL 10μM Cas12a和1μL 10μM dsDNAii混合。在37℃下反应30分钟后，加入18μL无核酸酶水和3.75μL 10μM FQ-ssDNA(总体积：50μL)。将反应混合物在荧光分光光度计中在37℃下孵育30分钟。
通过上述实验步骤，本发明测试了20个培养阳性和20个培养阴性的尿液样本(图7)，基于常用的临床阈值(1,000CFU/mL)，NA3C的检测结果为22个阳性样本，18个阴性样本(图8b)。相对于标准培养方法的阳性预测一致性(PPA)和阴性预测一致性(NPA)分别为100％和90％。受试者工作特征曲线下面积(AUC)为0.978，表明NA3C具有用于临床诊断的潜力。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
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uaacuauga 69
<210> 7
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctatgaactg actatgacct cactaccaag uaauuucuac uaaguguaga ugaucguuac 60
gcuaacuaug a 71
<210> 8
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 8
aggcaaccua cggcau 16
<210> 9
<211> 16
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 9
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<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 10
agaaauuauu uuuuuuuu 18
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<212> RNA
<213> 人工序列
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gggcaaccua cggcau 16
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<212> RNA
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<400> 12
ccauagcuag gaagaguuca uaguuagcgu aacg 34
<210> 13
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<212> RNA
<213> 人工序列
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ucauagucag uucauaguca uaguuagcgu aacg 34
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<400> 14
ggcgacccug augaggccga aaggccgaaa cggu 34
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<212> RNA
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ggcgaccuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuua cggu 34
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<212> DNA
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tagtagaaat taggctagct acaacgacat agtt 34
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tagtagaaat taaaaaaaaa aaaaaaacat agtt 34
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<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 18
gggcgacccu gaugagccuu gggaagaaac uguggcacuu cggugccagc acgucgaaac 60
ggu 63
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tcttgatcga acctgcgacc ggaagagttt gtgtg 35
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
atgccatcct accaaccatg actggtttgt actaagagat ttcaggcatc gctgcacgtc 60
gtaggtgagc tctgaactcg 80
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<212> DNA
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tagcattcca cagacagccc tacggcattt tttttttttt taaagttttg tcgtc 55
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<211> 55
<212> DNA
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<400> 22
gacgacaaaa ctttaaaaaa aaaaaaaatg ccgtagggct gtctgtggaa tgcta 55
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tagcattcca cagacagccc tcatagttag cgtaacgatc taaagttttg tcgtc 55
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<211> 55
<212> DNA
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<400> 24
gacgacaaaa ctttagatcg ttacgctaac tatgagggct gtctgtggaa tgcta 55
<210> 25
<211> 4
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ttatt 4
Claims (4)
1.一种基于核酸核酶与CcrRNA调控Cas12a的NA3C系统，其特征在于，所述的系统包括Cas12a、CcrRNA和核酸核酶；所述的核酸核酶包括核苷酸序列如SEQ ID NO：14-20所示的核酸核酶；
所述的CcrRNA通过线性LcrRNA模板和RNA连接模板连接环化获得；所述的LcrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-7所示；所述的RNA连接模板的核苷酸序列如SEQ ID NO：8-13所示；
所述的NA3C系统包括顺式切割底物dsDNA和反式切割底物ssDNA；所述的dsDNA的核苷酸序列由SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22连接构成或者由SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24连接构成；所述的ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示；
所述的ssDNA序列的两端分别修饰FAM荧光基团和Dabcyl猝灭基团，Cas12切割ssDNA后，使得荧光基团与猝灭基团分离，产生荧光信号。
2.根据权利要求1所述的NA3C系统，其特征在于，所述的NA3C系统包括缓冲溶液、RNase抑制剂、氯化镁溶液。
3.根据权利要求2所述的NA3C系统，其特征在于，所述的缓冲溶液包括Tris-HCl和Cas12a切割缓冲液，Cas12a切割缓冲液组成为：20mM Tris盐酸，100mM氯化钾，5mM氯化镁，1mM DTT，5％丙三醇，50μg/mL肝素钠，pH 7.5。
4.权利要求1-3任一项所述的NA3C系统在制备生物传感和临床诊断试剂方面中的应用。
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