CN114214464A

CN114214464A - 一种人类疱疹病毒8型的引物组合物、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN114214464A
Application number: CN202210008175.1A
Authority: CN
Inventors: 李论; 彭海; 高利芬; 方治伟; 万人静; 陈利红; 李甜甜; 周俊飞; 肖华峰
Original assignee: Jianghan University
Current assignee: Jianghan University
Priority date: 2022-01-04
Filing date: 2022-01-04
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2042-01-04
Also published as: CN114214464B

Abstract

本发明公开了一种人类疱疹病毒8型的MNP分子标记、引物对组合物、试剂盒及其应用。所述引物包括5对引物中的至少一对，所述引物对均包括正向引物和反向引物，引物序列如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.15所示。所述引物特异的鉴定HHV‑8的5个MNP分子标记，是指在HHV‑8基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域。所述引物互不干扰，可一次性对多样本的所述MNP标记进行序列分析，用于HHV‑8的特异鉴定，遗传变异检测和指纹数据库构建；包含了所述引物的所述试剂盒对HHV‑8具有免培养、高通量、多靶点、高灵敏、免培养的检测优势，对HHV‑8的科研和防疫监测均具有重要意义。

Description

一种人类疱疹病毒8型的引物组合物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明实施例涉及生物技术领域，特别涉及一种人类疱疹病毒8型的引物组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

疱疹病毒生物分类归属于疱疹病毒科，有分α、β、γ三个亚科，分别称之α疱疹病毒、β疱疹病毒和γ疱疹病毒，存在于人和动物体内，与人类感染有关者包括:α疱疹病毒(单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒)；β疱疹病毒(巨细胞病毒、人疱疹病毒6型即HHV-6和7型即HHV-7)和γ疱疹病毒(EB病毒、人疱疹病毒8型即HHV-8)。不同亚科的疱疹病毒感染特性不同，比如，α疱疹病毒其宿主范围广，复制周期短，繁殖速度快，是一类溶细胞性感染的病毒，多潜伏在感觉神经节内；β疱疹病毒的宿主范围窄，在细胞培养中复制缓慢，繁殖周期长，受感染细胞变大形成巨细胞，病毒在淋巴细胞内潜伏感染，也可潜伏于分泌腺、肾脏或其他组织；γ疱疹病毒主要感染B淋巴细胞并长期潜伏，大多不引起溶细胞性病变。

现有的筛查技术是通过镜检、分离培养、免疫学检测或经DNA探针进行原位杂交，在检测周期、复杂度、交叉反应、检测变异、准确性、灵敏度等方面存在一个或多个局限，病毒的分离培养尤其困难，现有技术难以特异鉴定一种疱疹病毒，因此，开发每种疱疹病毒特异的检测技术，包括分子标记、引物和试剂盒等，实现特定疱疹病毒的精准特异检测，成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明目的是提供一种鉴定人类疱疹病毒8型(HHV-8)的分子标记、引物组、试剂盒及应用，可以对HHV-8进行定性鉴定和变异检测，具有高通量、高准确、高特异、高灵敏的效果。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第二方面，提供了一种鉴定(HHV-8)的引物组合物，所述多重PCR引物组合物包括5对引物对中的至少一对。每个MNP标记的引物包括正向引物和反向引物。

在本发明的另一方面，提供了一种用于鉴定HHV-8试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。

又一方面，本发明实施例提供了一种引物组的应用，所述应用包括：利用所述引物组对HHV-8基因组上的5个MNP标记中的至少一个进行检测，根据获得的MNP标记的序列进行非诊断目的的HHV-8的定性鉴定、HHV-8内部的遗传变异鉴定、HHV-8毒株间的遗传变异鉴定、MNP指纹数据库的构建，所述5个MNP标记的序列如序列表中SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.5所示。

MNP标记是一种新型分子标记，是指在基因组上一段区域内由多个核苷酸引起的多态性标记。与SSR标记和SNP标记相比，MNP标记具有以下优势：(1)等位基因丰富，单个MNP 位点上有2ⁿ种等位基因，高于SSR和SNP，适用于群体生物的鉴定；(2)物种区分能力强，只需要少量的MNP标记就能实现物种鉴定，减少了检测错误率。

鉴于以上优点和特性，MNP标记及检测MNP标记的技术可实现群体生物多等位基因型的分类与溯源，在病原微生物的鉴定、指纹数据库构建、遗传变异检测等方面都具有应用潜力。本发明在HHV-8领域属于首创，并未见相关文献报道；本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明实施例提供的引物组互相间不冲突，可以通过多重PCR对HHV-8的MNP标记进行高效的扩增和序列分析，对HHV-8的鉴定具有较高的特异性和稳定性；使用该引物组的试剂盒能灵敏的检测到低至10拷贝/反应的HHV-8，每个样品不同文库间、不同建库批次间检测的重现率和准确率为100％。在复杂模板中检测HHV-8的高特异性，可用于非诊断目的的HHV-8的定性鉴定、HHV-8内部和毒株间的遗传变异鉴定、MNP指纹数据库的构建和HHV-8的精细分型鉴定。

具体实施方式下文将结合具体实施例，具体阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些具体实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本发明实施例提供的HHV-8菌株或样本的来源为湖北省疾病预防控制中心赠予。

实施例一本发明提供了一种鉴定HHV-8的引物组，该引物组包括：第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对中的至少一对，每对引物对均包括正向引物和反向引物。

所述第一引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO.6所示，所述第一引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO.11所示，所述第二引物对的正向引物如序列表中SEQ IDNO.7所示，所述第二引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO.12所示，所述第三引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO.8所示，所述第三引物对的反向引物如序列表中SEQ IDNO.13所示，所述第四引物对的正向引物如序列表中SEQ ID NO.9所示，所述第四引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO.14所示，所述第五引物对的正向引物如序列表中SEQ IDNO.10 所示，所述第五引物对的反向引物如序列表中SEQ ID NO.15所示。

本发明实施例提供了一种HHV-8的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组。

具体地，该试剂盒还可以包括多重PCR预混液。

本发明实施例提供的引物具体如表1所示。

表1为引物组的序列

MNP标记名称	正向引物	反向引物
			MNP-1	AGATATTCTTAGTTGTCGTGTCCGG	GGCTCCTTGCGATGAACCA
MNP-2	GGTGCGTATGCTCACGTGA	GAAGGTTGTCAGAGGGATCCATC
			MNP-3	CCTACGCCAGCTACGTTGT	GGCCTTGTCACCTTCCACA
MNP-4	ATCCTCCCCCTCCCATGTTT	ACAAGAATATATTCCAGTCTATGTACTACA
			MNP-5	GAATGCTACTTTGTGGTGGACA	CTTGACGATCGTCTGATTCTGC

评估该引物组的性能，具体如下：

将拷贝数已知的HHV-8的核酸加入到人基因组DNA中，该人基因组DNA的来源为本实验室保存的人Huh-7细胞系，分别制备成1拷贝/反应、10拷贝/反应和100拷贝/反应的HHV-8模拟样本，同时，设置等体积的无菌水作为空白对照(即0拷贝/反应的样本)。结果共计鉴定了如表2所示的0拷贝/反应、1拷贝/反应、10拷贝/反应和100拷贝/反应4个样本，每个样本每天使用本发明实施例提供的试剂盒构建3个重复文库，连续构建4天，即每个样本获得12个文库，4个样本共计获得48个文库。48个文库按照等摩尔量进行混合，混合后进行二代测序，每个样本获得12个测序片段组，4个样本获得共计48个测序片段组。

文库构建时采用本发明实施例提供的试剂盒对样本进行扩增，得到扩增产物，将该扩增产物连接上购买的商业化样本标签，获得适用于高通量测序的文库并对该文库进行高通量测序，测序结果具体如表2所示。

表2为试剂盒鉴定HHV-8的48个文库的分析结果

表2中：0拷贝/反应的样本均为空白对照组，其它3个梯度的样本均为阳性样本组。

如表2所示，所述试剂盒能在10拷贝/反应的样本中稳定的检出3个以上MNP位点，而在0拷贝/反应的样本中未检出MNP位点，所述试剂盒能够明显区分10拷贝/反应和0拷贝/反应的样品，具有技术稳定性和低至10拷贝/反应的检测灵敏度。

针对稳定性和灵敏度的评估

结合表2可知，在每个样本的12组重复实验中(每天3个重复，共计重复4天)，空白对照和HHV-8核酸标准品中均稳定地检出数目接近的HHV-8的MNP标记，可见本发明实施例提供的试剂盒鉴定HHV-8的稳定性良好。在10拷贝/反应的样本能稳定地检出全部5 个本发明实施例提供的MNP标记，而在0拷贝/反应的部分样本且最多能检出1的MNP标记，可见本发明实施例提供的试剂盒鉴定HHV-8的灵敏度可低至10拷贝/反应。

针对重现率和准确率的评估

基于每个样本的12组重复实验，任意两次重复实验中，采用共同检出的MNP标记的基因型是否可重现用于评估鉴定HHV-8的重现率和准确率。具体地，对100拷贝/反应的样本的12组数据分别进行成对比较，主基因型存在差异的MNP标记数目都为0；依据2组重复实验间可重现的基因型认为是准确的原则进行评估，准确率a＝1-(1-r)/2＝0.5+0.5r，式中 r代表重现率，重现率为主基因型可重现的位点数目占共有位点数目的比率。结果如表3所示。

表3为重现率和准确率的评估

由表3可知，重现率实验中每个样本的不同文库间和不同建库批次间共同鉴定MNP标记的主基因型存在差异的数目为0，即重现率r＝100％，准确率a＝100％。

针对质控方案和检出判定阈值的制定

由于MNP标记鉴定方法的极度灵敏，有可能在鉴定过程中由于气溶胶的污染导致出现假阳性的结果。本组实验设置了0拷贝/反应的样本的空白对照样本，1个拷贝/反应和10 拷贝/反应的弱阳性的样本，并进行了连续4天的重复鉴定，可用于质控体系污染和目标病原体检出的阈值和判定标准。

质控方案具体如下：

1)测序数据量大于20兆碱基。依据是：基于对空白对照样本，1个拷贝/反应和10拷贝/反应的弱阳性样本的多次检验，测序数据量达到20兆碱基时，所有10拷贝/反应的样品能够一次测试成功，低于20兆碱基时，部分10拷贝/反应的样品出现检出MNP标记数目少于3个的情况，且经过增加测序量也难以达到检出3个MNP标记。

2)根据测试样本中的HHV-8的信号指数S_T和空白对照中HHV-8的噪音指数S_c判定污染是否可以接受，其中：

空白对照的噪音指数S_c＝n_c/N_c，其中n_c和N_c分别代表空白对照中的HHV-8的测序片段的数量和总测序片段的数量。

测试样本的信号指数S_t＝n_t/N_t，其中n_t和N_t分别代表测试样本中的HHV-8的测序片段的数量和总测序片段的数量。

根据预期的检测下限，根据在含HHV-8的量呈梯度的测试样本和平信测定的空白对照中的HHV-8信噪比R值，即S_t和S_c的比值，设置污染是否可以接受的阈值。

3)统计每个样本中MNP标记的检出数目。

在本实施例中，信号指数/噪音指数的比值(信噪比)具体如表4所示，在本实施例表 4中，信噪比中的信号指数和噪音指数均为12组实验数据的平均值。

表4为样本中HHV-8的信噪比

结果如表4所示，HHV-8在空白对照中的噪音指数值最大是0.00001，在1拷贝/反应的12组数据中，HHV-8的最小信噪比是28。为了保证准确，并兼顾灵敏度，本发明实施例设置的R值至少要达到10，即样本中信号指数至少是空白对照中噪音指数的10倍。

为了避免少数污染位点过度扩增带来的高信噪比，本发明同时将检出位点数目作为判定条件之一。如表2所示，在1拷贝/反应的12组数据中，不是每次都能够稳定的检出HHV-8。在1拷贝/反应的12组数据中，能检出最多2个MNP位点。

基于实际临床样本的高复杂度，为了兼顾灵敏度，本发明规定同时采用检出位点数目和信噪比两个参数进行结果的判定，具体如下：

1)当检出标记数目不小于3个且信噪比不小于10时，判定样本中检出HHV-8的核酸；

2)当检出标记数目为0个或信噪比不大于1时，判定样品中未检出HHV-8的核酸；

3)其余情况判为样品中疑似检出HHV-8的核酸。

由此可见，该引物组能灵敏地鉴定到低至10拷贝/反应的HHV-8，具有极高的鉴定灵敏度和稳定性。

针对特异性的评估

人为的将HHV-8和水痘带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、人博卡病毒、人类疱疹病毒6型(HHV-6)和7型(HHV-7)、肺炎克雷伯杆菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌的DNA按照等摩尔量的混在一起，制备混合模板，和空白对照一起，采用本发明所提供的方法对混合模板中的HHV-8进行检测，进行3个重复实验。经序列比对，获得的序列都能特异的比对到HHV-8的5个MNP位点。按照所述的质控方案和判定阈值进行分析后，在3个重复实验中HHV-8的信噪比均为无穷大，检出的MNP位点数目均为5个，鉴定结论为检出HHV-8。表明所述MNP标记和所述试剂盒在复杂模板中检测目标微生物的高特异性。

实施例二本发明实施例提供了一种引物组的应用，该应用包括：利用所述引物组对 HHV-8基因组上的5个MNP标记进行鉴定，根据获得的MNP标记的序列进行HHV-8菌株间的遗传变异鉴定，5个MNP标记的序列如序列表中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5所示。

下面简单介绍一下MNP(多核苷酸多态性)标记的制备方法：

基于网上公开的4102个HHV-8不同分离株的基因组完整或部分序列，通过序列比对，获得5个MNP标记。对于网上不存在基因组数据的物种，也可以通过高通量测序获得待鉴定微生物物种代表小种的基因组序列信息，其中高通量测序可以是全基因组或简化基因组测序。为了保证所筛选标记的多态性，一般使用至少10个遗传上具有代表性的分离株的基因组序列作为参考。选择HHV-8的一个或多个代表株的基因组序列作为参考基因组，将该基因组序列和参考基因组进行序列比对，获得HHV-8各毒株的单核酸多态性位点；

在参考基因组上，以100-300bp为窗口，以1bp为步长进行窗口平移，筛选获得多个候选MNP标记区域，其中，候选MNP标记区域含有≥2个单核苷酸变异位点，且两端各30bp 的序列上均不存在所述单核酸多态性位点；

在候选多核苷酸多态性位点区域中筛选区分度DP≥0.2的区域作为MNP标记；其中， DP＝d/t，t是在候选多核苷酸多态性位点区域中所有小种两两比较时的比较对数，d是在候选多核苷酸多态性位点区域中至少两个单核酸多态性差异的样品对数。获得如序列表中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5所示的MNP标记(MNP-1～MNP-5)，MNP-1～MNP-5在参考序列上的起始位置如表5所示，且MNP-1～MNP-5的序列如序列表中SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.5所示。

表5为MNP标记在参考序列上的起始位置

利用本发明实施例提供的引物组对同一个HHV-8的不同时期的6份拷贝毒株进行鉴定， 6份拷贝毒株依次命名为S-1～S-6，每个毒株的测序平均覆盖倍数达2320倍，每个毒株均可以检出表5中全部5个MNP标记。将6个毒株的指纹图谱进行两两比对，结果如表6所示。

表6为6份拷贝毒株的鉴定分析

由表6可知，有1份(S-2)拷贝毒株和同批次一起鉴定的5份拷贝毒株均存在部分位点的主基因型差异，可见同一个HHV-8的不同时期存在毒株间变异。使用引物组鉴定菌株间遗传变异可以用于保证不同实验室相同命名HHV-8毒株的遗传一致性，从而保证研究结果的可比较性，这对于HHV-8的科学研究具有重要意义。而在临床上，可针对差异位点是否影响抗药性斟酌诊断方案。

实施例三本发明实施例提供了一种引物组的应用，应用包括：利用引物组对HHV-8基因组上的5个MNP标记进行HHV-8内部的遗传变异鉴定，5个MNP标记的序列如序列表中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5所示。

HHV-8作为群体生物，在保存和繁殖的过程中，部分个体会发生变异，形成杂合的群体，从而影响试验用HHV-8表型的稳定性和一致性。这种变异体在对群体进行分子标记检测时，表现为位点的主基因型以外的等位基因型。当变异个体占群体的极少部分时，变异个体表现为低频率的等位基因型。低频率的等位基因型和技术错误混在一起，导致现在的技术难以区分，需要判定鉴定到的次等位基因型的真实性。

本实施例次等位基因型的真实性评估按如下进行：首先按照以下规则排除具有链偏好性(在DNA双链上覆盖的测序序列数的比值)的等位基因型：链偏好性大于10倍，或者与主等位基因型的链偏好性之差大于5倍。

不存在链偏好性的基因型基于表6测序序列数目和比例判定其真实性。表7列出了基于BINOM.INV函数计算在α＝99.9999％的概率保障下，与主基因型存在1个(n＝1)或多个 (n≥2，即MNP)SNP的等位基因型的技术错误率e_max(n＝1)和e_max(n≥2)分别为1.03％和0.0994％时，在各个位点中次等位基因型的测序序列数目需满足的临界值。只有次等位基因型的测序序列数目超过临界值时判定为真实的次等位基因型。当存在多个候选次等位基因时，对各候选等位基因型的P值进行多重校正，FDR(False Discovery Rate，错误发现率)<0.5％的候选等位基因判定是真实的次等位基因型。

表7为部分测序深度下进行判定次等位基因型的临界值

表7涉及到的参数e_max(n＝1)和e_max(n≥2)指的是在本实施例中调查的930个纯合MNP位点中，获得的和主基因型存在n个SNP的次等位基因的频率的最大值。次等位基因型的频率是指该次等基因型的测序序列数占所在MNP标记总测序序列数的比例。

按照上述参数，将表6中展示的基因型存在差异的两个毒株的核酸分别按照以下8个比例：1/1000、3/1000、5/1000、7/1000、1/100、3/100、5/100和7/100进行混合，得到人工杂合样本，每个人工杂合样本重复检测3次，获得共计24个测序数据。通过和两个毒株的如序列表中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5所示的MNP标记的基因型进行精准比对，在 24个人工杂合样本中均鉴定到了存在真实次等位基因型的位点，这说明本发明实施例提供的如序列表中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5所示的MNP标记适用于HHV-8内部的遗传变异鉴定。在本实施例中，采用上述5个MNP标记共同进行HHV-8内部的遗传变异鉴定，在其他实施例中，还可以采用上述5个MNP标记中的任一个或任意几个的组合进行HHV-8内部的遗传变异鉴定。

实施例四本发明实施例提供了一种引物组的应用，应用包括：利用引物组对HHV-8基因组上的5个MNP标记进行检测，根据获得的MNP标记的序列进行MNP指纹数据库的构建，5个MNP标记的序列如序列表中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5所示。

将实施例二提供的6份拷贝毒株S-1～S-6,利用常规CTAB法提取用于构建HHV-8DNA指纹数据库的所有毒株的DNA，采用琼脂糖凝胶电泳进行收集，得到产物，将产物通过紫外分光光度计检测DNA的质量。若所提取的DNA在230nm与260nm处的吸光度值的比值大于2.0， 260nm与280nm吸光度值比值介于1.6与1.8之间，且DNA电泳主带明显，则说明基因组 DNA达到相关的质量要求，可进行后续序列比对。

将实施例二提供的6份毒株S-1～S-6的测序数据进行序列比对后，获得每个毒株的序列表中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5所示的MNP标记的主基因型，从而形成每个毒株的MNP 指纹图谱，录入数据库文件，构建成HHV-8DNA指纹数据库。所构建的MNP指纹数据库基于检测的毒株的基因序列，因此和所有的高通量测序数据兼容。通过将每次检测获得的毒株的MNP指纹图谱同已构建的MNP指纹数据库进行比对，将主基因型存在差异的毒株的MNP指纹图谱所构建的MNP指纹数据库，实现数据库的共建共享和时时更新。在本实施例中，采用上述5个MNP标记共同进行MNP指纹数据库的构建，在其他实施例中，还可以采用上述5个MNP标记中的任一个或任意几个的组合进行MNP指纹数据库的构建。

实施例五本发明实施例提供了一种引物组的应用，应用包括：利用引物组对HHV-8基因组上的5个MNP标记进行检测，根据获得的MNP标记的序列进行HHV-8精细分型中的应用，5个MNP标记的序列如序列表中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5所示。

利用本发明实施例一提供的引物组对上述6份HHV-8毒株进行检测，获得了每个毒株 MNP指纹图谱。将每个毒株的DNA指纹图谱进行两两比对和与构建的指纹数据库以及公开的 HHV-8分离株的基因组序列进行比对，与已有的指纹数据库相同的，为已有的变异株；至少在一个MNP标记存在主基因型差异的，定义为新的变异株，实现对HHV-8的精细分型。对6 份HHV-8毒株的检测如表7所示，所检测的6份HHV-8有1份和其它5份在5个MNP标记的主基因型存在差异，为不同的变异变型。5份指纹图谱一致的毒株和已有的菌株的基因型一致，为已有的变异株。因此，该应用对HHV-8的分辨率达到了单碱基的水平，可以实现对样本中HHV-8的精细分型。在本实施例中采用上述5个MNP标记共同进行HHV-8的精细分型，在其他实施例中也可以采用上述5个MNP标记中的任一个或任几个的组合进行HHV-8 的精细分型。

实施例六本发明实施例提供了一种引物的应用，应用包括:分别应用第一引物对，第二引物对，第三引物对，第四引物对和第五引物对为引物，采用本发明提供的试剂盒，对表2所示的100拷贝/反应的HHV-8标准品进行检测，获得5组测序数据。对每组数据进行分析，每对引物对检测到的序列都仅能比对到如表1所示的对应的MNP标记，表明每个引物对都能检出对应的MNP标记。而本发明所筛选的MNP标记是HHV-8基因组上特异的，如特异性评价部分实施例所示，从而表明每对引物对都可以用来鉴定低至100拷贝/反应的 HHV-8。

另外，本实施例还以第一引物对，第二引物对，第三引物对，第四引物对和第五引物对分别为引物，采用商业化的荧光定量PCR试剂盒(货号：AQ111-01，北京全式金生物技术有限公司)，按照厂家的使用说明书，在ABI公司的Stepone Plus荧光PCR仪上，对表2 所示的10拷贝/反应的HHV-8标准品进行检测，以无菌水为空白对照，共进行5组检测，每组进行三个重复，结果如表8所示，每对引物对在10拷贝/反应的HHV-8标准品中获得的CT值平均值依次为33.46、33.33、34.56、34.36和34.80，而平行检测的由无菌水组成的空白对照的CT值平均值均在38.3以上。基于CT值小于37可判为样品阳性的行业内通用的荧光PCR判定规则，因此，该应用采用5对引物对中的任意一对可以实现对低至10拷贝/反应的HHV-8的鉴定。

表8五对引物对任一经荧光PCR检测HHV-8的效果

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 江汉大学

<120> 一种人类疱疹病毒8型的引物组合物、试剂盒及其应用

<130> 20211229

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 148

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

agatattctt agttgtcgtg tccggctcca ctccgttatc gcagccacca cagcctgccg 60

tgtaatatcg cctgcggctg cagaaccccc ggtcccggag ggtccttctc ccggtgactc 120

cgacctggat ggttcatcgc aaggagcc 148

<210> 2

<211> 138

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ggtgcgtatg ctcacgtgag acatctccgg actacatcca aattatgcag tatctatcca 60

agtgcacact cgctgtcctg gaggaggttc gcccggacag cctgcgccta acgcggatgg 120

atccctctga caaccttc 138

<210> 3

<211> 140

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cctacgccag ctacgttgtc aggggtgcca accttgtcac cgccgttagc tacggaaggg 60

ctatgagaaa ctttgaacag tttatggcac gcatagtgga ccatcccaat gctctgccgt 120

ctgtggaagg tgacaaggcc 140

<210> 4

<211> 149

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atcctccccc tcccatgttt gccaatgaaa cctgcccttg gcgaagttac tgacctccca 60

gccatgaaat gggacaccct ggccctccaa aacaaggttg tgactagtct ccaccgcggt 120

gtagtacata gactggaata tattcttgt 149

<210> 5

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gaatgctact ttgtggtgga cacgctgacg aaagaggcga tggagcgcat gcccgaaatc 60

caggaatgcg tcccgtctat tactgagcac gcccgtgacc tggcgatctg ggagttggcg 120

ctgcgactgc agaatcagac gatcgtcaag 150

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

agatattctt agttgtcgtg tccgg 25

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

ggtgcgtatg ctcacgtga 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

cctacgccag ctacgttgt 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

atcctccccc tcccatgttt 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gaatgctact ttgtggtgga ca 22

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

ggctccttgc gatgaacca 19

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

gaaggttgtc agagggatcc atc 23

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

ggccttgtca ccttccaca 19

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

acaagaatat attccagtct atgtactaca 30

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

cttgacgatc gtctgattct gc 22

Claims

1.一种人类疱疹病毒8型的MNP分子标记，其特征在于，所述的MNP分子标记的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5中任一核苷酸序列所示，它们分别编号为MNP-1、MNP-2、MNP-3、MNP-4、MNP-5。

2.权利要求1所述的人类疱疹病毒8型的MNP分子标记组合，其特征在于，选自人类疱疹病毒8型的MNP分子标记MNP-1、MNP-2、MNP-3、MNP-4、MNP-5中的两种或更多种。

3.权利要求1所述的人类疱疹病毒8型的MNP分子标记的引物，其特征在于，所述引物序列为序列表中SEQ ID NO.6至SEQ ID NO.15，其中序列SEQ ID NO.6至SEQ ID NO.10为正向引物，SEQ ID NO.11至SEQ ID NO.15为反向引物，SEQ ID NO.6与SEQ ID NO.11用于扩增MNP1，SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.12用于扩增MNP2，以此类推。

4.权利要求3所述的人类疱疹病毒8型的MNP分子标记引物的组合，其特征在于，选自扩增分子标记MNP-1到MNP-5的引物对的两对或更多对。

5.一种鉴定人类疱疹病毒8型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的任一对引物或如权利要求4所述的引物对组合。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。

7.权利要求1所述的人类疱疹病毒8型的MNP分子标记或权利要求2所述的人类疱疹病毒8型的MNP分子标记组合在非诊断目的的人类疱疹病毒8型的定性鉴定、毒株间和毒株内的遗传变异监测、MNP指纹数据库的构建或精细分型鉴定方面的应用。

8.权利要求3所述的人类疱疹病毒8型的MNP分子标记引物或权利要求4所述的人类疱疹病毒8型的MNP分子标记引物组合在非诊断目的的人类疱疹病毒8型的定性鉴定、毒株间和毒株内的遗传变异监测、MNP指纹数据库的构建或精细分型鉴定方面的应用。

9.权利要求5或6所述的试剂盒在非诊断目的的人类疱疹病毒8型的定性鉴定、毒株间和毒株内的遗传变异监测、MNP指纹数据库的构建或精细分型鉴定方面的应用。