CN114208847B - 一种核壳结构糖基化纳米银抗菌材料及其绿色制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核壳结构糖基化纳米银抗菌材料及其绿色制备方法，所述核壳结构中，纳米银单质是核，糖基化涂层作为壳包裹在纳米银核外，所述糖基化涂层是甘露低聚糖糖基化涂层。首先将AgNO3、甘露低聚糖分别溶解于纯水中，然后将AgNO3溶液和甘露低聚糖水溶液混合均匀，25~80 oC水浴锅中反应10~240 min，反应结束后，冷却至室温进行离心沉淀，收集沉淀物溶于纯水中，即得核壳结构表面甘露糖基化纳米银Ag@CL产物。本发明所得的核壳结构表面甘露糖基化纳米银具有良好的抗菌性能，核壳结构的存在对纳米银核具有保护作用，糖基化核壳结构纳米银具有较低细胞毒性、高分散、稳定性。该制备方法简单、绿色、环保，可作为高效抗菌材料的制备大规模推广。

Description

一种核壳结构糖基化纳米银抗菌材料及其绿色制备方法
技术领域
本发明涉及一种制备核壳结构表面糖基化纳米银抗菌材料的绿色方法，属于有机/无机复合纳米材料领域。
背景技术
近年来，随着环境及公共卫生问题的频繁凸现，人们对抗菌材料的需求逐年增大，抗菌功能产品具有广阔的市场前景。纳米银是一种新型无机抗菌材料，其具有抗菌广谱、无耐药性、渗透性强、高效、耐高温等优点，已成为目前研究最广泛的纳米无机抗菌材料。然而，由于纳米材料渗透性强，纳米贵金属细胞毒性问题使得其被实际应用存在诸多争议，要获得销售纳米银产品的批准变得越来越困难；此外，纳米材料表面能高，作为添加剂复配时纳米颗粒易团聚而不容易分散，导致其稳定性不佳，很难实际应用。上述抗菌纳米银行业的两大痛点问题严重限制了纳米银的广泛使用。
核壳结构有机/无机复合纳米银材料正是在解决上述行业痛点问题要求下应运而生，核壳结构有机/无机复合纳米银是在传统纳米银单质颗粒表面通过物理、化学等手段引入一层有机分子保护壳层，壳层厚度通常在几纳米至数十纳米之间，从而有效降低纳米银颗粒表面能，抑制纳米粒子团聚，有效起到增加纳米银分散稳定性的作用；并且在一定程度上壳层分子的特殊理化性质也赋予了核壳结构纳米银材料特殊的理化特性，从而使得材料具有特殊的功能。
然而，传统的核壳结构有机/无机复合纳米银的制备方法主要有两种，一种是AgNO3在还原剂及稳定剂(无机或有机小分子)共同作用下合成纳米银作为核，而后通过大分子层层自组装聚集的方法在纳米银核表面包覆形成壳层，或预先合成端基含Br的巯基功能分子，进而通过金属-巯基成键化学反应在纳米金属核表面引入活性聚合引发剂Br端基，而后再进一步通过在金属核表面引发活性单体聚合反应形成大分子修饰的壳层。这类方法缺点明显，反应步骤多，功能分子化学合成、提纯繁琐，且大分子与纳米银核组装过程中反应体系稳定性差，纳米银容易团聚，目标产物收率极低；另一种是AgNO3与功能小分子在高温或一定pH条件下反应，通过小分子既作为还原剂制备纳米银核，同时又通过小分子自身在特定条件下氧化自聚合特性在纳米银核表面组装包覆形成壳层，从而一锅法制备核壳结构纳米银。例如专利文献CN201910037336.8此前报道了植物多酚单宁酸在pH较大的碱性溶液中，通过多酚分子还原以及氧化自聚合组装机理可一步法有效催化AgNO3还原反应制备核壳结构植物多酚修饰的纳米银。这类方法相对于前面方法步骤简单，只需要一步一锅法反应即可，但是一般小分子催化应动力不足，需要额外向体系提供能量使水溶液处于沸腾状态，如高温加热、微波、高能辐照等；或需要调节体系在特定酸碱条件下，如必须加入强碱弱酸盐、碱物质等使得反应体系成碱性，从而使得体系复杂，稳定性下降，并增加了核壳结构纳米银批量制备生产的成本。以上两类制备核壳结构纳米银的方法的缺陷限制了核壳结构纳米银进一步工业扩大化生产及应用。
糖是一种具有特殊生物学功效的分子，其在生命体中除了作为能量物质，主要以糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖等糖缀合物形式装饰着细胞表面。一方面，作为植物细胞壁和动物细胞外基质的结构组分，其大量极性羟基可以为细胞提供保护屏障；更重要的是，糖作为细胞“身份”的重要标记物，其在细胞识别、粘附、信号传导中均发挥至关重要的作用。将功能糖分子引入纳米金属(金或银)合成体系，制备核壳结构表面糖基化纳米金属(金或银)，不仅能提高纳米金属(金或银)的分散稳定性、生物相容及生物安全性，且表面功能糖分子还赋予纳米金属(金或银)特殊的生物学特性。然而，目前现有制备方法仅仅实现了功能糖小分子以单分子层结构修饰于纳米金/银表面，而并非形成一定厚度的壳结构，高精度TEM显微镜看不到核壳结构，本质是实心纳米金或银单质核颗粒，这种结构不能有效对纳米金或银起到保护作用，对其安全性、稳定性提高效果也不明显。
发明内容
为克服现有核壳结构纳米银抗菌材料制备及应用技术中的不足，开发新型核壳结构糖基化纳米银抗菌功能新材料，本发明提出采用甘露低聚糖作为还原和稳定剂，室温(25℃±5℃)、纯水相、一锅法简单绿色制备核壳结构表面糖基化纳米银并对其抗菌性能做初步考察。
本发明提供了一种制备核壳结构表面糖基化纳米银抗菌材料的绿色方法，操作简单，反应条件温和，所制备的核壳结构表面甘露糖基化纳米银具有优异的抗菌性能，不仅对大肠杆菌E.coli、铜绿假单胞菌P.aeruginosa、金黄色葡萄球菌S.aureus等革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌有优异的抗菌功效，对难以杀灭的真菌如热带假丝酵母菌也有优C.tropicalis异的抗菌效果。且核壳结构表面糖基化纳米银还具有较低细胞毒性，生物安全性高、分散性高、稳定性强的诸多优点。
本发明采用的技术方案如下：
一种核壳结构表面糖基化纳米银抗菌材料的制备方法，采用如下步骤：
(1)将AgNO3溶解于纯水，甘露低聚糖溶于纯水溶液中；
(2)将AgNO3水溶液加入至甘露低聚糖水溶液中，机械搅拌混合均匀；
(3)将混合溶液25～80℃反应10～240min；
(4)将步骤(3)中的反应液冷却至室温离心，收集沉淀物溶于纯水中，即得产物核壳结构糖基化纳米银Ag@CL。
优选地，AgNO3终浓度0.01～100mg/mL，甘露低聚糖浓度为0.01～500mg/mL。所述AgNO3与甘露低聚糖的质量比为1:1～100，随着甘露低聚糖与AgNO3质量比的提高，单质纳米银核直径逐渐降低，而其表面糖基化壳层厚度始终保持在5nm左右不变。
优选地，所述AgNO3与甘露低聚糖与的质量比优选为1:4，制得的核壳结构纳米银平均粒径为25～30nm，其中糖基化壳层厚度为5nm，纳米银核层直径20～25nm。
更优选地，所述步骤(3)反应温度为室温(25℃±5℃)，反应时间为120min。
另外，本发明还要求保护一种采用上述制备方法制备得到的核壳结构表面糖基化纳米银抗菌材料。
所述核壳结构表面糖基化纳米银抗菌材料中，纳米银单质是核，糖基化涂层作为壳层包裹在纳米银核外，所述糖基化涂层是甘露低聚糖糖基化涂层。
所述的核壳结构糖基化纳米银的平均粒径为10～105nm，其中纳米银核平均粒径5～100nm，糖基化壳层平均厚度5nm。
另外，本发明还要求保护一种上述制备的核壳结构表面糖基化纳米银作为抗菌材料的应用。
优选地，所述菌为大肠杆菌E.coli、铜绿假单胞菌P.aeruginosa、金黄色葡萄球菌S.aureus和热带假丝酵母菌C.tropicalis。
最后，本发明还要求保护一种抗菌剂，该抗菌剂包含上述的核壳结构表面甘露糖基化纳米银。
本发明采用的甘露低聚糖又称甘露寡聚糖，是一类新型抗原活性物质，不仅具有低热、稳定、安全无毒等良好的理化性质。其还具有特殊的生物学功效，如能控制动物胃肠道的微生态环境，利于有益菌的生长和繁殖，抑制有害菌对肠道的粘附和定植，从而保护肠道菌群在屏障、营养和免疫方面的正常功能。
本发明利用甘露低聚糖分子结构中位于端基的糖具有还原性，可以催化金属离子还原为金属单质核；与此同时，甘露低聚糖较大的低聚糖分子链(2～20个单元链接)能有效粘附于金属颗粒表面，并且糖分子与分子间氢键相互作用可以自组装聚集形成数纳米壳层，从而其可用于一步法绿色制备核壳结构表面糖基化纳米金属材料，表面糖基化壳层起到提高金属颗粒生物相容性、安全性、防止金属粒子团聚而稳定的作用，同时还可以赋予纳米金属颗粒糖的特殊生物学功效。
将甘露低聚糖分子引入纳米银合成体系，其不仅作为还原剂能有效催化银离子转化为单质银球，而且其特殊的拓扑结构还能作为稳定剂在纳米银球表面形成稳定的保护壳层，从而形成具有特殊核壳结构的表面甘露糖基化纳米银。
核壳结构甘露糖基化纳米银不仅能有效改善纳米银核表面生物相容性、降低其细胞毒性、还可提高其分散性、稳定性。并且，甘露糖分子还可与微生物表面凝集素特异性识别，如甘露糖残基特异性识别大肠杆菌(E.coil)表面的凝集素Fim H蛋白；甘露聚糖残基专一性识别酵母等真菌细胞壁表面凝集素蛋白。因此，核壳结构表面甘露糖基化纳米银除了具有低细胞毒性、高分散性、稳定性，不仅对各种细菌及真菌具有纳米银优异的抗菌性能，且还具有特异性识别特定微生物(大肠杆菌和酵母菌)，从而对特定种类微生物具有更高主动攻击和更强灭杀作用。
利用甘露低聚糖同时作为还原及模板稳定剂一步法室温水相催化核壳结构表面甘露糖基化纳米银抗菌材料的制备是一种简单、绿色的抗菌功能纳米银制备方法，该方法不仅能提高纳米银系抗菌材料的安全性、分散稳定性和特异性抗菌性，同时对推动纳米银系抗菌材料大规模产业化应用具有重要的现实意义。
本发明中核壳结构糖基化纳米银抗菌材料，平均粒径为10～105nm，其中纳米银核平均粒径5～100nm，糖基化壳层平均厚度5nm。目前文献中公开的甘露糖修饰纳米金/银均不是核壳结构，仅仅是表面小分子单分子层修饰，在现有文献中均没有任何高分辨显微镜显示其核壳结构存在，因为小分子单分子层厚度仅仅几个埃，不到1纳米，仅仅是修饰，无法形成致密且一定厚度的壳结构。
有益效果：
本发明表面糖基化纳米银制备方法采用室温、绿色水相合成，AgNO3和甘露低聚糖作为反应物一锅法制备核壳结构糖基化纳米银，所得的核壳结构糖基化纳米银具有优异的抗菌性能、低细胞毒性、高分散稳定性，制备方法简单，原料绿色、过程环保，适合大规模推广。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明制备方法得到的核壳结构糖基化纳米银浓溶液实物图。
图2为本发明制备方法得到的核壳结构糖基化纳米银的扫描电镜图。
图3为本发明制备方法得到的核壳结构糖基化纳米银的透射电镜图。
图4为不同时间下合成核壳结构糖基化纳米银的全波长紫外吸收光谱图。
图5为添加不同浓度的本发明实施例1制备的核壳结构糖基化纳米银的大肠杆菌E.coli生长情况图。
图6为添加不同浓度的本发明实施例1制备的核壳结构糖基化纳米银的铜绿假单胞菌P.aeruginosa生长情况图。
图7为添加不同浓度的本发明实施例1制备的核壳结构糖基化纳米银的金黄色葡萄球菌S.aureus生长情况图。
图8为添加不同浓度的本发明实施例1制备的核壳结构糖基化纳米银的热带假丝酵母菌C.tropicalis生长情况图。
图9为本发明制备方法得到的核壳结构糖基化纳米银对大肠杆菌E.coli、铜绿假单胞菌P.aeruginosa、金黄色葡萄球菌S.aureus、热带假丝酵母菌C.tropicalis的抑菌圈图。
图10为不同浓度本发明制备方法得到的核壳结构糖基化纳米银的细胞毒性图。
图11为本发明制备方法得到的核壳结构糖基化纳米银稀溶液在37℃下放置不同时间的分散稳定性分析图。
具体实施方式
以下将参照附图，通过实施例方式详细地描述本发明的技术方案。在此需要说明的是，对于这些实施例方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。
本文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，单独存在B，同时存在A和B三种情况，本文中术语“/和”是描述另一种关联对象关系，表示可以存在两种关系，例如，A/和B，可以表示：单独存在A，单独存在A和B两种情况，另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”关系。
甘露低聚糖平均数均分子量342.3～3600。
实施例1
一种制备核壳结构表面甘露糖基化纳米银抗菌材料的绿色方法，具体采用如下步骤：
1)将AgNO3溶解于纯水中，甘露低聚糖溶于纯水中，AgNO3终浓度1mg/mL，甘露低聚糖浓度为4mg/mL；
2)将AgNO3水溶液等体积加入至甘露低聚糖水溶液中，机械搅拌混合均匀，其中，控制所述AgNO3与甘露低聚糖的质量比为1:4；
3)将上述混合溶液放置于室温(25±5℃)反应120min；
4)将步骤(3)中的反应液室温离心，收集沉淀物溶于超纯水中，即得产物核壳结构糖基化纳米银Ag@CL。将制得的核壳型糖基化纳米银进行水溶液实物拍照、扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)拍摄，如图1-图3。由图可知，制得的纳米银为核壳结构，平均粒径为25～30nm，其中糖基化壳层厚度为5nm，纳米银核层直径20～25nm。
实施例2
一种制备核壳结构表面糖基化纳米银抗菌材料的绿色方法，具体采用如下步骤：
1)将AgNO3溶解于纯水中，甘露低聚糖溶于纯水溶液中，AgNO3终浓度0.01mg/mL，甘露低聚糖浓度为1mg/mL；
2)将AgNO3水溶液等体积加入至甘露低聚糖溶液中，机械搅拌混合均匀，其中，控制所述AgNO3与甘露低聚糖的质量比为1：100；
3)将上述混合溶液分别放置于室温(25±5℃)反应120min；
4)将步骤(3)中的反应液室温离心，收集沉淀物溶于超纯水中，即得产物核壳结构甘露糖基化纳米银Ag@CL。核壳结构糖基化纳米银的平均粒径为10～15nm，其中纳米银核平均粒径5～10nm，糖基化壳层平均厚度5nm。
实施例3
一种制备核壳结构表面糖基化纳米银抗菌材料的绿色方法，具体采用如下步骤：
1)将AgNO3溶解于纯水中，甘露低聚糖溶于纯水溶液中，AgNO3终浓度0.1mg/mL，甘露低聚糖浓度为1mg/mL；
2)将AgNO3水溶液等体积加入至甘露低聚糖溶液中，机械搅拌混合均匀，其中，控制所述AgNO3与甘露低聚糖的质量比为1：10；
3)将上述混合溶液分别放置于室温(25±5℃)反应120min；
4)将步骤(3)中的反应液室温离心，收集沉淀物溶于超纯水中，即得产物核壳结构甘露糖基化纳米银Ag@CL。核壳结构糖基化纳米银的平均粒径为45～50nm，其中纳米银核平均粒径40～45nm，糖基化壳层平均厚度5nm.
实施例4
一种制备核壳结构表面糖基化纳米银抗菌材料的绿色方法，具体采用如下步骤：
1)将AgNO3溶解于纯水中，甘露低聚糖溶于纯水溶液中，AgNO3终浓度10mg/mL，甘露低聚糖浓度为10mg/mL；
2)将AgNO3水溶液等体积加入至甘露低聚糖溶液中，机械搅拌混合均匀，其中，控制所述AgNO3与甘露低聚糖的质量比为1：1；
3)将上述混合溶液分别放置于室温(25±5℃)反应120min；
4)将步骤(3)中的反应液室温离心，收集沉淀物溶于超纯水中，即得产物核壳结构甘露糖基化纳米银Ag@CL。核壳结构糖基化纳米银的平均粒径为100～105nm，其中纳米银核平均粒径95～100nm，糖基化壳层平均厚度5nm。
实施例5
一种制备核壳结构表面糖基化纳米银抗菌材料的绿色方法，具体采用如下步骤：
1)将AgNO3溶解于纯水中，甘露低聚糖溶于纯水溶液中，AgNO3终浓度100mg/mL，甘露低聚糖浓度为500mg/mL；
2)将AgNO3水溶液等体积加入至甘露低聚糖溶液中，机械搅拌混合均匀，其中，控制所述AgNO3与甘露低聚糖的质量比为1：5；
3)将上述混合溶液分别放置于室温(25±5℃)反应120min；
4)将步骤(3)中的反应液室温离心，收集沉淀物溶于超纯水中，即得产物核壳结构甘露糖基化纳米银Ag@CL。核壳结构糖基化纳米银的平均粒径为25nm，其中纳米银核平均粒径20nm，糖基化壳层平均厚度5nm
实施例6
一种制备核壳结构表面糖基化纳米银抗菌材料的绿色方法，具体采用如下步骤：
1)将AgNO3溶解于纯水中，甘露低聚糖溶于纯水溶液中，AgNO3终浓度2mg/mL，甘露低聚糖浓度为8mg/mL；
2)将AgNO3水溶液等体积加入至甘露低聚糖水溶液中，机械搅拌混合均匀，其中，控制所述AgNO3与甘露低聚糖的质量比为1：4；
3)将上述混合溶液放置于75℃水浴锅中反应，按10min、30min、60min、90min、100min、110min、120min、130min取样；
4)将步骤(3)中的反应液室温离心，收集沉淀物溶于超纯水中，即得产物核壳结构表面甘露糖基化纳米银Ag@CL，见图4。由图可知，随着时间的增加，银离子转化率不断增加，溶液中纳米银数量增大，在120min转化完成，继续增加时间，纳米银量不再增大。此外，反应时间几乎对核壳结构纳米银的结构无影响，在此实施例反应条件下，纳米银单质核平均粒径20nm，糖基化壳层厚度平均5nm，不受反应时间的变化而变化。
实施例7
一种制备核壳结构表面糖基化纳米银抗菌材料的绿色方法，具体采用如下步骤：
1)将AgNO3溶解于纯水中，甘露低聚糖溶于纯水溶液中，AgNO3终浓度2mg/mL，甘露低聚糖浓度为8mg/mL；
2)将AgNO3水溶液等体积加入至甘露低聚糖水溶液中，机械搅拌混合均匀，其中，控制所述AgNO3与甘露低聚糖的质量比为1：4；
3)将上述混合溶液分别放置于25℃±5℃、40℃±5℃、55℃±5℃、60℃±5℃、65℃±5℃、70℃±5℃、75℃±5℃、80℃±5℃水浴锅中反应120min；
4)将步骤(3)中的反应液冷却至室温，离心，收集沉淀物溶于超纯水中，即得产物核壳结构甘露糖基化纳米银Ag@CL。随着反应温度不断升高，体系反应速率不断增大，但在120min内无论低温或稍高温度下，体系中银离子均转化完全，温度的提高不会增加体系的转化率；此外，反应温度几乎对核壳结构纳米银的结构无影响，在此实施例反应条件下，纳米银单质核平均粒径20nm，糖基化壳层厚度平均5nm，不受反应温度的变化而变化。综合考虑室温25℃±5℃下是一个温和、低能耗的反应体系，因此室温25℃±5℃为核壳结构糖基化纳米银制备的优选反应温度。
实施例8
一种制备核壳结构表面糖基化纳米银抗菌材料的绿色方法，具体采用如下步骤：
1)将AgNO3溶解于纯水中，AgNO3终浓度2mg/mL；甘露低聚糖溶于纯水中，甘露低聚糖终浓度分别为2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL、16mg/mL、30mg/mL、40mg/mL。
2)将AgNO3水溶液等体积加入至甘露低聚糖水溶液中，机械搅拌混合均匀，控制所述AgNO3与甘露低聚糖的质量比分别为1:1，1:2，1:4，1:8，1:15，1:20；
3)放置于室温(25℃±5℃)反应120min；
4)将步骤(3)中的反应液室温离心，收集沉淀物溶于超纯水中，即得产物核壳结构微甘露糖基化纳米银Ag@CL。当AgNO3与甘露低聚糖的质量比不同时，核壳结构糖基化纳米银的结构和转化率均不同，随着甘露低聚糖与AgNO3质量比的提高，单质纳米银核直径从100nm逐渐降低至30nm，而其表面糖基化壳层厚度始终保持在5nm左右不变；此外，溶液中银离子转化率随着甘露低聚糖与AgNO3质量比的提高而逐渐增大，在AgNO3与甘露低聚糖的质量比提到为1：4时，银离子转化率达到最大值95％，此后不随二者质量比的增加继续增加，因此1：4为优选的AgNO3与甘露低聚糖的质量比。
实施例9
将实施例1中反应制得的产物Ag@CL，作为抗菌剂。将保存于-80℃的大肠杆菌E.coli、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌进行活化，按1％的接种量接种至含有25ml LB培养基的离心管中，在离心管中添加1、2、4和8μg/mL不同浓度的核壳结构糖基化纳米银作为实验组，同时以未处理过的菌株培养基作为空白组，均置于37℃，200rpm，培养60h。按6、12、24、30、36、42、48、54、60h取样，测其OD600。结果见图5(大肠杆菌)、图6(铜绿假单胞菌)、图7(金黄色葡萄球菌)。由此可知，对于E.coli、铜绿假单胞及金黄色葡萄球菌来说，Ag@CL的最低抑菌浓度均低至2μg/mL,最低杀菌浓度均也低至2μg/mL。
实施例10
将实施例1中反应制得的产物Ag@CL，作为抗菌剂。将保存于-80℃甘油LB中的热带假丝酵母菌C.tropicalis进行活化，按1％的接种量接种至含有25ml YPD培养基的离心管中，在离心管中添加1、2、4、8和16μg/mL不同浓度的核壳结构糖基化纳米银作为实验组，同时以未处理过的菌株培养基作为空白组，均置于30℃，200rpm，培养60h。按6、12、24、30、36、42、48、54、60h取样，测其OD600。结果见表和图8。对于C.tropicalis来说，Ag@CL的最低抑菌浓度是8μg/mL，最低杀菌浓度为10μg/mL。
实施例11
将实施例1中反应制得的产物Ag@CL，作为抗菌剂。将存储在-80℃甘油LB中的大肠杆菌E.coli、铜绿假单胞菌P.aeruginosa、金黄色葡萄球菌S.aureus按1％接种量接种于装有5mL LB的试管中，过夜培养(37℃，200rpm)。发酵液稀释到10-6-10-7倍，涂布于LB平板中。将滴加纳米银系抗菌材料的滤纸(直径为5mm)置于涂布了微生物的LB平板上。以灭菌后不添加抗菌材料的滤纸作为对照。将平板先正置一段时间后倒置于恒温培养箱中，培养条件为：37℃，24h。其后观察抑菌圈，用于定性分析，结果见图9。对于三种常见致病细菌大肠杆菌E.coli、铜绿假单胞菌P.aeruginosa、金黄色葡萄球菌S.aureus，与不滴加纳米银抗菌剂的滤纸片相比，添加了核壳结构纳米银的滤纸片周围呈现了明显的抑菌圈。
实施例12
将保存于-80℃甘油LB中的热带假丝酵母菌C.tropicalis进行活化，按1％的接种量接种至含有25ml YPD培养基的离心管中，过夜培养(30℃，200rpm)。发酵液稀释到10-6-10-7倍，涂布于YPD培养基平板中。将滴加纳米银系抗菌材料的滤纸(直径为5mm)置于涂布了热带假丝酵母菌C.tropicalis的YPD培养基平板上。以灭菌后不添加抗菌材料的滤纸作为对照。将平板先正置一段时间后倒置于恒温培养箱中，培养条件为：30℃，24h。其后观察抑菌圈，用于定性分析，结果见图9。对于热带假丝酵母菌C.tropicalis，与不滴加纳米银抗菌剂的滤纸片相比，添加了核壳结构纳米银的滤纸片周围呈现了明显的抑菌圈。
实施例13
将实施例1中反应制得的产物Ag@CL按照不同浓度加入96孔板中细胞浓度约为2×104cell mL-1的COS-7细胞(猴成纤维细胞样细胞系)溶液中共孵育。加入抗生素(1％青霉素和链霉素)和10％胎牛血清24小时后，用MTT法对各组细胞生存活力进行评估。吸取细胞培养基在MTT前用230μL不含血清的DMEM代替化验。加入20微升5mg mL-1MTT PBS溶液。使得每个96孔板格的MTT最终浓度为0.4mg mL-1，与细胞在37℃孵育4小时，通过抽吸去除剩余的MTT后，紫色福马杂晶体用200μL二甲基亚砜溶解，并在570nm处用Wallac 1420多功能检测仪检测信号。以未加入Ag@CL处理的细胞MTT降低率设为100，Ag@CL处理的细胞的MTT降低率与未处理细胞进行百分比计算，得到经过Ag@CL处理的细胞的生存活性，结果见图10。由图可知核壳结构表面甘露糖基化纳米银对猴成纤维细胞的细胞生存活性影响较小，其即使在较高浓度下对细胞的致死率也很低，其具有较低的细胞毒性。
此外，将本发明所制备的核壳结构表面甘露低聚糖修饰纳米银与非核壳结构表面小分子甘露糖修饰纳米银在抗菌、细胞毒性及稳定性方面做一全面对比(表1)。其中非核壳结构表面小分子甘露糖修饰纳米银的制备方法参考技术文献(Colloids and Surfaces B:Biointerfaces 81(2010)570–577)，具体为：在反应容器中同时加入AgNO3(50mL,0.26mM)的水溶液和1-硫代葡萄糖钠盐(50mL,0.72mM)水溶液，反应混合物在沸水回流下进一步加热20分钟，溶液冷却至室温，即得非核壳结构表面小分子甘露糖修饰纳米银。
核壳结构表面甘露糖基化纳米银与非核壳结构表面甘露糖基化纳米银性能对比结果显示(表1)，相比于非核壳结构小分子甘露糖修饰的纳米银，核壳结构表面甘露低聚糖修饰纳米银对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌抗菌(最低抑菌及杀菌)性能相当，对细菌中的大肠杆菌和真菌中的热带假丝酵母菌具有更优的抗菌(最低抑菌及杀菌)性，这主要源于一定厚度的低聚甘露糖壳层对大肠杆菌和热带假丝酵母菌细胞表面凝集素蛋白具有特异性粘附的亲和能力，能有效主动“进攻”其细胞膜，从而与银离子杀菌协同作用，高效杀死该类致病菌。此外，核壳结构表面糖基化纳米银相比于小分子甘露糖修饰纳米银具有更低的细胞毒性、更高分散、储存稳定性。与非核壳结构的甘露糖小分子修饰纳米银实验对照，对比结果见表1。
表1
实施例14
将实施例1中反应制得的产物Ag@CL稀水溶液放置于玻璃瓶中，体系分别放置于25、37℃下，每隔一定时间观测纳米银溶液体系有无沉淀产生，具体地按照1、30、60、90、120、150、180天分别取样拍照，观测溶液颜色及纳米银分散情况。其中37℃下核壳结构糖基化纳米银不同时间的分散稳定性结果见图11，由图可知核壳结构表面甘露糖基化纳米银溶液在37℃下经过180天后，溶液仍然呈现均相且澄清状态，无明显的纳米银颗粒团聚现；而同样条件下，非核壳结构表面甘露糖基化纳米银在28天时已经呈现明显的团聚絮凝现象(表1)。以上结果表明核壳结构表面甘露糖基化纳米银具有更优优良的分散稳定性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种核壳结构糖基化纳米银抗菌材料的绿色制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将AgNO3溶解于纯水中，甘露低聚糖溶解于纯水中；
（2）将AgNO3水溶液加入至甘露低聚糖水溶液中，25 ~ 80 oC，混合均匀搅拌反应10 ~240 min；
（3）将步骤（2）中的反应液离心，收集沉淀物溶于纯水中，即得产物，核壳结构糖基化纳米银的平均粒径为10 ~ 105 nm，其中纳米银核平均粒径5 ~ 100 nm，糖基化壳层平均厚度5 nm；
所述AgNO3与甘露低聚糖的质量比为1:1 ~ 100；
所述AgNO3溶解于纯水中浓度为0.01 ~ 100 mg/mL；
所述甘露低聚糖溶解于纯水中，所得的甘露低聚糖溶液浓度为0.01~500 mg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种核壳结构糖基化纳米银抗菌材料的绿色制备方法，其特征在于，步骤（2）反应温度为25 oC ± 5℃；搅拌反应时间为120 min。
3.权利要求1或2所述的绿色制备方法制备得到的核壳结构糖基化纳米银抗菌材料。
4.根据权利要求3所述的核壳结构糖基化纳米银抗菌材料，其特征在于，所述核壳结构中，纳米银单质是核，糖基化涂层作为壳包裹在纳米银核外，所述糖基化涂层是甘露低聚糖糖基化涂层；甘露低聚糖较大的低聚糖分子链有效粘附于金属颗粒表面，并且糖分子与分子间氢键相互作用自组装聚集形成纳米壳层；所述的核壳结构糖基化纳米银的平均粒径为10 ~ 105 nm，其中纳米银核平均粒径5 ~ 100 nm，糖基化壳层平均厚度5 nm。
5.权利要求3所述核壳结构糖基化纳米银抗菌材料在抗菌材料中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，抗菌材料所涉及的菌为大肠杆菌E.coli、铜绿假单胞菌P. aeruginosa、金黄色葡萄球菌S. aureus、热带假丝酵母菌C.tropicalis。
7.一种抗菌剂，其特征在于，所述抗菌剂包含权利要求3所述的核壳结构表面甘露糖基化纳米银抗菌材料。
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