CN114208734B - 一种综合多种育种技术改良葡萄牙牡蛎三倍体生产性能的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种综合多种育种技术改良葡萄牙牡蛎三倍体生产性能的方法。通过二倍体快速生长系选育、三倍体诱导系构建、四倍体快速生长群系构建、杂交四倍体快速生长系构建、葡萄牙牡蛎三倍体回交改良系规模化生产等技术环节，综合利用选择育种、杂交育种、多倍体育种和回交育种技术，获得一种生长更快、育性更差、存活率高、品质好、100％三倍体率稳定的葡萄牙牡蛎三倍体遗传改良新品系。通过本发明获得的葡萄牙牡蛎三倍体遗传改良新品系比未改良的葡萄牙牡蛎三倍体生长提高了9.30％～20.18％，产量提高了.89％～24.67％。而且显著降低了可育比例，未改良的葡萄牙牡蛎三倍体繁殖期不育个体比例为0.67％～65.00％，而遗传改良后的葡萄牙牡蛎三倍体繁殖期不育个体比例提高至78.67％～81.67％。

Description

一种综合多种育种技术改良葡萄牙牡蛎三倍体生产性能的 方法

技术领域

本发明属于海洋农业中贝类遗传育种技术领域，具体涉及一种综合多种育种技术改良葡萄牙牡蛎三倍体生产性能的方法。

背景技术

葡萄牙牡蛎是我国产量最高的牡蛎养殖品种，2020年其产量为207万吨，约占全国牡蛎产量的38.13％，主要集中养殖在福建、广东、广西等，具有重要的经济价值。但是葡萄牙牡蛎产值明显低于另外两个牡蛎经济种太平洋牡蛎和香港牡蛎，主要是由于其具有个体小、性腺发育周期长、品质口感差、贝壳脆薄、价格低廉等缺陷，不能供应高端消费市场，这严重制约了葡萄牙牡蛎的发展。三倍体牡蛎具有生长快、存活率高、抵抗力强、个体大和育性差等特点，正好可以弥补葡萄牙牡蛎二倍体的缺陷，近两年已经在葡萄牙牡蛎养殖产业上获得了广泛应用。但是三倍体养殖过程中，发现葡萄牙牡蛎三倍体可育个体比例较高、部分三倍体性腺发育很饱且生长变慢，这一方面是与生存水域温度较高有关，另一方面也和葡萄牙牡蛎性腺发育机制有很大关系。产业迫切需要对葡萄牙牡蛎三倍体的生长和育性两个性状进行遗传改良。由于葡萄牙牡蛎三倍体的整体育性仍较差、可育比例仍显著低于二倍体且可育个体交配的子代存活率极低，直接进行葡萄牙牡蛎三倍体的选育极困难。这就需要对其亲本四倍体和二倍体进行遗传改良，间接培育得到葡萄牙牡蛎三倍体生长更快和育性更差的新品系。太平洋牡蛎三倍体可育比例很低且可育个体性腺发育较差，说明太平洋牡蛎的性腺发育基因表达量更低，可以把太平洋牡蛎优良滞育基因引入葡萄牙牡蛎中。

选择育种是水产动物中常见的一种育种技术手段，水生生物群体在野外海区环境中，由于受到环境影响，会产生性状分离和基因变异，部分个体会更加适应本地环境，进而产生优良性状个体，对这些优良性状持续进行选育，就可以选育得到优良群系。选择育种在水产业中得到了广泛应用，多嵴熊本牡蛎新品种“华海1号”、快速生长系禾花鲤新品种“乳源1号”、体重高和抗病性强新品种半滑舌鳎“鳎优1号”、体重和壳宽大的三角帆蚌新品种“申浙3号”、斑马壳色和生长快的菲律宾蛤仔新品种“斑马蛤2号”等都是通过群体持续选育得到的水产良种，都已经进行了实际应用，产生了良好效果，显著提高了产量和良种覆盖率。杂交育种分为种间杂交和种内杂交。在水产动物中，应用杂交育种比较普遍。通过杂交，可以增加子代的变异性，综合来自双亲的优良性状或产生新的优良性状，这就是杂种优势。在牡蛎中，杂种优势和杂种劣势共存，太平洋牡蛎和香港牡蛎、葡萄牙牡蛎和香港牡蛎表现出杂种劣势，而香港牡蛎和近江牡蛎、香港牡蛎和熊本牡蛎表现出杂种优势。扇贝新品种“渤海红”就是海湾扇贝和紫扇贝杂交后，以生长和存活为目标性状，持续选育到的水产新品种；白金丰产鲫是彭泽鲫和尖鳍鲤杂交后得到了生长快、雌性比例高、体型好的水产新品种。回交育种是传统育种方法的重要组成部分，也是一种重要的遗传改良手段，在农作物和畜牧业中应用较为广泛，近些年来随着水产种业振兴的迫切需要，在水产动物中也开始使用。回交育种技术是可育的杂交子代和亲本进行轮回杂交的育种手段，能够叠加子代和亲本的优良性状，并保留亲本原有的一些优点，获得一种改良新品种。例如，鲤鲫杂种F₁与鲤、鲫的回交制种，获得了生长快、产量高、抗逆性强的回交新品系；香港牡蛎和长牡蛎杂种子代与香港牡蛎的回交制种，获得了耐高盐、快速生长的“华南1号”新品种；海湾扇贝和紫扇贝杂种子代和海湾扇贝回交制种，获得了生长快、死亡率低、壳黑色的“青农2号”新品种等。

发明内容

本发明的目的是提供一种综合利用选育育种、杂交育种、回交育种和多倍体育种技术对葡萄牙牡蛎三倍体进行遗传优良，培育出生长更快、育性更差的葡萄牙牡蛎三倍体改良新品系的方法。

本发明通过对太平洋牡蛎和葡萄牙牡蛎不同地理群体进行选育，以生长和存活为目标性状，持续选育4代选育得到生长快和存活率高的二倍体快速生长新品系；通过抑制Pb2释放诱导得到太平洋三倍体和葡萄牙牡蛎三倍体诱导群系；用二倍体精子和三倍体卵子受精抑制Pb2诱导得到太平洋牡蛎和葡萄牙牡蛎四倍体群快速生长系；太平洋牡蛎四倍体精子和葡萄牙牡蛎四倍体卵子杂交得到杂交四倍体快速生长系；用杂交四倍体快速生长系的精子和葡萄牙牡蛎二倍体快速生长新品系的卵子受精，对葡萄牙牡蛎三倍体进行遗传改良，得到生长更快、育性更差的葡萄牙牡蛎三倍体改良新品系。本发明通过对亲本进行遗传改良，间接达到改良葡萄牙牡蛎三倍体生长和育性的目的，改良后的三倍体新品系具有生长更快、可育比例更低、可育个体育性更差、存活率高、三倍体率100％的特点，为葡萄牙牡蛎产业提供了一个三倍体改良新品系，这是本发明的创新点所在。

本发明是综合多种育种技术改良葡萄牙牡蛎三倍体生产性能的方法，包括以下步骤：

A、分别选育太平洋牡蛎二倍体快速生长系G₀和葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系A₀；

B、以步骤A的太平洋牡蛎二倍体快速生长系G₀为亲本获取太平洋牡蛎三倍体诱导群系，以步骤A的葡萄牙牡蛎的二倍体快速生长系A₀为亲本获取葡萄牙牡蛎三倍体诱导群系；

C、用太平洋牡蛎二倍体快速生长系为父本，以太平洋牡蛎三倍体诱导群系中的可育个体为母本，诱导获得太平洋牡蛎四倍体快速生长系；用葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系为父本，以葡萄牙牡蛎三倍体诱导群系中的可育个体为母本，诱导获得葡萄牙牡蛎四倍体快速生长系；

D、用太平洋牡蛎四倍体快速生长系为父本，以葡萄牙牡蛎四倍体快速生长系为母本，种间杂交得到杂交四倍体快速生长系；

E、以D中杂交四倍体快速生长系为父本，以A中葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系A₀为母本，回交得到葡萄牙牡蛎三倍体改良系。

优选，所述的综合多种育种技术改良葡萄牙牡蛎三倍体生产性能的方法步骤为：

A、分别采集太平洋牡蛎和葡萄牙牡蛎二倍体3-5个不同地理群系，以生长为目标性状，持续选育4代以上，分别选育得到太平洋牡蛎二倍体快速生长系G₀和葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系A₀；

B、分别以步骤A中的牡蛎二倍体快速生长系为亲本，2N♂×2N♀受精后用CB抑制pb2释放，分别得到太平洋牡蛎三倍体诱导群系和葡萄牙牡蛎三倍体诱导群系；

C、以A中牡蛎二倍体快速生长系为父本，以B中三倍体诱导群系中的可育个体为母本，2N♂×3N♀受精后抑制极体释放，分别诱导得到太平洋牡蛎四倍体快速生长系和葡萄牙牡蛎四倍体快速生长系；

D、以C中的太平洋牡蛎四倍体快速生长系为父本，以葡萄牙牡蛎四倍体快速生长系为母本，种间杂交4N♂×4N♀受精后得到杂交四倍体快速生长系；

E、以D中的杂交四倍体快速生长系为父本，以A中的葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系A0为母本，回交得到葡萄牙牡蛎三倍体改良系。

优选，所述的步骤A的牡蛎二倍体快速生长系的选育是首先对牡蛎3-5个不同地理群体进行生长和存活比较，得到优良群体X₀；然后对优良群体X₀进行选育，以生长和存活为目标形状，按照每代保种率10％进行持续选育4代，分别选育得到太平洋牡蛎二倍体快速生长系G₀和葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系A₀。

优选，所述的步骤B中的受精后用CB抑制pb2释放其诱导时间点是在第一极体Pb1约释放40％时开始处理，保留三倍体率超过90％且畸形率低于10％的诱导组。

优选，所述的步骤C中的受精后抑制极体释放其诱导时间点是在第一极体Pb1约释放50％时，用CB抑制。这个与国外的方法不同。

优选，所述的步骤D中在杂交四倍体快速生长系构建时，首先需要流式细胞仪鉴定闭壳肌倍性并筛选壳高大小前5％的个体作为亲本。

优选，所述的步骤E中的葡萄牙牡蛎三倍体改良系构建时，需要流式细胞仪鉴定杂交四倍体群系个体的闭壳肌倍性，并筛选壳高为前5％的个体为父本；同时需筛选葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系壳高前10％的个体作为母本。

优选，所述的综合多种育种技术改良葡萄牙牡蛎三倍体生产性能的方法，具体步骤为：

A、二倍体快速生长系选育：①分别搜集3-5个太平洋牡蛎二倍体地理群系和葡萄牙牡蛎二倍体地理群系，进行群体内自繁，分别布置在3个养殖海区中培和养成，以生长和存活为目标形状，进行基因型和环境型交互作用分析，筛选得到太平洋牡蛎二倍体优良群系X₀和葡萄牙牡蛎二倍体优良群系Y₀；②分别筛选X₀和Y₀壳高前10％且壳型整齐的个体作为亲本，进行群系内自繁，得到X₁和Y₁；③以壳高为选育目标，每代留种率为10％，再持续选育3代，选育得到太平洋牡蛎二倍体快速生长系G0和葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系A0；

B、三倍体诱导系构建：①分别取400-500个太平洋牡蛎二倍体快速生长系G0和葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系A0的个体，测量其壳高和全重，并按大小排列，取10％个体为亲本，在循环水系统中暂养一周，投喂足量饵料；②暂养后的亲贝，鉴定雌雄，筛选配子质量较好的个体进行人工受精，在受精后第一极体Pb1约出现40％时，用0.50mg/L的细胞松弛素B诱导处理30min，洗卵并选优幼虫；③用流式细胞仪鉴定三倍体率，保留三倍体率超过90％且畸形率低于10％的组，精细化培育幼虫，在海区中培和养成，此即为太平洋牡蛎三倍体诱导群系和葡萄牙牡蛎三倍体诱导群系；

C、四倍体群系构建：①分别取牡蛎二倍体快速生长系的100-200个成体和牡蛎三倍体诱导群系的300-400个成体，取壳高前10％个体作为亲本，在循环水系统中暂养一周，投喂足量饵料；②鉴定牡蛎三倍体诱导群系中可育个体和倍性，挑选出大个雌性个体作为母本；筛选牡蛎二倍体快速生长系中雄性个体作为父本；进行人工受精，受精后第一极体出现50％时，用0.60mg/L的细胞松弛素B处理55min，放入海水中孵化并选育幼虫；③用流式细胞仪鉴定四倍体率，保留四倍体率超过90％的组，精细化培养幼虫，此即为太平洋牡蛎四倍体快速生长系和葡萄牙牡蛎四倍体快速生长系；

D、杂交四倍体快速生长系构建：①分别取C中太平洋牡蛎四倍体快速生长系和葡萄牙牡蛎四倍体快速生长系各200-300个个体，流式细胞仪鉴定倍性，测量其壳高和全重，取前5％留种，暂养在循环水系统中一周；②以留种的太平洋牡蛎四倍体快速生长系为父本，留种的葡萄牙牡蛎四倍体快速生长系为母本，人工杂交受精，孵化并选优，精细化培养幼虫和稚贝，得到杂交四倍体快速生长系；

E、葡萄牙牡蛎三倍体回交改良系规模化生产：①取D中杂交四倍体快速生长系，鉴定倍性并筛选壳高为前5％的个体作为四倍体父本；取A中葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系个体并筛选壳高前10％的个体作为母本，进行回交育种和人工授精，孵化并选优幼虫；②精细化培育幼虫，投放附着基采集苗种，此即为葡萄牙牡蛎三倍体改良系。

经过以上环节,获得葡萄牙牡蛎三倍体改良系,此改良新品系具有生长更快、存活率更高、育性更差、品质更好、100％三倍体率稳定、适合南方海域规模化养殖、可全年上市等优点。

优选，步骤A中的不同地理群体的苗种来源不同，确保不同群体间有较大遗传差异。

优选，步骤A、B和C中，太平洋牡蛎不同群系构建时，亲贝暂养及受精海水环境条件为温度26-29℃和盐度为26-28ppt；葡萄牙牡蛎不同群系构建时，亲贝暂养和受精海水环境条件为温度29-31℃和盐度为25-27ppt。可以提高受精率和保证受精卵发育同步性，利于提高诱导倍化率和成功率。

优选，步骤A、B、C,D和E中的配子的优选原则为,优选的精子活力较好且精母细胞比例较低，优选的卵子为核内位置丰富、呈椭圆形或梨形、大小较为均为。

步骤E中葡萄牙牡蛎三倍体遗传改良系其三倍体率为100％,因其为四倍体精子和二倍体卵子受精获得。

本发明首次综合使用选择育种、杂交育种、回交育种和多倍体育种技术,通过选择育种得到2种牡蛎二倍体快速生长系，然后利用多倍体育种技术诱导得到2种牡蛎三倍体诱导系和四倍体群系，进一步进行2种牡蛎四倍体的杂交育种提高四倍体生长速度，最后用杂交四倍体快速生长系和葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系回交受精获得三倍体改良新品系，最终成功对葡萄牙牡蛎三倍体进行遗传改良。

通过选择育种、杂交育种、回交育种和多倍体育种等技术手段对亲本直接遗传改良，进而间接达到对葡萄牙牡蛎三倍体进行遗传改良的效果，改良后的新品系生长更快、性腺发育更差，可以显著降低养殖风险、提高产量、改良品质和提高养殖效益，助力牡蛎种业振兴和乡村振兴。而且，选育得到的三倍体育性更差，不会造成基因污染，也不会形成天然三倍体新群体，对保护海洋生物多样性也具有重要意义。

本发明基于葡萄牙牡蛎三倍体可育个体比例较高、部分可育个体性腺发育较好、可育个体的品质较差、生长减慢等产业痛点，通过多种育种技术手段对葡萄牙牡蛎三倍体进行遗传改良。本发明克服了三倍体育性差、自繁幼虫存活率极低导致不能直接进行遗传改良的缺点，通过对四倍体父本和二倍体母本进行双向遗传改良，通过倍性杂交获得兼具杂种优势、回交优势和三倍体优势的葡萄牙牡蛎三倍体改良系。本发明充分利用了选择育种、杂交育种和回交育种对牡蛎生长的优良改良效果，利用了多倍体育种对牡蛎育性的优良改良效果，综合叠加生长和育性改良效应，获得改良系。本发明对葡萄牙牡蛎三倍体生长和育性进行了遗传改良，运用四倍体改良系雄性个体和二倍体改良系雌性个体受精规模化生产葡萄牙牡蛎三倍体遗传改良系，三倍体率为100％，可以商业化应用和推广。通过本发明培育的葡萄牙牡蛎三倍体遗传改良系,兼具选择育种效应、杂交育种效应、回交育种效应和多倍体育种效应,具有生长更快、育性更差、品质更好、存活率更高、可全年上市、100％三倍体率稳定等优势,获得的三倍体比未改良的葡萄牙牡蛎三倍体生长提高了9.30％～20.18％，产量提高了7.89％～24.67％。未改良的葡萄牙牡蛎三倍体繁殖期不育个体比例为60.67％～65.00％，而遗传改良后的葡萄牙牡蛎三倍体繁殖期不育个体比例提高为78.67％～81.67％，本发明对葡萄牙牡蛎三倍体的生长和育性进行了显著改良。

本发明具有可操作性强、商业化应用潜力大、品种权保护相对较容易等优点。

附图说明：

图1是本发明的技术路线图；

图2是葡萄牙牡蛎三倍体未改良系(A)和本发明培育的葡萄牙牡蛎三倍体改良系(B)可育个体性腺发育比较图片。

具体实施方式：

结合下述实例对本发明提供的综合多种育种技术改良葡萄牙牡蛎三倍体生产性能的方法进行详细说明,并不是对本发明的限制。

实施例1

a,二倍体快速生长系选育：①性腺繁殖期，分别收集太平洋牡蛎5个不同地理群体的2～3龄个体各400个，分别是江苏连云港群体、河北秦皇岛群体、山东莱州群体、山东乳山群体、辽宁长海群体，在温度26-29℃和盐度为26-28ppt的海水中暂养7天，投喂足量的云微藻、角毛藻、扁藻等混合饵料；分别收集葡萄牙牡蛎4个不同地理群体的2龄个体各500个，分别是广西北海群体、广东台山群体、福建诏安群体、福建霞浦群体，在温度29-31℃和盐度为25-27ppt的海水中暂养7天，投喂足量的混合饵料。②分别测量各个野生群体的壳高和全重，按照大小排列，取前10％作为亲本，进行群体内自交，获得各个群体的子一代，孵化幼虫并选优幼虫，精细化培育幼虫(根据情况调整密度、饵料种类和数量、换水量等)，用蚝壳附着出足幼虫，分别把太平洋牡蛎5个地理群体子代布置在山东莱州、山东乳山、辽宁长海3个养殖点，把葡萄牙牡蛎4个地理群体子代布置在广西北海、福建霞美、福建诏安3个养殖点，追踪测量其壳高、存活率和全重，进行基因型和环境型交互作用分析，比较筛选得到太平洋牡蛎优良群系X₀和葡萄牙牡蛎优良群系Y₀；③繁殖期，从X₀和Y₀群系中分别挑选400个壳型好、大小均匀的个体，测量其壳高，按照壳高从大到小排列，筛选前10％即40个个体为亲本，循环流水暂养，投喂足量云微藻、角毛藻、扁藻等混合饵料；鉴定雌雄，进行群系内雌雄自交，获得X₁和Y₁，优良海区中培和养成；④按照③中的步骤，继续筛选并群系内自繁，继续选育3代，分别得到太平洋牡蛎二倍体快速生长系G₀和葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系A₀。

b,三倍体诱导系构建：①性腺繁殖期，从太平洋牡蛎二倍体快速生长系G₀中取400个大小均匀、壳型较好的个体，从葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系A₀中取500个大小均匀、壳型较好的个体，分别测量其壳高和全重，按照壳高从大到小排列，取前10％的个体为亲本，在循环流水系统中暂养7天，暂养期间投喂混合饵料、控制温度、控制氧气大小防止性腺自排。②暂养后的亲贝解剖鉴定雌雄，显微镜下筛选配子质量较好的个体，挤卵并用300目筛绢网过滤，在温度26-29℃和盐度为26-28ppt海水中浸泡水合太平洋牡蛎卵子，在温度29-31℃和盐度为25-27ppt的海水中浸泡水合葡萄牙牡蛎卵子。待卵子变圆且生发泡破裂时，挤取精子，海水中活化10min，用适量精子和卵子受精，观察极体释放情况。在第一极体Pb1释放约40％时，用DMSO溶解的0.50mg/L的CB持续处理30min。③CB处理结束后，用500目筛绢网洗去药物，放入海水中孵化。孵化到D形幼虫后，选优幼虫，并用流式细胞仪检测三倍体率，保留三倍体率超过90％且畸形率低于10％的组，分别为太平洋牡蛎三倍体诱导群系和葡萄牙牡蛎三倍体诱导群系。精细化培育幼虫，调控养殖密度、调整投饵量等，幼虫出足后用蚝壳附着，稚贝分别放在山东莱州、广西北海的优良海区中培和养成。

c,四倍体快速生长群系构建：①繁殖期，分别自a太平洋牡蛎二倍体快速生长系G₀和葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系A₀中筛选200个、150个大小均匀、壳型较好的个体，测量其壳高，取前10％个体作为亲贝，暂养在循环水系统中一周，投喂足量混合饵料。②繁殖期，分别从太平洋牡蛎三倍体诱导群系和葡萄牙牡蛎三倍体诱导群系筛选200个、300个大小均匀、壳型较好的个体，海水中暂养一周，投喂足量饵料，分别根据性腺发育积温结果调整温度和时间，促进三倍体性腺发育。③用流式细胞仪鉴定②中三倍体的倍性，并用显微镜鉴定三倍体性腺发育和卵子发育情况，筛选性腺发育较好且卵子质量好的个体，取壳高前10％的可育个体作为母本，挤卵并在合适海水环境中浸泡水合卵子；待三倍体卵子变圆且生发泡破裂后，解剖①中的二倍体亲本，鉴定并筛选出精子活跃的个体，按照壳高大小排列，取壳高最大的作为父本；用适量筛选的二倍体精子去授精三倍体卵子，观察极体释放，在第一极体释放Pb1约释放50％时，用0.60mg/L的CB诱导处理55min，处理结束后放入海水中孵化，待D形幼虫时选优幼虫。④显微镜下观察畸形率、流式细胞仪检测四倍体率，筛选畸形率低于10％且四倍体率超过90％的组，精细化培育幼虫，出足时用蚝壳附着，此即为太平洋牡蛎四倍体快速生长系和葡萄牙牡蛎四倍体快速生长系，稚贝放在山东莱州、广西北海的海区中中培和养成。

以上步骤a、b、c中太平洋牡蛎不同群系构建时，亲贝暂养及受精海水环境条件为温度26-29℃和盐度为26-28ppt；葡萄牙牡蛎不同群系构建时，亲贝暂养和受精海水环境条件为温度29-31℃和盐度为25-27ppt。

d，杂交四倍体快速生长系构建：①分别取c中太平洋牡蛎四倍体快速生长和葡萄牙牡蛎四倍体快速生长系各200和300个个体较大、壳型较好的个体，在海水中暂养(太平洋牡蛎的海水环境条件为温度26-29℃和盐度为26-28ppt；葡萄牙牡蛎的海水环境条件为温度29-31℃和盐度为25-27ppt)，根据不同品种的积温效应结果合理调整温度和促熟时间，促使四倍体性腺发育和卵子成熟；促熟后，测量其壳高、并按照壳高大小排列，取前5％个体留种；②解剖并鉴定四倍体倍性，以太平洋牡蛎四倍体为雄性，以葡萄牙牡蛎四倍体为雌性，浸泡卵子和激活精子后，人工受精。放入1000L黑桶中孵化，流式细胞仪检测幼虫倍性，精细化培养四倍体幼虫。山东莱州和广西北海优良海域进行中培和养成，此即为杂交四倍体快速生长系。

e，葡萄牙牡蛎三倍体回交改良系规模化生产：①取d中的杂交四倍体快速生长系200个体较大、壳型较好的个体，在温度29-31℃和盐度为25-27ppt的海水中暂养一周后，根据葡萄牙牡蛎的积温效应合理调整温度和促熟时间，促使杂交四倍体性腺发育和卵子成熟；促熟后，测量其壳高、并按照壳高大小排列，取前5％个体留种；②从葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系A₀中取500个大小均匀、壳型较好的个体，分别测量其壳高，按照壳高从大到小排列，取前10％的个体为亲本，在循环流水系统中暂养7天，暂养期间投喂足量混合饵料。③解剖并鉴定杂交四倍体倍性，以杂交四倍体为父本；解剖并鉴定葡萄牙牡蛎二倍体性别和卵子质量，以葡萄牙牡蛎二倍体为母本；在温度29-31℃和盐度为25-27ppt的海水中浸泡卵子至生发泡后，挤取四倍体精子并激活，用四倍体精子和二倍体卵子人工受精。放入水泥池中孵化，流式细胞仪检测三倍体幼虫倍性，精细化培养幼虫，此即为葡萄牙牡蛎三倍体改良系。同时设置葡萄牙牡蛎三倍体未改良系(即改良前的纯种葡萄牙牡蛎三倍体，由葡萄牙牡蛎4N♂×葡萄牙牡蛎2N♀获得)，稚贝布置在福建漳浦霞美镇和广西北海竹林盐场2个优良海区中培和养成，追踪相关生长数据。

步骤a、b、c,d和e中的配子进行优选时,优质的精子为活力较好、活跃幅度较大、精母细胞较少且精子数量较多,优选的卵子为椭圆形或梨形、核内物质丰富、大小均匀、生发泡明显。

表1葡萄牙牡蛎三倍体改良系和未改良系在2个不同养殖点的生长比较

表2葡萄牙牡蛎三倍体改良系和未改良系在2个养殖点的可育个体比例

从表1和表2可以看出，获得的葡萄牙牡蛎三倍体改良系比未改良的葡萄牙牡蛎三倍体生长提高了9.30％～20.18％，产量提高了7.89％～24.67％。未改良的葡萄牙牡蛎三倍体繁殖期不育个体比例为60.67％～65.00％，而遗传改良后的葡萄牙牡蛎三倍体繁殖期不育个体比例提高为78.67％～81.67％，本发明对葡萄牙牡蛎三倍体的生长和育性进行了显著改良。

Claims (3)

1.一种综合多种育种技术改良葡萄牙牡蛎三倍体生产性能的方法，其特征在于，具体步骤为：

步骤A、二倍体快速生长系选育：①分别搜集3-5个太平洋牡蛎二倍体地理群系和葡萄牙牡蛎二倍体地理群系，进行群体内自繁，分别布置在3个养殖海区中培和养成，以生长和存活为目标性状，进行基因型和环境型交互作用分析，筛选得到太平洋牡蛎二倍体优良群体X₀和葡萄牙牡蛎二倍体优良群系Y₀；②分别筛选X₀和Y₀壳高前10%且壳型整齐的个体作为亲本，进行群系内自繁，得到X₁和Y₁；③以壳高为选育目标，每代留种率为10%，再持续选育3代，选育得到太平洋牡蛎二倍体快速生长系G₀和葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系A₀；

步骤B、三倍体诱导系构建：①分别取400-500个太平洋牡蛎二倍体快速生长系G₀和葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系A₀的个体，测量其壳高和全重，并按大小排列，取10%个体为亲本，在循环水系统中暂养一周，投喂足量饵料；②暂养后的亲贝，鉴定雌雄，筛选配子质量好的个体进行人工受精，在受精后第一极体Pb1出现40%时，用0.50 mg/L的细胞松弛素B诱导处理30 min，洗卵并选优幼虫；③用流式细胞仪鉴定三倍体率，保留三倍体率超过90%且畸形率低于10%的组，精细化培育幼虫，在海区中培和养成，此即为太平洋牡蛎三倍体诱导群系和葡萄牙牡蛎三倍体诱导群系；

步骤C、四倍体群系构建：①分别取牡蛎二倍体快速生长系的100-200个成体和牡蛎三倍体诱导群系的300-400个成体，取壳高前10%个体作为亲本，在循环水系统中暂养一周，投喂足量饵料；②鉴定牡蛎三倍体诱导群系中可育个体和倍性，挑选出大个雌性个体作为母本；筛选牡蛎二倍体快速生长系中雄性个体作为父本；进行人工受精，受精后第一极体出现50%时，用0.60mg/L的细胞松弛素B处理55 min，放入海水中孵化并选育幼虫；③用流式细胞仪鉴定四倍体率，保留四倍体率超过90%的组，精细化培养幼虫，此即为太平洋牡蛎四倍体快速生长系和葡萄牙牡蛎四倍体快速生长系；

步骤D、杂交四倍体快速生长系构建：①分别取步骤C中太平洋牡蛎四倍体快速生长系和葡萄牙牡蛎四倍体快速生长系各200-300个个体，流式细胞仪鉴定倍性，测量其壳高和全重，取前5%留种，暂养在循环水系统中一周；②以留种的太平洋牡蛎四倍体快速生长系为父本，留种的葡萄牙牡蛎四倍体快速生长系为母本，人工杂交受精，孵化并选优，精细化培养幼虫和稚贝，得到杂交四倍体快速生长系；

步骤E、葡萄牙牡蛎三倍体回交改良系规模化生产：① 取步骤D中杂交四倍体快速生长系，鉴定倍性并筛选壳高前5%雄性个体作为四倍体父本；取步骤A中葡萄牙牡蛎二倍体快速生长系个体并筛选壳高前10%雌性个体作为母本，进行回交育种和人工授精，孵化并选优幼虫；②精细化培育幼虫，投放附着基采集苗种，此即为葡萄牙牡蛎三倍体改良系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，太平洋牡蛎不同群系构建时，亲贝暂养及受精海水环境条件为温度26-29 ℃和盐度为26-28 ppt；葡萄牙牡蛎不同群系构建时，亲贝暂养和受精海水环境条件为温度29-31℃和盐度为25-27 ppt。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，配子的筛选原则为：筛选的精子活力好且精母细胞比例低，筛选的卵子为核内位置丰富、呈椭圆形或梨形、大小较为均匀。

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