CN114207150A - 筛查、诊断和/或监测结直肠晚期肿瘤、晚期腺瘤和/或结直肠癌的改进方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及筛查、诊断和/或监测结直肠晚期肿瘤(AN)、晚期腺瘤(AA)和/或结直肠癌(CRC)的改进方法，其中AN包括CRC和AA。特别地，由于使用基于细菌标志物的特征进行的粪便潜血测试(FOBT)中假阳性结果的减少，所述方法提供了增加的特异性。本发明进一步涉及所述方法在选择对象以进行探索性测试(例如，结肠镜检查)或进行抗癌疗法治疗中的用途。

Description

筛查、诊断和/或监测结直肠晚期肿瘤、晚期腺瘤和/或结直肠 癌的改进方法
技术领域
本发明涉及癌症诊断领域。具体地，本发明涉及筛查、诊断和/或监测结直肠晚期肿瘤(Advanced neoplasia，AN)、晚期腺瘤(Advanced adenoma，AA)和/或结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)的改进方法，其中AN包括CRC和AA。特别地，由于使用基于细菌标志物的特征进行的粪便潜血测试(Fecal occult blood test，FOBT)中假阳性结果的减少，所述方法提供了增加的特异性。本发明进一步涉及所述方法在选择对象以进行探索性测试(例如结肠镜检查)或进行抗癌疗法治疗中的用途。
背景技术
CRC是全球男性中的第三大常见癌症，女性中的第二大常见癌症，也是癌症死亡的主要原因(2012年全球癌症估计发病率、死亡率和患病率，http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx)。到75岁时，有6％的人会受到影响，发达国家的发病率远高于发展中国家(Wilson，2005)。尽管癌症显示出很强的遗传组分，但大多数CRC是散发性的，而且它们发展缓慢(Brenner et al,2014)。在大多数患者中，在出现晚期疾病之前没有症状。定期肠癌筛查显示，当使用粪便测试时，死于CRC的风险降低了26％，而在应用软性乙状结肠镜检查时，则降低高达50％(Zauber,2015；Elmunzer et al,2012)。然而，CRC筛查计划仅在世界上一些国家实施。
指南建议从50岁开始对无症状成人进行CRC常规筛查(Rex et al,2017)。当前的筛查计划基于两种策略：基于内窥镜检查的侵入性操作和基于粪便测试的非侵入性操作(Quintero et al,2012)。CRC筛查有不同的内窥镜检查操作，例如软性乙状结肠镜检查和结肠镜检查。结肠镜检查的主要优势在于它能够直接观察整个结肠，使可以准确诊断，并因此可以通过早期检测癌前病变来预防CRC(Young&Womeldorph,2013)。然而，该操作需要肠道准备和镇静，存在肠穿孔和其他不良反应的风险，并且耗时且昂贵(Rutter et al,2012；Sieg et al,2001)。软性乙状结肠镜检查是一种替代方法，能够直接观察远端结肠，即直肠、乙状结肠和降结肠。这种方法避免镇静并降低肠穿孔的风险(Gatto et al,2003)。与内窥镜检查策略相比，粪便检查是非侵入性的且成本更低，因此在大多数国家成为首选的CRC筛查操作。任何替代性粪便测试呈阳性结果的对象通常会接受结肠镜检查以做出准确的诊断。因此，非侵入性测试经常被用作筛查方法的初步步骤。
筛查计划中使用的粪便测试之一是使用愈创木脂法的粪便潜血测试(愈创木脂粪便潜血测试(guaiac Fecal Occult Blood Test，gFOBT))，该方法基于血红素和α-愈创木酸之间的化学氧化反应。这类测试的主要缺点是需要规定的饮食，以避免因食用特定食物、酒精或非甾体抗炎药而导致的假阳性结果(Sanford,2009)。尽管它是非侵入性的，但它对CRC(25％-38％)和癌前病变(16％-31％)的灵敏度较低(Stracci,2014)。开发了粪便免疫化学测试(Fecal immunochemical test，FIT)以克服gFOBT的低灵敏度。该测试对人血血红蛋白具有特异性，不需要饮食限制。多项研究表明，与gFOBT相比，FIT筛查具有更高的灵敏度(Brenner&Tao,2013；Shapiro et al,2017；Mousavinezhad et al,2016；Goede et al,2017)。尽管FIT对CRC的总体灵敏度约为61％-91％，而对于晚期腺瘤的灵敏度为27％-67％(Stracci et al,2014)，但这些数字仍然意味着高的假阳性率。
最近，有报道称CRC患者的肠粘膜中的细菌群落与健康个体不同(Borges-Canhaet al,2015；Mira-Pascual et al,2014)。有证据表明肠道微生物群可能在CRC发病机制中发挥重要作用(Sobhani et al,2011；Jun et al,2010)。迄今为止，已经描述了肠道微生物群可能诱导肿瘤发生的两种可能机制。一方面，肠道微生物群可能会促进慢性炎症，进而可导致肿瘤形成(Kostic et al,2013；Zackular et al,2014)。另一方面，有证据表明，一些由肠道微生物群代谢的膳食成分，如红肉，会导致致癌化合物的产生(Joshi et al,2015)。此外，最近进行了许多研究以阐明是否存在CRC特异性生态失调，或者是否存在与CRC发展相关的任何特定物种(Dulal&Keku,2014；Zeller et al,2014；Marchesi et al,2011)。
2012年，我们团队对60名个体(41名CRC患者和19名结肠镜检查正常的患者)进行的一项初步前瞻性研究在粘膜活检中定义了一个细菌簇，其盛行与CRC风险相关(Mas deXaxars Rivero,2012)。在分析的55种种系型中，有6种在CRC患者中的频率显著高于对照对象。其中5种与从人类胃肠道或人类粪便中取出的未培养细菌序列具有相似性，1种与粪副拟杆菌(Parabacteroides merdae)具有97％的相似性。相比之下，有两种种系型B34(与系结梭菌(Clostridium nexile)的相似性为99％)和B35(与粪罗斯拜瑞氏菌(Roseburiafaecalis)的相似性为97％)，它们在健康对象中比在CRC患者中更为普遍。
随后，发明人的团队设计了特异性靶向于这些细菌标志物的定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)系统(Mas de Xaxars Rivero,2012)。随后在粪便样本(7个来自健康对照和9个来自CRC患者)上测试细菌特征，寻找不同的丰度，以检查哪一个适合用作CRC筛查的非侵入性工具(WO 2015/132273)。一项包括46名赫罗纳大学医院(Hospital Universitari de Girona)Josep Trueta博士(西班牙，赫罗纳)的患者的回顾性临床研究证实了一些细菌特征作为CRC标志物的适用性(WO 2015/132273)。
尽管最近取得了进展，但仍然需要通过基于人群的筛查和监控策略来寻找用于早期检测晚期结直肠肿瘤的新工具，以降低CRC死亡率。理想的技术应该是非侵入性的、具有成本效益的、可重复的并且能够检测具有高肿瘤发展风险的癌前病变以及灵敏度值和特异性值高。
发明内容
本发明提供了一种基于新细菌特征的新型非侵入性AA、CRC和/或AN筛查、诊断和/或监测测试，该测试补充了粪便潜血测试(例如，FIT)并能够减少FOBT相关假阳性结果，从而提高其特异性和阳性预测值(Positive predictive value，PPV)，同时保持相似的灵敏度水平。
本发明的第一方面涉及一种增加粪便潜血测试(FOBT)的特异性或降低FOBT的假阳性率的筛查、诊断和/或监测对象的结直肠晚期肿瘤(AN)、晚期腺瘤(AA)和/或结直肠癌(CRC)的方法，其中所述方法包括：
a)可选地，在从所述对象分离的粪便样本中进行FOBT，其中所述FOBT包括确定所述粪便样本中潜血的存在；和
b)在从所述对象分离的肠道样本(优选粪便样本)中定量以下细菌标志物中的至少一种，或其任何组合：
-麻疹孪生球菌(Gemella morbillorum，GMLL)，
-胃消化链球菌(Peptostreptococcus stomatis，PTST)，和
-脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis，BCTF)。
在一个相关方面，本发明涉及一种筛查、诊断和/或监测对象的AN、AA和/或CRC的方法，所述方法包括：
a)可选地，在从所述对象分离的粪便样本中进行FOBT，其中所述FOBT包括确定所述粪便样本中潜血的存在；
b)在从所述对象分离的肠道样本(优选粪便样本)中定量以下细菌标志物中的至少一种，或其任何组合：
-麻疹孪生球菌(GMLL)，
-胃消化链球菌(PTST)，和
-脆弱拟杆菌(BCTF)。
在另一方面，本发明提供了一种治疗患有AN、AA和/或CRC的对象的方法，其中所述对象是通过本发明其他方面的筛查、诊断和/或监测的方法选择的，并且其中所述方法还包括向对象施用抗癌疗法。
在相关方面，本发明还提供了如其他方面所述的任何方法，其进一步包括向所述患者施用治疗有效量的抗癌疗法的步骤。
在另一方面，本发明涉及一种用于治疗癌症患者的方法中的抗癌疗法，其中所述癌症患者是通过本发明其他方面的筛查、诊断和/或监测方法选择的。
在另一方面，本发明还涉及一种选择对象以进行探索性测试(该探索性测试选自由结肠镜检查、柔性乙状结肠镜检查、双对比钡剂灌肠和计算机断层扫描(Computedtomography，CT)结肠镜检查组成的组)、优选进行结肠镜检查的方法，其中所述对象是通过本发明其他方面的筛查、诊断或监测方法选择的。
在又一方面，本发明涉及一种在对象中进行探索性测试的方法，其中所述对象是已通过本发明其他方面的筛查、诊断或监测方法选择的，其中所述方法进一步包括对对象进行探索性测试，其中测试选自由结肠镜检查、柔性乙状结肠镜检查、双对比钡剂灌肠和计算机断层扫描(CT)结肠镜检查组成的组，优选结肠镜检查。
在另一方面，本发明提供一种适用于定量GMLL、PTST、BCTF或BCTT中任一种的试剂盒，其中所述试剂盒包含以下试剂中的一种或多种：
i.对GMLL基因组具有特异性的寡核苷酸，优选对SEQ ID NO：1具有特异性的寡核苷酸；
ii.对PTST基因组具有特异性的寡核苷酸，优选对SEQ ID NO：2具有特异性的寡核苷酸；
iii.对BCTF基因组具有特异性的寡核苷酸，优选对SEQ ID NO：3具有特异性的寡核苷酸；
iv.对BCTT基因组具有特异性的寡核苷酸，优选对SEQ ID NO：4具有特异性的寡核苷酸；以及
v.可选地，适用于如上文定义的真细菌的定量的寡核苷酸。
在另一方面，本发明还提供了一种如本文所述的试剂盒，所述试剂盒用于如本文所述的筛查、诊断和/或监测AN、AA和/或CRC的方法中。
附图说明
图1：针对结肠镜检查正常(Normal colonoscopy，NC)、非晚期腺瘤(Non-advancedadenoma，NAA)、晚期腺瘤(AA)和结直肠癌(CRC)的对象所分析的生物标志物(B10(普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)的最佳匹配BLAST)；B46(普氏栖粪杆菌、Subdoligranulum variabil的最佳匹配BLAST)；B48(瘤胃球菌(Ruminococcus)、罗斯拜瑞氏菌(Roseburia)、粪球菌(Coprococcus)的最佳匹配BLAST)；麻疹孪生球菌(GMLL)；胃消化链球菌(PTST)、脆弱拟杆菌(BCTF)、肠道柯林斯菌(Collinsella intestinalis，CINT)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron，BCTT)和肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburiaintestinalis，RSBI))的相对丰度百分比；
图2：以下不同诊断之间的生物标志物丰度比较：NC，结肠镜检查正常；肿瘤，非晚期腺瘤+晚期腺瘤+结直肠癌；晚期肿瘤，晚期腺瘤+结直肠癌；CRC，结直肠癌。显著性水平：*p值＜0.05时，**p值＜0.01时，***p值＜0.001时；
图3：针对具有结肠镜检查正常(NC)、非晚期腺瘤(NAA)、晚期腺瘤(AA)和结直肠癌(CRC)的对象所分析的生物标志物(产丁酸盐物种：B10、B46、B48和肠道罗斯拜瑞氏菌(RSBI)；机会病原体：麻疹孪生球菌(GMLL)、胃消化链球菌(PTST)和脆弱拟杆菌(BCTF)；H2和O2生产者：肠道柯林斯菌(CINT)；和糖分解菌：多形拟杆菌(BCTT))的相对丰度百分比。
具体实施方式
定义
术语“对象”或“个体”在本文中可互换使用，是指归类为哺乳动物的所有动物，包括但不限于家畜和耕畜、灵长类动物和人，例如人类、非人灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物。优选地，对象是任何年龄或种族的男性人类或女性人类。
如本文所用，术语“灵敏度”是指具有目标条件(参考标准阳性)并给出阳性测试结果的对象的比例(TP/(TP+FN))。它显示了测试在检测疾病方面的效果。灵敏度(“sens”)可以在0(0％)＜sens＜1(100％)的范围内，理想情况下，假阴性的数量等于0或接近等于0，灵敏度等于1(100％)或接近等于1(100％)。
如本文所用的与测试相关的术语“特异性”是指没有目标条件(参考标准阴性)并给出阴性测试结果的对象的比例(TN/(TN+FP))。它显示了测试在识别正常(阴性)状况方面的效果。特异性(“spec”)可以在0(0％)＜spec＜1(100％)的范围内，理想情况下，假阳性的数量等于0或接近等于0，特异性等于1(100％)或接近等于1(100％)。
如本文所用，术语“准确度”是指群体中真实结果(真阳性或真阴性)的比例。它衡量筛查测试对某个条件的准确程度，即确定和排除给定条件的正确程度(TN+TP)/(TN+TP+FN+FP)。准确度(“acc”)可以在0(0％)＜acc＜1(100％)的范围内，理想情况下，假阳性和假阴性的数量等于零或接近于零，准确度等于1(100％))或接近等于1(100％)。
如本文所用，术语“接受者工作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲线”是指说明二元分类器系统随着其鉴别阈变化的性能的图示。该曲线是通过在各种阈值设置下绘制真阳性率与假阳性率来创建的。真阳性率也称为灵敏度。假阳性率计算为1-特异性。因此，ROC曲线是一种以图形方式显示一系列截止值范围内的真阳性率与假阳性率(灵敏度与(1-特异性))以及选择临床使用的最佳截止值的方式。以ROC曲线下面积(AUC)表示的准确度为比较测试性能提供了一个有用的参数。接近1的AUC表示该测试是高度灵敏的和高度特异性的，而接近0.5的AUC表示该测试既不灵敏也不特异性。通常，如果AUC为0.6至0.75，则测试被认为是合适的鉴别器，如果AUC为0.75至0.9，则认为其具有良好的鉴别能力，以及如果AUC为0.9至1，则认为其是极好的鉴别器。更多细节参见例如Zweig MH andCampbell G,Clinical Chemistry 1993；39:561-577或Greiner et al.PreventiveVeterinary Medicine 2000；45:23-41。
本申请所用的术语“探针”是指长度为10个至285个碱基对的合成的或生物学上产生的核酸，其含有允许在预定条件下与目标核酸序列特异性优先杂交的特异性核苷酸序列，并且可选地含有用于检测或提高试验性能的部分。通常需要最少10个核苷酸以在统计学上获得特异性并形成稳定的杂交产物，并且最多285个核苷酸通常代表可以容易调节反应参数以确定错配序列和优先杂交的长度上限。探针可以可选地含有某些成分，这些成分在某些测定条件下有助于该探针适当起作用或起到最佳作用。例如，可以修饰探针以提高其对核酸酶降解的抗性(例如，通过封端)，以携带检测配体(例如荧光素)、携带用于纯化或富集目的的配体(例如生物素)或促进将它们捕获到固体支持物上(例如聚脱氧腺苷“尾”)。
本文所用的术语“引物”是指可用于扩增方法(例如聚合酶链反应(“PCR”))以扩增核苷酸序列的寡核苷酸。基于特定目标序列的多核苷酸序列(例如一个特异性16S rDNA序列)来设计引物。
本文所用的与核苷酸序列相关的术语“特异性”意指核苷酸序列将与预定的目标序列杂交/扩增预定的目标序列，并且在测定条件(通常使用严格条件)下不会实质性地与非目标序列杂交/扩增非目标序列。
本文所用的术语“杂交”是指这样的方法：通过该方法，在预定的反应条件下，使两条部分互补或完全互补的核酸链以反向平行方式聚合以形成具有特异且稳定的氢键的双链核酸，其遵循与核酸碱基可以彼此配对的明确规则。
术语“实质性杂交”意指观察到的杂交量将使得观察该结果的人认为，所述结果相对于阳性对照和阴性对照中的杂交数据结果是阳性的。被认为是“背景噪音”的数据不是实质性杂交。
术语“严格的杂交条件”意指大约35℃至65℃且在大约0.9摩尔的NaCl盐溶液中。严格性还可以由如存在于杂交溶液中的离子种类的浓度和类型、存在的变性剂的类型和浓度、以及杂交温度这些反应参数来控制。通常，随着杂交条件变得更加严格，如果要形成稳定的杂交物，则优选较长的探针。一般说来，杂交发生的条件的严格性将决定要使用的优选探针的某些特征。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指在向对象(例如人类患者)施用单剂量或多剂量后在疾病、病症或病理状况的预防性或治疗性治疗中有效的量。
如本文所用，术语“抗癌疗法”是指在治疗癌症中有用的疗法。抗癌疗法的实例包括但不限于，例如，手术、化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、抗激素剂、用于放射疗法的药剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂和其他治疗癌症的药剂，例如抗HER-2抗体(例如，
Figure BDA0003355055370000041
)、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)拮抗剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如，厄洛替尼
Figure BDA0003355055370000042
)、血小板衍生生长因子抑制剂(例如，GleevecTM(甲磺酸伊马替尼))、COX-2抑制剂(例如，塞来昔布)、干扰素、细胞因子、结合以下一种或多种靶标ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体、TRAIL/Apo2的拮抗剂(例如，中和抗体)，以及其他生物活性和有机化学试剂等。它们的组合也包括在本发明中。
如本文所用，术语“细胞毒剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如，At<211>、I<131>、I<125>、Y<90>、Re<186>、Re<188>、Sm<153>、Bi<212>、P<32>和Lu的放射性同位素)、化学治疗剂、和毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体)。
如本文所用，术语“化学治疗剂”是指可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括：烷化剂，例如噻替哌和
Figure BDA0003355055370000051
环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡(improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，例如，苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)、脲多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺类，包括六甲蜜胺、三乙胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；番荔枝内酯类(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他西酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素；卡利抑素(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素；倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；五加素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺、尿嘧啶芥；硝基脲类，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷尼司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔类抗生素(例如，卡利奇霉素(calicheamicin)，尤其卡利奇霉素γ1和卡利奇霉素ΩI1)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐，例如氯膦酸盐；拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团和相关的色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、
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多柔比星(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培普利欧霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链霉黑素、链脲菌素、块菌素、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，如氨鲁米特、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如弗洛林酸(frolinic acid；)；乙酰葡醛酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群(bisantrene)；edatraxate；地佛法明(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；亚丝醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；美登木素生物碱，如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶；喷司他丁(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
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多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺；细格孢氮杂酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；尿烷；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；格塞图辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌(thiotepa)；紫杉烷类，例如，
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紫杉醇、不含克列莫佛(Cremophor)的
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紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂和
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多西他赛(doxetaxel)；苯丁酸氮芥；
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吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱；
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长春瑞滨；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和亚叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluorometlhylornithine，DMFO)；类视黄醇类，如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；康普瑞汀(combretastatin)；亚叶酸(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼
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减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如，厄洛替尼
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)和VEGF-A的抑制剂、以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
如本文所用，术语“抗激素剂”是指起到调节或抑制激素对肿瘤作用的药剂，例如抗雌激素剂和选择性雌激素受体调节剂(Selective estrogen receptor modulator，SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括
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他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基三苯氧胺、曲沃昔芬(trioxifene)、克昔芬(keoxifene)、LY 117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON·托瑞米芬(toremifene)；抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，芳香酶调节肾上腺中雌激素的产生，例如，4(5)-咪唑类、氨鲁米特(aminoglutethimide)、
Figure BDA0003355055370000064
醋酸甲地孕酮、
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依西美坦(exemestane)、福美斯坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、
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伏氯唑(vorozole)、
Figure BDA0003355055370000067
来曲唑(letrozole)和
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阿那曲唑(anastrozole)；和抗雄激素剂，例如氟他胺、尼鲁他胺(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(一种1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制与异常细胞增殖有关的信号通路中的基因表达的那些，例如PKC-α、Ralf和H-Ras；核酶，例如VEGF表达抑制剂(例如，
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核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗，例如基因治疗疫苗，例如
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疫苗、
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疫苗和
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疫苗；
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rIL-2；
Figure BDA00033550553700000614
拓扑异构酶1抑制剂；
Figure BDA00033550553700000615
rmRH；以及任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
术语“细胞因子”是由一个细胞群释放的作为细胞间介质作用于另一个细胞的蛋白质的通用术语。这种细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(Folliclestimulating hormone，FSH)、促甲状腺激素(Thyroid stimulating hormone，TSH)和促黄体激素(Luteinizing hormone，LH)；表皮生长因子；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；米勒管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(thrombopoietin，TPO)；神经生长因子，如NGF-α；血小板生长因子；转化生长因子(Transforming growthfactor，TGF)，例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)；骨诱导因子；干扰素，例如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ集落刺激因子(Colony stimulating factor，CSF)，例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(Interleukin，IL)，例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；以及其他多肽因子，包括LIF和kit配体(kit ligand，KL)。如本文所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性等价物。
如本文所用，术语“生长抑制剂”是指在体外和/或体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞的百分比的一种物质。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进程(在S期以外的地方)的药剂，例如诱导G1期阻滞和M期阻滞的药剂。经典的M期阻滞剂包括长春花(长春新碱和长春碱)、
Figure BDA00033550553700000616
和topo II抑制剂，例如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素。那些阻滞G1的药物也会外溢成S期阻滞，例如DNA烷化剂，如他莫昔芬、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。更多信息可以在Mendelsohn和Israel编写的《癌症分子基础》(TheMolecular Basis of Cancer)的第一章中Murakami等人的标题为“细胞周期调节、致癌基因和抗肿瘤药物(Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs)”(WBSaunders:Philadelphia,1995)，尤其是第13页中找到。
如本文所用，术语“放射疗法”或“放疗”是指使用定向伽马射线或β射线来诱导对细胞的足够损伤以限制其正常运作的能力或完全破坏细胞。应当理解的是，本领域中将有已知的许多方法来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗是一次性给药，典型剂量范围为每天10至200单位(格雷)。
如本文所用，术语“肠疾病”是指影响小肠、结肠和/或直肠的那些疾病或病症。
本发明的方法
在第一方面，本发明涉及一种增加粪便潜血测试(FOBT)的特异性或降低FOBT的假阳性率的筛查、诊断和/或监测对象的结直肠晚期肿瘤(AN)、晚期腺瘤(AA)和/或结直肠癌(CRC)的方法，其中所述方法包括：
a)可选地，在从所述对象分离的粪便样本中进行FOBT，其中所述FOBT包括确定所述粪便样本中潜血的存在；和
b)在从所述对象分离的肠道样本(优选粪便样本)中定量以下细菌标志物中的至少一种，或其任何组合：
-麻疹孪生球菌(GMLL)，
-胃消化链球菌(PTST)，和
-脆弱拟杆菌(BCTF)。
在一个相关方面，本发明涉及一种筛查、诊断和/或监测对象的AN、AA和/或CRC的方法，所述方法包括：
a)可选地，在从所述对象分离的粪便样本中进行FOBT，其中所述FOBT包括确定所述粪便样本中潜血的存在；
b)在从所述对象分离的肠道样本(优选粪便样本)中定量以下细菌标志物中的至少一种，或其任何组合：
-麻疹孪生球菌(GMLL)，
-胃消化链球菌(PTST)，和
-脆弱拟杆菌(BCTF)。
在优选的实施方式中，a)中的FOBT和b)中细菌标志物的定量在粪便样本中进行，优选在相同的粪便样本中进行。
GMLL的参考菌株为麻疹孪生球菌NCTC11323菌株(细菌；厚壁菌门(Firmicutes)；杆菌纲(Bacilli)；芽孢杆菌目(Bacillales)；芽孢杆菌目科XI.地位未定(BacillalesFamily XI.Incertae Sedis)；孪生球菌属(Gemella))，其基因组序列的GenBank登录号为：LS483440.1。在特定实施方式中，对SEQ ID NO：1具有特异性的寡核苷酸可用于定量GMLL。SEQ ID NO：1对应于GenBank登录号：LS483440.1REGION:827110..827892。
Figure BDA0003355055370000071
PTST的参考菌株为胃消化链球菌DSM 17678菌株(细菌；厚壁菌门；梭菌纲(Clostridia)；梭菌目(Clostridiales)；消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)；消化链球菌属(Peptostreptococcus))，其基因组序列的GenBank登录号为：ADGQ01000060.1。在特定实施方式中，对SEQ ID NO：2具有特异性的寡核苷酸可用于PTST的定量。SEQ ID NO：2对应于GenBank登录号：ADGQ01000060.1REGION：互补(142796..143362)。
Figure BDA0003355055370000081
BCTF的参考菌株为脆弱拟杆菌NCTC 9343菌株(细菌；拟杆菌门(Bacteroidetes)；拟杆菌纲(Bacteroidia)；拟杆菌目(Bacteroidales)；拟杆菌科(Bacteroidaceae)；拟杆菌属(Bacteroides))，其基因组序列的GenBank登录号为：CR626927.1。在特定实施方式中，对SEQ ID NO：1具有特异性的寡核苷酸可用于定量BCTF。SEQ ID NO：3对应于GenBank登录号：CR626927.1REGION:417101..417817。
Figure BDA0003355055370000082
在优选的实施方式中，这些特定的寡核苷酸是表3中分别针对GMLL、PTST和BCTF记载的那些中的任何寡核苷酸，以及与其中任何寡核苷酸具有至少80％同一性的序列。
如实施例3所示，发现PTST与瘤病变高度相关(非晚期腺瘤+晚期腺瘤+CRC；p＜0.001)。此外，GMLL、PTST和BCTF中的每个都被鉴定为检测晚期肿瘤(AN)病变的潜在生物标志物(分别为p＝0.006、p＜0.001和p＝0.030)。此外，还发现CRC中的GMLL和PTST显著地比健康对象的更丰富(分别为p＝0.004和p＜0.001)。
如本文所用，术语“结直肠癌(Colorectal cancer)”、“CRC”是指始于结肠或直肠的癌症。根据其起源位置，这些癌症也可以分别称为结肠癌或直肠癌。结肠癌和直肠癌有许多共同的特点。根据ACS，几种类型的癌症可能始于结肠或直肠。95％以上的结直肠癌是一种被称为腺癌的癌症。这些癌症始于形成腺体的细胞，所述腺体产生粘液来润滑结肠和直肠的内部。其他不太常见类型的肿瘤也可能始于结肠和直肠。这些肿瘤包括：类癌瘤、胃肠道间质瘤(Gastrointestinal stromal tumor，GIST)、淋巴瘤和肉瘤。在一个优选的实施方式中，所述结直肠癌是腺癌。
腺瘤是器官(例如结肠)的内壁上的异常腺细胞的非癌性生长。符合以下一项或多项特征的腺瘤通常被归类为晚期腺瘤：测量直径大于等于10mm、具有绒毛结构、高度异型增生或粘膜内癌(Quintero E.,Castells A.,et al.,N Engl J Med.2012,366(8):697-706；Cubiella J.et al.,Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.2014,23(9):1884-92；Muto T,Bussey HJR MB.,Cancer 1975；36:2251–70)。
如本文所用，术语结直肠晚期肿瘤(AN)包括CRC和晚期腺瘤(AA)。根据ACS，最有可能同时发现AA和CRC的测试是优选的。涉及腺瘤患者的队列研究表明，息肉切除术可预防大约80％的结直肠癌(Citarda F,et al.,Gut 2001,48:812-5；Winawer SJ,et al.,N EnglJ Med 1993,329:1977-81)。
如本文所用，术语“诊断”既指试图确定和/或鉴定对象的可能的疾病的过程，即诊断过程，又指通过该程序得出的意见，即诊断意见。因此，它也可以被视为尝试将个人的状况分类为单独和不同的类别，以便做出有关治疗和预后的医疗决策。应当理解，在优选的实施方式中，该方法是在体外进行的方法，即不在人体或动物体上实施。特别地，确定CRC、AA和/或AN患者的诊断可能与鉴定和分类CRC、AA和/或AN患者的能力有关。
在一个特定的实施方式中，本发明的诊断方法在怀疑患有CRC的对象中进行。如本文所用，术语“怀疑患有CRC的对象”是指表现出一种或多种可能指示CRC的体征或症状的对象。怀疑患有CRC的对象还包括已经接受初步诊断但尚未对其进行验证测试(例如结肠镜检查)的个体。
可能指示CRC的体征或症状包括例如以下一项或多项：不明原因的体重减轻、腹痛、不明原因的直肠出血、缺铁性贫血、排便习惯改变以及粪便中存在潜血(参见例如Jellema et al,BMJ 2010,340:c1269，或Adelstein et al.BMC Gastroenterology 2011,11:65)。出于说明目的，下文提供了当前NICE指南(NG12)中怀疑是CRC的那些情况；https://www.nice.org.uk/guidance/ng12/chapter/1-Recommendations-organised-by-site-of-cancer#lower-gastrointestinal-tract-cancers:
-在以下情况下，推荐成人针对结直肠癌进行疑似癌症途径转诊(例如，2周内预约)：
·他们年龄在40岁及以上，有不明原因的体重减轻和腹痛，或者
·他们年龄在50岁及以上，有不明原因的直肠出血或
·他们年龄在50岁及以上，并且具有：
o缺铁性贫血或
o排便习惯改变，或
·测试显示他们的粪便中有潜血。
-对于具有直肠或腹部肿块的成人，考虑针对结直肠癌进行疑似癌症途径转诊(例如，在2周内预约)。
-对于50岁以下的具有直肠出血和以下任何不明原因的症状或发现的成人，考虑针对结直肠
癌进行疑似癌症途径转诊(例如，在2周内预约)：
·腹痛
·排便习惯改变
·体重减轻
·缺铁性贫血。
-提供粪便潜血测试，以针对结直肠癌对以下无直肠出血的成人进行评估：
·年龄在50岁及以上且具有不明原因的：
o腹痛或
o体重减轻，或者
·年龄在60岁以下，并且具有：
o排便习惯改变或
o缺铁性贫血，或者
·年龄在60岁及以上，并且具有贫血，即便并不缺铁。
本发明的方法还可以用于CRC、晚期腺瘤和/或晚期肿瘤与非晚期腺瘤之间的鉴别诊断。
降低CRC发病率和死亡率的最有效和最经济的措施是CRC风险筛查和监测测试。筛查测试分为：主要检测早期癌症的测试；和既能够检测早期癌症也能够检测晚期腺瘤从而通过息肉切除术(即息肉清除)提供更大预防潜力的测试，参见Levin等人的美国癌症协会(American Cancer Society，ACS)2008年筛查和监测指南(CA Cancer J Clinicians,2008；58(3)130-160)。平均风险人群和风险增加或高风险的人群应用不同的筛查指南(http://www.cancer.org/cancer/colonandrectumcancer/moreinformation/colonandrectumcancerearlydetection/col orectal-cancer-early-detection-acs-recommendations)。
术语“筛查”在本文中被理解为对属于一般人群的一组无症状个体，或对具有一种或多种风险因素的一组个体(例如，具有中患病风险或高患病风险的对象)的检查或测试，其目的是将健康个体与患有或怀疑患有疾病的个体区分开来。筛查方法通常用于疾病的“早期检测”。表述“早期检测”是指在临床体征出现之前的检测。
癌症筛查的目标是通过早期检测和治疗降低死亡率，从而降低通常预后较差的晚期疾病的发生率。为此，现代CRC筛查可通过腺癌(最好是早期腺癌)的检测和晚期腺瘤的检测和切除来实现这一目标。因此发现本发明的筛查方法是通过检测CRC和/或晚期肿瘤来降低与CRC相关的死亡率的有效工具。
本发明的筛查方法可以在不呈现CRC的体征和/或症状的个体(本文称为“无症状个体”)中进行。它也可以在具有或没有结肠肿瘤的个人史或家族史或如下所述的其他CRC风险因素的对象中进行。
在一个特定的实施方式中，本发明的筛查方法在具有中等CRC风险的对象中进行的。这些通常是50岁及以上的对象，他们没有个人或家族CRC背景。鼓励50岁及以上的一般风险的女性和男性进行结直肠癌筛查测试(参见Levin et al.,CA Cancer J Clinicians,2008；58(3)130-160的表2，其通过引用并入本文)。
在另一个实施方式中，本发明的筛查方法在风险增加和/或高风险的对象中进行。根据ACS(参见Levin et al.,CA Cancer J Clinicians,2008；58(3)130-160的表3，其通过引用并入本文)，风险增加和高风险的对象可能包括以下：
风险增加
-既往结肠镜检查有息肉病史的对象；
-患有结直肠癌的对象；和
-具有结直肠癌或腺瘤性息肉家族史的对象，包括：
i.60岁之前的一级亲属或任何年龄的2名或更多名一级亲属患有CRC或腺瘤性息肉；
和/或
ii.≥60岁的一级亲属或2名二级亲属患有CRC或腺瘤性息肉。
高风险
-通过基因检测诊断为具有家族性腺瘤性息肉病(Familial adenomatouspolyposis，FAP)或未经基因检测而疑似FAP的对象；
-患有遗传性非息肉性结肠直肠癌(Hereditary non-polyposis colon cancer，HNPCC或林奇综合征(Lynch syndrome))或未经基因检测的基于家族史具有增加的HNPCC风险的对象；和
-患有炎性肠病的对象，例如慢性溃疡性结肠炎或克罗恩病(Crohn's disease)。
本发明的另一个目的是提供一种预诊断工具。具体地，本发明的方法可用于筛查和/或识别具有CRC易感性或CRC风险增加的对象，例如通过检测晚期腺瘤的存在。
如本文所用，术语“监测”是指确定疾病的演变、和/或手术和/或治疗性治疗的功效，例如确定疾病是否缓解；或者相反，疾病是否进展或复发。本发明的监测方法的目标之一是早期检测复发。在一个特定的实施方式中，本发明的方法用于监测已接受手术切除的患有癌症的对象，可选地与辅助和/或新辅助治疗组合。
在优选的实施方式中，本发明的方法用于筛查、诊断和/或监测AN、AA和/或CRC。
如本文所用，术语“样本”或“生物样本”是指从对象分离的生物材料。生物样本可以包含适合于检测预期生物标志物的任何生物材料并且可以包含来自对象的细胞和/或非细胞材料。在一个优选的实施方式中，样本是肠样本。这些肠样本可以是例如来自结肠和/或直肠的粘膜组织的活检。优选地，该肠样本是粪便样本。临床实践中常规地使用粪便样本，本领域技术人员将知道如何确定获得和保存它们的最合适的方法。一旦获得样本，它可以新鲜使用，可以使用适当的方式冷冻或保存。
本发明的方法可选地包括：在步骤a)中，在从对象分离的粪便样本中进行FOBT，其中所述FOBT包括确定从所述对象分离的粪便样本中潜血的存在。便血是一种非特异性发现，其可能源自CRC或更大(＞1至2cm)的息肉。因为小腺瘤性息肉不会流血，而且癌症或大息肉的出血可能是间歇性的，或者在单次粪便样本中并不总是可以检测到，所以正确使用粪便血液检测通常需要每年进行检测，包括从连续排便中收集试样(2个或3个，视产品而定)。粪便血液检测通常被称为粪便潜血测试(FOBT)，因为它们旨在检测粪便中是否存在潜血。根据检测的分析物，FOBT分为两个主要类别：gFOBT和FIT。基于愈创木脂的测试通过血红素或血红蛋白的假过氧化物酶活性来检测粪便中的血液，而基于免疫化学的测试则对人珠蛋白起反应(Levin et al.CA Cancer J Clinicians,2008；58(3)130-160)。
通常的gFOBT方案包括从3次连续排便中每次收集2个样本。由于gFOBT是一项定性测试，因此通常由训练有素的实验室技术人员使用肉眼进行视觉读取，以阐明视觉结果。在使用灵敏的基于愈创木脂的测试进行测试之前，通常会指示个人避免阿司匹林和其他非甾体抗炎药、维生素C、红肉、家禽、鱼和一些生蔬菜，因为饮食-测试相互作用可能会增加假阳性和假阴性(特别是维生素C)结果的风险。市售gFOBT的一个例子是Hemoccult SENSA(Beckman Coulter，美国)。
FIT检测人珠蛋白，其是一种与血红素一起构成人血红蛋白的蛋白质。因此，与依赖于检测人血液中的过氧化物酶的基于愈创木脂的测试相比，FIT对人血液更具特异性，并且也与存在于稀有红肉、十字花科蔬菜和一些水果等膳食成分中的过氧化物酶产生反应。此外，与gFOBT不同，FIT在存在高剂量维生素C补充剂的情况(阻止过氧化物酶反应)下不会出现假阴性结果。此外，由于珠蛋白被上消化道的消化酶降解，FIT对下消化道出血也更具特异性，从而提高了它们对CRC的特异性。最后，与gFOBT相比，FIT的一些变型的样本收集对患者的要求更低，需要的样本更少或直接处理粪便的次数更少。基于不同的检测技术(例如，反向被动血凝(Reversed passive hemagglutination，RPHA)、乳胶凝集、ELISA和免疫比浊法)存在多种FIT，并包含在本文中(Levin B et al.,Gastroenterology 2008；134:1570-95)。优选地，所述免疫学测试基于乳胶凝集反应，例如实施例中使用的OC-SENSOR测定(Eiken Chemical Co.，日本)。
优选地，所述FOBT是定量人血红蛋白(human hemoglobin，hHb)的粪便免疫化学测试(FIT)。当粪便样本中的hHb水平高于预定阈值时，将确定对象为FIT阳性。例如，当hHb水平等于或高于10μg hHb/g粪便(或等于或高于50ng血红蛋白/mL；FIT50截止值)或当hHb水平等于或高于20μg hHb/g粪便(或等于或高于100ng血红蛋白/mL；FIT100截止值)，可以确定对象为FIT阳性。FIT100截止值是加泰罗尼亚和西班牙其他地区常用的作为FIT在CRC筛查中的截止值的一种。如表5所示，相对于仅使用对应的FIT测试，当使用两个阈值时，本发明的方法获得了特异性的改善。在优选的实施方式中，FIT阳性对象的hHb水平等于或高于10μg hHb/g粪便(FIT50截止值)，对此获得稍高的灵敏度。
如上所述，本发明的方法可以包括：在步骤b)中，对GMLL、PTST或BCTF中的任何以及其任何组合进行定量，包括i)GMLL和PTST；ii)GMLL和BCTF；iii)PTST和BCTF；和/或iv)GMLL、PTST和BCTF。可选地，如在任何这些实施方式中定义的所述方法可以进一步包括定量所述肠样本(优选地，粪便样本)中的多形拟杆菌(BCTT)。BCTT的参考菌株为多形拟杆菌VPI-5482菌株(细菌；拟杆菌门；拟杆菌纲；拟杆菌目；拟杆菌科；拟杆菌属)，其基因组序列的GenBank登录号为：AE015928.1。在特定的实施方式中，对SEQ ID NO：4具有特异性的寡核苷酸可用于BCTT的定量。SEQ ID NO：4对应于GenBank登录号：AE015928.1REGION:326008..326649。在优选的实施方式中，这些特定的寡核苷酸是表3中记载的BCTT的那些中的任何寡核苷酸，以及与其中任何寡核苷酸具有至少80％同一性的序列。
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优选地，步骤b)包括定量PTST、BCTF和BCTT或由定量PTST、BCTF和BCTT组成。
用于测定目标核酸序列的量的分子生物学方法在本领域中是公知的。这些方法包括但不限于：终点PCR、竞争性PCR、定量PCR(qPCR)、PCR-焦磷酸测序、PCR-ELISA、DNA微阵列、核酸测序(例如下一代测序方法)、原位杂交测定(例如斑点免疫印迹(dot-blot)或荧光原位杂交测定(Fluorescence In Situ Hybridization assay，FISH)、质谱、分支DNA(Nolte,Adv.Clin.Chem.1998,33:201-235)和所述方法的多重形式(参见例如Andoh etal.,Current Pharmaceutical Design,2009；15,2066-2073)和任何列出的技术的下一代及其组合，所有这些都在本发明的范围内。
已经描述多种下一代测序方法并且其是本领域技术人员公知的。这些下一代测序方法包括：例如，循环可逆终止法(例如，Illumina、SEQLL、Qiagen)合成测序、单核苷酸添加方法合成测序(例如Roche-454、Thermo Fisher-Ion Torrent)、连接测序(例如、ThermoFisher SOLiD和BGI-Complete Genomics)、实时长读长测序(例如Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies)、合成长读长测序(例如Illumina、10X Genomics、iGenomeX)，例如参见Goodwin S,et al.,Nat Rev Genet.2016,17(6):333-51。
在一些实施方式中，所述分子生物学定量方法是基于序列特异性扩增。这种基于扩增的测定包括扩增步骤，该扩增步骤包括使样本(优选分离的DNA样本)与两个或更多个对目标核酸中的目标序列特异的扩增寡核苷酸接触以产生扩增产物(如果目标核酸序列存在于样本中)。扩增产物将包含对应于目标序列的cDNA序列。合适的扩增方法包括：例如，复制酶介导的扩增、连接酶链式反应(Ligase chain reaction，LCR)、链置换扩增(Strand-displacement amplification，SDA)、转录介导的扩增(Transcription mediatedamplification,TMA)和包括定量PCR在内的聚合酶链式反应(Polymerase chainreaction,PCR)。
一种特别优选的定量方法是定量PCR(quantitative PCR，qPCR)，也称为实时PCR(real-time PCR)。它涉及一种扩增并同时定量目标DNA分子的PCR。其主要特点是随着反应的进行实时检测扩增的DNA。可以使用不同的仪器，例如，Applied Biosystems的ABI Prism7700SDS、GeneAmp 5700SDS、ABI Prism 7900HT SDS；Bio-Rad的iCycler iQ；Cepheid的Smart Cycler；Corbett Research的Rotor-Gene；Roche Molecular Biochemicals的LightCycler、Agilent的AriaMx以及Stratagene的Mx4000 Multiplex。qPCR过程通过在反应的指数阶段很早就测量PCR产物的积累而能够实时准确定量PCR产物，从而减少终点PCR中发生的与PCR扩增效率相关的定量偏差。实时PCR在本领域中是众所周知的，因此在本文中不再详细描述。qPCR的技术概述和方案例如可从上述供应商处获得，例如http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html或http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/pcr/quantitative-pcr/qpcr-technical-guide.html。有关qPCR方法的综述参见Wong ML yMedrano JF,Biotechniques 2005,39(1):75-85。在一个特定的实施方式中，定量方法是多重qPCR。
不同的检测化学可用于qPCR。所有这些都可以与上述qPCR仪器一起使用。术语“检测化学”是指在实时PCR中报告特定PCR产物的扩增的方法。这些检测化学可分为两组：第一组包括双链DNA嵌入分子，例如SYBR Green I和EvaGreen，而第二组包括荧光团标记的寡核苷酸。后者又根据PCR反应中使用的荧光分子的类型分为三个亚组：(i)引物-探针(Scorpions、
Figure BDA0003355055370000122
LUXTM、Cyclicons、
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)；(ii)探针；水解(TaqMan、MGB-TaqMan、Snake测定)和杂交(Hybprobe或FRET、Molecular Beacons、HyBeaconTM、MGB-Pleiades、MGB-Eclipse、
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Yin-Yang或置换)；以及(iii)核酸类似物(PNA、
Figure BDA0003355055370000125
ZNATM、非天然碱基：PlexorTM引物，Tiny-Molecular Beacon)，参见E.Navarro等人，临床化学学报，第439卷，2015年1月15日，第231-250页。
所述探针可以是双标记的寡核苷酸，例如水解探针或分子信标。寡核苷酸的5'端通常用荧光报告分子标记，而3'端用淬灭剂分子标记。探针的序列对扩增的目标分子中的感兴趣区域具有特异性。在更优选的实施方式中，所述探针是水解探针，其被设计成使得序列的长度将5'荧光团和3'猝灭剂放置在足够接近的位置以抑制荧光。用于qPCR探针的几种报告分子和猝灭剂是本领域公知的。
通常，为了定量核苷酸序列，使用特定的寡核苷酸，例如探针和/或引物。术语“引物和/或探针”具体包括“一个或多个引物和/或一个或多个探针”。两种表述在本文中可互换使用并且包括，例如，一个引物；一个探针；一个引物和一个探针；一对引物；以及一对引物和一个探针。引物和探针的设计和验证是本领域众所周知的。有关定量实时PCR方法中引物和探针的设计参见例如，Rodriguez A等人(Methods Mol Biol.,2015,1275:31-56)。可用于本发明方法的优选的引物和/或探针在下文本发明的试剂盒下描述。
优选地，用于本发明方法的寡核苷酸长度为约5个至约50个核苷酸，约10个至约30个核苷酸，或约20个至约25个核苷酸。在某些实施方式中，与目标序列特异性杂交的寡核苷酸的长度为约19个至约21个核苷酸。在一个特定的实施方式中，所述寡核苷酸已经针对检测目的或增强如本文所述的测定性能而被修饰。
这些寡核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。在特定的实施方式中，寡核苷酸可以具有至少一种化学修饰。例如，合适的寡核苷酸可以由一种或多种“构象受限”或双环的糖核苷修饰组成，例如“锁核酸”。“锁核酸”(Locked nucleic acid，LNA)是修饰的核糖核苷酸，其在核糖部分的2'碳和4’碳之间包含一个额外的桥，导致“锁”构象，这赋予了含有LNA的寡核苷酸增强的热稳定性。在其他实施方式中，寡核苷酸可以包含肽核酸(Peptidenucleic acid，PNA)，其包含基于肽的骨架而不是糖-磷酸骨架。寡核苷酸可以包含的其他化学修饰包括但不限于：糖修饰，例如2'-O-烷基(例如2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基)、2'-氟和4'硫代修饰；和骨架修饰，例如一个或多个硫代磷酸酯、吗啉代或膦酰基羧酸酯键。例如，这些寡核苷酸，特别是较短长度(例如，小于15个核苷酸)的寡核苷酸可包含一种或多种增强亲和力的修饰，例如但不限于LNA、双环核苷、膦酰甲酸酯、2'O-烷基等等。在一些实施方式中，寡核苷酸可以被化学修饰，例如以提高它们对核酸酶降解的抗性(例如通过封端)，以携带检测配体(例如荧光素)或促进将它们捕获到固体支持物上(例如聚脱氧腺苷“尾”)。
术语“定量水平”可以是浓度(每单位体积的DNA量)、每单位细胞数的DNA量、循环阈值(Ct值)或其任何数学变换。在一个优选的实施方式中，所述细菌序列的定量通过qPCR进行并且定量水平表示为Ct值。Ct(循环阈值)值定义为荧光信号超过阈值所需的qPCR循环数。Ct水平与样本中目标核酸的量成反比(即，Ct水平越低，样本中目标核酸的量越大)。
粪便样本中目标核酸序列(例如SEQ ID NO：1)的丰度的定量可以是绝对的或相对的。相对定量是基于一个或多个内部参考基因，即来自参考菌株的16S rRNA基因，例如使用通用引物测定总细菌(真细菌)并表示目标核酸序列相对于真细菌的丰度(例如SEQ ID NO:1/真细菌比率)。通过与DNA标准进行比较，绝对定量给出了目标分子的准确数量。
在一个特定的实施方式中，与如本文所述的一个或多个实施方式或特征可选地组合，步骤b)中细菌标志物的定量是相对于真细菌的，并表示为相应定量值的比率(例如Ct值的比率)。可用于定量真细菌的特定寡核苷酸是表3中针对EUB记载的那些中的任何寡核苷酸，以及与其中任何寡核苷酸具有至少80％同一性的序列。可选择地，也可以使用以下寡核苷酸中的任何一个，或与其中任何一个具有至少80％同一性的序列：
EUB2正向(SEQ ID NO：5)：ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
EUB2反向(SEQ ID NO：6)：GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC
在本发明方法的一个特定实施方式中，在定量所述细菌序列之前，从粪便样本中提取DNA。已知有几种从粪便样本中提取DNA的方法，所有这些方法都依赖于化学或机械破坏、使用去污剂进行裂解或这些方法的组合(Kennedy A.et al.,PLoS One,2014；9(2):e88982)。提取粪便样本中细菌DNA的方法从例如M Corist et al.,Journal ofMicrobiological Methods,2002；50(2):131-139、Whitney D et al.,Journal ofMolecular Diagnostics,American Society for Investigative Pathology,2004；6(4):386-395以及WO2003/068788获知。
优选的方法使用机械破碎的组合，例如高速珠打提取、化学裂解和最终纯化步骤，优选使用硅胶膜柱，例如包含在市售DNA提取试剂盒“MobioPower
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DNA提取程序”(Mo-Bio Laboratories Inc.,)、用于土壤程序的
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SPIN Kit(MP biomedicals)和
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Soil(Macherey-Nagel Gmbh&Co.KG)中的那些。从粪便样本提取的DNA中存在的PCR抑制剂，例如胆红素、胆汁盐和复合碳水化合物，这是测定从粪便中提取的DNA中的DNA生物标志物所面临的困难之一(Fleckna et al.,Mol Cell Probes,2007；21(4):282-7)。优选的DNA提取方法是那些提供具有少量PCR抑制剂的粪便提取物的方法，例如少于5％，优选少于2％，更优选少于1％，甚至更优选少于0.5％，例如少于0.25％、0.1％、0.05％或0.01％。
在一个具体的实施方式中，本发明的方法还包括：
c)由b)中确定的细菌标志物的水平计算组合评分；和
d)根据c)中获得的组合评分将FOBT阳性对象按照患有AN、AA和/或CRC或呈现患有AN、AA和/或CRC的增加风险分类。
步骤(c)的组合评分是根据给定的数学算法获得的值，例如，其中步骤b)中确定的每个细菌标志物的定量值是所述数学算法的变量。优选地，所述细菌标志物是PTST、BCTF和BCTT。
在特定的实施方式中，当计算组合评分时，这与样本中GMLL、PTST或BCTF的任何的绝对量或相对量成比例；与BCTT的绝对量或相对量成反比；其中分数越高，患有CRC、AA和/或AN的可能性越高。换句话说，高分数表明存在疾病。
例如，所述组合评分可以计算为在每个标志物的回归分析中获得的标准化β系数的乘积之和，其中细菌标志物值用作变量。在一个特定的实施方式中，标志物GMLL、PTST和/或BCTF的β系数是正的；BCTT的β系数是负的。正号表示个体标志物的量的增加与患有CRC、AA和/或AN或患有CRC、AA和/或AN的可能性较高的有关，负号表示个体标志物的量的减少与患有CRC、AA和/或AN或患有CRC、AA和/或AN的可能性较高有关。
通常，在步骤d)中，所述方法包括将对象样本中的组合评分与参考值(例如参考组合评分)进行比较；并且其中对象样本中的组合评分相对于所述参考值(例如参考组合评分)增加指示AN、AA和/或CRC。
如本文所用，术语“参考组合评分”是根据给定的数学算法获得的参考值，其中本发明方法中使用的每个细菌标志物的参考表达值是所述数学算法的变量。
如本文所用，术语“参考值”涉及用作评估从对象收集的样本获得的值或数据的参考的预定标准。该“参考值”也可以称为“截止值”或“阈值”。
参考值或参考水平可以是绝对值、相对值、具有上限或下限的值、一系列值、平均值、中值、均值、z-评分值(例如均值+1SD或-1SD)、三分位数值或与特定对照值或基线值相比的值。在特定的实施方式中，与上文或下文描述的一个或多个实施方式或特征可选地组合，所述参考值为均值或三分位数值。
此外，还应注意，用于建立表达的阈值或截止水平的多种统计和数学方法在现有技术中是已知的。可以选择特定生物标志物的阈值或截止表达水平，例如，基于来自接受者工作特征(ROC)图的数据进行选择。本领域技术人员将会理解，这些阈值或截止表达水平可以改变，例如，通过沿特定生物标志物或其组合的ROC图移动，从而获得不同的灵敏度或特异性值，从而影响整体测定性能。
参考值可基于单个样本值，但通常基于大量样本，包括或不包括要测试的样本。例如，该参考值可以来自上文定义的筛查群体之一(例如，普通人群中的无症状成年人、50岁以上的无症状成年人或具有一种或多种风险因素的无症状成年人)或来自具有CRC相关症状的个体群体。此外，该参考值可以来源自参考AN、AA和/或CRC患者群体的组织样本的集合，这些患者群体的与相应癌症患者的实际临床结果相关的历史信息是可获得的。
可选择地，根据本发明的方法的参考值可从以下获得：一名或多名未患有CRC或晚期腺瘤、未患有胃肠道疾病的对象(即健康对照对象)、患有晚期腺瘤的对象、患有早期CRC例如无症状(临床前阶段)的对象或被诊断为患有CRC和/或晚期腺瘤但在较早的时间点的同一对象。
在一个特定的实施方式中，本发明的方法是筛查或诊断AN、AA和/或CRC的方法，并且参考值获得自未患有AN、AA和/或CRC的对象或未患有胃肠道疾病的对象。在另一个实施方式中，本发明的方法是一种筛查方法，并且所述参考值获得自本文定义的筛查群体。在另一个实施方式中，本发明的方法是一种诊断方法，并且所述参考值获得自具有CRC相关症状的个体。
在又一个特定的实施方式中，本发明的方法是筛查或诊断AN、AA和/或CRC的方法，并且参考值获得自患有非晚期腺瘤的对象。例如，当需要相对于非晚期腺瘤(NAA)进行AN、AA和/或CRC之间的鉴别诊断时，可能就是这种情况。
在另外的特定实施方式中，本发明的方法是监测AN、AA和/或CRC的方法并且参考值获得自被诊断为患有AN、AA和/或CRC但在较早的时间点的同一对象。
在其他实施方式中，本发明的方法可以包括如上文所述的步骤a)和b)并且进一步包括：
e)将粪便样本中GMLL、PTST、BCTF和/或BCTT中任何的量与相应的参考值进行比较；
f)其中相对于相应的参考值，FOBT阳性对象的样本中GMLL、PTST和/或BCTF的量增加和BCTT的量减少指示AN、AA和/或CRC。
优选地，其中相对于相应的参考值，FOBT阳性对象的样本中PTST和BCTF的量增加以及BCTT的量减少指示AN、AA和/或CRC。
在本发明的方法中，当所述组合评分(或细菌标志物量)低于参考组合评分(或参考值)时，组合评分(或细菌标志物量)被认为是“降低的”。优选地，当组合评分比参考综合得分(或参考值)低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或更多时，认为组合评分比参考组合评分(或参考值)低。
同样，在本发明的方法的上下文中，当所述组合评分高于参考组合评分(或参考值)时，组合评分(或细菌标志物量)被认为是“增加的”。优选地，当组合评分(或细菌标志物量)比参考综合得分(或参考值)高至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或更多时，认为组合评分比参考组合评分(或参考值)高。
可选择地或另外地，对象具有相对于本文所述的参考组合评分(或参考值)大于约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20倍的水平偏差(即增加或减少)是本文所述。
正如本领域技术人员所理解的那样，本发明的方法并不声称分析的样本中100％是正确的。但是，它要求对统计学上显著的量的分析样本进行正确分类。统计学上显著的量可由本领域技术人员通过使用通过统计检验获得的不同的统计显著性度量来确定；所述统计显著性度量的说明性、非限制性示例包括确定置信区间、确定p值等。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％。p值优选小于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005或小于0.0001。本发明的教导优选地允许对所分析的测定组或群体的对象的至少60％、至少70％、至少80％或至少90％正确分类。
有效性研究解决了关于识别目标条件的能力的提议的(指数)测试与参考标准之间的一致性(参见Florkowski M.C.,Clin Biochem Rev.2008,29(Suppl 1):S83–S87)。灵敏度、特异性、准确度、阳性似然比、阴性似然比、阳性预测值和阴性预测值是可以被定义以评估测试性能的统计值。首字母缩略词的定义和更多详细信息在下表1中提供。
Figure BDA0003355055370000151
根据临床实践中测试的目标用途，测试通常根据所需的特异性和灵敏度进行校准。高灵敏度对应于高阴性预测值，通常被认为是“排除(rule out)”测试(例如随后通常会进行确认测试的筛查测试)的理想特性。高特异性对应于高阳性预测值，通常被认为是“(rule in)”测试(例如伴随诊断测试)的理想特性。
在优选的实施方式中，本发明的方法在所分析的组或群体的至少60％中，或优选地在所分析的组或群体的至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中，具有至少约60％，优选至少约70％，并且可以为例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的灵敏度值、特异性值和/或准确度值。
进一步注意到，通过额外考虑患者的其他基因或细菌标志物、生化参数和/或临床特征(例如年龄、性别、吸烟和/或其他风险因素)，可以进一步提高本发明方法的准确度。这些其他标志物、参数和/或特征的测定可以与本文所述的本发明方法的任何或所有步骤顺序地或同时地进行。
在一个特定的实施方式中，与本文所述的一个或多个特征或实施方式可选地组合，本发明的方法进一步包括定量选自由以下组成的组的一种或多种细菌标志物：B10、B46、B48、肠道罗斯拜瑞氏菌(RSBI)、肠道柯林斯菌(CINT)、普氏栖粪杆菌(Duncan et al.,Int.J.Syst.Evol.Microbiol 2002,52:2141-2146)和/或其系统群中的任何菌株(参见WO2017/025617A1和Lopez-Siles et al.Appl Environ Microbiol.2012,78:420-428)、以及大肠杆菌。
B10具有序列SEQ ID NO：7(如下所示)，对应于未培养细菌分离物DGGE凝胶条带Eub_10 16S核糖体RNA基因，部分序列(GenBank：GQ411118.1)。在特定的实施方式中，对SEQID NO：7具有特异性的寡核苷酸可用于B10的定量。
Figure BDA0003355055370000161
B46具有序列SEQ ID NO：8(如下所示)，对应于未培养细菌分离物DGGE凝胶条带Eub_46 16S核糖体RNA基因，部分序列(GenBank：GQ411150.1)。在特定的实施方式中，对SEQID NO：8具有特异性的寡核苷酸可用于B46的定量。
Figure BDA0003355055370000162
B48具有序列SEQ ID NO：9(如下所示)，对应于未培养细菌分离物DGGE凝胶条带Eub_48 16S核糖体RNA基因、部分序列(GenBank：GQ411152.1)。在特定的实施方式中，对SEQID NO：9具有特异性的寡核苷酸可用于B48的定量。
Figure BDA0003355055370000163
Figure BDA0003355055370000171
RSBI的参考菌株为肠道罗斯拜瑞氏菌L1-82菌株(细菌；厚壁菌门；梭菌纲；梭菌目；毛螺菌科(Lachnospiraceae)；罗斯拜瑞氏菌属(Roseburia))，其基因组序列在GenBank登录号为：LR027880.1中示出。在特定的实施方式中，对SEQ ID NO：10具有特异性的寡核苷酸可用于RSBI的定量。SEQ ID NO：10对应于GenBank登录号：LR027880.1REGION:599208..600101。
Figure BDA0003355055370000172
CINT(细菌；放线菌门(Actinobacteria)；红蝽菌纲(Coriobacteriia)；红蝽菌目(Coriobacteriales)；红蝽菌科(Coriobacteriaceae)；柯林斯菌属(Collinsella))的参考菌株是肠道柯林斯菌DSM 13280菌株，其基因组序列的NCBI参考序列为GG692711.1。在特定的实施方式中，对SEQ ID NO：11具有特异性的寡核苷酸可用于CINT的定量。SEQ ID NO：11对应于NCBI参考序列：GG692711.1REGION:297314..298120。
Figure BDA0003355055370000173
普氏栖粪杆菌(细菌；厚壁菌门；梭菌纲；梭菌目；疣微菌科(Ruminococcaceae)；粪杆菌属(faecalibacterium))的参考菌株是普氏栖粪杆菌A2-165(GenBank登录号：AJ270469.2)，它也是其系统群II(PHGII)的代表性菌株。普氏栖粪杆菌M21/2(GenBank登录号：DS483503.1)是其系统群I(PHGI)的代表性菌株。在特定的实施方式中，对SEQ ID NO：12具有特异性的寡核苷酸可用于普氏栖粪杆菌的定量，SEQ ID NO：12(如下所示)对应于GenBank登录号：AJ270469.2。
Figure BDA0003355055370000174
Figure BDA0003355055370000181
大肠杆菌(细菌；变形菌门(Proteobacteria)；丙型变形菌纲(Gammaproteobacteria)；肠杆菌目(Enterobacterales)；肠杆菌科(Enterobacteriaceae)；埃希氏杆菌属(Escherichia))的参考菌株是大肠杆菌菌株K-12亚菌株MG1655，以及其基因组序列的GenBank登录号为CP032667.1。在特定的实施方式中，对SEQ ID NO：13(如下所示)具有特异性的寡核苷酸可用于大肠杆菌的定量。
Figure BDA0003355055370000182
Figure BDA0003355055370000191
在优选的实施方式中，表3中记载的任何特定寡核苷酸以及与其中任何一个具有至少80％同一性的序列可分别用于B10、B46、B48、CINT或RSBI的定量。此外，在优选的实施方式中，WO2017/025617A1的表2中记载的任何特定寡核苷酸，以及与其中任何一个具有至少80％同一性的序列，可用于普氏栖粪杆菌、其系统群(即PHGI和PHGII)以及大肠杆菌的定量。
本发明的方法或其任何步骤可以由计算机实施。本文使用的术语计算机可以指任何可编程装置或系统。在特定的实施方式中，与本文所述的任何特征或实施方式可选地组合，步骤c)的组合评分是使用计算机计算的；和/或步骤d)的选择、分类和/或测定使用计算机进行的。
因此，本发明的另一方面涉及一种计算机实施的方法，其中该方法是本文公开的任何方法或其任何组合。
注意的是，能够实施本发明的任何方法或用于实施这些方法中的任一种或其任何组合的任何计算机程序也构成本发明的一部分。
该计算机程序通常可直接加载到数字计算机的内部存储器中，包括用于执行以下步骤的软件代码部分：当所述产品在计算机上运行时，对来自对象的一个或多个生物样本的组合评分(例如，从如本文所述的一个或多个目标标志物的水平获得的)与参考值(例如，参考组合值)进行比较，并且确定所述对象的诊断。
还应注意的是，包括如下器件的任何设备或装置都被包括作为本说明书的一部分，所述器件用于执行本发明的任何方法或其任何组合的步骤，或携带能够实施或用于实施本发明的任何方法或其任何组合的计算机程序。
本发明的方法还可以包括将方法结果存储在数据载体中，优选地，其中所述数据载体是计算机可读介质。本发明还涉及一种其上存储有本发明的计算机程序或本发明的任何方法的结果的计算机可读存储介质。
如本文所用，“计算机可读介质”可以是可以包含、存储、通信、传播或传输本发明方法中确定的结果的任何装置。该介质可以是电子、磁、光、电磁、红外线或半导体系统(或装置或设备)或传播介质。
治疗方法和相关医疗用途
在另一方面，本发明提供了一种治疗患有AN、AA和/或CRC的对象的方法，其中所述对象是通过本文如上所述的用于筛查、诊断和/或监测的方法选择的，并且其中所述方法还包括向对象施用抗癌疗法。
在相关方面，本发明还提供了本文如上所述的任何方法，其进一步包括向所述患者施用治疗有效量的抗癌疗法的步骤。
在另一方面，本发明涉及一种用于治疗癌症患者的方法中的抗癌疗法，其中所述癌症患者是通过本文所述的筛查、诊断和/或监测方法选择的。
在另一方面，本发明还涉及一种选择对象以进行探索性测试(该探索性测试选自由结肠镜检查、柔性乙状结肠镜检查、双对比钡剂灌肠和计算机断层扫描(CT)结肠镜检查组成的组)、优选进行结肠镜检查的方法，其中所述对象是通过本文所述的筛查、诊断或监测方法选择的。
在又一方面，本发明涉及一种在对象中进行探索性测试的方法，其中所述对象是已通过本文所述的筛查、诊断或监测方法选择的，其中所述方法进一步包括对对象进行探索性测试，其中测试选自由结肠镜检查、柔性乙状结肠镜检查、双对比钡剂灌肠和计算机断层扫描(CT)结肠镜检查组成的组，优选结肠镜检查。
试剂盒及试剂盒在本发明方法中的用途
在另一方面，本发明提供一种适用于定量GMLL、PTST、BCTF或BCTT中任一种的试剂盒，其中所述试剂盒包含以下试剂中的一种或多种：
i.对GMLL基因组具有特异性的寡核苷酸，优选对SEQ ID NO：1具有特异性的寡核苷酸；
ii.对PTST基因组具有特异性的寡核苷酸，优选对SEQ ID NO：2具有特异性的寡核苷酸；
iii.对BCTF基因组具有特异性的寡核苷酸，优选对SEQ ID NO：3具有特异性的寡核苷酸；
iv.对BCTT基因组具有特异性的寡核苷酸，优选对SEQ ID NO：4具有特异性的寡核苷酸；以及
v.可选地，适用于如上文定义的真细菌的定量的寡核苷酸。
可选地，还包括使用所述试剂测定从对象分离的粪便样本中的所述细菌标志物的水平的说明。
术语“试剂盒”或“测试试剂盒”表示分析所需的试剂和助剂的组合。尽管在大多数情况下测试试剂盒由若干个单元组成，但也可以使用一件式分析元件，它们同样必须被视为测试试剂盒。
在优选的实施方式中，所述试剂盒适用于定量PTST、BCTF和BCTT，并且所述试剂盒包含如上文定义的试剂ii)、iii)和iv)。优选地，它还包含如上定义的试剂v)。
在特定的实施方式中，与如本文所述的一种或多种特征或实施方式可选地组合，
-对SEQ ID NO：1具有特异性的寡核苷酸是包含以下任何序列的或由以下任何序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23、或与其中任何序列具有至少80％同一性的序列；和/或
-对SEQ ID NO：2具有特异性的寡核苷酸是包含以下任何序列或由以下任何序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25、或与其中任何序列具有至少80％同一性的序列；和/或
-对SEQ ID NO：3具有特异性的寡核苷酸是包含以下任何序列或由以下任何序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27、或与其中任何序列具有至少80％同一性的序列；和/或
-对SEQ ID NO：4具有特异性的寡核苷酸是包含以下任何序列或由以下任何序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31、或与其中任何序列具有至少80％同一性的序列；和/或
-适用于定量真细菌的寡核苷酸是包含以下任何序列或由以下任何序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15、或与其中任何序列具有至少80％同一性的序列。
优选的实施方式涉及一种适用于定量PTST、BCTF和BCTT的试剂盒，其中所述试剂盒包含以下试剂：
-包含以下任何序列或由以下任何序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO：24或SEQ IDNO：25、或与其中任何序列具有至少80％同一性的序列；
-包含以下任何序列或由以下任何序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO：26或SEQ IDNO：27、或与其中任何序列具有至少80％同一性的序列；和
-包含以下任何序列或由以下任何序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO：30或SEQ IDNO：31、或与其中任何序列具有至少80％同一性的序列；和
-可选地，适用于定量真细菌的寡核苷酸(优选为包含以下任何序列或由以下任何序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15、或与其中任何序列具有至少80％同一性的序列)；
-可选地，还包括使用所述试剂测定从对象分离的粪便样本中的所述细菌标志物的水平的说明。
所述特定的寡核苷酸如上文所述。优选地，所述寡核苷酸是引物和/或探针。
另一个优选的实施方式涉及一种适用于定量PTST、BCTF和BCTT的试剂盒，其中所述试剂盒包含以下试剂：
-包含SEQ ID NO：24或由SEQ ID NO：24组成的引物、包含SEQ ID NO：25或由SEQID NO：25组成的引物、或与其中任何具有至少80％同一性的序列；
-包含SEQ ID NO：26或由SEQ ID NO：26组成的引物、包含SEQ ID NO：27或由SEQID NO：27组成的引物、或与其中任何具有至少80％同一性的序列；和
-包含SEQ ID NO：30或由SEQ ID NO：30组成的引物、包含SEQ ID NO：31或由SEQID NO：31组成的引物、或与其中任何具有至少80％同一性的序列；和
-可选地，适用于定量真细菌的寡核苷酸(优选包含SEQ ID NO：5或由SEQ ID NO：5组成的引物、包含SEQ ID NO：6或由SEQ ID NO：6组成的引物、包含SEQ ID NO：14或由SEQID No：14组成的引物，或包含SEQ ID NO：15或由SEQ ID NO：15组成的引物、或与其中任何具有至少80％同一性的序列)；
-可选地，还包括使用所述试剂测定从对象分离的粪便样本中的所述细菌标志物的水平的说明。
在优选的实施方式中，所述具有至少80％同一性的序列是与参考序列具有至少约85％、优选至少约90％、更优选至少约95％、96％、97％、98％或99％的序列。两个序列之间的同一性百分比可以通过本领域已知的任何方式确定，例如Needleman和Wunsch全局比对算法。
此外，所述试剂盒还包含对上文所述的其他基因或细菌标志物具有特异性的寡核苷酸。例如，其中所述其他细菌标志物选自由以下组成的组：B10、B46、B48、CINT、RSBI、普氏栖粪杆菌、普氏栖粪杆菌(F.prausnitzii)PHGI、普氏栖粪杆菌PHGII和大肠杆菌。
所述试剂盒可以包含额外的试剂。在一个特定的实施方式中，所述试剂盒包含进行实时PCR反应的试剂，其通常包括DNA聚合酶，例如TaqDNA聚合酶(例如，热启动TaqDNA聚合酶)、缓冲液、镁、dNTP和可选的其他试剂(例如，稳定剂，如明胶和牛血清白蛋白)。此外，实时PCR反应混合物还包含用于实时检测和定量如上本文所述的扩增产物的试剂。
可选地，该试剂盒还可包括用于DNA提取的适当的管和溶剂，例如氯仿/甲醇溶液。此外，该试剂盒还可以包括用于收集粪便样本的容器和可选地任何足以用于样本保存的缓冲液和/或添加剂，例如实施例中使用的FIT管收集器。本发明试剂盒的其他优选特征和实施方式如本文通篇说明书所述。
在另一方面，本发明还提供了一种如本文所述的试剂盒，所述试剂盒用于如本文所述的筛查、诊断和/或监测AN、AA和/或CRC的方法中。
预期本文所述的任何特征可任选地与本发明的任何方法、医疗用途、试剂盒和试剂盒用途的任何实施方式组合；并且本说明书中讨论的任何实施方式都可以针对这些中的任何一个来实现。应该理解的是，本文所述的特定实施方式是作为说明而不是作为对本发明的限制而示出的。
本文中的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，就像是具体且单独地表明每个单独的出版物或专利申请通过引用并入本文。
“一”或“一个”的使用可以指“一个”，但也与“一个或多个”，“至少一个”以及“一个或多于一个”的意思相一致。术语“另一个”的使用也可以指一个或多个。除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，否则在权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”。
如在本说明书和权利要求中使用的，词语“包含(comprising)”(以及包含的任何形式，例如“comprise”和“comprises”)、“具有(having)”(以及任何形式的具有，例如“have”和“has”)、“包括(including)”(以及任何形式的包括，例如“include”和“includes”)或“含有(containing)”(以及任何形式的包含，例如“contain”和“contains”)是包容性的或开放式的并且不排除额外的、未提及的元素或方法步骤。术语“包含”还涵盖并明确公开了术语“由……组成”和“基本上由……组成”。如本文所用，短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为特定的材料或步骤，以及那些不会实质性影响所要求保护的发明的基本和新颖的特征的材料或步骤。如本文所用，短语“由……组成”排除了权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分，除了通常与该元素或限制相关的杂质之外。
如本文所用，术语“或其组合”是指该术语之前所列项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括以下至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，如果顺序在特定的上下文中很重要，则还有BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该示例，明确包括的是包含一个或多个项目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。本领域技术人员将理解，除非从上下文中另外显而易见，否则通常对任何组合中的项目或术语的数量没有限制。
如本文所用，近似词例如但不限于“约”、“大概”、“大约”是指这样一种情况：当被这样修饰时可理解为不一定是绝对的或极其准确的，但将被认为足够接近本领域的普通技术人员保证将这种情况指定为存在的情况。描述可以变化的程度将取决于可以进行多大的改变并且本领域普通技术人员仍然承认修饰后的特征仍然具有未修饰的特征所需的特性和能力。一般而言，但根据前面的讨论，本文中由诸如“约”等近似词修饰的数值可以与所述值相差±1％、±2％、±3％、±4％、±5％、±6％、±7％、±8％、±9％或±10％。因此，术语“约”可以指指示值±其值的5％，优选为指示值±其值的2％，最优选地，术语“约”指准确的指示值(±0％)。
以下实施例用于说明本发明而不应解释为限制本发明的范围。
条款
1、一种增加粪便潜血测试(FOBT)的特异性或降低所述FOBT的假阳性率的筛查、诊断和/或监测对象的结直肠晚期肿瘤(AN)、晚期腺瘤(AA)和/或结直肠癌(CRC)的方法，其中所述FOBT包括确定从对象分离的粪便样本中潜血的存在；以及其中所述方法还包括在从所述对象分离的粪便样本中定量至少以下细菌标志物：
-胃消化链球菌(PTST)，
-脆弱拟杆菌(BCTF)，和
-多形拟杆菌(BCTT)；
其中术语结直肠晚期肿瘤(AN)包括CRC和晚期腺瘤(AA)。
2、一种筛查、诊断和/或监测人类对象的AN、AA和/或CRC的方法，所述方法包括：
a)在从所述对象分离的粪便样本中进行FOBT，其中FOBT包括确定所述粪便样本中潜血的存在；
b)在从所述对象分离的粪便样本中定量至少由胃消化链球菌(PTST)、脆弱拟杆菌(BCTF)、和多形拟杆菌(BCTT)组成的细菌标志物：
c)由b)中确定的细菌标志物的水平计算组合评分；和
d)根据c)中获得的组合评分将FOBT阳性对象按照呈现患有AN、AA和/或CRC的风险增加分类。
3、根据条款1所述的方法，其中，c)中计算的组合评分与PTST和BCTF的量成正比；以及与BCTT的量成反比；其中评分越高，患有AN、AA和/或CRC的可能性越高。
4、根据条款2或3中任一项所述的方法，其中，在步骤d)中，所述方法包括将对象的样本中的组合评分与参考值进行比较；并且其中对象的样本中的组合评分相对于所述参考组合评分增加指示AN、AA和/或CRC。
5、一种筛查、诊断和/或监测人类对象的AN、AA和/或CRC的方法，所述方法包含根据条款2的步骤a)和b)，其中所述方法进一步包括：
e)将所述粪便样本中PTST、BCTF和BCTT的量与相应的参考值进行比较；
f)其中相对于相应的参考值，FOBT阳性对象的样本中PTST和BCTF的量增加以及BCTT的量减少指示AN、AA和/或CRC。
6、根据条款1至5中任一项所述的方法，其中，所述对象是怀疑患有CRC的对象。
7、根据条款1至5中任一项所述的方法，其中，所述对象是无症状对象。
8、根据条款7所述的方法，其中所述对象是具有中等CRC风险或高CRC风险的对象；其中具有中等CRC风险的对象为50岁或以上，没有个人或家族CRC背景；以及其中具有增加和/或高CRC风险的对象。
9、根据条款1至8中任一项所述的方法，其中，所述CRC是腺癌。
10、根据条款1至9中任一项所述的方法，其中，所述FOBT是定量人血红蛋白(hHb)的愈创木脂FOBT或粪便免疫化学测试(FIT)。
11、根据条款1至10中任一项所述的方法，其中，所述FOBT是定量人血红蛋白(hHb)的粪便免疫化学测试(FIT)。
12、根据条款11所述的方法，其中，FIT阳性对象的hHb水平等于或高于10μg hHb/g粪便(FIT50截止值)或者等于或高于20μg hHb/g粪便(FIT100截止值)，优选地其中FIT阳性对象的hHb水平等于或高于10μg hHb/g粪便(FIT50截止值)。
13、根据条款1至12中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括定量选自由以下组成的组的一种或多种细菌标志物：B10(SEQ ID NO：7)、B46(SEQ ID NO：8)、B48(SEQID NO：9)、麻疹孪生球菌(GMLL)、肠道罗斯拜瑞氏菌(RSBI)、肠道柯林斯菌(CINT)、普氏栖粪杆菌和/或其系统群中的任何菌株、以及大肠杆菌(ECO)。
14、根据条款1至13中任一项所述的方法，其中，测定PTST、BCTF和BCTT以及可选的条款13的细菌标志物的水平是通过分子生物学方法进行的，该分子生物学方法选自由以下组成的组：下一代测序、定量PCR(qPCR)、PCR-焦磷酸测序、PCR-ELISA、DNA微阵列、分支DNA、斑点免疫印迹、荧光原位杂交测定(FISH)、以及所述方法的多重形式。
15、根据条款14所述的方法，其中，所述分子生物学方法是qPCR，优选地其中定量水平表示为Ct值。
16、根据条款1至15中任一项所述的方法，其中，PTST、BCTF和BCTT的水平以及可选的条款12所述的细菌标志物的水平表示为相对丰度，优选表示为相对于真细菌(EUB)水平的相对丰度。
17、根据条款1至16中任一项所述的方法，其中，在定量PTST、BCTF和BCTT以及可选的条款12所述的细菌标志物之前，从粪便样本中提取DNA。
18、根据条款1至17中任一项所述的方法，其中，FOBT、和PTST、BCTF和BCTT以及可选的权利要求12所述的细菌标志物的定量是在同一粪便样本中进行的。
19、根据条款1至18中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括将方法结果存储在数据载体中，优选其中所述数据载体是计算机可读介质。
20、一种计算机实施的方法，其中该方法如条款1至19中任一项所定义。
21、一种数据处理装置，包括用于执行条款20的方法的步骤的器件。
22、一种适用于定量PTST、BCTF和BCTT的试剂盒，其中所述试剂盒包含以下试剂：
-对SEQ ID NO：2具有特异性的寡核苷酸；
-对SEQ ID NO：3具有特异性的寡核苷酸；和
-对SEQ ID NO：4具有特异性的寡核苷酸；
-可选地，适用于定量真细菌的寡核苷酸；
可选地，还包括使用所述试剂测定从对象分离的粪便样本中的所述细菌标志物的水平的说明。
23、根据条款22所述的试剂盒，其中，
-对SEQ ID NO：2具有特异性的寡核苷酸是包含以下任何序列或由以下任何序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25、或与其中任何序列具有至少80％同一性的序列；和/或
-对SEQ ID NO：3具有特异性的寡核苷酸是包含以下任何序列或由以下任何序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27、或与其中任何序列具有至少80％同一性的序列；和/或
-对SEQ ID NO：4具有特异性的寡核苷酸是包含以下任何序列或由以下任何序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31、或与其中任何序列具有至少80％同一性的序列；和/或
-适用于定量真细菌的寡核苷酸是包含以下任何序列或由以下任何序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15、或与其中任何序列具有至少80％同一性的序列。
24、根据条款22或23中任一项所述的试剂盒在根据条款1至20中任一项所述的筛查、诊断和/或监测AN、AA和/或CRC的方法中的用途。
25、一种治疗患有AN、AA和/或CRC的对象的方法，其中所述对象是通过根据条款1至20中任一项所述的筛查、诊断和/或监测的方法选择的，并且其中所述方法还包括向对象施用抗癌疗法。
26、一种选择对象以进行探索性测试(该探索性测试选自由结肠镜检查、柔性乙状结肠镜检查、双对比钡剂灌肠和计算机断层扫描(CT)结肠镜检查组成的组)、优选进行结肠镜检查的方法，其中所述对象是通过根据条款1至20中任一项所述的筛查、诊断或监测方法选择的。
实施例
实施例1.-材料和方法
研究群体
招募了一个由333名具有CRC相关症状的连续患者组成的队列，这些患者从一级和二级医疗保健机构转诊到奥伦塞综合医院(Complexo Hospitalario de Ourense)(奥伦塞，西班牙)建议进行诊断性结肠镜检查(表1)。排除标准是：(1)接受结肠镜检查进行CRC筛查的无症状对象；(2)接受监视结肠镜检查的有既往结肠疾病史的患者；(3)需要住院的患者；(4)评估前3个月内症状已停止的患者；以及(5)入组前最后一个月内接受过抗生素治疗的患者。该研究方案得到了维哥大学医院综合体生物库(Biobanco del ComplexoHospitalario Universitario de Vigo)(维哥，西班牙)的批准。从所有研究患者获得了书面知情同意书。
表1.根据结肠镜检查诊断对患者特征进行分类。Hb：血红蛋白；FIT100(20μg Hb/g粪便)；CRC：结直肠癌；AA：晚期腺瘤；NAA：非晚期腺瘤；NC：结肠镜检查正常。
Figure BDA0003355055370000241
所有对象均接受结肠镜检查以确定他们的结直肠状态。根据内镜检查和病理结果，诊断分为四组：结肠镜检查正常(结肠镜检查无发现或发现乙状结肠增生性息肉和/或直肠增生性息肉＜10mm)；非晚期腺瘤(管状腺瘤＜10mm伴随低级异型增生，锯齿状息肉＜10mm且无异型增生)；晚期腺瘤(腺瘤＞10mm或有绒毛成分或高度异型增生，锯齿状息肉＞10mm或有异型增生，和pTis腺癌)；以及侵入性CRC。诊断具有CRC的患者也根据肿瘤的分期进行分类(表2)。还要求个人回答问卷以记录临床和流行病学数据。
表2.根据肿瘤TNM分期的结直肠癌患者。CRC：结直肠癌。
Figure BDA0003355055370000242
粪便样本采集
要求参与者在结肠镜检查之前和肠道清洁之前，在无菌粪便容器中采集一次排便的粪便样本。沉积后立即冷冻样本。然后，对象将样本带到医院，在医院里将样本冷冻在-20℃下进行短期储存，并在到达赫罗纳(西班牙)的GoodGut S.L.设施时储存在-80℃。共有11名对象由于粪便样本采集错误而被排除在研究之外。
从粪便样本中提取DNA
使用NucleoSpin Soil Kit(Macherey-Nagel GMbH&Co.，杜仑，德国)进行均质化后从冷冻粪便样本中提取基因组DNA。按照制造商的说明，最终在100μl终体积的SE洗脱缓冲液中洗脱DNA，并将DNA储存在-20℃直至使用。DNA浓度用Qubit荧光定量法(ThermoFisher Scientific，沃尔瑟姆，USA)测定。所有样本均调整至终浓度为8ng/μl并再次定量。
CRC生物标志物的qPCR检测
目标特定细菌序列有十个：真细菌(EUB)、B10(最佳匹配BLAST普氏栖粪杆菌)、B46(最佳匹配BLAST Subdoligranulum variabile)、B48(最佳匹配BLAST瘤胃球菌属、罗斯拜瑞氏菌属、粪球菌属)、肠道罗斯拜瑞氏菌(RSBI)、麻疹孪生球菌(GMLL)、胃消化链球菌(PTST)、脆弱拟杆菌(BCTF)、肠道柯林斯菌(CINT)、和多形拟杆菌(BCTT)。
通过使用SYBR Green Master Mix(Promega，麦迪逊，USA)为每种生物标志物准备单一反应，来进行不同生物标志物的定量。每个反应由20μl组成，其中含有1×GoTaq qPCRMaster Mix，浓度为150nM至300nM的每种引物，以及最多20ng的基因组DNA模板。本研究中使用的物种特异性引物见表3，并且其购自Macrogen(Macrogen，首尔，韩国)。
表3.本研究中使用的正向引物和反向引物。EUB：真细菌；B10；B46；B48；GMLL：麻疹孪生球菌；PTST：胃消化链球菌；BCTF：脆弱拟杆菌；CINT：肠道柯林斯菌；BCTT：多形拟杆菌；RSBI：肠道罗斯拜瑞氏菌。
Figure BDA0003355055370000251
Figure BDA0003355055370000261
所有定量PCR均在AriaMx实时PCR系统(Agilent Technologies，圣克拉拉，USA)上运行。根据所分析的生物标志物，热分布(Thermal profile)是不同的(表4)。在每个qPCR的结尾添加了熔解曲线步骤，以验证预期扩增子大小的存在以及控制引物二聚体的形成。使用1.3版Aria软件(Agilent Technologies，圣克拉拉，USA)收集和分析数据。所有样本按一式两份进行扩增，当阈值循环(Ct)之间的差异小于0.6时，则被认为是有效的。针对每种生物标志物建立了一个由从10到108基因组单位/μL的8个对数组成的动态范围，并用于计算相对丰度。每个PCR运行中都包括无模板对照反应。
表4.以下菌的qPCR条件：EUB：真细菌；B10；B46；B48；GMLL：麻疹孪生球菌；PTST：胃消化链球菌；BCTF：脆弱拟杆菌；CINT：肠道柯林斯菌；BCTT：多形拟杆菌；RSBI：肠道罗斯拜瑞氏菌。
Figure BDA0003355055370000262
FIT分析
FIT分析在奥伦斯大学综合大楼(Complexo Universitario de Ourense)进行，使用的样本与CRC特异性生物标志物分析中使用的样本相同。用于粪便血红蛋白测定的粪便样本使用OC-Sensor管收集器进行分析，并使用自动OC-Sensor进行测定，该OC-Sensor检测与例如CRC、息肉和憩室炎等疾病相关的胃肠道出血(Eiken Chemical Co.，东京，日本)，如先前在Cubiella,J.et al.,2016中所述。OC-Sensor样本管中的样本缓冲液确保了样本从采集到分析的最佳稳定性和安全运输。阳性测试是指粪便血红蛋白浓度等于或高于100ng/mL(20μg Hb/g粪便；FIT100)。
统计分析
在定性分析方面，如果获得的Ct值不在其动态范围内，则认为不存在生物标志物。所有统计分析均使用SPSS 23.0统计软件包(IBM，NYC，USA)进行。对P值≤0.05建立显著性水平。
通过Kolmogorov-Smirnov检验评估数据正态性。非参数Kruskal-Wallis检验用于检验具有两个以上类别的变量的差异。使用Mann-Whitney检验分析这些变量的子类别的成对比较。使用Bonferroni校正来校正多重比较。所有使用细菌标志物的比较都是在以每种细菌标志物的动态范围进行标准化的相对丰度之间进行的。
应用接受者工作特征(ROC)曲线分析来确定每种生物标志物在区分不同结肠肿瘤状态方面的有用性。通过ROC曲线下面积(AUC)来衡量鉴别的准确性。
使用机器学习来确定哪些研究变量(性别、年龄、BMI、吸烟、细菌标志物、FIT)组合能够区分晚期肿瘤病变的对象与结肠镜检查正常或非晚期腺瘤的对象。具体方法包括对数据集的100个随机分区的初始训练迭代和使用4种不同机器学习算法(神经网络、逻辑回归、梯度提升树、随机森林)生成的预测模型的进一步验证。RAID-CRC最终是使用所分析的四种细菌标志物与FIT结果的组合一起设计的。
实施例2.-肿瘤进展中的粪便生物标志物
针对每个诊断(结肠镜检查正常、非晚期腺瘤、晚期腺瘤、CRC)确定每种细菌标志物的相对丰度(图1)。无论结肠镜诊断如何，三种不同的产丁酸盐物种(B10、B46和B48)是最普遍的生物标志物，其相对丰度值分别为20.4％、19.0％和20.0％。CRC群体中的GMLL和PTST相比于结肠镜检查正常个体(分别为p＝0.006和p＜0.001)或非晚期腺瘤对象(分别为p＝0.047和p＜0.001)显著更多。尽管没有显著差异，但可以观察到B46的趋势，其在CRC患者中比在晚期腺瘤患者中更丰富(p＝0.087)。有趣的是，无论肿瘤状态如何，EUB丰度都保持恒定。不同CRC分期(0、I、II、III和IV)之间的比较没有显示出任何细菌标志物的丰度存在显著差异。
实施例3.-GMLL、PTST和BCTF可检测晚期肿瘤病变
将对象分组后如下比较细菌标志物的相对丰度：(1)结肠镜检查正常；(2)肿瘤(非晚期腺瘤+晚期腺瘤+CRC)；(3)晚期肿瘤(晚期腺瘤+CRC)；以及(4)CRC(图2)。发现PTST与肿瘤病变高度相关(p＜0.001)。关于晚期肿瘤病变的检测，GMLL、PTST和BCTF是晚期肿瘤病变检测的潜在生物标志物(分别为p＝0.006、p＜0.001和p＝0.030)。在盛行率方面，发现这三种机会病原体在晚期肿瘤患者(GMLL，64.9％；PTST，58.4％；和BCTF，44.7％)中比健康对象(GMLL，53.5％；PTST，26.1％；和BCTF，29.8％)中更多。
我们的结果清楚地表明CRC患者存在细菌失调。根据肠道健康相关表型对研究的细菌标志物进行分类：丁酸盐生产者(B10、B46、B48、RSBI)、机会病原体(GMLL、PTST、BCTF)、氢和氧生产者(CINT)和糖分解物种(BCTT)(图3)。发现这些表型的相对丰度随着疾病状态的进展而逐渐改变。特别是，在结肠镜检查正常的对象和具有CRC的对象之间，我们发现丁酸盐生产者的相对丰度下降，被病原菌组取代，病原菌组在CRC和晚期腺瘤个体中比结肠镜检查正常的对象中更丰富。
我们的结果显示出，PTST和BCTF丰度高与晚期肿瘤相关，而BCTT丰度与健康个体相关。BCTT是一种常见于健康个体的肠道微生物群中的共生细菌。已观察到共生细菌减轻了肠道炎症并有助于定殖抗力(Macfarlane&Macfarlane,2012；Baümler&Sperandio,2016)。因此，高丰度的BCTT与良好的肠道健康相关。
实施例4.-CRC细菌标志物和FIT的组合显著减少假阳性结果
一方面，当使用FIT100(20μg Hb/g粪便)时，在结肠镜检查正常或非晚期腺瘤与晚期肿瘤的对象之间观察到显著差异(p＜0.001)。显示结肠镜检查正常的17.1％(19名)的对象和具有非晚期腺瘤的24.3％(27名)的对象显示出FIT阳性值。这些结果导致获得针对晚期肿瘤检测的分别84.0％和81.0％的灵敏度和特异性，以及分别为58.0％和94.0％的阳性预测值和阴性预测值(AUC＝0.828，95.0％CI(0.773-0.883))。另一方面，当使用FIT50(10μg Hb/g粪便)时，显示结肠镜检查正常的21.1％(27名)的对象和具有非晚期腺瘤的24.2％(31名)的对象显示出假阳性结果。FIT50导致针对晚期肿瘤检测获得分别91.0％和76.0％的灵敏度和特异性，以及分别为55.0％和96.0％的阳性预测值和阴性预测值(AUC＝0.836，95.0％CI(0.787-0.886))。单独的针对细菌标志物的灵敏度值要低得多，针对GMLL为39.0％(AUC＝0.622，95.0％CI(0.541-0.694))，针对PTST为53.0％(AUC＝0.710，95.0％CI(0.628-0.7376％)和针对BCTF为33.0％(AUC＝0.571，95.0％CI(0.499-0.656))，而特异性值是类似的。
将FIT结果(FIT100和FIT50)与粪便细菌标志物组合，以了解哪种在晚期肿瘤病变检测的灵敏度值和特异性值方面提供更高的性能。细菌标志物和FIT100(RAID CRC-FIT100)的组合导致获得了76.0％的灵敏度和91.0％的特异性(表5)。尽管如此，FIT50(RAIDCRC-FIT50)还稍微改善了这些结果，因为它显示出对于晚期肿瘤检测，在特异性值相似的情况下，灵敏度高4.0％(80.0％)，因此是选择的截止值。因此，优选的测试基于EUB、PTST、BCTF和BCTT的组合，其中粪便血红蛋白浓度等于或高于50ng/μL(10μg Hb/g粪便)。尽管BCTT在结肠镜检查正常或非晚期腺瘤患者与晚期肿瘤患者之间没有显示出显著差异，但一旦与EUB、PTST和BCTF组合使用，BCTT就能够提高测试的特异性。
表5.所研究的有症状人群的RAID-CRC(使用FIT100和FIT50)、FIT100、和FIT50与筛查群体的FIT100相比的诊断性能。FIT100(20μg血红蛋白/g粪便)；FIT50(10μg血红蛋白/g粪便)；PPV：阳性预测值；NPV：阴性预测值。
Figure BDA0003355055370000281
最终测试(RAID CRC-FIT50测试)包括FIT50与以真细菌标准化的三种细菌标志物(PTST/EUB、BCTF/EUB、BCTT/EUB)的定量水平的组合，其中定量水平表示为Ct值。
使用比率允许数据标准化(ratios allowed data normalization)，这对于控制qPCR相关变量至关重要，以便区分真实的生物学变化和实验诱导的变化(Vandesompele etal,2002)。在RAID CRC-FIT50测试中将粪便血红蛋白浓度阈值从100ng/μL降低至50ng/μL允许捕获否则以100ng/μL的截止值将会被视为假阴性的阳性对象，其代价是增加假阳性率。然而，与细菌标志物组合稀释了这种影响，因为由于FIT50和FIT100的晚期肿瘤检测的特异性增加(表5)，RAID CRC-FIT50测试导致假阳性结果的显著减少。
将RAID CRC-FIT50测试应用于检测晚期肿瘤导致FIT100的假阳性结果的数量减少，9.7％的对象显示出结肠镜检查结果正常，以及11.7％的对象具有非晚期腺瘤。总之，RAID-CRC-FIT50测试显示出提供了分别为80.0％和90.0％的灵敏度和特异性(AUC＝0.837，95.0％CI(0.730-0.944))，分别为70.0％和94.0％的阳性预测值和阴性预测值。更重要的是，假阳性率降低了50.0％，FIT100的假阳性结果为46名对象，RAID-CRC测试-FIT50测试的假阳性结果为23名对象。有趣的是，RAID CRC-FIT50测试和RAID CRC-FIT100测试对CRC和AN的灵敏度与FIT100方案相似，但具有更高的特异性和阳性预测值(PPV)。
在本工作中，我们开发了一种适用于使用粪便样本的国家CRC筛查计划的新方法。这项工作中使用的细菌特征最初是从粘膜样本中取出的。因此，它们在粪便中的存在不受饮食和一些外部因素引起的可变性的严重影响(Conlon&Bird,2015；Vandeputte et al,2015)，而是结肠粘膜中真实丰度的度量。这有助于克服粪便中存在的巨大背景噪音，并为生物标志物提供生理学意义。
我们的数据集中没有关于身体质量指数(Body mass index，BMI)、吸烟或饮食习惯的元数据。尽管据报道这些参数会影响粪便样本的微生物群组成(Davis et al,2017；Yun et al,2017；Rogers et al,2012；Capurso&Lahner,2017；Baothman et al,2016)，但如上所述我们的生物标志物来自不太依赖外部因素的粘膜样本(Watt et al,2016；Durbánet al,2011)。Biedermann等人报告说，戒烟会增加微生物多样性(Biedermann et al,2013)。其他研究观察到，长期饮酒会导致变形菌增加和拟杆菌减少(Kakiyama et al,2013；Rao et al,2004)。关于BMI，它对微生物群的影响是有争议的(Turnbaugh et al,2006；Schwiertz et al,2010；Santacruz et al,2009)。由于本文所述的RAID-CRC测试可能用于筛查场景中，其中被筛查的群体可能会受到各种条件和习惯的影响，因此发现非分层策略是一种以最高可靠性来重现CRC筛查场景的好方法。
在基于群体的筛查中，成本效益也是一个关键问题(Sonnenberg et al,2000；McGrath et al,2002；Telford et al,2010)。Wong和同事在这种场景下对FIT和结肠镜检查进行了比较，显示出FIT在平均风险筛查中具有成本效益，而结肠镜检查在高风险对象中具有成本效益(Wong，2015)。因此，将FIT与粪便细菌标志物组合在成本效益方面可能是更好的，因为使用RAID-CRC可以允许节省多达30％的不必要的结肠镜检查。更具体地说，与基于FOBT的筛查计划相比，在CRC筛查计划中实施RAID-CRC将导致减少33000次由于假阳性结果而进行的结肠镜检查(55000次对比22000次假阳性)(García et al,2012)。考虑到RAID-CRC的成本与FOBT的成本相当，阳性筛查后的后续结肠镜检查的估计节省将为每100000名筛查计划参与者节省7700万€(表6)。此外，使用这项工作中提出的CRC生物标志物在发达地区和结肠镜检查设施有限的资源匮乏的地区均可实现，因为RAID-CRC表现为CRC筛查场景中潜在可行的、具有成本效益的工具。
总之，由于RAID-CRC的非侵入性、成本低和减少与使用FOBT(例如FIT)相关的假阳性结果数量的能力，RAID-CRC是一种很有前途的CRC筛查工具。
表6.不同CRC筛查计划中与后续结肠镜检查相关的成本的比较。
Figure BDA0003355055370000291
*节省的计算是假设将FOBT与微生物群分析组合可将筛查灵敏度比单独使用FOBT提高45％以上。
**考虑到测试成本为25€，而计算相关成本。
***考虑到测试成本为10€，而计算相关成本。
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(717)
<223> GenBank登录号: CR626927.1 REGION: 417101..417817
<400> 3
atggcaaata ctaatatgga acacggagaa ataatactat accaaccaga caatactata 60
aaactggaag tgcgaataga gaatgaaacc gtttggttga cacaagcaca aattgttaac 120
ttattccagt caagtaaagc caatatcagt gagcatataa gaaatatata tgactcagat 180
gaattatctg ctgaatcaac tgttcggaaa ttccgaacag ttcgaatgga aggtaataga 240
aaggttaccc gcattcttga atattataat ctggatatga ttatttccgt aggttatcgt 300
gtgaattcca agcgaggagt ccagttccgc caatggtcaa caggagtact taaagaatat 360
ctattaaaag gctacgcaat caatcagcgc gtggagcagt tggaaaacaa agcaaacacc 420
catgaccggc aactggaaga gttaacaaac aaagtcgact ttttcgtccg gacttcatta 480
cctcctattg aaggtgtctt tttcaacgga cagattttcg atgcctatgt cttttccgct 540
cagttgataa agtctgcaaa gtcatcttta gtattgattg acaactttgt cgatgaaagc 600
gtgctcttac tattgagtaa acgtttgccc ggagtgactt ctatcatata taccaagcaa 660
gtaactccac agttagaatt agatttgaca aagcacaaca gtcaataccc ccaatag 717
<210> 4
<211> 642
<212> DNA
<213> 多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(642)
<223> GenBank登录号: AE015928.1 REGION: 326008..326649
<400> 4
atggcagtac aatttgaatt atataagact ccgatgccaa aggagaaaaa gaacaagacg 60
cgttatcatg cccgtccggt aagttttgag accgtcaata ccgagaaact ggcttatcgc 120
atccatgatc gctccacatt aagagtatcg gacattattt caaccttgga agaactgaaa 180
aatgaagtag ctcagtgcct cctggaaggt aaaaaggtgc atgtcgatgg attaggattc 240
tttcaggtca ctctttcctg cgaagaagaa atacgtaacc cgaaagacaa acgtgtgcac 300
cgggtaaaat tgaaagctat aaagtttaaa gctgataaag aattgaaagg ggaattgtgt 360
cacatgaaat tccagcgttc taaaatcaga ccgcactccg ccaatttatc agaagtagaa 420
atagacatga aactaactga atattttgct gaaaatcaga ttatcacccg gaaagatttt 480
caatatctct gcggaatgac acaaatcact gcatatcgcc atatcaagag gttaatggca 540
gaaaagaaat tgcaaaataa agggacgatc tatcaaccga tatatactcc ggttccgggt 600
aattacaggg tatcggtgga tttaaaatat aaagaacaat ga 642
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EUB2正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 5
actcctacgg gaggcagcag t 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EUB2反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<400> 6
gtattaccgc ggctgctggc ac 22
<210> 7
<211> 485
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B10;未培养细菌分离物DGGE凝胶条带Eub_10 16S
核糖体RNA基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(485)
<400> 7
cttcggattg taaactcctg ttgttgagga gataatgacg gtactcaaca aggtaagtga 60
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa aacgtaggtc acaagcgttg tccggaatta 120
ctgggtgtaa agggagcgca ggcgggaaga caagttggaa gtgaaatcca tgggctcaac 180
ccatgaactg ctttcaaaac tgtttttctt gagtagtgca caggtaggcg gaattcccgg 240
tgtagcggtg gaatgcgtag atatcgggag gaacaccagt ggcgaaggcg gcctactggg 300
caccaactga cgctgaggct cgaaagtgtg ggtagcaaac aggattagat accctggtag 360
tccacactgt aaacgatgat tactaggtgt tggaggattg accccttcag tgccgcagtt 420
aacacaataa gtaatccacc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga 480
cggac 485
<210> 8
<211> 474
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B46; 未培养细菌分离物DGGE凝胶条带Eub_46 16S
核糖体RNA基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(474)
<400> 8
gtaacatttc tgtaacaaga catacagcag tttctcagag ttcccaaact caaaggaatt 60
gacggaagcc gcggttccac gtaagtcaca agcgttgtcc ggaattactg ggtgtaaagg 120
gagcgcaggc gggaagacaa gttggaagtg aaatccatgg gctcaaccca taaactgctt 180
tcctaactgt ttttcttgag tagtgcacag gtaggcggaa ttcccggtgt agcggtggaa 240
tgcctagata tcgggaggaa caccattggc gaaggcggcc tactggactg caactgacgc 300
tgaggctcga aagtgtgggt agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc actccgtaaa 360
ccatgattac tacgtgttgg aggattgacc ccttctgtgc cgcagataac acaataagta 420
atccacctgg ggagtacgac cgcccggttg agactcacag gaattgacgg actc 474
<210> 9
<211> 566
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B48; 未培养细菌分离物DGGE凝胶条带Eub_48 16S
核糖体RNA基因
<400> 9
tctcttacgg ggagcagcag tggggaatat tgcacaatgg gggaaaccct gatgcagcga 60
cgccgcgtga gcgatgaagt atttcggtat gtaaagctct atcagcaggg aagaaaatga 120
cggtacctga ctaagaagcc ccggctaaat acgtgccagc agccgcggta atacgtatgg 180
tgcaagcgtt atccggattt actgggtgta aagggagcgt agacggagtg gcaagtctga 240
tgtgaaaacc cggggctcaa ccccgggact gcattggaaa ctgtgcatct agagtgtcgg 300
agaggtaagc ggaattccta gtgtagcggt gaaatgcgta gatattagga ggaacaccag 360
tggcgaaggc ggcttactgg acgataactg acgctgaggc tcgaaagcgt ggggagcaaa 420
caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga ctactaggtg tcggggagca 480
cagctcttcg gtgccgcagc aaacgcaata agtattccac ctggggagta cgttcgcaag 540
aatgaaactc acagaatttg acggag 566
<210> 10
<211> 894
<212> DNA
<213> 肠道罗斯拜瑞氏菌（Rosburia intestinalis） L1-82菌株
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(894)
<223> GenBank登录号 LR027880.1 REGION: 599208..600101
<400> 10
atgtcttttt caagtgaagt gaaacaggag ttagcaaagc agagtggaaa gagcagacat 60
tgtcagatcg ctgaacttgc ggcgttagtt gcttttgacg gaaagcgtca gcagctgatc 120
ggggatgcgg gagatgtgct ggattcggaa aatccgcttc tgcaggaaaa atatggactg 180
ttactggcac agctgttcca tgttaatata gaagagatag atacattgcc accggaacgc 240
attcttgaga caatcaagat gtggaatcag tctttaaggt gtgcagatat cacagagacg 300
gtaaatggta ttttactgca gcagacatgt tgcaggcggg catatatccg gggagcattt 360
ttagcaggtg gatcgatcag tgatccgaat aagtcttatc attttgagat tgtctgccgg 420
gaaattgcgc aggcgaaaca gcttcaggat gcaatcaaca gttttgagat ggaagcaaag 480
atcgtagaac gaaagaaaca ccaggtcgta tatttaaagg aaggtgccca gatcgtggat 540
atgttaaata tcatggaagc acatgtggca ctgatgaatc ttgaaaatgt gcgtatctta 600
aaagaaatga gaaattctgt caaccgaaag gtaaattgtg agacggcaaa tatcagcaag 660
actgtggcgg cagccgtaaa acagcttggc gatattgaat atattaaaca gaatgcaggc 720
ttagacagtc tgcctgaaaa cctaaaagaa atggcgttgc tgcggttaga gtatccggat 780
acaccgctta aggaactggg aacatatctc gatcctccgg tcggaaaatc gggagtgaac 840
cacaggctgc gcaggatcag tgagattgca gatgagctgc gtgaaaaaga ataa 894
<210> 11
<211> 807
<212> DNA
<213> 肠道柯林斯菌（Collinsella intestinalis）DSM 13280菌株
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(807)
<223> NCBI参考序列: GG692711.1 REGION: 297314..298120
<400> 11
atgtccggac actctaaatg ggcaactacc aagcaccgca agggtgcgca ggacgctaag 60
cgttccgccc tgttctccaa gctgagccgt aacatcaccg tcgcggcccg tcttggcaac 120
gaccccaacc cggacaacaa cgcctccctc gccgctgccg tggccaaggc caaggctcag 180
tccatgccca aggacaagat caaggccgcc atcgacaagg ccttcggttc cggcgccgac 240
gccgccgtgt acgagaacat cgtgtacgag ggctacggcc cggccggtgt tgccgtgtac 300
gtcgagtgcc tgaccgacaa ccgcaaccgc accgccgccg atgtccgctc cgccttctcc 360
cacgctggcg gcaacctggg caccaccggc tccgttgcct tccagttcga gcgcaagggc 420
caggtcgtgg tctccaagca gatcgtcgac ccgaacgaca agaaggagaa cctcatggcc 480
aacggcgctg ccggcgatga ggaagagttc atgatggtca tcgccgaggc cggtggcgac 540
gactacgagg acgccggtga cgagtgggtc gtgtggaccg ccgcgggcga cctcatggcc 600
gtgtccaagg gcatcgaggc tcagggcatc gaggtcaagg gtgccgagct caccatggtc 660
ccgaccaccc cgacggccgt ctccggcgcc gacgccaaga aggtccagcg cctcatcgac 720
cgcctcgagg acctggacga cgtccaggac gtgtactcca ccatggacat gaccgacgag 780
gtcatcgctg ccctcgaaga ggagtaa 807
<210> 12
<211> 1466
<212> DNA
<213> 普氏栖粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1466)
<223> GenBank登录号: AJ270469.2
<400> 12
gttgatcctg gctcaggacg aacgctggcg gcgcgcctaa cacatgcaag tcgaacgagc 60
gagagagagc ttgctttctc gagcgagtgg cgaacgggtg agtaacgcgt gaggaacctg 120
cctcaaagag ggggacaaca gttggaaacg actgctaata ccgcataagc ccacagctcg 180
gcatcgagca gagggaaaag gagcaatccg ctttgagatg gcctcgcgtc cgattagcta 240
gttggtgagg taatggccca ccaaggcaac gatcggtagc cggactgaga ggttgaacgg 300
ccacattggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc 360
acaatggggg aaaccctgat gcagcgacgc cgcgtggagg aagaaggtct tcggattgta 420
aactcctgtt gttgaggaag ataatgacgg tactcaacaa ggaagtgacg gctaactacg 480
tgccagcagc cgcggtaaaa cgtaggtcac aagcgttgtc cggaattact gggtgtaaag 540
ggagcgcagg cgggaagaca agttggaagt gaaatctatg ggctcaaccc ataaactgct 600
ttcaaaactg tttttcttga gtagtgcaga ggtaggcgga attcccggtg tagcggtgga 660
atgcgtagat atcgggagga acaccagtgg cgaaggcggc ctactgggca ccaactgacg 720
ctgaggctcg aaagtgtggg tagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacaccgtaa 780
acgatgatta ctaggtgttg gaggattgac cccttcagtg ccgcagttaa cacaataagt 840
aatccacctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900
caagcagtgg agtatgtggt ttaattcgac gcaacgcgaa gaaccttacc aagtcttgac 960
atcctgcgac gatgctggaa acagtatttt ccttcgggac gcagagacag gtggtgcatg 1020
gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta 1080
ctgtcagtta ctacgcaaga ggactctggc aggactgccg ttgacaaaac ggaggaaggt 1140
ggggatgacg tcaaatcatc atgcccttta tgacttgggc tacacacgta ctacaatggc 1200
gttaaacaaa gagaagcaag accgcgaggt ggagcaaaac tcagaaacaa cgtcccagtt 1260
cggactgcag gctgcaactc gcctgcacga agtcggaatt gctagtaatc gtggatcagc 1320
atgccacggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgagagccg 1380
gggggacccg aagtcggtag tctaaccgca aggaggacgc cgccgaaggt aaaactggtg 1440
attggggtga agtcgtaaca aggtac 1466
<210> 13
<211> 1452
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1452)
<400> 13
cgccctcccg aaggttaagc tacctacttc ttttgcaacc cactcccatg gtgtgacggg 60
cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgtggcatt ctgatccacg attactagcg 120
attccgactt catggagtcg agttgcagac tccaatccgg actacgacgc actttatgag 180
gtccgcttgc tctcgcgagg tcgcttctct ttgtatgcgc cattgtagca cgtgtgtagc 240
cctggtcgta agggccatga tgacttgacg tcatccccac cttcctccag tttatcactg 300
gcagtctcct ttgagttccc ggccggaccg ctggcaacaa aggataaggg ttgcgctcgt 360
tgcgggactt aacccaacat ttcacaacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtct 420
cacggttccc gaaggcacat tctcatctct gaaaacttcc gtggatgtca agaccaggta 480
aggttcttcg cgttgcatcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc 540
aattcatttg agttttaacc ttgcggccgt actccccagg cggtcgactt aacgcgttag 600
ctccggaagc cacgcctcaa gggcacaacc tccaagtcga catcgtttac ggcgtggact 660
accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgca cctgagcgtc agtcttcgtc 720
cagggggccg ccttcgccac cggtattcct ccagatctct acgcatttca ccgctacacc 780
tggaattcta cccccctcta cgagactcaa gcttgccagt atcagatgca gttcccaggt 840
tgagcccggg gatttcacat ctgacttaac aaaccgcctg cgtgcgcttt acgcccagta 900
attccgatta acgcttgcac cctccgtatt accgcggctg ctggcacgga gttagccggt 960
gcttcttctg cgggtaacgt caatgagcaa aggtattaac tttactccct tcctccccgc 1020
tgaaagtact ttacaacccg aaggccttct tcatacacgc ggcatggctg catcaggctt 1080
gcgcccattg tgcaatattc cccactgctg cctcccgtag gagtctggac cgtgtctcag 1140
ttccagtgtg gctggtcatc ctctcagacc agctagggat cgtcgcctag gtgagccgtt 1200
accccaccta ctagctaatc ccatctgggc acatccgatg gcaagaggcc cgaaggtccc 1260
cctctttggt cttgcgacgt tatgcggtat tagctaccgt ttccagtagt tatccccctc 1320
catcaggcag tttcccagac attactcacc cgtccgccac tcgtcagcaa agaagcaagc 1380
ttcttcctgt taccgttcga cttgcatgtg ttaggcctgc cgccagcgtt caatctgagc 1440
catgatcaaa ct 1452
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EUB_F正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 14
actcctacgg gaggcagcag t 21
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EUB_R反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<400> 15
gtattaccgc ggctgctggc ac 22
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B10_F正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<400> 16
caacaaggta agtgacggc 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B10_R反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 17
cgcctacctg tgcactactc 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B46_F正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<400> 18
tccacgtaag tcacaagcg 19
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B46_R反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 19
cgcctacctg tgcactactc 20
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B48_F正向引物
<400> 20
gtacggggag cagcagtg 18
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B48_R反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<400> 21
gacactctag atgcacagtt tcc 23
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GMLL_F正向引物
<400> 22
aagagttcca aggcgttctc 20
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GMLL_R反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<400> 23
ccatttcaag atccgctttc tattt 25
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PTST_F正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<400> 24
aggttgatgc tctgagtagt ag 22
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PTST_R反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<400> 25
atgaatacta gcctctcctc ttt 23
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCTF_F正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<400> 26
tgaaagcgtg ctcttactat tg 22
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCFT_R反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 27
tattggctgt tgtgctttgt 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CINT_F正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 28
gaccatcatg aactcttcct c 21
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CINT_R反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<400> 29
ccgttgcctt ccagttc 17
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCTT_F正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<400> 30
agtgacctga aagaatccta at 22
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCTT_R反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 31
gaccgtcaat accgagaaac 20
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> RSBI_F正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 32
gtgccagtaa cagtccatat t 21
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> RSBI_R反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 33
tagcaaagca gagtggaaag 20

Claims (16)

1.一种增加粪便潜血测试(FOBT)的特异性或降低所述FOBT的假阳性率的筛查、诊断和/或监测对象的结直肠晚期肿瘤(AN)、晚期腺瘤(AA)和/或结直肠癌(CRC)的方法，其中所述方法包括：
a.在从所述对象分离的粪便样本中进行FOBT，其中所述FOBT包括确定所述粪便样本中潜血的存在；和
b.在从所述对象分离的粪便样本中定量至少以下细菌标志物：
-胃消化链球菌(PTST)，
-脆弱拟杆菌(BCTF)，和
-多形拟杆菌(BCTT)；
其中术语结直肠晚期肿瘤(AN)包括CRC和晚期腺瘤(AA)。
2.一种筛查、诊断和/或监测对象的结直肠晚期肿瘤(AN)、晚期腺瘤(AA)和/或结直肠癌(CRC)的方法，其中所述方法包括：
a.在从所述对象分离的粪便样本中进行FOBT，其中所述FOBT包括确定所述粪便样本中潜血的存在；和
b.在从所述对象分离的粪便样本中定量至少以下细菌标志物：
-胃消化链球菌(PTST)，
-脆弱拟杆菌(BCTF)，和
-多形拟杆菌(BCTT)；
其中术语结直肠晚期肿瘤(AN)包括CRC和晚期腺瘤(AA)。
3.根据权利要求2所述的用于筛查、诊断和/或监测人类对象的AN、AA和/或CRC的方法，其中，所述方法进一步包括：
c)由b)中确定的所述细菌标志物的水平计算组合评分；和
d)根据c)中获得的所述组合评分将FOBT阳性对象按照患有AN、AA和/或CRC分类。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，c)中计算的所述组合评分与PTST和BCTF的量成正比；以及与BCTT的量成反比；其中评分越高，患有AN、AA和/或CRC的可能性越高。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中，在步骤d)中，所述方法包括将所述对象的样本中的组合评分与参考值进行比较；并且其中所述对象的样本中的组合评分相对于所述参考值增加指示AN、AA和/或CRC。
6.根据权利要求2所述的筛查、诊断和/或监测人类对象的AN、AA和/或CRC的方法，其中，所述方法进一步包括：
i.将所述粪便样本中GMLL、PTST和BCTT的量与相应的参考值进行比较；
ii.其中相对于相应的参考值，FOBT阳性对象的样本中GMLL和PTST的量增加和BCTT的量减少指示AN、AA和/或CRC。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述对象是怀疑患有CRC的对象或无症状对象。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述FOBT是定量人血红蛋白(hHb)的粪便免疫化学测试(FIT)。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，FIT阳性对象的hHb水平等于或高于10μg hHb/g粪便(FIT50截止值)或者等于或高于20μg hHb/g粪便(FIT100截止值)，优选地其中FIT阳性对象的hHb水平等于或高于10μg hHb/g粪便(FIT50截止值)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括定量选自由以下组成的组的一种或多种细菌标志物：B10(SEQ ID NO：7)、B46(SEQ ID NO：8)、B48(SEQ IDNO：9)、麻疹孪生球菌(GMLL)、肠道罗斯拜瑞氏菌(RSBI)、肠道柯林斯菌(CINT)、普氏栖粪杆菌和/或其系统群中的任何菌株、以及大肠杆菌(ECO)。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，PTST、BCTF和BCTT以及可选的权利要求10所述的细菌标志物的水平的测定通过qPCR进行，优选地其中定量水平表示为Ct值。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，PTST、BCTF和BCTT的水平以及可选的权利要求10所述的细菌标志物的水平表示为相对丰度，优选表示为相对于真细菌(EUB)水平的相对丰度。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括将所述方法结果存储在数据载体中，优选其中所述数据载体是计算机可读介质。
14.一种计算机实施的方法，其中所述方法如权利要求1至13中任一项所定义。
15.一种适用于定量PTST、BCTF和BCTT的试剂盒，其中所述试剂盒包含以下试剂：
-包含以下任何序列或由以下任何序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25、或与其中任何序列具有至少80％同一性的序列；
-包含以下任何序列或由以下任何序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27、或与其中任何序列具有至少80％同一性的序列；和
-包含以下任何序列或由以下任何序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31、或与其中任何序列具有至少80％同一性的序列；和
-可选地，适用于定量真细菌的寡核苷酸，优选为包含以下任何序列或由以下任何序列组成的寡核苷酸：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15、或与其中任何序列具有至少80％同一性的序列；
-可选地，还包括使用所述试剂测定从对象分离的粪便样本中的所述细菌标志物的水平的说明。
16.根据权利要求15所述的试剂盒在根据权利要求1至14中任一项所述的筛查、诊断和/或监测AN、AA和/或CRC的方法中的用途。
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