CN114196673A

CN114196673A - 一种胚胎特异的锌指蛋白在鳞翅目害虫防治方面的应用

Info

Publication number: CN114196673A
Application number: CN202111301913.3A
Authority: CN
Inventors: 徐关峰; 田玉霖; 付彤煜; 郑思春
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2021-11-04
Filing date: 2021-11-04
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2041-11-04
Also published as: CN114196673B

Abstract

本发明公开了一种胚胎特异的锌指蛋白在鳞翅目害虫防治方面的应用。本发明首次提出将胚胎特异的锌指蛋白应用到鳞翅目害虫防治中，胚胎特异的锌指蛋白表达量降低或活性降低可使得害虫的胚胎发育率大幅降低，进而大幅降低害虫的数量。

Description

一种胚胎特异的锌指蛋白在鳞翅目害虫防治方面的应用

技术领域

本发明属于鳞翅目有害昆虫防治领域，具体涉及一种胚胎特异的锌指蛋白在鳞翅目害虫防治方面的应用。

背景技术

鳞翅目有许多重要害虫，如桃小食心虫、苹果小卷叶蛾、棉铃虫、菜粉蝶、小菜蛾以及许多鳞翅目仓虫，如印度谷螟等。绝大多数种类的鳞翅目幼虫危害各类栽培植物，体形较大者常食尽叶片或钻蛀枝干。体形较小者往往卷叶、缀叶、结鞘、吐丝结网或钻入植物组织取食为害。体小至大形，成虫翅、体及附肢上布满鳞片，口器虹吸式或退化。幼虫蠋形，口器咀嚼式，身体各节密布分散的刚毛或毛瘤、毛簇、枝刺等，有腹足2～5对，以5对者居多，具趾钩，多能吐丝结茧或结网。蛹为被蛹。卵多为圆形、半球形或扁圆形等。

斜纹夜蛾(Spodoptera litura)属于昆虫鳞翅目，为鳞翅目夜蛾科农业害虫，是一种广泛分布的多食性农业害虫。主要分布在亚洲和大洋洲的亚热带和温带地区。斜纹夜蛾食性较广，涉及包括99个科的超过290种植物。幼虫主要取食甘薯、棉花、芋、莲、田菁、大豆、烟草、甜菜和十字花科和茄科蔬菜等植物的叶片。由于斜纹夜蛾幼虫具有暴食性，六龄幼虫进食量急剧增多，体型飞速增长，间歇性猖獗为害，严重危害我国的粮食作物。

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)也属于昆虫鳞翅目夜蛾科，其幼虫分别以玉米和水稻为主要食草。草地贪夜蛾在农业上属于害虫，其幼虫可大量啃食禾本科如水稻、甘蔗和玉米之类细粒禾榖及菊科、十字花科等多种农作物，造成严重的经济损失，其发育的速度会随着气温的提升而变快，一年可繁衍数代，一只雌蛾即可产下超过1000颗卵。

基于此，对鳞翅目害虫进行防治对农业领域具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种胚胎特异的锌指蛋白在鳞翅目害虫防治方面的应用，其能够显著提高害虫的死亡率。

根据本发明的一个方面，提出了一种胚胎特异的锌指蛋白在鳞翅目害虫防治中的应用。

根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明首次提出将胚胎特异的锌指蛋白应用到鳞翅目害虫防治中，胚胎特异的锌指蛋白表达量降低或活性降低可使得害虫的胚胎发育率大幅降低，进而大幅降低害虫的数量。本发明提供了一种对环境友好、高效、低毒的鳞翅目害虫防治方法，为斜纹夜蛾、草地贪夜蛾等鳞翅目害虫的防控提供了新的技术和策略。

在本发明的一些实施方式中，所述胚胎特异的锌指蛋白选自XICOF6、ZnF 470或ZnF 471中的至少一种。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述XICOF6用于防治家蚕及其近源昆虫，所述ZnF 470用于防治斜纹夜蛾，所述ZnF 471用于防治草地贪夜蛾。家蚕XICOF6(ZnFXICOF6)以及同源的斜纹夜蛾ZnF 470和草地贪夜蛾ZnF 471被干扰后虫子胚胎发育异常，出现死亡，可以实现对害虫的数量上的控制，在不影响生态平衡的前提下，达到有效防治害虫的目的。

根据本发明的另一个方面，提出了一种胚胎特异的锌指蛋白在鳞翅目害虫的杀虫剂制备中的应用。

根据本发明的再一个方面，还提出了一种胚胎特异的锌指蛋白的编码基因作为鳞翅目害虫防治靶点的应用。

本发明还提出了一种胚胎特异的锌指蛋白的编码基因表达抑制剂或活性抑制剂在鳞翅目害虫防治中的应用。

本发明还提出了一种胚胎特异的锌指蛋白的dsRNA在鳞翅目害虫防治中的应用，所述dsRNA的正义链如Seq ID No.1至3任一项所述。

根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：通过RNA干扰可显著提高害虫的死亡率，本发明序列的dsRNA可显著抑制鳞翅目模式昆虫家蚕、斜纹夜蛾和草地贪夜蛾中的一种锌指蛋白的表达量，并且显著提高其死亡率。本发明首次发现家蚕锌指蛋白XICOF6(ZnF XICOF6)以及同源的斜纹夜蛾ZnF 470和草地贪夜蛾ZnF 471被干扰之后，胚胎发育受阻，孵化率下降。

本发明还提出了一种胚胎特异的锌指蛋白的dsRNA在鳞翅目害虫防治药剂制备中的应用，所述dsRNA的正义链如Seq ID No.1至3任一项所述。

本发明还提出了一种胚胎特异的锌指蛋白的编码基因表达抑制剂或活性抑制剂在制备鳞翅目害虫防治药剂中的应用。

本发明还提出了一种胚胎特异的锌指蛋白的编码基因表达抑制剂或活性抑制剂在阻碍鳞翅目害虫胚胎发育中的应用。

本发明还提出了一种防治鳞翅目害虫的方法，包括如下步骤：使鳞翅目害虫中的胚胎特异的锌指蛋白的不表达或降低所述胚胎特异的锌指蛋白的活性。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中家蚕胚胎ZnF XICOF6 RNAi 24h后ZnF XICOF6 mRNA的相对相对表达量(relative mRNA expression level)水平分析图；

图2为本发明实施例1中斜纹夜蛾胚胎ZnF 470RNAi 24h后ZnF 470mRNA相对表达量水平分析图；

图3为本发明实施例1中草地贪夜蛾胚胎ZnF 471RNAi 24h后ZnF 471mRNA相对表达量水平分析图；

图4为本发明实施例2中家蚕胚胎ZnF XICOF6 RNAi后的胚胎表型(上)和孵化率统计(下)图；

图5为本发明实施例2中斜纹夜蛾胚胎ZnF 470RNAi后的胚胎表型(上)和孵化率统计(下)图；

图6为本发明实施例2中草地贪夜蛾胚胎ZnF 471RNAi后的胚胎表型(上)和孵化率统计(下)图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

锌指蛋白(Zinc finger protein，ZF)最初从非洲爪蟾卵母细胞中发现，是一类广泛存在于生物体内的具有“指状”结构的转录因子。作为一种重要的转录因子，锌指蛋白主要通过与DNA、RNA或蛋白质的结合在转录和翻译水平上精确调控相应功能基因的表达，进而影响哺乳动物胚胎发育、精子发生、细胞增殖与凋亡、疾病发生以及细胞骨架构建等多种生理代谢过程。在家蚕中，锌指蛋白影响成虫盘、腿以及翅的发育。家蚕锌指蛋白ZnFXICOF6以及同源的斜纹夜蛾ZnF 470和草地贪夜蛾ZnF 471是一种典型的包含锌指结构的转录因子，在哺乳动物中有着比较详尽的研究，本发明采用瞬时RNAi对家蚕、斜纹夜蛾、草地贪夜蛾的相应的ZnF XICOF6、ZnF 470和ZnF 471抑制表达。

根据家蚕ZnF XICOF6、斜纹夜蛾ZnF 470和草地贪夜蛾ZnF 471的cDNA序列设计dsRNA序列如表1所示：

表1

实施例1

本实施例提供了一种胚胎特异的锌指蛋白的dsRNA在鳞翅目害虫防治中的应用，其中，dsRNA的正义链如Seq ID No.1至3。根据试剂盒T7 RiboMAX^TM Express RNAi System(购自Promega公司)的说明书分别合成家蚕ZnF XICOF6以及同源的斜纹夜蛾ZnF 470和草地贪夜蛾ZnF 471的dsRNA，并用GFP dsRNA作为对照，用于后续的RNAi实验。家蚕ZnFXICOF6、斜纹夜蛾ZnF 470、草地贪夜蛾ZnF 471和EGFP的dsRNA的正义链分别如SEQ ID NO:1、NO:2、NO:3和NO:4所示。家蚕ZnF XICOF6(图1)、斜纹夜蛾ZnF 470(图2)和草地贪夜蛾ZnF471(图3)RNAi 24h后锌指蛋白基因的mRNA水平变化结果分别如图1-图3所示。

从图中可以看出，相比对照组(dsGFP)，家蚕ZnF XICOF6、斜纹夜蛾ZnF 470和草地贪夜蛾ZnF 471RNAi后对应锌指蛋白基因的mRNA明显下调。由此表明，采用RNAi技术可显著降低锌指蛋白的表达量，进而显著降低害虫数量。

实施例2

本实施例提供了一种鳞翅目害虫防治方法，具体包括如下步骤：

分别选取900-1000颗家蚕、斜纹夜蛾和草地贪夜蛾的受精4h内的卵。平均分为3组，即不做处理的CK组(空白对照组)、GFP RNAi(实验对照组)和ZnF RNAi(实验处理组)。将受精4h内的卵整齐粘在载玻片上。取适量浓度为1000-1500ng/μL的dsRNA加到毛细玻璃针中，利用双针显微注射系统(FemtoJet 4i,Eppendorf,Germany)将dsRNA注射到受精卵内，每个卵注射20-30ng dsRNA，用速干胶水封住注射口，以防止卵内容物流失导致胚胎死亡。观察胚胎发育情况，以及统计虫子孵化率(hatching rate)。

结果如图4-6所示，从图中可以看出，胚胎注射ZnF XICOF6 dsRNA后，对发育8天的家蚕卵进行观察发现与对照相比，ZnF XICOF6 RNAi组的家蚕胚胎发育受阻，不能形成完整的胚胎，生殖死亡(图4)。同样斜纹夜蛾ZnF 470和草地贪夜蛾ZnF 471的RNAi实验组胚胎也出现大量死亡。统计三种虫子进行RNAi后的孵化率发现在抑制特异锌指蛋白基因的表达后家蚕(图4)、斜纹夜蛾(图5)和草地贪夜蛾(图6)的胚胎孵化率都被显著的抑制。

此外，将XICOF6用于防治家蚕近源昆虫时，可获得与家蚕类似的抑制效果。

综上所述，本发明提供的一种胚胎特异的锌指蛋白在鳞翅目害虫防治方面的应用，由于胚胎特异的锌指蛋白对胚胎发育具有重要意义，因此，胚胎特异的锌指蛋白表达量降低或活性降低可使得害虫的胚胎发育率大幅降低，进而大幅降低害虫的数量。本发明的实施例结果显示了胚胎特异的干扰锌指蛋白的表达量会显著减弱美洲大蠊的聚集，为斜纹夜蛾、草地贪夜蛾等鳞翅目害虫的防控提供了新的策略。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

序列表

<110> 华南师范大学

<120> 一种胚胎特异的锌指蛋白在鳞翅目害虫防治方面的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 540

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uggagggaug agauacaaug auagagauaa uauuucgguu ggaucugauu guagugacga 60

uaaaucauua aguuuauuga agaaaacuaa gagucuaaag agucguaaua aagccgagug 120

ucccauaugu aagcuucguu ucaagaguga agcuuccgua gacuugcaca ggcgacacac 180

gcacaagaag aaguuccagu auaaaagcug cccuaaaaca cuuagugaug cugcuuuaac 240

cggagaagac aagaagaaac guucgaaaca acccguuaau aauaagcgcg cguuaaaugg 300

ccacggagac uugucggaac caaaacgucu gggaacauau cgaugcgaua auugcaaugu 360

caaguuugua ucggagggcg cacuucgagu ucaccuacuc acuucaaguc gacauaauag 420

uaaaguuaca agcucggccc ccuccgauuc gaauacgaau aaaacgugca agaucugucu 480

aaaggaguac gaacugccgu ccgaacugcu ccggcacgug cugaccgacc accgcaagag 540

<210> 2

<211> 372

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaaaucaaa gggcuuacac cagaugagag uaauaugcua aaauauuuug auaucgucga 60

auuaucguca acugaacaga uagaggaaug gcagaagagu gucguccgcc guacuuugac 120

aagugagaug guguaucaau guaagauaug caccaaaaca uuugcgaaca ccaagucuua 180

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gcuucgcuuu aaaagugcaa cguuggcggc ugcacauaga aaacgagcgc acagcaagaa 300

auucuucugc aaaucguguc ccaagucuuu uaauaacguc aaugucgcca aaaagcauag 360

ucguuggcac gc 372

<210> 3

<211> 484

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ugucaacuca gcaccauucc cuacaaacuc uugcgauaug uauuuuaaga gugaaaaaaa 60

uacucauaua gauuccaaaa guuauaccgu ccuagguacg gauuguaaag uugaaauuua 120

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aaguccgaaa guggauaugg uugaggagga aaaauugaaa ucuaagaaau guacuaagaa 240

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gagcacccac ucuuaccaac aucacaucaa guaucaugau ccgaguuugg gucaagauga 480

augu 484

<210> 4

<211> 413

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

uacggcgugc agugcuucag ccgcuacccc gaccacauga agcagcacga cuucuucaag 60

uccgccaugc ccgaaggcua cguccaggag cgcaccaucu ucuucaagga cgacggcaac 120

uacaagaccc gcgccgaggu gaaguucgag ggcgacaccc uggugaaccg caucgagcug 180

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aagauccgcc acaacaucga ggacggcagc gugcagcucg ccgaccacua ccagcagaac 360

acccccaucg gcgacggccc cgugcugcug cccgacaacc acuaccugag cac 413

Claims

1.一种胚胎特异的锌指蛋白在鳞翅目害虫防治中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述胚胎特异的锌指蛋白选自XICOF6、ZnF470或ZnF 471中的至少一种；优选地，所述XICOF6用于防治家蚕及其近源昆虫，所述ZnF470用于防治斜纹夜蛾，所述ZnF 471用于防治草地贪夜蛾。

3.一种胚胎特异的锌指蛋白在鳞翅目害虫的杀虫剂制备中的应用。

4.一种胚胎特异的锌指蛋白的编码基因作为鳞翅目害虫防治靶点的应用。

5.一种胚胎特异的锌指蛋白的编码基因表达抑制剂或活性抑制剂在鳞翅目害虫防治中的应用。

6.一种胚胎特异的锌指蛋白的dsRNA在鳞翅目害虫防治中的应用，其特征在于：所述dsRNA的正义链如Seq ID No.1至3任一项所述。

7.一种胚胎特异的锌指蛋白的dsRNA在鳞翅目害虫防治药剂制备中的应用，其特征在于：所述dsRNA的正义链如Seq ID No.1至3任一项所述。

8.一种胚胎特异的锌指蛋白的编码基因表达抑制剂或活性抑制剂在制备鳞翅目害虫防治药剂中的应用。

9.一种胚胎特异的锌指蛋白的编码基因表达抑制剂或活性抑制剂在阻碍鳞翅目害虫胚胎发育中的应用。

10.一种防治鳞翅目害虫的方法，其特征在于：包括如下步骤：使鳞翅目害虫中的胚胎特异的锌指蛋白的不表达或降低所述胚胎特异的锌指蛋白的活性。