CN114191421A - 和厚朴酚在诱导白血病细胞铁死亡中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学技术领域，和厚朴酚在诱导白血病细胞铁死亡中的应用，所述白血病细胞为急性髓系白血病细胞，和厚朴酚可用于诱导急性髓系白血病细胞铁死亡，有望为急性髓系白血病铁死亡的研究提供一种有效的诱导剂，同时也为急性髓系白血病的治疗提供新的药物。

Description

和厚朴酚在诱导白血病细胞铁死亡中的应用

技术领域

本发明涉及医学技术领域，涉及和厚朴酚在诱导白血病细胞铁死亡中的应用，具体地说，和厚朴酚在诱导急性髓系白血病细胞铁死亡中的应用。

背景技术

铁死亡于2012年由Dixon在《cell》杂志上首次报道[S.J. Dixon, K.M. Lemberg,M.R. Lamprecht, R. Skouta, E.M. Zaitsev, C.E. Gleason, D.N. Patel, A.J.Bauer,A.M. Cantley, W.S. Yang, B. Morrison, 3rd, B.R. Stockwell, Ferroptosis:an iron-dependent form of nonapoptotic cell death, Cell 149(5) (2012) 1060-72.]，是一种铁依赖的、脂质过氧化诱导的细胞死亡方式，有别于传统的细胞凋亡方式。目前已知的铁死亡的机制主要分为经典的和非经典的机制两种，其中，经典的机制通过下调GPX4表达实现铁死亡；非经典的机制通过上调HMOX1（HO-1）来实现[Tang D, Chen X, KangR, Kroemer G. Ferroptosis: molecular mechanisms and health implications. CellRes. 2021 Feb;31(2):107-125.]。

研究发现，诱导肿瘤细胞铁死亡可用于抑制肿瘤的发生与发展，这已在胰腺癌[Badgley, M. A. et al. Cysteine depletion induces pancreatic tumorferroptosis in mice. Science 368, 85–89 (2020).]、白血病[ Birsen R, Larrue C,Decroocq J, Johnson N, Guiraud N, Gotanegre M, Cantero-Aguilar L, Grignano E,Huynh T, Fontenay M, Kosmider O, Mayeux P, Chapuis N, Sarry JE, Tamburini J,Bouscary D. APR-246 induces early cell death by ferroptosis in acute myeloidleukemia. Haematologica. 2021 Jan 7.]、肝癌[Chang WT, Bow YD, Fu PJ, Li CY, WuCY, Chang YH, Teng YN, Li RN, Lu MC, Liu YC, Chiu CC. A Marine Terpenoid,Heteronemin, Induces Both the Apoptosis and Ferroptosis of HepatocellularCarcinoma Cells and Involves the ROS and MAPK Pathways. Oxid Med Cell Longev.2021 Jan 4;2021:7689045.]、乳腺癌[Ma S, Henson ES, Chen Y, Gibson SB.Ferroptosis is induced following siramesine and lapatinib treatment of breastcancer cells. Cell Death Dis. 2016 Jul 21;7(7):e2307.]、前列腺癌[Ghoochani A,Hsu EC, Aslan M, Rice MA, Nguyen HM, Brooks JD, Corey E, Paulmurugan R,Stoyanova T. Ferroptosis Inducers Are a Novel Therapeutic Approach forAdvanced Prostate Cancer. Cancer Res. 2021 Mar 15;81(6):1583-1594.]、卵巢癌[Wang Y, Zhao G, Condello S, Huang H, Cardenas H, Tanner EJ, Wei J, Ji Y, LiJ, Tan Y, Davuluri RV, Peter ME, Cheng JX, Matei D. Frizzled-7 IdentifiesPlatinum-Tolerant Ovarian Cancer Cells Susceptible to Ferroptosis. CancerRes. 2021 Jan 15;81(2):384-399.]等中得到证实。此外，铁死亡还是解决肿瘤细胞耐药问题的一条重要策略[Wang Y, Zhao G, Condello S, Huang H, Cardenas H, TannerEJ, Wei J, Ji Y, Li J, Tan Y, Davuluri RV, Peter ME, Cheng JX, Matei D.Frizzled-7 Identifies Platinum-Tolerant Ovarian Cancer Cells Susceptible toFerroptosis. Cancer Res. 2021 Jan 15;81(2):384-399.], [Roh JL, Kim EH, JangH, Shin D. Nrf2 inhibition reverses the resistance of cisplatin-resistanthead and neck cancer cells to artesunate-induced ferroptosis. Redox Biol.2017 Apr;11:254-262.]。

和厚朴酚是从木兰的树皮中提取的一种双酚类小分子化合物，化学式见图1。它可靶向EGFR、STAT3、mTOR、自噬等多种信号通路及分子，具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗血管生成及抗癌等多种活性[Rauf A, Olatunde A, Imran M, Alhumaydhi FA, Aljohani ASM,Khan SA, Uddin MS, Mitra S, Emran TB, Khayrullin M, Rebezov M, Kamal MA,Shariati MA. Honokiol: A review of its pharmacological potential andtherapeutic insights. Phytomedicine. 2021 Sep;90:153647.]。

目前尚未有和厚朴酚诱导铁死亡的报道，更没有关于和厚朴酚用于诱导白血病细胞铁死亡应用的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种和厚朴酚在诱导急性髓系白血病细胞铁死亡中的应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：和厚朴酚在诱导白血病细胞铁死亡中的应用。

进一步地，所述白血病细胞为急性髓系白血病细胞。

由于本发明采用了上述技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：

和厚朴酚可用于诱导急性髓系白血病细胞铁死亡，有望为急性髓系白血病铁死亡的研究提供一种有效的诱导剂，同时也为急性髓系白血病的治疗提供新的药物。

附图说明

附图1是和厚朴酚的化学式；

附图2为本发明实施例中AML细胞系THP-1、U-937与SKM-1经不同浓度和厚朴酚处理后的细胞活力结果图；

附图3为本发明实施例中和厚朴酚诱导THP-1、U-937与SKM-1细胞凋亡结果图；

附图4为本发明实施例中和厚朴酚处理THP-1、U-937与SKM-1细胞24h后的细胞周期结果图；

附图5为本发明实施例中和厚朴酚处理THP-1与SKM-1细胞14天后的细胞集落结果图；

附图6为本发明实施例中和厚朴酚处理12h后，THP-1与U-937转录组测序结果中共有差异基因分析结果图；

附图7为本发明实施例中和厚朴酚处理12h后，THP-1与U-937转录组测序结果中对差异基因的KEGG通路富集分析结果图；

附图8为本发明实施例中和厚朴酚处理12h后，THP-1与U-937转录组测序结果中共有通路的差异基因表达情况分析结果图；

附图9为本发明实施例中和厚朴酚处理12h后，THP-1与U-937转录组测序结果中共有通路的差异基因蛋白互作网络分析结果图；

附图10为本发明实施例中和厚朴酚处理12h后，THP-1、U-937与SKM-1细胞内脂质过氧化物检测结果图；

附图11为本发明实施例中和厚朴酚处理24h后，THP-1与U-937中HO-1 WB结果图；

附图12为本发明实施例中和厚朴酚通过上调HO-1诱导铁死亡机制验证结果图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将结合附图对本发明技术方案做详细说明。

实施例，和厚朴酚在诱导急性髓系白血病细胞铁死亡中的应用。

实验证实，和厚朴酚能诱导急性髓系白血病（acute myeloid leukemia）细胞THP-1、SKM-1和U-937铁死亡，从而抑制AML疾病进展。

（1）THP-1、U-937、SKM-1细胞系的培养

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养细胞，待其进入对数生长期时收集细胞并计数后，再进行后续实验，包括细胞增殖试验、细胞凋亡试验、细胞周期试验、细胞集落试验、转录组测序、脂质过氧化检测、荧光实时定量PCR、Western Bloting。

（2）CCK-8法检测细胞增殖

实验分为2大组：DMSO组和和厚朴酚组。每大组设6个不同的剂量，以溶剂（DMSO）组作为对照，每个剂量做3个复孔。接种细胞至96孔板，5000个细胞/孔，终体积为100μL/孔，于37℃、5% CO2中分别培养24h、48h、72h，于培养结束前4h内向每孔内加入10μL CCK-8，将培养板置于培养箱内孵育2 ~ 4小时，用酶标仪测定OD_450nm，计算IC50，选择IC50最小值所对应的处理时间作为后续实验的处理时间。

（3）流式细胞术检测细胞凋亡

将处于对数生长期的THP-1、U-937、SKM-1细胞接种到24孔板中，加入不同浓度的和厚朴酚，同时设立溶剂对照及复孔，于37℃、5% CO₂中培养24h后，收集细胞，用结合缓冲液洗涤，分别加入5μL Annexin-V-FITC和PI（Propidium Iodide），避光孵育15min, 上流式细胞仪检测，从而确定细胞凋亡情况。

（4）流式细胞术检测细胞周期

将处于对数生长期的THP-1、U-937、SKM-1细胞，接种到24孔板中，加入和厚朴酚，同时设立溶剂对照及复孔，于37℃、5% CO₂中培养24h后，收集细胞，用70%冷乙醇溶液固定过夜，然后加入含RNase的PI溶液，室温避光孵育15min, 上流式细胞仪检测，从而确定细胞周期分布情况。

（5）转录组测序

将处于对数生长期的THP-1和U-937细胞，接种到6孔板中，加入和厚朴酚，同时设立溶剂对照及复孔，于37℃、5% CO₂中培养24h后，收集细胞，离心，弃上清，加入TRIzol，提RNA，行转录组测序及生物信息学分析。

（6）脂质过氧化检测

将处于对数生长期的THP-1、U-937、SKM-1细胞，接种到24孔板中，加入和厚朴酚，同时设立溶剂对照及复孔，于37℃、5% CO₂中培养12h后，收集细胞，离心，弃上清，并用200μL HBSS清洗2次，去除HBSS，加入200 μL用HBSS稀释的1 μmol/L的Liperfluo溶液，在37℃，5%的CO₂培养箱中培养30 min，去除溶液，用200 μL HBSS清洗2次，上流式细胞仪检测，从而确定细胞内脂质过氧化物含量。

（7）RT-qPCR（荧光实时定量PCR）与WB（Western Bloting）

将处于对数生长期的THP-1和U-937细胞，接种到6孔板中，加入和厚朴酚，同时设立溶剂对照及复孔，于37℃、5% CO₂中培养24h后，收集细胞，离心，弃上清，将细胞平均分成两份，一份加入TRIzol，提取RNA，逆转录并行qPCR，从而确定目的mRNA表达情况；另一份加入含蛋白酶抑制剂的RIPA溶液，冰上孵育30min，于4℃，12000rpm离心15min，收集上清，加入5× loading buffer，100℃加热5min，行WB(Western Bloting)，从而确定目的蛋白表达变化。

（8）铁死亡机制确证试验

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养THP-1、U-937与SKM-1细胞；待其进入对数生长期时收集细胞并计数，接种于96孔板中，1×10⁴/孔，100μL/孔；加入和厚朴酚（THP-1：20μM；U-937：35μM；SKM-1：30μM）、3μM ZnPP或者二者的混合物，以加DMSO组为对照，于37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养24h，于结束培养前4h加入CCK-8，10μL/孔，2 ~ 4h后于450nm测定吸光度，从而确定HO-1是否是和厚朴酚诱导AML细胞铁死亡的关键调控分子。

上述八个步骤的目的是通过观察和厚朴酚处理前后白血病细胞死亡情况，确定和厚朴酚杀伤白血病细胞的方式。

实施例一：

材料与试剂：

和厚朴酚溶液（用DMSO溶解成终浓度为5000μM，购自MCE）、RPMI 1640培养基、胎牛血清、CCK-8（购自同仁化学研究所）、15ml无菌离心管、1.5ml离心管、10μL、200μL和1mL无菌吸头、96孔细胞培养板。

步骤：

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养THP-1、U-937与SKM-1细胞；

待其进入对数生长期时收集细胞并计数，接种于96孔板中，1×10⁴/孔，100μL/孔；

加入和厚朴酚，以加DMSO组为对照，于37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养24h、48h、72h，于结束培养前4h加入CCK-8，10μL/孔，2 ~ 4h后于450nm测定吸光度。

图2是AML细胞系THP-1、U-937与SKM-1经不同浓度和厚朴酚处理后的细胞增殖结果图（CCK-8法）。

从图2中可以看出，伴随着和厚朴酚剂量及孵育时间的增加，THP-1、U-937与SKM-1这3种细胞活力均呈下降趋势。

统计学结果显示和厚朴酚在这3种细胞中的IC50见下表：

表1. 和厚朴酚在3种AML细胞系中的IC50值

根据细胞增殖曲线计算IC50，用IC50±SD表示。实验重复3次，每次实验做3个复孔。

实施例二：

材料与试剂：

和厚朴酚溶液（用DMSO溶解成终浓度为5000μM，购自MCE）、RPMI 1640培养基、胎牛血清、Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（购自BD Bioscience）、PI（含RNase）（购自BDBioscience）、15ml无菌离心管、1.5ml离心管、10μL、200μL和1mL无菌吸头、6孔细胞培养板。

步骤：

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养THP-1、U-937与SKM-1细胞；

待其进入对数生长期时收集细胞并计数，接种于6孔板中，1×10⁷/孔；加入不同浓度的和厚朴酚，以加DMSO组为对照，于37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养24h；

然后收集细胞，将其分为2份；其中，第一份细胞于1000rpm离心5min，弃上清，在细胞沉淀中加入1ml 1×Binding Buffer, 重悬细胞沉淀，分别加入5μL Annexin-V-FITC和PI，于冰上避光染色15min，用流式细胞仪进行检测；第二份细胞于1000rpm离心5min，弃上清，用PBS洗涤1次，加入70%的冷乙醇溶液，充分重悬细胞，于4℃孵育过夜，1000rpm离心5min，弃上清，再用PBS洗涤2次，然后加入500 μL含RNase的PI溶液，于冰上避光染色15min，用流式细胞仪进行检测。

从图3的结果中可以看出，当和厚朴酚的浓度为10μM和20μM时，THP-1细胞凋亡率分别为21.5%±1.37%和34.36%±5.19%，明显高于不加药组（11.68%±1.42%）；U-937细胞凋亡率分别为12.72%±0.62%和38.16%±1.82%，明显高于不加药组（0.94%±0.12%，P<0.05）。另外，从图3中我们还发现，无论和厚朴酚剂量高低，死亡细胞主要集中在散点图的右上象限，即以晚凋的细胞为主，而常规的细胞凋亡发生时，应该是右下象限的细胞百分率会伴随着用药剂量的增加而增加。因此，和厚朴酚诱导的细胞死亡方式并不是我们常见的细胞凋亡，可能是其他的细胞死亡方式。

从图4结果可以看出，在和厚朴酚处理THP-1、U-937与SKM-1细胞24h后，与未加药组相比，G0/G1期细胞明显增加（THP-1：40.62%±0.72% vs 62.41%±1.87%；U-937：40.62%±0.72% vs 46.24%±2.32%；SKM-1：44.33%±3.76% vs 51.26%±1.23%，P<0.05）。

实施例三：

材料与试剂：

和厚朴酚溶液（用DMSO溶解成终浓度为5000μM，购自MCE）、RPMI 1640培养基、胎牛血清、MethoCult^TM H4100（购自STEMCELL Technologies）、青链霉素、5637细胞培养基上清、15ml无菌离心管、1.5ml离心管、10μL、200μL和1mL无菌吸头、24孔细胞培养板

步骤：

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养THP-1与SKM-1细胞；

待其进入对数生长期时收集细胞并计数，调整细胞密度为2×10⁵/ml；

取出100μL细胞与100μL和厚朴酚溶液（含不同浓度的和厚朴酚）、200μL FBS（占总体积的10%）、200μL 5637细胞培养基上清、1.38ml RPMI-1640培养基以及20μL青链霉素充分混合；

然后加到24孔板中，500μL/孔，置于37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养14d，然后于光学显微镜下计数并采集图片。

从图5中可以看出，伴随着和厚朴酚浓度的增加，THP-1与SKM-1形成的细胞集落的数量逐渐减少，并且在30μM和35μM，两种细胞几乎无集落形成。

实施例四：

材料与试剂：

和厚朴酚溶液（用DMSO溶解成终浓度为5000μM，购自MCE）、RPMI 1640培养基、胎牛血清、MethoCult^TM H4100（购自STEMCELL Technologies）、青链霉素、Liperfluo（购自同仁化学研究所）、15ml无菌离心管、1.5ml离心管、10μL、200μL和1mL无菌吸头。

步骤：

将处于对数生长期的THP-1、U-937、SKM-1细胞，接种到6孔板中；

加入和厚朴酚，同时设立溶剂对照及复孔，于37℃、5% CO₂中培养12h后，收集细胞，离心，弃上清，并用200 μL HBSS清洗2次，去除HBSS；加入200 μL用HBSS稀释的1 μmol/L的Liperfluo溶液，在37℃，5%的CO₂培养箱中培养30 min；

去除溶液，用200 μL HBSS清洗2次，上流式细胞仪检测，从而确定细胞内脂质过氧化物含量。

从图10结果可以看出，伴随着和厚朴酚剂量的增加，THP-1、U-937、SKM-1细胞的荧光强度逐渐增加，说明在一定剂量范围内，这些AML细胞内的脂质过氧化物含量与和厚朴酚的剂量成正相关，而脂质过氧化物累积是铁死亡的重要表现。由此可见，和厚朴酚诱导AML细胞铁死亡。

实施例五：

材料与试剂：

和厚朴酚溶液（用DMSO溶解成终浓度为5000μM，购自MCE）、RPMI 1640培养基、胎牛血清、TRIzol、青链霉素、RIPA、4×loading buffer、逆转录及实时荧光定量PCR试剂盒（购自Takara公司）、HMOX1抗体（购自abcam公司）、15ml无菌离心管、1.5ml离心管、10μL、200μL和1mL无菌吸头、6孔细胞培养板

步骤：

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养THP-1与U-937细胞；

待其进入对数生长期时收集细胞并计数，接种于6孔板中，1×10⁷/孔；

加入不同浓度的和厚朴酚（THP-1：25μM；U-937：35μM），以加DMSO组为对照，于37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养24h；

然后收集细胞，加入TRIZOL，将其分为3份，一份行转录组测序，第二份冻存于-80℃，以备后续的qPCR验证用，第三份加入含蛋白酶抑制剂的RIPA溶液，冰上孵育30min，4℃，12000rpm离心15min，收集上清，加入4×loading buffer，100℃加热5min，冻存于-80℃。

从图6可以看出，通过转录组测序在THP-1和U-937两株细胞系中共筛选到685个共有差异基因。对其进行KEGG通路富集分析，结果找到了4条有统计学意义的共有通路：ferroptosis, regulation of lipolysis in adipocytes, PPAR signaling pathway,bile secretion（图7）。这充分验证了我们前述的铁死亡结果。在铁死亡通路中，筛选到3个共有基因：SAT1、HMOX1、SLC7A11（图8、图9）。经qPCR及WB验证结果显示，和厚朴酚上调了THP-1和U-937两株细胞内HMOX1的表达（图11）。

实施例六：

材料与试剂：

和厚朴酚溶液（用DMSO溶解成终浓度为5000μM，购自MCE）、RPMI 1640培养基、胎牛血清、ZnPP（用DMSO溶解成终浓度为1000μM，购自MCE）、CCK-8（购自同仁化学研究所）、青链霉素、15ml无菌离心管、1.5ml离心管、10μL、200μL和1mL无菌吸头、96孔细胞培养板

步骤：

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养THP-1、U-937与SKM-1细胞；

待其进入对数生长期时收集细胞并计数，接种于96孔板中，1×10⁴/孔，100μL/孔；

加入和厚朴酚（THP-1：20μM；U-937：35μM；SKM-1：30μM）、3μM ZnPP或者二者的混合物，以加DMSO组为对照，于37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养24h，于结束培养前4h加入CCK-8，10μL/孔，2 ~ 4h后于450nm测定吸光度。

从图12可以看出，与和厚朴酚单用组相比较，经过HMOX1抑制剂ZnPP与和厚朴酚共处理后的THP-1、U-937以及SKM-1细胞活力明显提高，表明和厚朴酚通过上调HMOX1表达诱导THP-1、U-937与SKM-1细胞铁死亡。

通过以上实施例及数据我们可以看出，和厚朴酚能通过上调HMOX1诱导急性髓系白血病细胞铁死亡，该药物可以用于基于铁死亡机制的抗肿瘤治疗。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (2)

1.和厚朴酚在诱导白血病细胞铁死亡中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述白血病细胞为急性髓系白血病细胞。

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