CN114190431A - 一种抑制青霉生长及降低柑橘类果实采后腐烂率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抑制青霉生长及降低柑橘类果实采后腐烂率的方法，属于水果采后贮藏与加工技术领域。所述抑制青霉生长方法通过天然植物材料释放抑制意大利青霉生长气体物质从而达到降低柑橘类果实采后腐烂率的效果。本发明提供的青霉生长抑制方法及基于所述抑制青霉生长方法贮藏柑橘的生物处理方式，不仅能有效降低腐烂发生，而且安全无毒，环境友好，耗能少，便于操作，可大规模实施等诸多优点。本发明基于有效，环保，简便的原则，提出一种可以降低柑橘采后腐烂率的方法，能有效改善商业成熟后贮藏运输过程中果实腐烂变质损失多的现状，提升我国柑橘产业的贸易竞争力。

Description

一种抑制青霉生长及降低柑橘类果实采后腐烂率的方法

技术领域

本发明属于水果采后贮藏与加工技术领域，具体涉及一种抑制青霉生长及降低柑橘类果实采后腐烂率的方法。

背景技术

柑橘是世界第一大水果，同时柑橘在我国农业生产中具有非常重要的地位,是我国南方栽培面积最广、经济地位最重要的果树之一。加入世界贸易组织后，我国柑橘产业无论在种植规模上还是在总产量上都稳步提升。由于柑橘成熟期集中，易造成季节性过剩，贮藏不当导致品质下降，在此期间，果实极易受到真菌的侵染。柑橘采后病害主要由真菌引起，在运输与贮藏期间危害柑橘果实造成的烂果现象十分普遍，轻者腐烂率为10%~30%，严重时甚至高达50%，对我国柑橘产业造成了严重的经济损失。

柑橘的采后腐烂主要是由意大利青霉（P.italicum）引起的青霉病和由指状青霉（P.digitatum）引起的绿霉病。绿霉病发病初期呈水渍状病斑，后期病斑上有白色霉层，且中央有绿色粉状物（分生孢子梗与分生孢子），病斑边缘形成一圈白色的菌丝环，绿色的指状青霉孢子层覆盖整个病斑。青霉病发病初期呈水渍状病斑，病斑中央有青色霉层，后期，霉层覆盖整个果实。病原菌以分生孢子在病果、病残体或土壤内越冬，通过果皮上的伤口侵入危害，靠气流传播。在柑橘类水果中，绿霉病和青霉病是在果实收获后最具破坏性、造成最大经济损失的病害，其致病原因是果实受到机械损伤，果皮细胞受损，休眠致病菌孢子在果实的表面变得活跃，并迅速萌发、定植到受伤的组织中，从而导致柑橘的采后腐烂。由意大利青霉和指状青霉共同造成柑橘果实腐烂率达30%~50%，如果能够找到可以抑制意大利青霉或者指状青霉的方法，从而降低果实的采后腐烂率，是非常具有经济意义的。特别是柑橘类水果通常又种植在偏远山区，远离消费市场。收获的果实通常在进入消费市场前贮藏、运输，在此期间，果实极易受到真菌的侵染，最终整果生理紊乱，腐烂变质。

目前，我国大部分柑橘类果实贮藏与保鲜技术采用传统的杀菌剂，至今为止，用于防治柑橘采后真菌性病害的化学杀菌剂主要有：氟咯菌腈、抑菌哇、扑菌灵、特克多、邻苯酚钠、嘧菌酯、仲丁胺以及苯丙咪唑类杀菌剂、噻菌灵、咯菌腈、嘧霉胺等。但是大量使用化学杀菌剂会造成病原菌产生抗药性、农药残留与病原菌再爆发与环境污染等问题。例如已有学者报告，由于长期使用抑霉唑、噻菌灵、邻苯酚钠杀菌剂导致指状青霉和意大利青霉产生抗药性，使防治柑橘采后病害成为一大难题，有学者报道中国也出现了指状青霉对抑霉唑的抗性菌株。农药残留也是一大问题，许多农药都是直接浸泡或喷到果蔬表面，对于直接食用的果蔬来说，会有一部分农药进入人身体中，给人们的健康带来威胁，如双胍盐可能有致癌作用，许多国家禁止使用。因此开发新的安全无副作用的抑菌剂对柑橘采后贮藏与保鲜有着重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种降低柑橘类果实采后腐烂率的方法，能明显的降低果实的腐烂率，延长果实的贮藏期，维持果实的生理品质。

本发明提供抑制青霉方法，以黄皮植物组织材料作为抑制剂来抑制青霉生长。

优选的，所述黄皮植物组织材料包括黄皮叶子和/或黄皮果实。

优选的，所述黄皮果实包括黄皮果肉和黄皮果皮。

本发明提供了所述青霉生长抑制方法在柑橘类果实贮藏中的应用。

优选的，所述青霉生长抑制方法在减少柑橘类果实腐烂中的应用。

优选的，所述青霉生长抑制方法在提高柑橘类果实品质中的应用。

优选的，所述青霉生长抑制方法在柑橘果实贮藏过程中，降低柑橘类果实贮藏过程中柑橘果实的呼吸强度和延缓果实的软化。

本发明提供了一种降低柑橘类果实采后腐烂率的方法，包括以下步骤：

将所述黄皮植物材料与柑橘类果实通过接触或非接触方式共同贮藏。

优选的，所述柑橘类果实包括但不限于克里曼丁橙果实、纽荷尔果实、椪柑果实或蜜柑果实。

本发明提供了一种青霉生长抑制方法，包括黄皮植物组织材料。本发明通过抑制意大利青霉生长试验证明，将黄皮植物组织材料（包括黄皮叶子、黄皮果肉和黄皮果皮）在未经过二次加工的情况下，通过接触或不接触病原菌的情况下可以显著抑制意大利青霉的生长，而黄皮植物组织材料经过不同溶剂提取以及加工后所得物质并不能有效抑制意大利青霉生长。这表明黄皮植物组织材料可能通过释放抑制意大利青霉产孢的气体物质达到抑制意大利青霉生长的作用。

进一步的，本发明提供的青霉生长抑制方法还进一步限定了黄皮叶子、黄皮果肉和黄皮果皮。抑菌试验结果表明，在培养皿培养3天后，对照组的孢子覆盖面积为23.67cm2，蜜柑果皮组孢子覆盖面积为15.5cm2，黄皮果皮组孢子生长面积为4.85cm2，黄皮果肉组孢子生长面积为15.25cm2，黄皮叶子组孢子覆盖面积为6.08cm2。可见，在没有物理接触的情况下，黄皮的果皮、黄皮的果肉、黄皮的叶子均降低了培养皿中意大利青霉孢子的覆盖面积。并且黄皮果皮以及黄皮叶子的抑制意大利青霉的效果较好。

本发明提供了所述青霉生长抑制方法在柑橘类果实贮藏中的应用。本发明通过将所述青霉生长抑制方法应用于多种柑橘类果实贮藏中，与对照组相比，能显著降低柑橘果实的腐烂率。同时采用所述植物材料与柑橘一同贮藏，可以有效延缓果实的软化以及降低果实的呼吸速率从而保持果实的品质。

附图说明

图1为黄皮材料直接接触型抑菌试验结果图；

图2为黄皮材料非接触型抑菌试验示意图；

图3为黄皮材料非接触型抑菌试验统计图；其中，不同字母表示代表经过t检验具有显著性差异（P<0.05）；

图4为克里曼丁、温州蜜柑与黄皮叶混合贮藏腐烂率统计图；

图5为椪柑分别与黄皮叶粉末与黄皮果皮粉末混合贮藏腐烂率统计图；

图6为纽荷尔与黄皮叶混合贮藏色差统计图；

图7为纽荷尔与黄皮叶混合贮藏硬度统计图；

图8为纽荷尔与黄皮叶混合贮藏呼吸强度统计图；

图9为纽荷尔与黄皮叶混合贮藏腐烂率统计图；

图10为克里曼丁接种实验结果图；

图11为克里曼丁接种病斑面积统计图，其中*表示代表经过t检验具有显著性差异*表示P<0.05；**表示P<0.01，***表示P<0.001。

图12为纽荷尔与黄皮叶子完全密封贮藏结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种青霉生长抑制方法，以黄皮植物组织材料为抑制剂来抑制青霉生长。

在本发明中，所述黄皮植物组织材料优选包括黄皮叶子和/或黄皮果实；所述黄皮果实优选包括黄皮果肉和黄皮果皮。抑制青霉生长的植物材料更优选为黄皮果皮和黄皮叶子。所述黄皮果皮、黄皮果肉、黄皮叶子优选为采集的新鲜的材料或自然风干后的材料。所述黄皮植物组织材料含有具有抑制意大利青霉产孢的气体物质从而实现抑制青霉生长的作用。本发明所述黄皮植物组织材料为未经过二次加工的材料。当该方法包括两种组织材料时，两种材料以任意质量比混合即可。本发明对黄皮植物的品种不做具体限定，采用本领域所熟知的黄皮植物品种即可。

本发明提供了所述青霉生长抑制方法在柑橘类果实贮藏中的应用。

在本发明中，所述青霉生长抑制方法优选在减少柑橘类果实腐烂中的应用。

在本发明中，所述青霉生长抑制方法优选在柑橘类果实贮藏过程中降低柑橘类果实贮藏过程中柑橘果实的呼吸强度和延缓果实的软化。

本发明对柑橘类果实的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的柑橘种类果实即可，例如克里曼丁橙果实、纽荷尔果实、椪柑果实或密柑果实。所述贮藏的时间优选为1~60d，更优选为18~54d，进一步优选为30~45d。

本发明提供了一种降低柑橘类果实采后腐烂率的方法，包括以下步骤：

将所述抑制青霉生长的植物材料与柑橘类果实通过接触或非接触方式共同贮藏。

在本发明中，所述接触的方法优选为将植物材料置于贮藏柑橘类果实的上面和/或下面，柑橘类果实与植物材料接触。所述非接触方式优选将植物材料单独置于带孔的容器中，将所述容器与柑橘类果实一同放置于贮藏空间中，每30kg果子与0.8kg叶片混合贮藏。

在本发明中，所述柑橘类果实优选包括克里曼丁橙、纽荷尔、椪柑、密柑。

下面结合实施例对本发明提供的一种抑制青霉生长的方法及降低柑橘类果实采后腐烂率的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

加工与未经过二次加工的不同植物组织材料的抑制效果

将黄皮果皮、黄皮果肉、黄皮叶子，自然风干磨成粉末用于抑菌试验。同时采用以下提取方法获得相应提取物进行抑菌试验，后期观察其抑菌效果。

抑菌试验共分以下几组：

（1）分别用乙酸乙酯、80%乙醇水溶液、二氯甲烷作为提取溶剂，采用超声辅助提取黄皮叶粉末，物料比1:10，超声40min。超声后冷却至室温，置于50mL离心管中，8000r/min离心2min，取上清液减压抽滤过0.22μm滤膜，得到三种不同提取液。采用牛津杯法验证抑菌活性，加入提取液50μl至涂布有150μl 的1×10⁵意大利青霉孢悬液的9cm培养皿上。

（2）用60%乙醇水溶液蒸馏回流提取黄皮叶子粉末，物料比1：8，蒸馏8h后取上清液减压抽滤过0.22μm滤膜，滤纸片扩散法验证抑菌活性。

（3）将黄皮果实的果皮在常温太阳照射下自然风干磨粉，将果皮粉与意大利青霉共同培养，观察其抑菌活性。

（4）直接接触抑菌实验，用新鲜黄皮样品经过液氮速冻后-80°冷藏，将样品磨粉后恢复常温的样品粉末直接与意大利青霉混合涂布共培养，如图1所示9cm直径的PDA培养皿中均匀的涂布1×10⁴意大利青霉孢悬液，并加入2g黄皮果皮粉末均匀涂布，28℃下培养，每隔24h拍照记录意大利青霉的生长情况。

（5）非接触性抑菌实验，如图2所示将意大利青霉均匀涂布于9cm直径的PDA培养皿中。将黄皮果的叶子，果皮，果肉，各称取2g用无菌水稀释后均匀涂于15cm培养皿中，每个处理十组。密封后28℃恒温培养3天后拍照几率孢子萌发情况，用ImageJ统计孢子的萌发情况。

在上述五组抑菌实验中，处理（1）、（2）和（3）的抑菌结果为均无抑菌圈产生，推测黄皮的各种材料在经过提取的过程中其中所含的抑菌物质可能分解或变性失去抑菌作用，而处理（4）结果如图1所示，在意大利青霉培养3d的过程中，加入黄皮果皮粉末的培养皿中的意大利青霉生长明显受到了抑制。处理（5）结果如图3所示，在培养皿培养3天后，对照组的孢子覆盖面积为23.67cm²，黄皮果皮组孢子生长面积为4.85cm²，黄皮果肉组孢子生长面积为15.25cm²，黄皮叶子组孢子覆盖面积为6.08cm²。由此可见，在没有物理接触的情况下，黄皮的果皮、黄皮的果肉、黄皮的叶子均能降低培养皿中意大利青霉孢子的覆盖面积。而黄皮的果皮以及黄皮的叶子效果较好，可能含有具有抑制意大利青霉产孢的气体物质。本发明所用的植物材料在未经过二次加工不接触病原菌的情况下可以显著抑制意大利青霉的生长;经过不同方法的提取以及加工后并不具有抑制意大利青霉生长的效果。

综上，采用未经二次加工的黄皮组织材料，无论在直接接触病原菌或者未接触的情况下均对意大利青霉具有很强的抑制作用。而经过不同方法的提取以及加工后并不具有抑制意大利青霉生长的效果。

实施例2

将黄皮叶片洗净平铺晾干后，挑选完整无病害的叶片备用。选择转色均匀，果面无伤痕，成熟度一致的克里曼丁与温州蜜柑果实（华中农业大学种质资源圃），并在样品处理前经过了果蔬分选线的清洗分选烘干等。将柑橘果实分别和黄皮果叶片混合贮藏于室温（18~25℃）、相对湿度（RH）为85%~90%条件下，每种柑橘的处理与对照各210果分三组，每组70果在果实的底层和最上方分别铺一层黄皮叶片，放置于果框中并用PE塑料膜适当密封果框（非完全密封），每隔六天统计烂果数量，计算平均腐烂率。

本发明提供的实施例2处理克里曼丁与温州蜜柑果实后，克里曼丁对照组在6d至54d的果实腐烂率为分别为7.78%，15.56%，25%，31.11%，39.44%，48.89%，52.78%，64.44%，68.89%；处理组在6d至54d的腐烂率分别为7.78%，13.33%，17.78%，21.11%，23.89%，28.33%，38.33%，47.22%，53.89%。温州蜜柑对照组在6d至54d的腐烂率为分别为5%，7.78%，9.44%，11.67%，13.89%，23.33%，23.89%，24.44%，25%;处理组在6d至54d的腐烂率为分别为5%，6.67%，7.22%，9.44%，12.22%，13.33%，14.44%，15%，15.56%，见图4。

由图4可知，实施例2所描述的方法可以有效降低果实采后腐烂率。对照组在采后各个时期的腐烂率均高于处理组。

实施例3

选取转色均匀、大小统一、无伤口的椪柑果实备用（华中农业大学种质资源圃）。将黄皮果的果皮和叶子磨粉并准确称取80g放入四周带孔的塑料盒中，然后将椪柑分别贮藏于纸箱中，塑料盒位于椪柑中间下方，每个处理120果分三组，每组40果，纸盒用PE塑料膜密封（非完全密封）。每隔六天统计烂果数量，并计算平均腐烂率。

贮藏30天后，对照组果实腐烂率分别为7.5%，9.17%，14.17%，22.5%。黄皮果皮处理组果实的腐烂率为分别为4.17%，8.33%，15%，21.67%。叶子处理组果实的腐烂率为分别为8.33%，12.5%，14.17%，15%，见图5。

以上的数据显示，随着贮藏期的延长，采后处理30d时，黄皮果叶子磨粉后处理效果最好，可以显著降低柑橘果实的腐烂率。

实施例4

挑选完整无病害的黄皮果叶片备用。选取大小均一转色均匀没有伤口的纽荷尔果实，每种处理分为四组。每组100个果子，将黄皮叶子与纽荷尔混合贮藏，每100果为一筐，在框底铺一层黄皮叶子，放置50果，再铺一层黄皮叶子之上再放置50果，最后框子采用聚氯乙烯薄膜适当密封。每隔十五天统计果实的腐烂率，测定果实色差值，硬度，失重率，呼吸强度。

通过以下实验步骤进行数据测量和收集：

（1）通过色差仪精确计量果皮色差值。用手持色差仪分别在果实的赤道面选择六个点进行色差的测定，记录L*（亮度）、a*（红色饱和度）、b*（黄色饱和度）的数值。颜色用光泽度L*、色相角度H°（=arctangent(b*/a*)）和色差值CCI（= 1000×a*/(L*×b*)）来综合评估，L*值在0到100之间，值越高，果皮越亮；H°在0到360°之间，0为红-紫色，90°为黄色，180°为蓝绿色；CCI是一个综合指标，正值为红色，负值为蓝绿色，0为红色，黄色，蓝绿色的混合色。

（2）利用气相色谱仪（Agilent 7890A，美国）测定果实的呼吸强度。将不同处理果子分别放入2.6L保鲜盒，室温条件下密封3 h后，用气密针从保鲜盒顶部取1 mL气体于气相色谱测定二氧化碳含量，并根据单位质量单位时间单位体积二氧化碳的释放量计算果实的呼吸速率。

（3）果实失重率的测定。处理和对照各选择20个果实进行标记，每隔15天称其果实重量，按照式I计算失重率。

失重率（%）= （m₀－m_n）/m₀ 式I

果实硬度的测定。采用质构仪测定柑橘在贮藏过程中的硬度变化，单位用 kg/f表示，沿果实赤道上等距离测定 5 次。每个处理测定12个果子的硬度。

（7）果实腐烂率。每隔15天将果子全都从取出再放回，挑选出其中腐烂的果实并计数。

处理后的纽荷尔在0d至45d的贮藏中，ck组CCI值分别为11.51，11.23，10.90，11.83。处理组的CCI值分别为11.51，11.56，12.09，11.41，见图6。ck组的硬度分别为800.58g，720.75g，642.25g，554.31g。处理组的硬度分别为，800.58g，718.86g，610.04g，587.80g，见图7。ck组的呼吸速率为3.92ml/kg×h，5.50ml/kg×h，11.70ml/kg×h，6.74ml/kg×h。处理组的呼吸强度为，3.92ml/kg×h，5.18ml/kg×h，7.99ml/kg×h，5.76ml/kg×h，见图8。ck组的腐烂率为0%，0%，4%，9%，处理组的腐烂率为0%，0%，2.67%，6.33%，见图9。

由图6可知，在两组纽荷尔的整个贮藏过程中，CCI值均在10.5以上所以自贮藏开始起果实已经基本完成了转色。实施例4的整个过程中，CCI值均在11.5以上并且无反青现象发生，对纽荷尔的色泽无负面影响。由图7可知，在贮藏的过程中，30d时处理组的果皮硬度低于对照组，45d时处理组的硬度显著高于对照组（P=0.02<0.05），说明实施例4的处理方法在纽荷尔贮藏30d至45d的过程中可以有效延缓果实的软化。由图8可知，在实施例4的整个贮藏过程中，处理组的呼吸强度均低于对照组，在45d时差异极显著（P=0.009<0.01），可以有效降低果实的呼吸速率从而保持果实的品质。由图9可知，实施例4的处理方法可以降低果实的腐烂率，0d至45d贮藏过程中处理组的腐烂率均低于对照组。

实施例5

选取转色均匀、大小统一、无伤口的克里曼丁橙备用（华中农业大学种质资源圃）。采果后用2 %的醋氯酸钠溶液浸泡2 min，浸泡后用流动的清水洗净吸水纸擦干。用血球计数板配制1×10⁵的意大利青霉孢悬液，每个果子用接种针刺破黄皮层接种10μl的孢悬液，ck接种10μl无菌水，克里曼丁处理组与ck各接种6果，每个果子沿赤道接种三处，保存于密封的收纳盒中，在最下方垫一层湿润的吸水纸保持其湿度，放入28度恒温培养箱中培养。本实验进行了两次，第一次在处理组的收纳盒底部加入了10g黄皮叶子粉末，ck以及处理组各处理6个果子，保存5d后拍照。第二次在处理组的底部加入了10g黄皮果叶子粉末，ck以及处理组各16个果子，保存6d后拍照，见图10。两次试验后均用ImageJ计算所有果子绿色孢子所覆盖的面积并统计分析。

结果见图11。加入黄皮叶子粉末接种后5d，对照组平均病斑面积为3.76cm²，处理组平均病斑面积为2.08cm²，处理后病斑面积显著小于对照组（P=0.014）。加入黄皮果皮粉末后6d对照组平均病斑面积为3.65cm²，处理组平均病斑面积为0.08cm²，处理后病斑面积显著极小于对照组（P<0.001）。

实施例6

挑选完整无病害的黄皮果叶片备用。选取大小均一转色均匀没有伤口的纽荷尔果实。每种处理分成处理组与对照两组每组八个果子，处理组将在收纳盒的底部平铺一层黄皮叶子在叶子上防治纽荷尔果实，收纳盒盖上盖子后用封口膜完全密封。对照组将纽荷尔果实直接放入收纳盒中盖上盖子用封口膜完全密封。收纳盒在温度20℃，湿度65%的环境下保存，两个月后观察果实的保存情况。

结果见图12，处理组没有出现任何腐烂情况，而对照组均出现了不同程度的腐烂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种青霉生长抑制方法，其特征在于，以黄皮植物组织材料作为抑制剂抑制青霉生长。

2.根据权利要求1所述青霉生长抑制方法，其特征在于，所述黄皮植物组织材料包括黄皮叶子和/或黄皮果实。

3.根据权利要求2所述青霉生长抑制方法，其特征在于，所述黄皮果实包括黄皮果肉和黄皮果皮。

4.权利要求1~3任意一项所述青霉生长抑制方法在柑橘类果实贮藏中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述青霉生长抑制方法在减少柑橘类果实腐烂中，提高采后贮藏性能的应用。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述青霉生长抑制方法在柑橘果实贮藏过程中，降低柑橘类果实贮藏过程中柑橘果实的呼吸强度和延缓果实的软化。

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