CN114184726A - 一种桔梗皂苷的质谱谱库及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种桔梗皂苷的质谱谱库的构建方法，包括以下步骤：步骤一，构建桔梗皂苷的模拟分子；步骤二，计算模拟分子的化学信息；步骤三，建立模拟分子的一致性谱图并产生相应的谱库。本发明还提供了根据一种桔梗皂苷的质谱谱库的构建方法获得的质谱谱库及其在桔梗皂苷样品解析中的应用。本发明在标准品的基础上建立桔梗皂苷的质谱谱库，能够对桔梗中药、含有桔梗的复方制剂、含桔梗的食品、桔梗相关的生物样品（包括血浆、尿液、组织匀质等）中的桔梗皂苷成分进行快速分析，该方法不需要分析工作者具有专业的质谱解谱能力，通过谱图比对即能对样品进行快速的全谱图分析，不完全依赖于标准化合物、分析周期短、结果的准确度高、结果的重现好。

Description

一种桔梗皂苷的质谱谱库及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种桔梗皂苷的质谱谱库及其构建方法和应用，属于谱库构建技术领域。

背景技术

桔梗作为药材被使用最早记录于《神农本草经》，桔梗是桔梗科植物桔梗的干燥根。自古以来，桔梗的药用价值非常高，在古代桔梗就被用来治疗多种疾病，而现在桔梗同样能够得到人们的充分重视。临床上，桔梗在治疗咳嗽痰多，胸闷气短，咽喉肿痛中发挥着巨大的作用。中医认为，桔梗辛开苦泄，具有宣肺、祛痰、利咽、排脓的功效。桔梗不仅药用价值极高，在朝鲜族，桔梗也作为日常的泡菜被享用。桔梗在治疗和保健方面都突出着巨大的潜力。临床上很多中药配伍桔梗以达到化痰止咳平喘的功效。如复方桔梗片是常用的中成药制剂，主要含有桔梗、甘草、远志、款冬花等等，其治疗上呼吸道感染肺炎。疗效确切。

我国幅员辽阔，气候差异大，不同产地的桔梗质量良莠不齐，桔梗中主要的效应成分为桔梗皂苷类，皂苷类成分具有明显的抗癌、抗突变、抗炎以及免疫调节作用。桔梗总皂苷中桔梗皂苷D含量最高，是桔梗质量标志物的首选。2020版中国药典中规定，以干燥品计算，桔梗中的桔梗皂苷D的含量不得少于0.1％。目前仅仅只以桔梗皂苷D来评价桔梗质量的优劣是远远不够的，从植物亲缘关系、多种皂苷类成分也将成为新的评价桔梗质量标准的质量标志物，为桔梗质量评价提供更多充实可靠的依据。

2020版中国药典中规定，桔梗的含量测定以桔梗皂苷D为标准品，参照高效液相色谱法进行含量测定。研究者普遍使用高效液相色谱法测定桔梗中皂苷类成分，其重现性好，质量浓度与峰面积在测定范围内线性关系良好，并且方法稳定可靠，操作简单方便。但是液相色谱法也有一定的局限性，由于中药桔梗的成分复杂，目标物质桔梗皂苷D并没有共轭结构，没有强的发色团，在用高效液相色谱紫外检测器检测桔梗皂苷D，没有紫外吸收，末端干扰较大，检测结果不准确。因此这些因素制约了高效液相色谱在中药质量检测中的应用。

随着质谱技术的发展，液相色谱质谱联用仪被用来检测皂苷类成分。质谱法应用范围广，不仅可以得出精确的分子质量还可以推测分子式和结构式。质谱法的高特异性、高灵敏度以及分析的快速性使其在皂苷的成分分析中发挥着不可或缺的作用。近年来用HPLC-MS/MS方法来检测桔梗质量受到人们的青睐。无论是在中药复方还是单味药材的皂苷检测中，HPLC-MS/MS很好弥补了液相色谱与质谱法的种种缺陷，极大地提高了检验的灵敏度和专属性，突破了液相色谱、质谱法检验桔梗皂苷D的瓶颈，为中药质量标准的检验提供了一套强大可行的分析检测方法。但质谱法谱图的解析是皂苷分析的难点，质谱法的自动化程度比较低，对人的依赖性较大，数据的处理环节需要投入大量的精力。其他多种桔梗皂苷类化合物的解析，往往需要专业的解谱人员加以分析。这对于桔梗皂苷类化合物的解析带来了巨大的挑战。

桔梗皂苷的解析多依赖于标准品作为标样，采用质谱法分析。市面上出售的标准品仅10种以内，多数成分没有现成的标准化合物作为标样。桔梗皂苷的成分解析多依赖于分析工作者进行专业性的手动解谱，其效率低，周期长，需要专业解谱知识。

在采用液相色谱进行定性时，必须由已知的标准物质做定性对照，当无纯物质对照时，对样品的定性就很困难。随着科学技术的发展，具有高灵敏度和高特异性的质谱技术深入到各个领域。质谱技术能够提供丰富的结构信息，准确测定生物大分子的分子量。近年来，LC-MS技术蓬勃发展，液相色谱使复杂样品中的各类成分得到更好的分离，以便在质谱检测中获得更高质量的质谱信息。

自古以来，中药在预防、治疗疾病以及康复保健发挥着不可忽视的作用，然而由于中药的成分十分复杂，中药发挥疗效的靶点多，因此一直制约着中药现代化发展，中药药效物质基础以及作用机制的不清晰对中药质量标准的分析提出了极高的需求。虽然LC-MS技术解决了中药成分分析的瓶颈，但是数据有效正确的解析仍是当下我们需要思考并解决的问题。因此需要构建模拟谱库，以便于更加快速准确地解析数据。

桔梗皂苷的成分检测多通过液相色谱法和质谱法，对获取的质谱谱图进行手动解谱，从而给出桔梗皂苷结构，在此基础上进行全谱图分析。传统的质谱谱图解析方法效率慢，时间周期长，并且要求分析工作者有较高的解谱能力，结果完全依赖于分析工作者的分析经验。很多的分析工作者只懂得获取质谱数据，而由于没有较强的数据解析能力，而使得分析存在误差。

故，本发明建立了一种桔梗皂苷专属性的质谱谱库及其构建方法和应用，用于快速解析桔梗皂苷相关样品的质谱数据，全面准确的表征样品中含有的桔梗皂苷成分。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供了一种桔梗皂苷的质谱谱库，能够对桔梗中药、含有桔梗的复方制剂、含桔梗的食品、桔梗相关的生物样品(包括血浆、尿液、组织匀质等)中的桔梗皂苷成分进行快速分析。

同时，本发明提供了一种桔梗皂苷的质谱谱库的构建方法，该方法不需要分析工作者具有专业的质谱解谱能力，通过谱图比对即能对样品进行快速的全谱图分析，不完全依赖于标准化合物、分析周期短、结果的准确度高、重现好。

同时，本发明提供一种桔梗皂苷的质谱谱库在桔梗皂苷样品解析中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种桔梗皂苷的质谱谱库的构建方法，包括以下步骤：

步骤一，构建桔梗皂苷的模拟分子；

步骤二，计算模拟分子的化学信息；

步骤三，建立模拟分子的一致性谱图并产生相应的谱库。

步骤一包括以下内容：

S01，根据标准化合物提取母核信息和C3位、C28位分子要素构成信息；

S02，将母核信息的个数、C3位分子要素构成信息的个数和C28位分子要素构成信息的个数，通过组合化学的方式构建桔梗皂苷的模拟分子，建桔梗皂苷的模拟分子的个数＝(母核信息的个数×C3位分子要素构成信息的个数+母核信息的个数)×C28位分子要素构成信息的个数。

所述标准化合物为桔梗皂苷的关联化合物；所述关联化合物为：在pubchem网站上以及SciFinder数据库中存在、且文献已经报导过的、桔梗中所含有的桔梗皂苷类化合物。

所述母核信息包括桔梗皂苷元、远志酸苷元、桔梗酸苷元和桔梗酮苷元，所述C3位分子要素构成信息包括Glu、Glu-Glu、Glu-Glu-Glu、GlucA、Glu-GlucA；所述C28位分子要素构成信息包括Ara-Rha-Xyl-Api、Ara-Rha-Xyl、Ara-Rha-Xyl-Api|Acetyl-2″、Ara-Rha-Xyl-Api|Acetyl-3″。

一种桔梗皂苷的质谱谱库的构建方法，步骤二包括以下内容：

获取模拟分子的分子式、分子量、精确质量数、InChIKey信息、IUPAC名称；

计算模拟分子的母离子的精确质量数。

所述母离子包括[M-H]^-离子、[M+HCOOH-H]^-离子、[M+H]⁺离子以及[M+Na]⁺离子；M代表模拟分子，其中，氢H的精确质量数为1.0078、碳C的精确质量数为12.000、氧O的精确质量数为15.996、钠Na的精确质量数为22.9898。

步骤三包括以下内容：

S1，构建标准品的一致性谱图：分别配制标准品桔梗皂苷D、去芹菜糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷E、去芹菜糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷D2、去芹菜糖桔梗皂苷D2以及远志皂苷的甲醇母液，浓度为20μg/mL；

母液逐级稀释，配制成3个浓度梯度的溶液，即20μg/mL、10μg/mL和5μg/mL，每个标准品的每个浓度梯度平行进样5次，获取其产生的一级质谱图和相应的二级质谱图，每个标准品产生多张二级质谱图，收集所有二级质谱图中产生的碎片离子进行统计；

每个标准品中碎片离子在其所有的二级质谱图产生的频率大于30％的碎片离子被确定为一致性碎片离子，用于构建一致性谱图；

收集一致性碎片离子对应的丰度值，丰度值用下面的式(1)计算，构建一致性谱图，其中，n_s表示二级质谱图的个数；n_a表示该一致性碎片离子在二级质谱图中出现的次数；I_median表示一致性碎片离子丰度值的中位数值；

通过式(2)计算二级质谱图的信噪比；当信噪比的值大于5.3时，则表明二级质谱图存在较多的干扰碎片离子，且二级质谱图的丰度值重现性差，故排除信噪比的值大于5.3的二级质谱图，获取可靠的一致性谱图，以减少假阳性结果的出现；

式(2)中，Signal To Noise代表信噪比，I_n代表丰度值排名在第n的碎片离子的丰度；

S2，一致性碎片离子的结构注释：对所有的一致性碎片离子进行结构注释，收集所有二级质谱图的一致性碎片离子的丰度值，根据式(1)计算得到的一致性碎片离子的相对丰度值为模拟分子碎片离子的丰度值；

S3，构建模拟分子的谱图并形成质谱谱库：在标准品一致性谱图的基础上，根据每个模拟分子的结构以及对应的分子量，通过Excel计算出每个模拟分子对应的一致性碎片离子的质荷比的精确质量数值，根据标准品一致性谱图计算模拟分子一致性碎片离子的丰度；

模拟分子的碎片离子及其丰度通过R language软件的Reshape2数据包进行格式转置，得到文本文件格式的谱库；产生的文本文件格式的谱库，通过LIB2NIST软件转化成msp格式的质谱谱库，由此产生桔梗皂苷专属性的质谱谱库。

一种桔梗皂苷的质谱谱库的构建方法获得的质谱谱库。

一种桔梗皂苷的质谱谱库在桔梗皂苷样品解析中的应用。

应用包括以下步骤：样本经处理后进样，通过高分辨质谱进行样品分析，产生的桔梗皂苷的质谱原始数据，导入至MS-DAIL软件或者mzMine2软件中，将建立的msp格式的质谱谱库置入软件，MS-DAIL软件或者mzMine2软件产生谱图匹配的余弦相似度得分值，即为式(3)中Score_谱图的得分值；为了说明桔梗皂苷的注释结果，通过式(4)计算Score_碎片注释的值，Score_碎片注释表示为碎片离子注释的得分值；式(4)中，选择丰度值的强度排在前10的碎片离子进行结构注释，能够被结构注释的碎片离子的丰度以I_n'表示；用所有能够被结构注释的碎片离子丰度值之和比上丰度值排名在前10的所有碎片离子的丰度值之和，即为Score_碎片注释；

母离子测量的准确度，即Accuracy_母离子通过式(5)计算得到，其中m/z_测量值表示测量得到的母离子的质核比，m/z_理论值表示质谱谱库中对应的理论计算值；

通过式(6)和式(7)来计算Score_母离子；如果计算得到的Accuracy_母离子小于或等于5，则通过式(6)计算Score_母离子；如果算出来的Accuracy_母离子大于5且小于或等于20，则通过式(7)计算Score_母离子；最终通过式(3)计算得到桔梗皂苷总的匹配度值，即Total Score；当Total Score大于700时，说明匹配度良好，从而实现样本中化合物的定性；

式(3)中，Total Score代表桔梗皂苷总的匹配度值；Score_母离子代表母离子的得分值；Score_碎片注释代表碎片离子注释的得分值；

式(4)中，I_n'代表丰度值排名在前10强的碎片离子中，能够被结构注释的第n强碎片离子的丰度；I_n代表丰度值排名在前10的碎片离子中，第n强的碎片离子的丰度；

Score_母离子＝-5×Accuracy_母离子+999.5(if Accuracy_母离子≤5) (6)

Score_母离子＝﹣35×Accuracy_母离子+1144.5(if 5＜Accuracy_母离子≤20) (7)。

本发明的有益效果：

本发明在标准品的基础上建立桔梗皂苷的质谱谱库，能够对桔梗中药、含有桔梗的复方制剂、含桔梗的食品、桔梗相关的生物样品(包括血浆、尿液、组织匀质等)中的桔梗皂苷成分进行快速分析，该方法不需要分析工作者具有专业的质谱解谱能力，通过谱图比对即能对样品进行快速的全谱图分析，不完全依赖于标准化合物、分析周期短、结果的准确度高、结果的重现好。

附图说明

图1是本发明的流程图；

图2是本发明的二级谱图信噪比的频次图；

图3是本发明的案例阐述结果图。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明一种桔梗皂苷的质谱谱库及其构建方法和应用作进一步详细说明。

如图1所示，一种桔梗皂苷的质谱谱库的构建方法，包括以下步骤：

(1)构建桔梗皂苷的模拟分子

①根据标准化合物提取母核信息和分子要素构成信息

在Pubchem网站上(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)以及SciFinder数据库中查找桔梗皂苷的关联合物，参照标准化合物的二维结构信息或者将得到的SMILES信息输入至ChemDrawJSSamplePage在线网站上，具体网址为https://chemdrawdirect.perkinelmer.cloud/js/sample/index.html获取标准化合物的结构，提取标准化合物的母核信息(Skeleton)以及C3和C28位分子要素构成信息(Building Blocks)，具体信息见表1。由此得到桔梗皂苷关联物质的4种母核信息。

表1：桔梗皂苷的相关化合物主要的母核以及分子构成要素

②母核信息和分子要素构成信息

以桔梗皂苷元(Platycodigenin，化合物CID号：12314399)、远志酸苷元(Polygalacic acid，化合物CID号：161388)、桔梗酸苷元(Platycogenicacid，化合物CID号：20056221)和桔梗酮苷元(16-Oxo-Platycodigenin)这4种桔梗皂苷的苷元作为母核；以β-D-吡喃葡萄糖取代基(β-D-glucopyranosyl)、β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)-O-β-D-吡喃葡萄糖取代(β-D-glucopyranosyl-(1-6)-O-β-D-glucopyranosyl)、β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)-O-β-D-吡喃葡萄糖取代(β-D-glucopyranosyl-(1-6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1-6)-O-β-D-glucopyranosyl)、β-D-吡喃葡萄糖醛酸取代(β-D-glucopyranosiduronic acid)和β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸取代(β-D-glucopyranosyl-(1-6)-O-β-D-glucopyranosiduronic acid)这5种糖取代模式作为C3位的分子构成要素；以呋喃芹菜糖-(1-3)-O-β-D-吡喃木糖-(1-4)-O-α-吡喃鼠李糖-(1-2)-L-吡喃阿拉伯糖取代基(O-D-apio-β-D-furanosyl-(1-3)-O-β-D-xylopyranosyl-(1-4)-O-6-deoxy-α-L-mannopyranosyl-(1-2)-L-arabinopyranoside)、β-D-吡喃木糖-(1-4)-O-α-吡喃鼠李糖-(1-2)-L-吡喃阿拉伯糖取代基(O-β-D-xylopyranosyl-(1-4)-O-6-deoxy-α-L-mannopyranosyl-(1-2)-L-arabinopyranoside)、α-吡喃鼠李糖-(1-2)-L-吡喃阿拉伯糖取代基((1-4)-O-6-deoxy-α-L-mannopyranosyl-(1-2)-L-arabinopyranoside)、β-D-吡喃葡萄糖取代基(β-D-glucopyranoside)这四种糖作为C28位的分子构成要素，在此基础上，在鼠李糖的2位羟基上进行乙酰化取代，新增三种乙酰化的C28位分子构成要素，分别为：呋喃芹菜糖-(1-3)-O-β-D-吡喃木糖-(1-4)-O-α-2-乙酰基吡喃鼠李糖-(1-2)-L-阿拉伯吡喃糖取代基(O-D-apio-β-D-furanosyl-(1-3)-O-β-D-xylopyranosyl-(1-4)-O-6-deoxy-α-L-2″O-Acetylmannopyranosyl-(1-2)-L-arabinopyranoside)、β-D-吡喃木糖-(1-4)-O-α-2-乙酰基吡喃鼠李糖-(1-2)-L-阿拉伯吡喃糖取代基(O-β-D-xylopyranosyl-(1-4)-O-6-deoxy-α-L-2″O-Acetylmannopyranosyl-(1-2)-L-arabinopyranoside)、α-2-乙酰基吡喃鼠李糖-(1-2)-L-阿拉伯吡喃糖取代基((1-4)-O-6-deoxy-α-L-2″O-Acetylmannopyranosyl-(1-2)-L-arabinopyranoside)。综上所述，共得到7种糖取代模式作为C28位的分子构成要素。最终将桔梗皂苷元(共计4种)、C3位的分子构成要素(共计5种)和C28位的分子构成要素(共计7种)，具体的名称和表达方式汇总在表2种，通过组合化学的方式构建桔梗皂苷的模拟分子。

表2：构建桔梗皂苷模拟分子所使用的母核以及相应的分子构成要素

③构建模拟分子

从标准化合物中提取的4个母核信息分别与5个C3位分子构成要素配对组合，得到20(4×5＝20)个中间模拟分子，这20个中间模拟分子与4个母核分子一起共计24种作为脚手架(20+4＝24)，和7个C28位分子要素(含3个乙酰基化的取代)配对组合，共产生了168(24×7＝168)个模拟分子。具体步骤如下所述：

第一步：通过ChemDraw JS Sample Page在线软件，具体网址为https://chemdrawdirect.perkinelmer.cloud/js/sample/index.html来获得4个桔梗皂苷苷元以及C3和C28位分子构成要素的SMILES信息。第二步，进一步通过SmiLibv2.0软件将4个母核和5个C3位分子构成要素进行组合，软件中“Scaffolds”条目中输入4个母核分子的SMILES信息，“Building Blocks”条目中输入5个C3位分子构成要素的SMILES信息，由于母核与C3位分子构成要素之间以氧化键(即—O—键)结合，所以软件中“Linkers”条目中输入“[R1]O[A]”，即可以得到20个(中间)模拟分子的SMILES信息。第三步，在第一、二步的基础上进一步迭代构建模拟分子，“Scaffolds”条目中输入4个母核的SMILES信息和第二步产生的20个(中间)模拟分子的SMILES信息(共计24条SMILES信息)，“Building Blocks”条目中输入7个C28位分子构成要素的SMILES信息，组合成最终的168个模拟分子(24×7＝168)，最终由软件自动产生168个模拟分子的SMILES信息。该SMILES信息即可产生相应的二维的分子结构。

(2)计算模拟分子的化学信息

通过SmiLibv2.0软件获得的168个模拟分子的SMILES信息输入至ChemDraw JSSample Page在线软件获取模拟分子的分子式、分子量、精确质量数、InChIKey信息、IUPAC名称的相关信息，同时通过Excel软件计算前体离子(即母离子)的精确质量数，本发明中涉及的前体离子包括[M-H]^-离子、[M+HCOOH-H]^-离子、[M+H]⁺离子以及[M+Na]⁺离子的精确质量数。在计算精确质量数的过程，氢(H)的精确质量数为1.0078、碳(C)的精确质量数为12.000、氧(O)的精确质量数为15.996、钠(Na)的精确质量数为22.9898。

在上述步骤中，通过软件计算出模拟分子的IUPAC名称较复杂，在构建模拟分子质谱谱库时，以简化的方式表示桔梗皂苷的结构。具体为“苷元，C3糖基取代，C28糖基取代(/乙酰化)”的方式表示，如果该化合物存在通用名，则以“|”隔开，在“|”符号之后表示通用名。糖基取代则以简化的方式表示(见表1)。如化合物16-oxo-platycodin D在谱库中表示为“16-Oxo-platycodigenin,3-glu,28-api-xyl-rha-ara ester|16-oxo-platycodin D”。

(3)建立模拟分子的一致性谱图并产生相应的谱库

①构建标准品的一致性谱图

二级质谱图的数据采集，会由于样品处理、溶剂干扰、仪器污染等各种原因产生随机噪音或者干扰离子。因此在构建化合物谱库时，需要辨识并排除干扰离子获取可靠的一致性谱图，以减少假阳性结果的出现。

本技术采用以下方法获取标准化合物的一致性谱图：配制标准化合物桔梗皂苷D、去芹菜糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷E、去芹菜糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷D2、去芹菜糖桔梗皂苷D2以及远志皂苷的甲醇母液，浓度为20μg/mL。母液逐级稀释，配制成3个浓度梯度的溶液，即20μg/mL、10μg/mL和5μg/mL，每个标准样品的每个浓度梯度平行进样5次，获取其产生的一级质谱图和相应的二级质谱图，每个标准化合物会产生多张二级质谱图，其中桔梗皂苷D共产生167张二级质谱图、去芹菜糖桔梗皂苷D共产生147张二级质谱图、桔梗皂苷E共产生123张二级质谱图、去芹菜糖桔梗皂苷E共产生82张二级质谱图、桔梗皂苷D2共产生201张二级质谱图、去芹菜糖桔梗皂苷D2共产生331张二级谱图、远志皂苷共产生221张二级谱图，收集所有二级谱图中产生的碎片离子进行统计，以上合计1272张二级谱图。每个标准化合物中碎片离子产生的频率大于30％的碎片离子被确定为一致性碎片离子，用于构建一致性谱图。收集一致性碎片离子对应的丰度值，相应的丰度用下面的公式(1)计算构建一致性谱图，其中n_s表示谱图的个数；n_a表示该一致性碎片离子在谱图中出现的次数；I_median表示一致性碎片离子丰度值的中位数值。其相应的丰度值具体见表2。谱图的评价通过谱图的信噪比来评价，具体计算方法见公式(2)。当信噪比的值大于5.3时，则表明谱图的质量较差，在所有的标准品二级谱图中，约有1％的谱图的信噪比大于5.3(图2)。这些谱图存在较多的干扰碎片离子且二级谱图的丰度值重现性较差。

公式1

公式2

②一致性碎片离子的注释

通过对标准化合物在高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱质谱联用仪(HPLC-LTQ-Orbitrap)中碎裂分析的结果显示，对所有的一致性碎片离子进行结构注释，得到所有一致性碎片离子的结构注释，包括[S–C₂H₈O₆–H]^–、[S–C₂H₆O₅–H]^–、[S–CH₂O₃–H]^–、[S–CH₄O₂–H]^–、[S–H₂O–H]^–、[S–H]^–、[^1,3A_4α–H]^–、[B_4α–H]^–、[Y_0α–B_1β–H]^–、[Y_0α–CH₂O₂–H]^–、[Y_0α–H₂O–H]^–、[Y_0α–H]^–、[^0,2X_0α–B_3α–H]^–、[^1,3X_0α–H]^–、[M–B_1α–H₂O–H]^–、[M–B_1α–H]^–、[^0,2X_0α–H]^–、[M–H₂O–H]^–、[Z_0β–CH₂O–H]^–、[M–CH₂O–H]^–、[M–C₂H₂O–H₂O–H]^–、[M–C₂H₂O–H]^–。

能够进行上述结构注释的丰度值强度排在前10的碎片离子为能够被结构注释的碎片离子，能够被结构注释的碎片离子的丰度以I_n'表示。不能进行上述结构注释的碎片离子的丰度不能以I_n'表示。

本发明一致性碎片离子的结构注释的方法为参考文献A systematicnomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra ofglycoconjugates.Glycocojugate J(1998)5:397-409。

收集所有谱图的一致性碎片离子的丰度，根据公式(1)计算得到的碎片离子的相对丰度值为模拟化合物碎片离子的丰度值(表3)。

表3:碎片离子及其相应的丰度变化

③构建模拟分子的谱图并形成质谱谱库

在标准品一致性谱图的基础上，根据每个模拟分子的结构以及对应的分子量，通过Excel软件计算出每个模拟分子对应的一致性碎片离子的质荷比的精确质量数值，根据标准品一致性谱图计算模拟分子一致性碎片离子的丰度。

模拟分子的碎片离子及其丰度通过R language软件的Reshape2数据包进行格式转置，得到了文本文件格式的谱库。产生的文本文件形式的谱库，通过LIB2NIST软件进一步转化成msp格式的质谱谱库，由此产生了桔梗皂苷专属性的质谱谱库，该谱库与质谱软件MS-DAIL兼容，可以直接对样本中的桔梗皂苷进行结构解析。

本实施例同时提供一种桔梗皂苷的质谱谱库的构建方法获得的质谱谱库。

(4)谱库的运用

样本经处理后进样，通过高分辨质谱进行样品分析，如HPLC-LTQ-Oibtrap、HPLC-Q-Exactive、AB SciexTripleTOF等，产生的桔梗皂苷相关的质谱原始数据，导入至MS-DAIL软件或者mzMine2软件中，将建立的msp格式的谱库置入软件，MS-DAIL软件或者mzMine2软件产生谱图匹配的余弦相似度得分值，即为公式(3)中Score_谱图的得分值。为了说明桔梗皂苷的注释结果，本发明通过公式(4)计算Score_碎片注释的值，Score_碎片注释表示为碎片离子注释的得分值。公式(4)中选择丰度在前10的碎片离子进行注释，能够注释的碎片离子的丰度以I_n'表示。用所有已经得到注释的碎片离子丰度之和比上所有丰度前10的碎片离子丰度之和即为Score_碎片注释。母离子测量的准确度(Accuracy_母离子)通过公式(5)计算得到，其中m/z_测量值表示测量得到的母离子的质核比，m/z_理论值表示谱库中对应的理论计算值。通过公式(6)和公式(7)来计算Score_母离子。如果计算得到的母离子的准确度(Accuracy_母离子)小于等于5，则通过公式(6)计算Score_母离子。如果算出来的母离子的准确度(Accuracy_母离子)大于5且小于等于20，则通过公式(7)计算Score_母离子。最终通过公式(3)计算得到桔梗皂苷化合物总的匹配度值，即Total Score。当Total Score大于700时，说明匹配度良好，从而实现样本中化合物的定性。

公式3：

公式4：

公式5：

公式6：Score_母离子＝-5×Accuracy_母离子+999.5

公式7：Score_母离子＝﹣35×Accuracy_母离子+1144.5。

案例阐述

检测桔梗药材提取物中桔梗皂苷成分：

数据采集方法：色谱分离条件所采用的色谱柱为ThermoScientificTMSyncronisTMC18(2.1mm×100mm,1.7μm)，流动相0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱：0～27min，22-30％B；27～28min，30～50％B；28～29min，50～100％B；29～30min，100％B；30～31min，100～22％B；31～36min，22B％。柱温35℃，样品室温度10℃，流速0.3mL·min^-1，进样量2μL。采用的质谱检测条件为LTQ-Orbitrap XL(ThermoFisherScientific)，电喷雾离子化方式，负离子条件检测，离子源内加热的毛细管温度为270摄氏度，鞘气和辅助气的流速分别为40和10单位。电喷雾的温度为300摄氏度，Orbitrap质量分析器扫描的范围为m/z500-1800，二级谱图获取的方式为数据依赖型的采集方式。产生二级碎片谱图的能量为45，动态排除的时间为10s。

数据解析方式：得到的以.raw为后缀的原始文件直接输入到MS-DIAL v.3.96软件中。软件的参数具体为保留时间范围为0-30min，质谱采集的范围500-1800Da，色谱平滑为5个扫描点，最小的峰高阈值为2000振幅。将产生的msp数据库导入软件中，桔梗皂苷化合物的注释的阈值设定为75％。运行软件，得到的结果。

如图3所示，桔梗皂苷的谱库导入MS-DAIL中，按照“数据解析方式”项下参数设定软件，运行结果显示，共检测到59个桔梗皂苷类化合物，且模拟谱图与样品谱图的匹配度较好。

结果显示，该药材提取物中含有桔梗皂苷类成分136个桔梗皂苷类的成分，并且模拟谱图和实际测量产生的谱图，匹配度很好。

(1)发明技术方案中的第(2)步骤，通过SmiLibv2.0软件获得的168个模拟分子的SMILES，可以输入至OpenBabel软件，通过格式转化产生sdf格式的分子列表文件，产生的sdf分子列表文件通过ChemAxon软件包内的cxcalc.exe批处理文件批量计算出分子列表中每个模拟分子的分子式、分子量、精确质量数信息。

(2)发明技术方案中的第(2)步骤，通过SmiLibv2.0软件获得的168个模拟分子的SMILES，可以输入至R language软件的rCDK包中，直接计算出每个模拟分子的分子式、分子量、精确质量数信息。

(3)发明技术方案中的第(3)步骤，模拟分子产生的碎片离子和碎片离子丰度通过Rlanguage软件的Reshape2数据包进行格式转置，得到了文本文件格式的谱库。该步骤可以通过其他替代性的数据格式转化软件实现，如python 3.0。

(4)发明技术方案中的第(3)步骤，任何能够产生二级碎裂谱图的高分辨质谱产生的数据，都可以导入MS-DAIL软件或者mzMine2软件，在软件功能设置处导入产生的桔梗皂苷数据库，对样本中存在的桔梗皂苷进行结构注释。

尽管根据有限数量的实施例描述了本发明，但是受益于上面的描述，本技术领域内的技术人员明白，在由此描述的本发明的范围内，可以设想其它实施例。此外，应当注意，本说明书中使用的语言主要是为了可读性和教导的目的而选择的，而不是为了解释或者限定本发明的主题而选择的。因此，在不偏离所附权利要求书的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。对于本发明的范围，对本发明所做的公开是说明性的，而非限制性的，本发明的范围由所附权利要求书限定。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种桔梗皂苷的质谱谱库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，构建桔梗皂苷的模拟分子；

步骤二，计算模拟分子的化学信息；

步骤三，建立模拟分子的一致性谱图并产生相应的谱库。

2.根据权利要求1所述的一种桔梗皂苷的质谱谱库的构建方法，其特征在于，步骤一包括以下内容：

S01，根据标准化合物提取母核信息和C3位、C28位分子要素构成信息；

S02，将母核信息的个数、C3位分子要素构成信息的个数和C28位分子要素构成信息的个数，通过组合化学的方式构建桔梗皂苷的模拟分子，建桔梗皂苷的模拟分子的个数＝(母核信息的个数×C3位分子要素构成信息的个数+母核信息的个数)×C28位分子要素构成信息的个数。

3.根据权利要求2所述的一种桔梗皂苷的质谱谱库的构建方法，其特征在于，所述标准化合物为桔梗皂苷的关联化合物；所述关联化合物为：在pubchem网站上以及SciFinder数据库中存在、且文献已经报导过的、桔梗中所含有的桔梗皂苷类化合物。

4.根据权利要求2所述的一种桔梗皂苷的质谱谱库的构建方法，其特征在于，所述母核信息包括桔梗皂苷元、远志酸苷元、桔梗酸苷元和桔梗酮苷元，所述C3位分子要素构成信息包括Glu、Glu-Glu、Glu-Glu-Glu、GlucA、Glu-GlucA；所述C28位分子要素构成信息包括Ara-Rha-Xyl-Api、Ara-Rha-Xyl、Ara-Rha-Xyl-Api|Acetyl-2”、Ara-Rha-Xyl-Api|Acetyl-3”。

5.根据权利要求2所述的一种桔梗皂苷的质谱谱库的构建方法，其特征在于，步骤二包括以下内容：

获取模拟分子的分子式、分子量、精确质量数、InChIKey信息、IUPAC名称；

计算模拟分子的母离子的精确质量数。

6.根据权利要求5所述的一种桔梗皂苷的质谱谱库的构建方法，其特征在于，所述母离子包括[M-H]^-离子、[M+HCOOH-H]^-离子、[M+H]⁺离子以及[M+Na]⁺离子；M代表模拟分子，其中，氢H的精确质量数为1.0078、碳C的精确质量数为12.000、氧O的精确质量数为15.996、钠Na的精确质量数为22.9898。

7.根据权利要求6所述的一种桔梗皂苷的质谱谱库的构建方法，其特征在于，步骤三包括以下内容：

S1，构建标准品的一致性谱图：分别配制标准品桔梗皂苷D、去芹菜糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷E、去芹菜糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷D2、去芹菜糖桔梗皂苷D2以及远志皂苷的甲醇母液，浓度为20μg/mL；

母液逐级稀释，配制成3个浓度梯度的溶液，即20μg/mL、10μg/mL和5μg/mL，每个标准品的每个浓度梯度平行进样5次，获取其产生的一级质谱图和相应的二级质谱图，每个标准品产生多张二级质谱图，收集所有二级质谱图中产生的碎片离子进行统计；

每个标准品中碎片离子在其所有的二级质谱图产生的频率大于30％的碎片离子被确定为一致性碎片离子，用于构建一致性谱图；

收集一致性碎片离子对应的丰度值，丰度值用下面的式(1)计算，构建一致性谱图，其中，n_s表示二级质谱图的个数；n_a表示该一致性碎片离子在二级质谱图中出现的次数；I_median表示一致性碎片离子丰度值的中位数值；

通过式(2)计算二级质谱图的信噪比；当信噪比的值大于5.3时，则表明二级质谱图存在较多的干扰碎片离子，且二级质谱图的丰度值重现性差，故排除信噪比的值大于5.3的二级质谱图，获取可靠的一致性谱图，以减少假阳性结果的出现；

式(2)中，Signal To Noise代表信噪比，I_n代表丰度值排名在第n的碎片离子的丰度；

S2，一致性碎片离子的结构注释：对所有的一致性碎片离子进行结构注释，收集所有二级质谱图的一致性碎片离子的丰度值，根据式(1)计算得到的一致性碎片离子的相对丰度值为模拟分子碎片离子的丰度值；

S3，构建模拟分子的谱图并形成质谱谱库：在标准品一致性谱图的基础上，根据每个模拟分子的结构以及对应的分子量，通过Excel计算出每个模拟分子对应的一致性碎片离子的质荷比的精确质量数值，根据标准品一致性谱图计算模拟分子一致性碎片离子的丰度；

模拟分子的碎片离子及其丰度通过R language软件的Reshape2数据包进行格式转置，得到文本文件格式的谱库；产生的文本文件格式的谱库，通过LIB2NIST软件转化成msp格式的质谱谱库，由此产生桔梗皂苷专属性的质谱谱库。

8.根据权利要求1～7任意一项所述的一种桔梗皂苷的质谱谱库的构建方法获得的质谱谱库。

9.根据权利要求8所述的一种桔梗皂苷的质谱谱库在桔梗皂苷样品解析中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：样本经处理后进样，通过高分辨质谱进行样品分析，产生的桔梗皂苷的质谱原始数据，导入至MS-DAIL软件或者mzMine2软件中，将建立的msp格式的质谱谱库置入软件，MS-DAIL软件或者mzMine2软件产生谱图匹配的余弦相似度得分值，即为式(3)中Score_谱图的得分值；为了说明桔梗皂苷的注释结果，通过式(4)计算Score_碎片注释的值，Score_碎片注释表示为碎片离子注释的得分值；式(4)中，选择丰度值的强度排在前10的碎片离子进行结构注释，能够被结构注释的碎片离子的丰度以I_n'表示；用所有能够被结构注释的碎片离子丰度值之和比上丰度值排名在前10的所有碎片离子的丰度值之和，即为Score_碎片注释；

母离子测量的准确度，即Accuracy_母离子通过式(5)计算得到，其中m/z_测量值表示测量得到的母离子的质核比，m/z_理论值表示质谱谱库中对应的理论计算值；

通过式(6)和式(7)来计算Score_母离子；如果计算得到的Accuracy_母离子小于或等于5，则通过式(6)计算Score_母离子；如果算出来的Accuracy_母离子大于5且小于或等于20，则通过式(7)计算Score_母离子；最终通过式(3)计算得到桔梗皂苷总的匹配度值，即Total Score；当TotalScore大于700时，说明匹配度良好，从而实现样本中化合物的定性；

式(3)中，Total Score代表桔梗皂苷总的匹配度值；Score_母离子代表母离子的得分值；Score_碎片注释代表碎片离子注释的得分值；

式(4)中，I_n'代表丰度值排名在前10强的碎片离子中，能够被结构注释的第n强碎片离子的丰度；I_n代表丰度值排名在前10的碎片离子中，第n强的碎片离子的丰度；

Score_母离子＝-5×Accuracy_母离子+999.5(ifAccuracy_母离子≤5) (6)

Score_母离子＝﹣35×Accuracy_母离子+1144.5(if5＜Accuracy_母离子≤20) (7)。

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