CN114174290A - Trex1的调节剂 - Google Patents

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Abstract

提供了式(I)的化合物和其药学上可接受的盐以及其组合物，所述化合物和所述药学上可接受的盐以及所述组合物可用于治疗与TREX1相关的各种病状。

Description

TREX1的调节剂
相关申请
本申请要求于2019年7月23日提交的美国临时申请第62/877,482号的优先权的权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
与非自身的先天免疫系统识别有关的癌症需要潜在免疫疗法，并且需要潜在免疫疗法以用于检测和防止潜在的危险。癌细胞在抗原上不同于其正常对应物并且类似于病毒感染发出危险信号来警示免疫系统。这些包含损伤相关分子模式(DAMP)和病原体相关分子模式(PAMP)的信号进一步激活先天免疫系统，从而保护宿主免受各种威胁(《细胞与感染微生物学前言(Front.Cell Infect.Microbiol.)》2012,2,168)。
异位表达的单链DNA(ssDNA)和双链DNA(dsDNA)是已知的PAMP和/或DAMP，其由环状GMP-AMP合酶(cGAS)(一种核酸传感器)识别(《自然(Nature)》2011,478,515-518)。在感测到胞质DNA后，cGAS催化环状二核苷酸2',3'-cGAMP(一种干扰素基因的ER跨膜衔接蛋白刺激因子(STING)的强效第二信使和激活剂)的产生(《细胞报告(Cell Rep.)》2013,3,1355-1361)。STING激活通过TBK1触发IRF3的磷酸化，这进而导致I型干扰素的产生和干扰素刺激基因(ISG)的激活；这是激活先天免疫和启动适应性免疫的先决条件。因此I型干扰素的产生构成了先天免疫与适应性免疫之间的关键桥梁(《科学(Science)》2013,341,903-906)。
过量I型IFN可能对宿主有害并且诱导自身免疫性，因此，存在抑制I型IFN介导的免疫激活的负反馈机制。3'修复核酸外切酶I(TREX1)是负责去除异位表达的ssDNA和dsDNA的3'-5'DNA核酸外切酶，并且因此是cGAS/STING途径的关键阻遏物(《美国国家科学院院刊(PNAS)》2015,112,5117-5122)。
I型干扰素和下游促炎性细胞因子应答对于免疫应答的发展和其有效性至关重要。I型干扰素通过引发如CD40、CD80和CD86等共刺激性分子的上调来增强树突状细胞和巨噬细胞吸收、处理抗原、向T细胞呈递和交叉呈递抗原的能力，以及所述树突状细胞和巨噬细胞刺激T细胞的效力(《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》2011,208,2005-2016)。I型干扰素还结合其自身的受体并且激活干扰素应答基因，所述干扰素应答基因有助于激活参与适应性免疫的细胞(《欧洲分子生物学组织报告(EMBO Rep.)》2015,16,202-212)。
从治疗的角度来看，I型干扰素和可以诱导I型干扰素产生的化合物具有用于治疗人类癌症的潜力(《自然免疫学评论(Nat.Rev Immunol.)》2015,15,405-414)。干扰素可以直接抑制人类肿瘤细胞增殖。另外，I型干扰素可以通过触发来自先天性和适应性免疫系统两者的细胞的激活来增强抗肿瘤免疫性。重要地，PD-1阻断的抗肿瘤活性需要预先存在的肿瘤内T细胞。通过将冷肿瘤转变为热肿瘤并由此引发自发的抗肿瘤免疫，I型IFN诱导疗法有可能扩大对抗PD-1疗法有应答的患者群以及增强抗PD-1疗法的有效性。
目前正在开发的诱导有效I型干扰素应答的疗法需要局部或肿瘤内施用以达到可接受的治疗指数。因此，仍需要具有全身递送和较低毒性的新药剂以将I型IFN诱导疗法的益处扩展至没有外周治疗可及的病灶的患者。人类和小鼠遗传研究表明TREX1抑制可能适合于全身递送途径并且因此TREX1抑制性化合物可以在抗肿瘤治疗领域中发挥重要作用。TREX1是癌细胞对放射治疗作出应答的免疫原性有限的关键决定因素[《细胞生物学趋势(Trends in Cell Biol.)》,2017,27(8),543-4；《自然通讯(Nature Commun.)》,2017,8,15618]。TREX1由遗传毒性应激诱导并且参与保护胶质瘤和黑色素瘤细胞以免受抗癌药物的影响[《生物化学与生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)》,2013,1833,1832-43]。STACT-TREX1疗法在多种鼠癌症模型中表现出稳健的抗肿瘤功效[Glickman等人,PosterP235,第33届癌症免疫治疗学会年会(33rd Annual Meeting of Society forImmunotherapy of Cancer),华盛顿特区(Washington DC),2018年11月7-11日]。
发明内容
本文提供了具有式I的化合物：
Figure BDA0003483117870000021
和其药学上可接受的盐以及其组合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、x以及环A如本文所述。所公开的化合物和组合物调节TREX1，并且可用于多种治疗性应用，例如，治疗癌症。
附图说明
图1A展示了来自使用CRISPR的在B16F10肿瘤细胞中的TREX1敲低实验的结果。图1B展示了TREX1减弱了B16F10肿瘤细胞中cGAS/STING途径的激活。
图2展示了与亲本B16F10肿瘤相比，TREX被沉默的肿瘤具有较小的体积。
图3示出了TREX1敲除B16F10肿瘤表现出总体免疫细胞的显著增加。这反映肿瘤浸润CD4和CD8 T细胞以及浆细胞样树突状细胞(pDC)数目的增加。
图4示出了来自在HCT116结直肠癌细胞系中使用本文所述的化合物的荧光素酶测定的结果。
具体实施方式
1.化合物的总体描述
在第一实施例中，本文提供了式I的化合物：
Figure BDA0003483117870000031
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是氢、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、3元到4元环烷基、-ORf、-SRf或-NReRf；
R2是氢、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基或3元到4元环烷基；
R3是氢或任选地被苯基取代的(C1-C4)烷基，其中所述苯基任选地被选自卤素、(C1-C4)烷基和卤代(C1-C4)烷基的1到3个基团取代；
R4是氢或(C1-C4)烷基；
R5是氢、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、苯基或任选地被苯基或-NHC(O)ORa取代的(C1-C4)烷基，其中所述苯基中的每一个任选地且独立地被选自卤素、(C1-C4)烷基和卤代(C1-C4)烷基的1到3个基团取代；
x是0、1或2；
环A是芳基、杂芳基、杂环基或环烷基，所述芳基、杂芳基、杂环基或环烷基中的每一个任选地且独立地被选自R6的1或2个基团取代；
R6是(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷氧基、卤素、苯基、-CN、-NHC(O)ORa、-NHC(S)ORa、-C(O)Rb、-NHC(O)NHRg、-NHC(S)NHRg、-NHS(O)2NHRg、-C(S)Rb、-S(O)2Rc、-S(O)Rc、-C(O)ORd、-C(S)ORd、-C(O)NReRf、-C(S)NHRe、-NHC(O)Rd、-NHC(S)Rd、-ORe、-SRe、-O(C1-C4)烷基ORe、-NReRf、4元到6元杂芳基或4元到7元杂环基，其中
-用于R6的所述苯基任选地被选自Rg的1或2个基团取代；
-用于R6的所述(C1-C4)烷基任选地被选自ORh、-NRjRk、苯基和5元到6元杂芳基的1或2个基团取代；并且
-用于R6的所述4元到7元杂环基和4元到6元杂芳基各自任选地且独立地被选自Rm的1或2个基团取代；并且其中针对R6中的(C1-C4)烷基所列出的任选取代基的所述苯基和5元到6元杂芳基各自任选地且独立地被选自Rg的1或2个基团取代；
Rg、Rh、Rj、Rk和Rm各自独立地是氢、卤素、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、苯基、-(C1-C4)烷基苯基、3元到4元环烷基、4元到6元杂芳基或4元到7元杂环基，并且其中用于Rg、Rh、Rj和Rk的所述4元到7元杂环基进一步任选地被＝O取代。
Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf各自独立地是氢、卤素、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、苯基、3元到4元环烷基、4元到6元杂芳基或4元到7元杂环基，其中
-用于Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf的所述(C1-C4)烷基任选地被选自苯基、–ORh、-NRjRk的1或2个基团取代，
-用于Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf的所述苯基、4元到6元杂芳基和4元到7元杂环基各自任选地且独立地被选自Rg的1或2个基团取代，并且
-用于Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf的所述4元到7元杂环基进一步任选地被＝O取代。
2.定义
当结合地用于描述可能具有多个连接点的化学基团时，连字符(-)表示所述基团与定义其的变量的连接点。例如，-NHC(O)ORa和-NHC(S)ORa意指此基团的连接点出现在氮原子上。
术语“卤素(halo/halogen)”是指选自氟(氟代，-F)、氯(氯代，-Cl)、溴(溴代，-Br)和碘(碘代，-I)的原子。
术语“烷基”当单独使用或作为如“卤代烷基”等较大部分的一部分等时，意指饱和直链或支链单价烃基。除非另有指定，否则烷基通常具有1-4个碳原子，即(C1-C4)烷基。
“烷氧基”意指通过氧连接原子连接的由–O-烷基表示的烷基。例如，“(C1-C4)烷氧基”包含甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基。
术语“卤代烷基”包含单卤代烷基、多卤代烷基和全卤代烷基，其中卤素独立地选自氟、氯、溴和碘。
“卤代烷氧基”是通过氧原子连接到另一部分的卤代烷基，例如–OCHF2或–OCF3。
除非另有指定，否则术语“芳基”是指总共具有6到10个环成员的芳香族碳环系统。在某些实施例中，“芳基”是指包含但不限于苯基和萘基的芳香族环系统。应理解，当指定时，芳基上的任选的取代基可以存在于任何可取代位置上并且包含例如连接芳基的位置。
单独使用或作为较大部分的一部分使用的术语“杂芳基”是指含有1-4个选自N、O和S的5元到12元(例如，5元到6元)芳香族基团。杂芳基可以是单环或双环的。单环杂芳基包含例如噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、三嗪基、四嗪基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基等。双环杂芳基包含其中单环杂芳环与一个或多个芳基或杂芳环稠合的基团。非限制性实例包含吲哚基、咪唑并吡啶基、苯并噁唑基、苯并氧代二唑基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、吡咯并吡啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并吡啶基、噻吩并吡啶基、噻吩并嘧啶基、吲哚嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。应理解，当指定时，杂芳基上的任选的取代基可以存在于任何可取代位置上并且包含例如连接杂芳基的位置。
术语“杂环基”是指含有1到4个独立地选自N、O和S的杂原子的4元到12元饱和或部分不饱和杂环。杂环可以在形成稳定结构的任何杂原子或碳原子处与其侧基连接。杂环基可以是单环或双环的。单环饱和杂环基或部分不饱和杂环基的实例包含但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、哌啶基、噁唑烷基、哌嗪基、二氧杂环烷基、二氧戊环基、吗啉基、二氢呋喃基、二氢吡喃基、二氢吡啶基、四氢吡啶基、二氢嘧啶基和四氢嘧啶基。双环杂环基包含例如与以下稠合的不饱和杂环基：另一不饱和杂环基、环烷基或芳香族环或杂芳基环，例如，苯并二氧杂环戊烯基、二氢苯并噁嗪基、二氢苯并二噁英基、6,7-二氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,2,4]三唑基、5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡啶基、1,2-二氢喹啉基、二氢苯并呋喃基、四氢萘啶、吲哚啉酮、二氢吡咯并三唑、喹啉酮、苯并二氢吡喃基(chromanyl)和二氧杂螺癸烷。还应理解，当指定时，杂环基上的任选的取代基可以存在于任何可取代位置上并且包含例如连接杂环基的位置。
术语“螺环”是指共享一个环原子(例如，碳)的两个环。
术语“稠合”是指彼此共享两个相邻环原子的两个环。
术语“桥接”是指彼此共享三个环原子的两个环。
除非另有指定，否则术语“环烷基”是指具有3到10个碳环原子的环烃。单环环烷基包含但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环庚烯基和环辛基。应理解，当指定时，环烷基或脂环族基上的任选的取代基可以存在于任何可取代位置上并且包含例如连接环烷基或脂环族基的位置。
所公开的化合物以各种立体异构形式存在。立体异构体是仅在其空间排列方面不同的化合物。对映异构体为镜像不可重叠的立体异构体对，最常是因为其含有充当手性中心的不对称取代碳原子。“对映异构体”意指为彼此的镜像且不可重叠的一对分子中的一个。非对映异构体为含有两个或更多个不对称取代碳原子的立体异构体。“R”和“S”表示围绕一个或多个手性碳原子的取代基的构型。
“外消旋体”或“外消旋混合物”意指等摩尔量的两种对映异构体的化合物，其中此类混合物不表现出光学活性，即其不使偏振光平面旋转。
当公开的化合物的立体化学由结构命名或描述时，所命名或描述的立体异构体相对于所有其它立体异构体具有按重量计至少60％、70％、80％、90％、99％或99.9％的纯度。相对于所有其它立体异构体的按重量计的纯度百分比是一种立体异构体的重量与其它立体异构体的重量的比率。当按照结构命名或描述单一对映异构体时，所描述或命名的对映异构体具有按重量计至少60％、70％、80％、90％、99％或99.9％的光学纯度。按重量计的光学纯度百分比是对映异构体的重量与对映异构体的重量加上其光学异构体的重量的比率。
当所公开化合物的立体化学通过结构命名或描绘，并且命名或描绘的结构涵盖多于一种立体异构体(例如，如在非对映异构体对中)时，应理解包含所涵盖的立体异构体之一或所涵盖的立体异构体的任何混合物。应进一步理解，所命名或描绘的立体异构体的立体异构纯度相对于所有其它立体异构体按重量计为至少60％、70％、80％、90％、99％或99.9％的纯度。在这种情况下，通过将混合物中所述名称或结构所涵盖的立体异构体的总重量除以混合物中所有立体异构体的总重量来确定立体异构纯度。
当所公开的化合物通过结构命名或描绘而不表明立体化学，并且所述化合物具有一个手性中心时，应当理解，所述名称或结构涵盖化合物的一种对映异构体，所述对映异构体不含对应的光学异构体、所述化合物的外消旋混合物或一种对映异构体相对于其对应的光学异构体富集的混合物。
当所公开的化合物通过结构命名或描述而不表明立体化学并且例如所述化合物具有多于一个手性中心(例如，至少两个手性中心)时，应当理解，所述名称或结构涵盖一种立体异构体，所述立体异构体不含其它立体异构体、立体异构体的混合物或其中一种或多种立体异构体相对于其它立体异构体富集的立体异构体混合物。例如，所述名称或结构可以涵盖一种立体异构体，所述立体异构体不含其它非对映异构体、立体异构体的混合物或其中一种或多种非对映异构体相对于其它非对映异构体富集的立体异构体混合物。
术语“TREX1”是指3'修复核酸外切酶1或DNA修复核酸外切酶1，其是在人类中由TREX1基因编码的酶。Mazur DJ,Perrino FW(1999年8月).“编码哺乳动物3'-->5'核酸外切酶的TREX1和TREX2 cDNA序列的鉴定和表达(Identification and expression of theTREX1 and TREX2 cDNA sequences encoding mammalian 3'-->5'exonucleases)”.《生物化学杂志(J Biol Chem)》274(28):19655–60.doi:10.1074/jbc.274.28.19655.PMID10391904；Hoss M,Robins P,Naven TJ,Pappin DJ,Sgouros J,Lindahl T(1999年8月).“与大肠杆菌DnaQ/MutD蛋白同源的人类DNA编辑酶(A human DNAediting enzyme homologous to the Escherichia coli DnaQ/MutD protein)”.《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)》18(13):3868–75.doi:10.1093/emboj/18.13.3868.PMC1171463.PMID10393201。此基因编码人细胞中主要的3'->5'DNA核酸外切酶。蛋白质是可以为人DNA聚合酶提供校对功能的非加工性核酸外切酶。所述蛋白质也是SET复合物的组分，并且用于在颗粒酶A介导的细胞死亡期间迅速降解带切口DNA的3'末端。缺乏功能性TREX1的细胞表现出慢性DNA损伤检查点激活和内源性单链DNA底物的核外积累。似乎TREX1蛋白通常作用于由处理异常复制中间体产生的单链DNA多核苷酸物种。TREX1的这种作用减弱DNA损伤检查点信号传导并阻止病理性免疫激活。TREX1根据细胞内在抗病毒监测代谢内源性逆转录元件的逆转录单链DNA，从而产生强效的I型IFN应答。TREX1通过降解细胞质中的病毒cDNA来帮助HIV-1逃避胞质感测。
术语“TREX2”是指3'修复核酸外切酶2，是在人类中由TREX2基因编码的酶。此基因编码具有3'到5'核酸外切酶活性的核蛋白。编码的蛋白质参与双链DNA断裂修复，并且可以与DNA聚合酶δ相互作用。具有此活性的酶参与DNA复制、修复和重组。TREX2是主要在角化细胞中表达并且有助于表皮对UVB诱导的DNA损伤作出应答的3′-核酸外切酶。TREX2生物化学和结构性质类似于TREX1，但是两者并不相同。所述两种蛋白质共享二聚体结构并且可以在体外以几乎相同的kcat值处理ssDNA和dsDNA底物。然而，与酶动力学、结构域和亚细胞分布相关的若干个特征将TREX2与TREX1区分开来。与TREX1相比，TREX2在体外对DNA底物的亲和力降低了10倍。与TREX1相比，TREX2缺乏可以介导蛋白质-蛋白质相互作用的COOH-末端结构域。TREX2位于细胞质和细胞核两者中，而TREX1存在于内质网中并且在颗粒酶A介导的细胞死亡期间或在DNA损伤后被动员到细胞核中。
术语“受试者”和“患者”可以互换使用，并且意指需要治疗的哺乳动物，例如，伴侣动物(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，牛、猪、马、绵羊、山羊等)和实验室动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠等)。通常，受试者是需要治疗的人。
术语“抑制(inhibit、inhibition或inhibiting)”包含生物活性或过程的基线活性的降低。
如本文所使用的，术语“治疗(treatment、treat和treating)”是指逆转、缓解、延迟如本文所述的疾病或病症或其一种或多种症状的发作或抑制其进展。在一些方面中，可以在出现一种或多种症状后施用治疗，即治疗性治疗。在其它方面中，可以在不存在症状的情况下施用治疗。例如，可以在症状发作之前(例如，根据症状历史和/或根据暴露于特定生物体或其它易感因素)向易感个体施用治疗，即预防性治疗。还可以在症状已经消退之后继续治疗，例如以延迟其复发。
术语“药学上可接受的载体”是指不会破坏与其一起调配的化合物的药理活性的无毒的载体、佐剂或媒剂。可以用于本文所述组合物的药学上可接受的载体、佐剂或媒剂包含但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、如人血清白蛋白等血清蛋白、如磷酸盐等缓冲物质、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
对于在药物中的使用，本文中描述的化合物的盐是指无毒“药学上可接受的盐”。药学上可接受的盐形式包含药学上可接受的酸性/阴离子或碱性/阳离子盐。本文所述化合物的适合的药学上可接受的酸加成盐包含例如无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸和硫酸)和有机酸(如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、甲磺酸和对甲苯磺酸)的盐。具有如羧酸等酸性基团的本发明教导的化合物可以与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。合适的药学上可接受的碱性盐包含例如铵盐、碱金属盐(如钠盐和钾盐)和碱土金属盐(如镁和钙盐)。具有季铵基团的化合物也含有抗衡阴离子，如氯离子、溴离子、碘离子、乙酸根、过氯酸根等。此类盐的其它实例包含盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲烷磺酸盐、硝酸盐、苯甲酸盐以及与如谷氨酸等氨基酸的盐。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指将引发受试者的所需或有益生物或医疗应答的本文所述的化合物的量，例如介于0.01-100mg/kg体重/天之间的剂量。
3.化合物
在第二实施例中，本文提供了式II的化合物：
Figure BDA0003483117870000091
或其药学上可接受的盐，其中变量如以上针对式I所述。
在第三实施例中，在式I或II的化合物中，R2是(C1-C4)烷基。
在第四实施例中，本文提供了式III的化合物：
Figure BDA0003483117870000092
或其药学上可接受的盐，其中变量如以上在第一、第二或第三实施例中所述。
在第五实施例中，式I、II或III的化合物中的R3是任选地被苯基取代的(C1-C4)烷基，其中变量如以上在第一、第二、第三或第四实施例中所述。可替代地，式I、II或III的化合物中的R3是(C1-C4)烷基，其中变量如以上在第一、第二、第三或第四实施例中所述。
在第六实施例中，本文提供了式IV的化合物：
Figure BDA0003483117870000093
或其药学上可接受的盐，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四或第五实施例中所述。
在第七实施例中，本文提供了式V的化合物：
Figure BDA0003483117870000094
或其药学上可接受的盐，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五或第六实施例中所述。
在第八实施例中，式I、II、III、IV或V的化合物中的x是0或1，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七实施例中所述。
在第九实施例中，在式I、II、III、IV或V的化合物中的R5是氢、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、苯基或任选地被苯基或-NHC(O)ORa取代的(C1-C4)烷基，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八实施例中所述。可替代地，作为第九实施例的一部分，式I、II、III、IV或V的化合物中的R5是氢、苯基或任选地被苯基或-NHC(O)ORa取代的(C1-C4)烷基，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八实施例中所述。可替代地，作为第九实施例的一部分，式I、II、III、IV或V的化合物中的R5是环烷基或苯基，其中所述苯基任选地被选自卤素、(C1-C4)烷基和卤代(C1-C4)烷基的1到3个基团取代，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八实施例中所述。可替代地，作为第九实施例的一部分，式I、II、III、IV或V的化合物中的R5是环丙基，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八实施例中所述。可替代地，作为第九实施例的一部分，式I、II、III、IV或V的化合物中的R5是任选地被选自卤素和(C1-C4)烷基和卤代(C1-C4)烷基的1到2个基团取代的苯基，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八实施例中所述。可替代地，作为第九实施例的一部分，式I、II、III、IV或V的化合物中的R5是任选地被1到2个卤素取代的苯基，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八实施例中所述。
在第十实施例中，式I、II、III、IV或V的化合物中的Ra是(C1-C4)烷基，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九实施例中所述。
在第十一实施例中，式I、II、III、IV或V的化合物中的环A是芳基、杂芳基或杂环基，所述芳基、杂芳基或杂环基中的每个任选地且独立地被选自R6的1或2个基团取代，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十实施例中所述。可替代地，式I、II、III、IV或V的化合物中的环A是萘基、吲唑基、苯基、吡啶基、吡唑基、氮杂环丁烷基、四氢吡喃基、哌啶基、二氢苯并噁嗪基、二氢苯并二噁英基或苯并二氢吡喃基，所述萘基、吲唑基、苯基、吡啶基、吡唑基、氮杂环丁烷基、四氢吡喃基、哌啶基、二氢苯并噁嗪基、二氢苯并二噁英基或苯并二氢吡喃基中的每个任选地且独立地被选自R6的1或2个基团取代，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十实施例中所述。在另一替代方案中，式I、II、III、IV或V的化合物中的环A是任选地被选自R6的1或2个基团取代的苯基，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十实施例中所述。在另一替代方案中，式I、II、III、IV或V的化合物中的环A是嘧啶基或噻唑基，所述嘧啶基或噻唑基中的每个任选地被选自R6的1或2个基团取代，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十实施例中所述。在另一替代方案中，式I、II、III、IV或V的化合物中的环A是任选地被选自R6的1或2个基团取代的吡啶基，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十实施例中所述。
在第十二实施例中，式I、II、III、IV或V的化合物中的R6是卤代(C1-C4)烷基、卤素、-CN、-NHC(O)ORa、-C(O)Rb、-NHC(O)NHRg、-C(O)NReRf、-NHC(O)Rd、-NReRf、-ORe或4元到6元杂芳基，其中所述4元到6元杂芳基任选地被选自Rm的1或2个基团取代，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或第十一实施例中所述。可替代地，式I、II、III、IV或V的化合物中的R6是(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、卤素、-CN、-C(O)Rb、-C(O)NReRf、-ORe或4元到6元杂芳基，其中所述4元到6元杂芳基任选地被选自Rm的1或2个基团取代，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或第十一实施例中所述。可替代地，式I、II、III、IV或V的化合物中的R6是苯基或4元到6元杂芳基，其中所述苯基任选地被选自Rg的1或2个基团取代，并且所述4元到6元杂芳基任选地被选自Rm的1或2个基团取代，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或第十一实施例中所述。
在第十三实施例中，式I、II、III、IV或V的化合物中的Rb是(C1-C4)烷基，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一或第十二实施例中所述。
在第十四实施例中，式I、II、III、IV或V的化合物中的Re是(C1-C4)烷基，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二或第十三实施例中所述。
在第十五实施例中，式I、II、III、IV或V的化合物中的Rr是(C1-C4)烷基，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四实施例中所述。
在第十六实施例中，式I、II、III、IV或V的化合物中的Rm是(C1-C4)烷基，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四或第十五实施例中所述。
在第十七实施例中，式I、II、III、IV或V的化合物中的Rg是卤素，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五或第十六实施例中所述。
在第十八实施例中，式I、II、III、IV或V的化合物中的R6是Cl、F、CF3、-C(O)N(Me)2、-OCH3、-C(O)CH3或任选地被1或2个CH3取代的吡唑基，其中变量如以上在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六或第十七实施例中所述。
本文还提供了药物组合物，其包括：1)具有式I的化合物：
Figure BDA0003483117870000121
或其药学上可接受的盐，其中变量如以上针对第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七或第十八实施例所述；以及2)药学上可接受的载体。
具有式I的化合物在范例中进一步公开并且包含在本公开中。包含其药学上可接受的盐以及中性形式。
4.用途、调配和施用
本文描述的化合物和组合物通常对调节TREX1的活性是有用的。在一些方面，本文描述的化合物和药物组合物抑制活性TREX1。
在一些方面，本文所述的化合物和药物组合物可用于治疗与TREX1功能相关的病症。因此，本文提供治疗与TREX1功能相关的病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或包括所公开的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。还提供了本文所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或包括所公开的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物用于制造用于治疗与TREX1功能相关的病症的药物的用途。还提供了本文所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或包括所公开的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，其用于治疗与TREX1相关的病症。
在一些方面，本文描述的化合物和药物组合物可用于治疗癌症。
在一些方面，由本文所述的化合物和药物组合物治疗的癌症选自结肠癌、胃癌、甲状腺癌、肺癌、白血病、胰腺癌、黑色素瘤、多发性黑色素瘤、脑癌、CNS癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、白血病和乳腺癌。
在一些方面，由本文所述的化合物和药物组合物治疗的癌症选自肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌和黑色素瘤。
在某些方面，本文所述的药物组合物被调配成用于向需要此类组合物的患者施用。本文所述的药物组合物可以经口、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或经由植入式贮器施用。如本文所使用的术语“肠胃外”包含皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内以及颅内注射或输注技术。在一些实施例中，所述组合物经口、腹膜内或静脉内施用。本文所述的药物组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域中已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来调配。
在一些方面，经口施用药物组合物。
用于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于各种因素，包含所采用的具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合和治疗医生的判断以及被治疗的特定疾病的严重程度。组合物中的本文所述的化合物的量还将取决于药物组合物中的特定化合物。
范例
化学合成
以下的代表性实例旨在帮助展示本公开，并且其不旨在也不应解释为限制本发明的范围。
2-氯-N-(异噁唑-4-基)-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酰胺(IntF)的合成
Figure BDA0003483117870000131
实验程序
2-甲氧基-3-氧代丁二酸1,4-二乙酯(Int A)的合成
Figure BDA0003483117870000141
向用氮气惰性气氛吹扫并维持的1L的3颈圆底烧瓶中放入乙醇(600mL)、乙醇钠(31.7g，0.470mmol，1.10当量)，在室温下添加草酸乙酯(68.0g，467mmol，1.10当量)。随后在室温下在搅拌的情况下逐滴地添加2-甲氧基乙酸乙酯(50.0g，423mmol，1.00当量)。将所得溶液在35℃下搅拌过1夜。在真空下浓缩所得混合物以去除大部分乙醇。在0℃下用氯化氢(1M)将溶液的pH值调节到3。将所得溶液用4×500mL的乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。这产生90g呈棕色油形式的(粗)2-甲氧基-3-氧代丁二酸1,4-二乙酯(IntA)。
2-甲氧基-2-[(4E)-1-甲基-2,5-二氧代咪唑烷-4-亚基]乙酸乙酯(Int B)的合成
Figure BDA0003483117870000142
向2L圆底烧瓶中放入2-甲氧基-3-氧代丁二酸1,4-二乙酯(Int A)(90.0g，413mmol，1.00当量)、甲脲(30.6g，413mmol，1.00当量)、乙酸(1.20L)、氯化氢(400mL，二噁烷中的4M)。将所得溶液在105℃下搅拌3小时。将所得混合物在真空下浓缩。将所得混合物用1×500ml己烷洗涤。这产生90g呈棕色固体形式的(粗)2-甲氧基-2-[(4E)-1-甲基-2,5-二氧代咪唑烷-4-亚基]乙酸乙酯(Int B)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ8.75(s,1H),7.47(s,0.4H),5.09(s,2H),4.51-4.30(m,3H),3.85(s,1H),3.84(s,3H),3.12(s,3H),3.07(s,1H),2.14(d,J＝12.9Hz,1H),1.45-1.42(m,2H),1.42-1.37(m,3H)。
2-羟基-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-羧酸(Int C)的合成
Figure BDA0003483117870000143
向2L圆底烧瓶中放入2-甲氧基-2-[(4E)-1-甲基-2,5-二氧代咪唑烷-4-亚基]乙酸乙酯(Int B)(80.0g，351mmol，1.00当量)、氢氧化钾(水中的1M)(1.40L)。将所得溶液在105℃下搅拌3小时。用水/冰浴将反应混合物冷却到0℃。在0℃下用氯化氢(12M)将溶液的pH值调节到3，通过过滤收集固体并且将沉淀物在真空下干燥。这产生40g呈白色固体形式的2-羟基-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-羧酸(Int C)(收率57％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ14.35(s,1H),10.91(s,1H),3.68(s,3H),3.14(s,3H)。
2-羟基-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-甲酸乙酯(Int D)的合成
Figure BDA0003483117870000151
向用氩气惰性气氛吹扫并维持的1L 3颈圆底烧瓶中放入2-羟基-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-羧酸(Int C)(20g，0.10mmol，1.00当量)和乙醇(400mL)。随后在0℃下在搅拌的情况下逐滴地添加乙酰氯(118g，1.50mmol，15.0当量)。将所得溶液在回流下加热过夜。将反应混合物用水/冰浴冷却。将固体通过过滤收集。这产生16g呈白色固体形式的2-羟基-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-甲酸乙酯(Int D)(收率：70％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.08(s,1H),4.32(q,J＝7.1Hz,2H),3.70(s,3H),3.15(s,3H),1.31(t,J＝7.1Hz,3H)。
2-氯-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-甲酸乙酯(Int E)的合成
Figure BDA0003483117870000152
向用氩气惰性气氛吹扫并维持的1L 3颈圆底烧瓶中放入2-羟基-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-甲酸乙酯(Int D)(16.0g，70.1mmol，1.00当量)、二甲基苯胺(1.20g，98.2mmol，1.40当量)和三氯氧磷(320.0mL)。将所得溶液在100℃下搅拌过1夜。将所得混合物在真空下浓缩。将残留物施加到硅胶柱上并用乙酸乙酯/石油醚(1/10-1/4)洗脱。这产生13.3g呈黄色固体形式的2-氯-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-甲酸乙酯(Int E)(收率77.0％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ4.32(q,J＝7.1Hz,2H),3.84(s,3H),3.54(s,3H),1.30(t,J＝7.1Hz,3H)。
2-氯-5-甲氧基-1-甲基-N-(1,2-噁唑-4-基)-6-氧代嘧啶-4-甲酰胺(Int F)的合成
Figure BDA0003483117870000161
在氩气气氛下在室温下，向2-氯-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-甲酸乙酯(IntE)(1.00g，4.05mmol，1.00当量)和1,2-噁唑-4-胺(341mg，4.05mmol，1.00当量)于甲苯(15mL)中的搅拌溶液中添加三甲基铝(甲苯中的2M)(4.1mL，8.10mmol，2.0当量)。将所得溶液在80℃下用微波辐射搅拌15分钟。将反应混合物用0℃的水/冰淬灭。将所得溶液用3×40mL的乙酸乙酯萃取，将合并的有机层用盐水(1×30mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩。将残留物施加到硅胶柱上并用乙酸乙酯/石油醚(1/10-1/1)洗脱。这产生650mg呈浅黄色固体形式的2-氯-5-甲氧基-1-甲基-N-(1,2-噁唑-4-基)-6-氧代嘧啶-4-甲酰胺(Int F)(收率53.0％)。ESI-MS m/z＝285.2[M+H]+。MW计算值:284.2 1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.84(s,1H),9.28(s,1H),8.78(s,1H),3.86(s,3H),3.62(s,3H)。
([[2-(3-氯苯基)吡啶-3-基]甲基](甲基)胺)(Int H)的合成
Figure BDA0003483117870000162
(2-(3-氯苯基)吡啶-3-甲醛)(Int G)的合成
Figure BDA0003483117870000163
向用氩气惰性气氛吹扫并维持的100mL 3颈圆底烧瓶中放入2-溴吡啶-3-甲醛(2.00g，10.7mmol，1.00当量)、3-氯苯基硼酸(2.52g，16.1mmol，1.50当量)、Pd(dppf)Cl2(236mg，0.323mmol，0.0300当量)、碳酸钾(4.46g，32.3mmol，3.00当量)、1,4-二噁烷(40.0mL)和水(8.00mL)。将所得溶液在油浴中在90℃下搅拌3小时。然后将反应通过添加10mL的水来淬灭。将所得溶液用3×30mL的乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥并且浓缩。将残留物施加到硅胶柱上并用乙酸乙酯/石油醚(1:3)洗脱。这产生1.9g呈黄色固体形式的(2-(3-氯苯基)吡啶-3-甲醛)(Int G)(收率81％)。ESI-MS m/z＝218.2[M+H]+MW计算值:217.0
使用与以上步骤中所述的那些条件类似的条件以及适当的起始材料合成以下中间体。
Figure BDA0003483117870000171
([[2-(3-氯苯基)吡啶-3-基]甲基](甲基)胺(Int H)的合成
Figure BDA0003483117870000172
向40mL小瓶中放入(2-(3-氯苯基)吡啶-3-甲醛)(Int G)(900mg，4.13mmol，1.00当量)、甲醇(20.0mL)、乙酸(0.100mL)和甲胺(在甲醇中的30％，5.00mL)。将所得溶液在室温下搅拌2小时。在0℃下将硼氢化钠(313mg，8.27mmol，2.00当量)分批添加到混合物中。将所得溶液在25℃下搅拌12小时。然后将反应通过添加5mL的水来淬灭。将所得混合物浓缩。将残留物施加到硅胶柱上并用乙酸乙酯/石油醚(1:3)洗脱。这产生700mg呈黄色半固体形式的([[2-(3-氯苯基)吡啶-3-基]甲基](甲基)胺)(Int H)(收率73％)。ESI-MS m/z＝233.2[M+H]+。MW计算值:232.1
使用与以上步骤中所述的那些条件类似的条件以及适当的起始材料合成以下中间体。
Figure BDA0003483117870000173
Figure BDA0003483117870000181
(2-氯苯基)(苯基)甲胺(Int K)的合成
Figure BDA0003483117870000182
在环境气氛下在室温下向(2-氯苯基)(苯基)甲酮(25.0g，115mmol，1.00当量)和盐酸羟胺(12.0g，173mmol，1.50当量)的搅拌溶液中分批添加乙酸钠(1.89g，231mmol，2.00当量)和乙醇(500mL)。在氮气气氛下在80℃下将所得混合物搅拌6小时。将所得混合物在减压下浓缩。将粗产物((Z)-N-[(2-氯苯基)(苯基)亚甲基]羟胺)(Int J)在不进行进一步纯化的情况下直接用于下一步骤。
在环境气氛下在0℃下向Int J((Z)-N-[(2-氯苯基)(苯基)亚甲基]羟胺)(50.0g，108mmol，1.00当量)和乙醇(250mL)以及乙酸(250mL)的搅拌溶液中分批添加锌(70.6g，1080mmol，10.0当量)。将所得混合物在氮气下在室温下搅拌4小时。将所得混合物过滤，将滤饼用乙醇洗涤。将滤液在减压下浓缩。将所得混合物用水稀释。将混合物用氢氧化钠碱化到pH 10，过滤，并且将滤饼用乙酸乙酯洗涤。将所得混合物用乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥。过滤后，将滤液在减压下浓缩。将残留物通过硅胶柱色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油洗脱以得到12.5g呈淡黄色固体形式的(1-(2-氯苯基)-1-苯基甲胺)(收率53％)。(ESI-MS m/z＝201.2[M-NH3]+。MW计算值:217.1)
使用与以上步骤中所述的那些条件类似的条件以及适当的起始材料合成以下中间体。
Figure BDA0003483117870000191
Figure BDA0003483117870000201
3-(氨基(苯基)甲基)苯甲腈(Int K5)的合成
Figure BDA0003483117870000202
向250mL圆底烧瓶中放入(S)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(4.47g，36.9mmol，1.00当量)、Ti(Oi-Pr)4(21g，74mmol，2.0当量)、二氯甲烷(90mL)。随后在0℃下逐滴地添加3-氰基苯甲醛(5.00g，38.0mmol，1.03当量)于二氯甲烷(10mL)中的溶液。将所得溶液在室温下搅拌18小时。然后将反应通过添加50mL的水来淬灭。将固体过滤掉。将所得溶液用二氯甲烷萃取并且将有机层合并。将残留物施加到使用乙酸乙酯/石油醚(2:3)的硅胶柱上。这产生5.5g呈白色固体形式的(S)-N-[(3-氰基苯基)亚甲基]-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(Int N)(63％收率)。
在氩气气氛下在-70℃下向(S)-N-[(3-氰基苯基)亚甲基]-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(Int N)(1.0g，4.0mmol，1.0当量)于THF(15.0mL)中的搅拌溶液中逐滴地添加苯基溴化镁(8.0mL，8.0mmol，2.0当量)。将所得混合物在氩气下在-30℃下搅拌2小时。在0℃下将反应用饱和氯化铵淬灭。将所得混合物用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥。过滤后，将滤液在减压下浓缩。将残留物通过硅胶柱色谱法纯化，用石油醚/乙酸乙酯(100:1～1:1)洗脱以得到1g呈棕色油形式的(S)-N-((3-氰基苯基)(苯基)甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(Int O)(收率68％)。
在室温下将Int O((S)-N-((3-氰基苯基)(苯基)甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺)(2.00g，6.09mmol，1.00当量)于含氯化氢(气体)的1,4-二噁烷(50.0mL)中的搅拌溶液搅拌。将所得混合物在室温下搅拌过夜。将沉淀的固体通过过滤收集并用乙酸乙酯洗涤。这产生1.5g呈黄色固体形式的Int K5 3-(氨基(苯基)甲基)苯甲腈盐酸盐(收率86％)。(ESI-MSm/z＝192.1[M-NH3]+。MW计算值:208.1)
(2,6-二氯苯基)(吡啶-2-基)甲胺(Int K6)的合成
Figure BDA0003483117870000211
向用氩气惰性气氛吹扫并维持的250mL 3颈圆底烧瓶中放入2-溴吡啶(5.00g，31.6mmol，1.00当量)和四氢呋喃(100mL)。随后在-78℃下在搅拌的情况下逐滴地添加正丁基锂(己烷中的2.5M)(3.58mL，55.8mmol，1.20当量)。在-78℃下在搅拌的情况下向其中逐滴地添加2,6-二氯苯甲腈(7.08g，41.1mmol，1.30当量)。将所得溶液在-78℃到-60℃下搅拌2小时。将反应在-20℃下用饱和氯化铵淬灭。将所得混合物用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将合并的有机层用水(3×50mL)洗涤，并且经无水硫酸钠干燥。过滤后，将滤液在减压下浓缩。向混合物中添加在0℃下的甲醇(100mL)、氰基硼氢化钠(9.94g，158mmol，5.00当量)、乙酸(2.85g，47.5mmol，1.50当量)。将所得溶液在室温下搅拌2小时。将反应在0℃下用水淬灭。将所得混合物用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将合并的有机层用水(1×100mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥。过滤后，将滤液在减压下浓缩。这产生3g呈深棕色油形式的Int K6(1-(2,6-二氯苯基)-1-(吡啶-2-基)甲胺)(收率37％)。(ESI-MS m/z＝252.9[M+H]+。MW计算值:252.0)
使用与以上步骤中所述的那些条件类似的条件以及适当的起始材料合成以下中间体。
Figure BDA0003483117870000212
Figure BDA0003483117870000221
N,N-二甲基-2-((甲基氨基)甲基)苯甲酰胺(Int K9)的合成
Figure BDA0003483117870000222
将2-(溴甲基)-N,N-二甲基苯甲酰胺(0.45g，1.9mmol)和甲胺于THF(4.5mL)中的1M溶液放入密封管中并且在室温下搅拌30分钟。反应完成后(由TLC监测)，将溶剂蒸发以获得粗标题化合物(0.4g)，所述粗标题化合物在不进行进一步纯化的情况下用于下一步骤。ESI-MS m/z＝193.0[M+H]+。MW计算值:192.26
使用与以上步骤中所述的那些条件类似的条件以及适当的起始材料合成以下中间体。
Figure BDA0003483117870000223
Figure BDA0003483117870000231
(2-氯苯基)(2-甲基嘧啶-5-基)甲胺(Int O)的合成
Figure BDA0003483117870000232
步骤-1：(2-氯苯基)(2-甲基嘧啶-5-基)甲醇：
将iPrMgCl.LiCl(THF中的1.3M)(180mL，234mmol)在氮气气氛下冷却到-78℃。在-78℃下向其中逐滴地添加5-溴-2-甲基嘧啶(30g，170mmol)于干燥THF(150mL)中的溶液。将反应混合物在-78℃下搅拌1.5小时。在-78℃下向此混合物中逐滴地添加2-氯苯甲醛(31.6g，225mmol)于干燥THF(150mL)中的溶液。将反应混合物温热到室温并在室温下搅拌12小时。反应完成后(通过TLC监测)，缓慢添加10％氯化铵的水溶液(1L)。将有机层分离，并将水层用乙酸乙酯(2×1L)萃取。将合并的有机层用盐水(500mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩以得到粗化合物。将粗化合物通过柱色谱法(正己烷:乙酸乙酯)纯化以得到标题化合物(8.5g，20％)。LCMS:ESI-MS m/z＝235.16[M+H]+。MW计算值:234.68
步骤-2：(2-氯苯基)(2-甲基嘧啶-5-基)甲酮：
在氮气气氛下在室温下向(2-氯苯基)(2-甲基嘧啶-5-基)甲醇(8g，34mmol)于干燥二氯甲烷(160mL)中的搅拌溶液中分批添加氯铬酸吡啶盐(8.13g，37.7mmol)。将所得反应混合物搅拌另外12小时。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物通过硅藻土床(celite-bed)过滤，用乙酸乙酯(3×100mL)洗涤，并且然后将滤液在减压下浓缩以获得粗化合物，所述粗化合物通过使用柱色谱法(正己烷:乙酸乙酯)来纯化以得到标题化合物(5g，63％)。LCMS:ESI-MS m/z＝233.16[M+H]+。MW计算值:232.67步骤-3：(2-氯苯基)(2-甲基嘧啶-5-基)甲胺：
在-78℃下向(2-氯苯基)(2-甲基嘧啶-5-基)甲酮(0.650g，2.79mmol)于甲苯(6.5mL)中的搅拌溶液中逐滴地添加TiCl4(0.742g，3.91mmol)。将反应混合物搅拌15分钟。在-78℃下向反应中鼓充NH3(g)并且将反应在室温下搅拌过夜。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物通过硅藻土床过滤，用乙酸乙酯(3×30mL)洗涤。将合并的滤液在减压下浓缩。将所获得的粗标题化合物在不进行进一步纯化的情况下用于下一步骤(0.5g)。LCMS:ESI-MS m/z＝232.10[M+H]+。MW计算值:231.68
步骤-4：(2-氯苯基)(2-甲基嘧啶-5-基)甲胺(Int K12)：
向(2-氯苯基)(2-甲基嘧啶-5-基)甲胺(0.5g，2mmol)于甲醇(5mL)中的搅拌溶液中添加乙酸(0.2g)中并且将反应混合物搅拌15分钟。向其中添加氰基硼氢化钠(0.204g，3.24mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌另外3小时。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物在乙酸乙酯(2×30mL)中稀释并且用饱和碳酸氢钠溶液(3×20mL)洗涤，随后用盐水(20mL)洗涤。将有机层分离，经硫酸钠干燥并且蒸发到干燥以得到粗化合物。使用含碱性氧化铝的二氯甲烷:MeOH通过柱色谱法纯化获得的粗化合物：以获得纯标题化合物(0.30g，46％(2个步骤))。LCMS:ESI-MS m/z＝234.10[M+H]+。MW计算值:233.70。
4-苯甲酰基-3-氯-N,N-二甲基苯甲酰胺(Int L2)的合成
Figure BDA0003483117870000241
步骤-1：4-溴-2-氯-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺：
在0℃下向4-溴-2-氯苯甲酸(5.0g，21.23mmol)于干燥DMF(50mL)中的搅拌溶液中添加N,O-二甲基羟胺盐酸盐(2.48g，25.5mmol)，随后添加HATU(12.10g，31.85mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时。向混合物中在0℃下逐滴添加DIPEA(10.95mL，63.70mmol)并且所得反应混合物在室温下搅拌4小时。反应完成后(通过TLC监测)，将水(250ml)缓慢添加并且用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。将合并的有机层用盐水(200mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩。将粗化合物通过柱色谱法纯化以产生纯标题化合物(5.0g，84％)。LCMS:ESI-MS m/z＝280.1[M+2H]+。MW计算值:278.53
步骤-2：(4-溴-2-氯苯基)(苯基)甲酮：
在-78℃下向4-溴-2-氯-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(5.1g，18.31mmol)于干燥THF(50mL)中的搅拌溶液中添加苯基溴化镁(27.5mL，THF中的1M，27.5mmol)。使反应混合物达到室温并搅拌16小时。反应完成后(通过TLC监测)，缓慢添加饱和氯化铵(100mL)并且将反应混合物用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。将合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩。将粗化合物通过柱色谱法纯化以产生纯标题化合物(3.53g，65％)。LCMS:ESI-MS m/z＝297.3[M+2H]+。MW计算值:295.5。
步骤-3：4-苯甲酰基-3-氯苯甲酸甲酯：
在氮气气氛下将(4-溴-2-氯苯基)(苯基)甲酮(3.0g，10mmol)于MeOH(60mL)中的溶液放入钢压力反应器中。向其中添加乙酸钠(2.41g，29.4mmol)、Pd(OAc)2(0.227g，1.01mmol)和PdCl2(dppf)(0.741g，1.01mmol)。向容器中填充CO气体到约150PSI压力并且将反应混合物在室温下搅拌16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物通过硅藻土床过滤并且用甲醇(2×60mL)洗涤。将滤液浓缩，并且将粗化合物通过柱色谱法纯化以产生纯标题化合物(1.8g，64％)。LCMS:ESI-MS m/z＝275.1[M+H]+。MW计算值:274.70
步骤-4：4-苯甲酰基-3-氯-N,N-二甲基苯甲酰胺：
在室温下向4-苯甲酰基-3-氯苯甲酸甲酯(1.8g，6.55mmol)于甲醇:THF:水(1:1:1，48mL)中的搅拌溶液中添加氢氧化钠(0.314g，7.86mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物在减压和与二氯甲烷(3×10mL)的共沸混合物下浓缩。将反应混合物在高真空下干燥以得到4-苯甲酰基-3-氯苯甲酸钠盐(1.8g粗品，97％)。LCMS:ESI-MS m/z＝259.1[M-H]+。MW计算值:260.67
在室温下向上述制备的4-苯甲酰基-3-氯苯甲酸钠盐(1.8g，6.4mmol)于干燥DMF(20mL)中的搅拌溶液中添加HATU(3.63g，9.55mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。向上述溶液中逐滴地添加DIPEA(3.29mL，19.1mmol)，随后在室温下添加二甲胺(0.52mL，9.55mmol)。使反应混合物在室温下搅拌4小时。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物用水(100mL)稀释并且将水层用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩。将粗产物通过柱色谱法纯化以得到标题化合物(0.60g，31％)。LCMS:ESI-MS m/z＝288.3[M+H]+。MW计算值:287.74
一般程序：
Figure BDA0003483117870000261
2-(二苄基氨基)-5-乙氧基-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酸乙酯(1)的合成
Figure BDA0003483117870000262
将2-氯-5-乙氧基-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酸乙酯(130mg，498μmol)、氟化铯(76mg，498μmol)和二苄胺(196mg，996μmol)在室温下溶解在DMSO(498μL)中并且将反应在100℃下搅拌2小时。将粗反应混合物直接在10g反相柱上纯化以得到130mg的2-(二苄基氨基)-5-乙氧基-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酸乙酯(A1)，收率为62.2％。MW计算值:421.497；ESI-MS m/z＝422.2[M+H]+。
使用与以上步骤中所述的那些条件类似的条件以及适当的起始材料合成以下中间体。
Figure BDA0003483117870000263
Figure BDA0003483117870000271
Figure BDA0003483117870000281
Figure BDA0003483117870000291
Figure BDA0003483117870000301
Figure BDA0003483117870000311
2-(苄基(甲基)氨基)-5-乙氧基-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酸乙酯(A6)的合成：
Figure BDA0003483117870000312
将2-氯-5-乙氧基-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酸乙酯(0.400g，1.53mmol)、N-甲基-1-苯基甲胺(0.371g，3.06mmol)于干燥DMSO(4ml)中的混合物在110℃下加热3小时。将反应混合物冷却到室温并且倒入冰冻水的混合物(50mL)中。将反应混合物用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。将粗化合物通过快速色谱法纯化以得到纯标题化合物(0.30g，56％)。MW计算值:345.4。ESI-MS m/z＝346.2[M+H]+
使用与以上步骤中所述的那些条件类似的条件以及适当的起始材料合成以下中间体。
Figure BDA0003483117870000313
Figure BDA0003483117870000321
Figure BDA0003483117870000331
Figure BDA0003483117870000341
Figure BDA0003483117870000351
2-(((2-氯苯基)(2-甲基嘧啶-5-基)甲基)氨基)-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酸乙酯(A55)的合成
Figure BDA0003483117870000361
2-(((2-氯苯基)(2-甲基嘧啶-5-基)甲基)氨基)-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酸乙酯：
向(2-氯苯基)(2-甲基嘧啶-5-基)甲胺(0.2g，0.85mmol)和2-氯-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酸乙酯(0.211g，0.85mmol)于DMSO(2mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.332g，2.57mmol)并且将反应混合物在100℃下加热3小时。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物用乙酸乙酯(40mL)稀释，用冷水(3×30mL)和盐水(30mL)洗涤。将有机层分离，经硫酸钠干燥并且蒸发到干燥以得到粗化合物。将获得的粗品通过使用正己烷柱:乙酸乙酯的柱色谱法纯化以获得标题化合物(0.32g，84％)。LCMS:ESI-MS m/z＝444.30[M+H]+。MW计算值:443.89
使用与以上步骤中所述的那些条件类似的条件以及适当的起始材料合成以下中间体。
Figure BDA0003483117870000362
Figure BDA0003483117870000371
2-(([1,1'-联苯]-2-亚甲基)(甲基)氨基)-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酸乙酯(A18)的合成
Figure BDA0003483117870000381
向用氩气惰性气氛吹扫并维持的40mL小瓶中放入2-[[(2-溴苯基)甲基](甲基)氨基]-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-甲酸乙酯(A4)(500mg，1.22mmol，1.00当量)、苯基硼酸(223mg，1.83mmol，1.50当量)、Pd(dppf)Cl2(26.8mg，0.0370mmol，0.03当量)、碳酸钾(505mg，3.65mmol，3.00当量)、1,4-二噁烷(7.00mL)和水(1.40mL)。将所得溶液在油浴中在95℃下搅拌12小时。将固体通过过滤去除。将所得混合物浓缩。将残留物施加到硅胶柱上并用乙酸乙酯/石油醚(1:3)洗脱。这产生440mg呈黄色油形式的(2-([[1,1'-联苯]-2-亚甲基](甲基)氨基)-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-甲酸乙酯)(A18)(收率88％)。MW计算值:407.2。ESI-MS m/z＝408.3[M+H]+
使用与以上步骤中所述的那些条件类似的条件以及适当的起始材料合成以下中间体。
Figure BDA0003483117870000382
Figure BDA0003483117870000391
2-[(二苯甲基)(甲基)氨基]-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-甲酸乙酯(A29-2)的合成
Figure BDA0003483117870000392
在室温下经4小时向2-[(二苯甲基)氨基]-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-甲酸乙酯(4.2g，10.7mmol，1.00当量)和碳酸铯(7.0g，21.4mmol，2当量)于N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中的搅拌混合物中分批添加碘甲烷(4.6g，32.1mmol，3.00当量)。将所得混合物用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥。过滤后，将滤液在减压下浓缩。将残留物施加到使用乙腈/水(0.1％FA)(4:1)的反相柱上。这产生3.1g呈黄色固体形式的2-[(二苯甲基)(甲基)氨基]-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-甲酸乙酯(A29-2)(收率66％)。ESI-MS m/Z＝408.3[M+H]+MW计算值:407.1
使用与以上步骤中所述的那些条件类似的条件以及适当的起始材料合成以下中间体。
Figure BDA0003483117870000393
Figure BDA0003483117870000401
Figure BDA0003483117870000411
Figure BDA0003483117870000421
Figure BDA0003483117870000431
Figure BDA0003483117870000441
O-甲基羟基嘧啶酮酯的手性分离
Figure BDA0003483117870000451
将800mg的PH-CON-395-3(2-[[(2-氯苯基)(苯基)甲基](甲基)氨基]-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-甲酸乙酯)的外消旋体通过制备手性HPLC在以下条件(柱：CHIRALPAK IC SFC(02)，5*25cm，5um；流动相A：CO2，流动相B：IPA(2mM NH3-MeOH)；流速：1.80毫升/分钟；梯度：50％B；220nm；异构体1的保留时间：6.15分钟，异构体2的保留时间：7.55分钟；注射体积：5mL运行次数：16)下纯化。
在6.15分钟时分离左峰产生360mg呈白色固体形式的A30-2异构体1(2-[[(2-氯苯基)(苯基)甲基](甲基)氨基]-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-甲酸乙酯)。
在7.55分钟时分离右峰产生360mg呈白色固体形式的A30-2异构体2(2-[[(2-氯苯基)(苯基)甲基](甲基)氨基]-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-甲酸乙酯)。
使用与以上所述的那些条件类似的条件分离以下中间体。
Figure BDA0003483117870000452
Figure BDA0003483117870000461
Figure BDA0003483117870000471
2-(((2-氰基苯基)(苯基)甲基)(甲基)氨基)-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酸乙酯(A57-3)的合成
Figure BDA0003483117870000472
2-(((2-氰基苯基)(苯基)甲基)(甲基)氨基)-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酸乙酯：
将2-(((2-溴苯基)(苯基)甲基)(甲基)氨基)-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酸乙酯(0.47g，0.96mmol)溶解于DMF(4.7mL)中并且将氰化铜(I)(0.26g，2.9mmol)添加到溶液中。将反应混合物加热到150℃，持续16小时。反应完成后(由TLC监测)，将反应混合物用水淬灭，在乙酸乙酯(3×30mL)中萃取，经硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗化合物。将获得的粗化合物通过使用正己烷:乙酸乙酯的柱色谱法纯化以获得纯标题化合物(0.30g，71％)。LCMS:ESI-MS m/z＝433.19[M+H]+。MW计算值:432.48
使用与以上步骤中所述的那些条件类似的条件以及适当的起始材料合成以下中间体。
Figure BDA0003483117870000481
2-(二苄基氨基)-5-乙氧基-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-羧酸(B1)的合成
Figure BDA0003483117870000482
在室温下将2-(二苄基氨基)-5-乙氧基-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酸乙酯(130mg，308μmol)和氢氧化锂(14.7mg，616μmol)于THF(1.5mL)和水(0.75mL)中的搅拌溶液搅拌3小时。将所得混合物在真空下浓缩，并且将粗品B1直接用于下一步骤。MW计算值:393.4ESI-MS m/z＝394.2[M+H]+。
使用与以上步骤中所述的那些条件类似的条件以及适当的起始材料合成以下中间体。
Figure BDA0003483117870000483
Figure BDA0003483117870000491
Figure BDA0003483117870000501
Figure BDA0003483117870000511
Figure BDA0003483117870000521
Figure BDA0003483117870000531
Figure BDA0003483117870000541
(2-[苄基(乙基)氨基]-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-羧酸)(B13)的合成
Figure BDA0003483117870000542
在氩气气氛在0℃下向(2-[苄基(乙基)氨基]-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-甲酸乙酯)(A2)(1.00g，2.89mmol，1.00当量)于四氢呋喃(10.0mL)/水(2.00mL)中的搅拌混合物中分批添加单水氢氧化锂(0.610g，14.5mmol，5.02当量)。将所得混合物在氩气气氛下在室温下搅拌2小时。将混合物用氯化氢(水溶液)酸化到pH 5。将所得混合物在减压下浓缩以得到1g的(2-[苄基(乙基)氨基]-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代吡啶碘-4-羧酸)(B13)(收率100％)。将粗产物在不进行进一步纯化的情况下直接用于下一步骤。ESI-MS m/z＝318.3[M+H]+MW计算值:317.3
使用与以上步骤中所述的那些条件类似的条件以及适当的起始材料合成以下中间体。
Figure BDA0003483117870000551
Figure BDA0003483117870000561
Figure BDA0003483117870000571
Figure BDA0003483117870000581
Figure BDA0003483117870000591
Figure BDA0003483117870000601
Figure BDA0003483117870000611
2-(二苄基氨基)-5-乙氧基-N-(异噁唑-4-基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酰胺(C1)
Figure BDA0003483117870000612
将2-(二苄基氨基)-5-乙氧基-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-羧酸(B1)(121mg，307μmol)和HATU(233mg，614μmol)在DMF(3mL)中合并并且搅拌15分钟，随后依次添加1,2-噁唑-4-胺盐酸盐(74.0mg，614μmol)，随后添加三乙胺(128μL，921μmol)。然后将此混合物在RT下搅拌0.5小时。将反应混合物通过反相色谱法来直接纯化，以得到107mg的2-(二苄基氨基)-5-乙氧基-N-(异噁唑-4-基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酰胺(C1)，收率为76％。MW计算值:459.5ESI-MS m/z＝460.2[M+H]+。
使用与以上步骤中所述的那些条件类似的条件以及适当的起始材料合成以下中间体。
Figure BDA0003483117870000621
Figure BDA0003483117870000631
Figure BDA0003483117870000641
Figure BDA0003483117870000651
Figure BDA0003483117870000661
Figure BDA0003483117870000671
Figure BDA0003483117870000681
Figure BDA0003483117870000691
Figure BDA0003483117870000701
Figure BDA0003483117870000711
Figure BDA0003483117870000721
Figure BDA0003483117870000731
Figure BDA0003483117870000741
Figure BDA0003483117870000751
O-甲基羟基嘧啶酮酰胺的手性分离
Figure BDA0003483117870000752
将化合物C52的两种对映异构体通过手性HPLC使用CHIRAL ART纤维素-SB柱(0.46*10cm，3um)使用70比30的比率的正己烷(0.1％二乙胺)和乙醇作为洗脱液在1.0毫升/分钟的流速和环境温度下分离。C52异构体1在3.98分钟处洗脱(优对映体)并且C52在4.71分钟处洗脱(劣对映体)。
使用与以上所述的那些条件类似的条件分离以下中间体。
Figure BDA0003483117870000761
Figure BDA0003483117870000771
Figure BDA0003483117870000781
Figure BDA0003483117870000791
Figure BDA0003483117870000801
Figure BDA0003483117870000811
Figure BDA0003483117870000821
Figure BDA0003483117870000831
2-(二苄基氨基)-5-乙氧基-N-(异噁唑-4-基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酰胺(C17)的合成
Figure BDA0003483117870000832
在氩气气氛下向B13(2-[苄基(乙基)氨基]-5-甲氧基-1-甲基-6-氧代嘧啶-4-羧酸)(1.00g，3.15mmol，1.00当量)、1,2-噁唑-4-胺(0.530g，6.30mmol，2.00当量)于N,N-二甲基甲酰胺中的搅拌混合物中分批添加1-甲基-1H-咪唑(0.780g，9.45mmol，3.00当量)。将所得混合物在氩气气氛下在室温下搅拌0.5分钟。在0℃下经0.5分钟向上述混合物中分批添加双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(2.26g，4.73mmol，1.50当量)。将所得混合物在室温下另外搅拌2小时并且过滤，将滤饼用乙腈洗涤。将滤液在减压下浓缩。将残留物通过硅胶柱色谱法纯化，用石油醚/乙酸乙酯(100:1～1:1)洗脱以得到600mg呈黄色固体形式的C17(2-[苄基(乙基)氨基]-5-甲氧基-1-甲基-N-(1,2-噁唑-4-基)-6-氧代嘧啶-4-甲酰胺)(收率50％)。ESI-MS m/z＝384.4[M+H]+。MW计算值:383.2。
N-(异噁唑-4-基)-5-甲氧基-1-甲基-2-(甲基(萘-1-基甲基)氨基)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酰胺(C18)的合成
Figure BDA0003483117870000841
向40mL密封管中放入(2-氯-5-甲氧基-1-甲基-N-(1,2-噁唑-4-基)-6-氧代嘧啶-4-甲酰胺)(Int F)(300mg，1.05mmol，1.00当量)、甲基(萘-1-基甲基)胺(217mg，1.26mmol，1.20当量)、乙腈(6.00mL)、三乙胺(0.440mL，4.34mmol，3.00当量)。将所得溶液在50℃下搅拌2小时。将残留物施加到使用乙腈/水(0.1％甲酸)(1:1)作为洗脱液的反相柱上。这产生110mg呈橙色固体形式的5-甲氧基-1-甲基-2-[甲基(萘-1-基甲基)氨基]-N-(1,2-噁唑-4-基)-6-氧代嘧啶-4-甲酰胺(C18)(收率24％)。MW计算值:419.2ESI-MS m/z＝420.2[M+H]+。
使用与以上步骤中所述的那些条件类似的条件以及适当的起始材料合成以下中间体。
Figure BDA0003483117870000842
(2-氯-5-甲氧基-1-甲基-N-(1,2-噁唑-4-基)-6-氧代嘧啶-4-甲酰胺(C20)的合成
Figure BDA0003483117870000851
向40mL小瓶中添加(2-氯-5-甲氧基-1-甲基-N-(1,2-噁唑-4-基)-6-氧代嘧啶-4-甲酰胺)(Int H)(420mg，1.48mmol，1.00当量)、([[2-(3-氯苯基)吡啶-3-基]甲基](甲基)胺)(C20)(687mg，2.95mmol，2.00当量)、氟化铯(672mg，4.43mmol，3.00当量)、N,N-二甲基甲酰胺(15.0mL)。将所得溶液在油浴中在80℃下搅拌12小时。将固体过滤掉。将粗产物通过制备型HPLC在以下条件(IntelFlash-1)下纯化：柱，C18硅胶；流动相，CH3CN/H2O/甲酸＝10/90增加到CH3CN/H2O/甲酸＝50/50；检测器，254nm。这产生300mg呈黄色半固体形式的(2-([[2-(3-氯苯基)吡啶-3-基]甲基](甲基)氨基)-5-甲氧基-1-甲基-N-(1,2-噁唑-4-基)-6-氧代嘧啶-4-甲酰胺)(C20)(收率42％)。ESI-MS m/z＝481.2[M+H]+。MW计算值:480.1
使用与以上步骤中所述的那些条件类似的条件以及适当的起始材料合成以下中间体。
Figure BDA0003483117870000852
Figure BDA0003483117870000861
Figure BDA0003483117870000871
2-((1-乙酰基哌啶-4-基)(甲基)氨基)-5-乙氧基-N-(异噁唑-4-基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酰胺(C64-2)的合成
Figure BDA0003483117870000872
在氮气气氛下在0℃下向4-((5-乙氧基-4-(异噁唑-4-基氨基甲酰基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-2-基)(甲基)氨基)哌啶-1-甲酸叔丁基酯(0.2g，0.42mmol)于二氯甲烷(2mL)中的冰冷溶液中逐滴地添加TFA(0.6mL)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物浓缩以得到粗化合物。将粗化合物用正己烷(4×1mL)研磨并且将所获得的固体在真空下干燥以得到纯标题化合物(0.216g)。LCMS:ESI-MS m/z＝377.6[M+H]+。MW计算值:476.42
在氮气气氛下在0℃下向5-乙氧基-N-(异噁唑-4-基)-1-甲基-2-(甲基(哌啶-4-基)氨基)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酰胺的TFA盐(0.22g，0.44mmol)于二氯甲烷(10.8mL)中的冰冷溶液中添加三乙胺(0.112g，1.10mmol)。在0℃下向上述反应混合物中逐滴地添加乙酰氯(0.038g，0.48mmol)。将反应混合物在0℃下进一步搅拌2小时。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物浓缩以得到粗产物。将粗产物通过使用正己烷:乙酸乙酯的柱色谱法进行纯化以得到纯标题化合物(0.15g，87％)(2个步骤)。
LCMS:ESI-MS m/z＝417.6[M-H]+。MW计算值:418.45
2-(二苄基氨基)-5-乙氧基-N-(异噁唑-4-基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酰胺(实例1)的合成
Figure BDA0003483117870000881
在氩气气氛下在-60℃下向2-(二苄基氨基)-5-乙氧基-1-甲基-N-(1,2-噁唑-4-基)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酰胺(C1)(91mg，0.20mmol)于二氯甲烷(1.32mL)中的搅拌溶液中逐滴地添加三溴化硼(990μL，990μmol)。将所得混合物在-30℃下搅拌40分钟并且然后用1.5mL甲醇在-30℃下淬灭。将所得混合物用2mL的甲苯稀释。将溶剂在减压下去除。将所得残留物通过反相色谱法纯化以得到11.8mg的2-(二苄基氨基)-5-乙氧基-N-(异噁唑-4-基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酰胺(实例1)，收率为13％。MW计算值:431.4ESI-MS m/z＝432.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝11.30-11.02(m,1H),10.52-10.27(m,1H),9.29(s,1H),8.91(s,1H),7.46-7.16(m,10H),4.36(s,4H),3.58(s,3H)
Figure BDA0003483117870000882
Figure BDA0003483117870000891
Figure BDA0003483117870000901
Figure BDA0003483117870000911
Figure BDA0003483117870000921
Figure BDA0003483117870000931
2-(苄基(乙基)氨基)-5-羟基-N-(异噁唑-4-基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-甲酰胺(实例13)的合成
Figure BDA0003483117870000932
在室温下向40mL小瓶中添加2-[苄基(乙基)氨基]-5-甲氧基-1-甲基-N-(1,2-噁唑-4-基)-6-氧代嘧啶-4-甲酰胺(C17)(100mg，0.261mmol，1.00当量)和含溴化锂(340mg，3.91mmol，15.0当量)的N,N-二甲基甲酰胺(5.00mL)。将所得混合物在氩气气氛下在95℃下搅拌过夜。将粗产物通过制备型HPLC在以下条件(柱：XSelect CSH Prep C18OBD柱，5um，19*150mm；流动相A：水(0.05％三氟乙酸)，流动相B：乙腈；流速：25毫升/分钟；梯度：在8分钟内40B到55B；254/220nm)下纯化，以得到60mg呈白色固体形式的2-[苄基(乙基)氨基]-5-羟基-1-甲基-N-(1,2-噁唑-4-基)-6-氧代嘧啶-4-甲酰胺(实例13)(收率62％)。ESI-MS m/z＝370.1[M+H]+。MW计算值:369.1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.19(s,1H),10.46(s,1H),9.31(s,1H),8.94(s,1H),7.40–7.38(m,2H),7.33–7.31(m,2H),7.29–7.20(m,1H),4.46(s,2H),3.48(s,3H),3.17(q,J＝7.0Hz,2H),1.13(t,J＝7.0Hz,3H)。
使用与以上步骤中所述的那些条件类似的条件以及适当起始材料合成以下实例。
Figure BDA0003483117870000941
Figure BDA0003483117870000951
Figure BDA0003483117870000961
Figure BDA0003483117870000971
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Figure BDA0003483117870001101
Figure BDA0003483117870001111
生物化学分析
1.使肿瘤细胞中的TREX1沉默
在感测胞质DNA和随后的I型IFN产生后，cGAS/STING途径的激活可以在肿瘤细胞和先天性免疫细胞，特别是树突状细胞中发生。为了评估TREX1是否通过一种充分描述的在通过STING激动剂激活I型IFN后会经历免疫介导的排斥的冷同基因型肿瘤模型来阻止I型IFN的产生，使用CRISPR在B16F10肿瘤细胞中将TREX1敲低(图1A)。通过肿瘤细胞的DNA转染积累胞质DNA使得相对于亲本肿瘤细胞，TREX1敲除B16F10细胞的IFNβ产生增加约5倍，这表明TREX1减弱B16F10肿瘤细胞中cGAS/STING途径的激活(图1B)。
2.TREX1胜任型和缺陷型B16F10肿瘤细胞在体内的生长
评估了TREX1胜任型和缺陷型B16F10肿瘤细胞在体内的生长。将C57BL/6J小鼠在右胁腹皮下接种300,000个亲本或TREX1敲除的B16F10肿瘤细胞。每周收集体重两次，并且每周进行肿瘤测量两到三次，在肿瘤变得可测量时开始并且在研究的剩余持续时间内持续。与亲本B16F10肿瘤相比，TREX1被沉默的肿瘤呈现显著更小的体积(图2)。
在研究终止后的第19天采集肿瘤，并且消化成单细胞悬浮液以使得能够进行肿瘤浸润的免疫群体的流式细胞术定量。发现TREX1敲除B16F10肿瘤表现出总体免疫细胞的显著增加，这反映肿瘤浸润CD4和CD8 T细胞以及浆细胞样树突状细胞(pDC)数量的增加(图3)。已知pDC在诱导抗原特异性抗肿瘤免疫应答中起核心作用，而已知T细胞是小鼠和人类中抗肿瘤功效的主要效应物。因此，缺乏TREX1的肿瘤的免疫浸润的深刻变化表明对后者肿瘤生长的抑制至少部分是免疫介导的。
TREX1生物化学测定
通过荧光测定评估化合物效力，所述荧光测定测量在相对链上具有荧光团-淬灭剂对的定制dsDNA底物的降解。dsDNA的降解会释放游离荧光团以产生荧光信号。具体地，将7.5μL的含在N端带His-Tev标签的全长人TREX1(在大肠杆菌(E.coli)中表达并在内部纯化)的反应缓冲液(50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，2mM DTT，0.1mg/mL BSA，0.01％(v/v)吐温-20和100mM MgCl2)添加到已经含有DMSO中的不同浓度的化合物(150nL)作为10点剂量应答的384孔Black ProxiPlate Plus(珀金埃尔默(Perkin Elmer))中。向其中添加7.5μL的含dsDNA底物(链A：5'TEX615/GCT AGG CAG 3'；链B：5'CTG CCT AGC/IAbRQSp(集成DNA技术(Integrated DNA Technologies)))的反应缓冲液。最终浓度为具有1.0％DMSO(v/v)的反应缓冲液中的150pM TREX1、60nM dsDNA底物。在室温下25分钟之后，通过添加5μL终止缓冲液(与反应缓冲液加200mM EDTA相同)来将反应淬灭。淬灭反应中的最终浓度为20μL体积中的112.5pM TREX1、45nM DNA和50mM EDTA。在室温下温育5分钟后，在激光源Envision(珀金埃尔默)中对板进行读取，在用570nm光激发后测量615nm处的荧光。通过使用非线性最小二乘四参数拟合和Genedata或GraphPad Prism(GraphPad软件公司(GraphPadSoftware,Inc.))将在615nm下测得的荧光相对于用终止缓冲液预淬灭的对照孔(100％抑制)和无抑制剂(0％抑制)对照的比率进行比较来计算IC50值。
TREX2生物化学测定
通过荧光测定评估化合物效力，所述荧光测定测量在相对链上具有荧光团-淬灭剂对的定制dsDNA底物的降解。dsDNA的降解会释放游离荧光团以产生荧光信号。具体地，将7.5μL的含在N端带His-Tev标签的人TREX2(残基M44-A279，在大肠杆菌中表达并在内部纯化)的反应缓冲液(50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，2mM DTT，0.1mg/mL BSA，0.01％(v/v)吐温-20和100mM MgCl2)添加到已经含有DMSO中的不同浓度的化合物(150nL)作为10点剂量应答的384孔Black ProxiPlate Plus(珀金埃尔默)中。向其中添加7.5μL的含dsDNA底物(链A：5'TEX615/GCT AGG CAG 3'；链B：5'CTG CCT AGC/IAbRQSp(IDT)的反应缓冲液。最终浓度为具有1.0％DMSO(v/v)的反应缓冲液中的2.5nM TREX2、60nM dsDNA底物。在室温下25分钟之后，通过添加5μL终止缓冲液(与反应缓冲液加200mM EDTA相同)来将反应淬灭。淬灭反应混合物中的最终浓度为20μL体积中的1.875pM TREX2、45nM DNA和50mM EDTA。在室温下温育5分钟后，在激光源Envision(珀金埃尔默)中对板进行读取，在用570nm光激发后测量615nm处的荧光。通过使用非线性最小二乘四参数拟合和Genedata或GraphPad Prism(GraphPad软件公司)将在615nm下测得的荧光相对于用终止缓冲液预淬灭的对照孔(100％抑制)和无抑制剂(0％抑制)对照的比率进行比较来计算IC50值。
结果示出在表1中。TREX1 IC50：A＝<0.1μM；B＝0.1到1μM；C＝1到10μM；D＝>10μM。TREX2 IC50：A＝<1μM，B＝1到10μM，C＝10到100μM，D＝>100μM。
表1
Figure BDA0003483117870001131
Figure BDA0003483117870001141
Figure BDA0003483117870001151
HCT116细胞测定
HCT116双细胞(美国加利福尼亚圣地亚哥的因维沃根公司(Invivogen,SanDiego,CA,USA))源自人类HCT116结直肠癌细胞系。已选择用于稳定整合SEAP和荧光素酶报告基因的细胞，其表达分别受NF-KB/AP1和STAT1/STAT2的5个串联应答元件控制。细胞系用于通过测量培养基中分泌的Lucia荧光素酶的活性来监测I型干扰素诱导和后续信号传导。
将HCT116细胞以40,000个细胞/孔铺敷在96孔板中的补充有10％FBS和25mMHepes(pH 7.2–7.5)的100uL DMEM中。在静置过夜之后，根据产品手册建议，在将1.25ug/mLpBR322/BstNI限制性酶切消化(美国马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室(NewEngland Biolabs,Ipswich,MA,USA))用Lipofectamine LTX(美国纽约格兰德岛的赛默飞世尔(ThermoFisher,Grand Island,NY,USA))转染之前，将细胞用TREX1i处理4小时(最大DMSO分数为0.1％)。简而言之，将Lipofectamine LTX(0.4uL/孔)在OptiMEM(5uL/孔)中稀释。在添加Plus试剂(0.1uL/100ng DNA)之前，将pBR322/BstNI(100ng/孔)在OptiMEM(5uL/孔)中稀释。在室温下温育5分钟后，将DNA混合物与稀释的Lipofectamine LTX滴加混合。在另外温育10分钟后，将转染混合物(10uL/孔)添加到细胞中。在从细胞培养基中监测Lucia荧光素酶活性之前，将细胞维持在37℃下48小时。通过在Genedata Screener或GraphPadPrism(GraphPad软件公司)中使用非线性最小二乘四参数拟合将测得的发光相对于10uM化合物39(100％抑制)和无抑制剂(0％抑制)对照进行比较来计算EC50值。
结果示出在表1中。TREX1 IC50：A＝<1.0μM；B＝1.0到10μM；C＝10到100μM
表2
Figure BDA0003483117870001161
Figure BDA0003483117870001171
虽然已经描述了多个实施例，但显而易见的是，可以改变本发明的基础实例以提供利用本发明的化合物和方法的其它实施例。因此，应理解本发明的范围应由随附权利要求书而不是通过举例表示的具体实施例进行限定。
在整个本申请中引用的所有参考文献(包含文献参考、授予的专利、公开的专利申请以及共同待决专利申请)的内容特此以全文引用的方式明确地并入本文。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均与本领域的普通技术人员通常已知的含义一致。

Claims (33)

1.一种化合物，其具有式I：
Figure FDA0003483117860000011
或其药学上可接受的盐，其中：
R1是氢、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、3元到4元环烷基、-ORf、-SRf或-NReRf；
R2是氢、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基或3元到4元环烷基；
R3是氢或任选地被苯基取代的(C1-C4)烷基，其中所述苯基任选地被选自卤素、(C1-C4)烷基和卤代(C1-C4)烷基的1到3个基团取代；
R4是氢或(C1-C4)烷基；
R5是氢、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、苯基或任选地被苯基或-NHC(O)ORa取代的(C1-C4)烷基，其中所述苯基中的每一个任选地且独立地被选自卤素、(C1-C4)烷基和卤代(C1-C4)烷基的1到3个基团取代；
x是0、1或2；
环A是芳基、杂芳基、杂环基或环烷基，所述芳基、杂芳基、杂环基或环烷基中的每一个任选地且独立地被选自R6的1或2个基团取代；
R6是(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷氧基、卤素、苯基、-CN、-NHC(O)ORa、-NHC(S)ORa、-C(O)Rb、-NHC(O)NHRg、-NHC(S)NHRg、-NHS(O)2NHRg、-C(S)Rb、-S(O)2Rc、-S(O)Rc、-C(O)ORd、-C(S)ORd、-C(O)NReRf、-C(S)NHRe、-NHC(O)Rd、-NHC(S)Rd、-ORe、-SRe、-O(C1-C4)烷基ORe、-NReRf、4元到6元杂芳基或4元到7元杂环基，其中
-用于R6的所述苯基任选地被选自Rg的1或2个基团取代；
-用于R6的所述(C1-C4)烷基任选地被选自ORh、-NRjRk、苯基和5元到6元杂芳基的1或2个基团取代；并且
-用于R6的所述4元到7元杂环基和4元到6元杂芳基各自任选地且独立地被选自Rm的1或2个基团取代；并且
其中针对R6中的(C1-C4)烷基所列出的任选取代基的所述苯基和5元到6元杂芳基各自任选地且独立地被选自Rg的1或2个基团取代；
Rg、Rh、Rj、Rk和Rm各自独立地是氢、卤素、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、苯基、-(C1-C4)烷基苯基、3元到4元环烷基、4元到6元杂芳基或4元到7元杂环基，并且其中用于Rg、Rh、Rj和Rk的所述4元到7元杂环基进一步任选地被＝O取代；
Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf各自独立地是氢、卤素、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、苯基、3元到4元环烷基、4元到6元杂芳基或4元到7元杂环基，其中
-用于Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf的所述(C1-C4)烷基任选地被选自苯基、–ORh、-NRjRk的1或2个基团取代；
-用于Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf的所述苯基、4元到6元杂芳基和4元到7元杂环基各自任选地且独立地被选自Rg的1或2个基团取代；并且
-用于Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf的所述4元到7元杂环基进一步任选地被＝O取代。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式II：
Figure FDA0003483117860000021
或其药学上可接受的盐。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R2是(C1-C4)烷基。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式III：
Figure FDA0003483117860000022
或其药学上可接受的盐。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的化合物，其中R3是任选地被苯基取代的(C1-C4)烷基。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的化合物，其中R3是(C1-C4)烷基。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式IV：
Figure FDA0003483117860000031
或其药学上可接受的盐。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式V：
Figure FDA0003483117860000032
或其药学上可接受的盐。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的化合物，其中x是0或1。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的化合物，其中R5是氢、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、苯基或任选地被苯基或-NHC(O)ORa取代的(C1-C4)烷基。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的化合物，其中R5是氢、苯基或任选地被苯基或-NHC(O)ORa取代的(C1-C4)烷基。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的化合物，其中Ra是(C1-C4)烷基。
13.根据权利要求1到10中任一项所述的化合物，其中R5是环烷基或苯基，其中所述苯基任选地被选自卤素、(C1-C4)烷基和卤代(C1-C4)烷基的1到3个基团取代。
14.根据权利要求1到10中任一项所述的化合物，其中R5是环丙基。
15.根据权利要求1到10中任一项所述的化合物，其中R5是任选地被选自卤素和(C1-C4)烷基以及卤代(C1-C4)烷基的1到2个基团取代的苯基。
16.根据权利要求1到10中任一项所述的化合物，其中R5是任选地被1到2个卤素取代的苯基。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的化合物，其中环A是芳基、杂芳基或杂环基，所述芳基、杂芳基或杂环基中的每个任选地且独立地被选自R6的1或2个基团取代。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的化合物，其中环A是萘基、吲唑基、苯基、吡啶基、吡唑基、氮杂环丁烷基、四氢吡喃基、哌啶基、二氢苯并噁嗪基、二氢苯并二噁英基或苯并二氢吡喃基，所述萘基、吲唑基、苯基、吡啶基、吡唑基、氮杂环丁烷基、四氢吡喃基、哌啶基、二氢苯并噁嗪基、二氢苯并二噁英基或苯并二氢吡喃基中的每个任选地且独立地被选自R6的1或2个基团取代。
19.根据权利要求1到18中任一项所述的化合物，其中环A是任选地被选自R6的1或2个基团取代的苯基。
20.根据权利要求1到17中任一项所述的化合物，其中环A是各自任选地被选自R6的1或2个基团取代的嘧啶基或噻唑基。
21.根据权利要求1到17中任一项所述的化合物，其中环A是任选地被选自R6的1或2个基团取代的吡啶基。
22.根据权利要求1到21中任一项所述的化合物，其中R6是卤代(C1-C4)烷基、卤素、-CN、-NHC(O)ORa、-C(O)Rb、-NHC(O)NHRg、-C(O)NReRf、-NHC(O)Rd、-NReRf、-ORe或4元到6元杂芳基，其中所述4元到6元杂芳基任选地被选自Rm的1或2个基团取代。
23.根据权利要求1到22中任一项所述的化合物，其中R6是(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、卤素、-CN、-C(O)Rb、-C(O)NReRf、-ORe或4元到6元杂芳基，其中所述4元到6元杂芳基任选地被选自Rm的1或2个基团取代。
24.根据权利要求1到23中任一项所述的化合物，其中R6是苯基或4元到6元杂芳基，其中所述苯基任选地被选自Rg的1或2个基团取代，并且所述4元到6元杂芳基任选地被选自Rm的1或2个基团取代。
25.根据权利要求1到24中任一项所述的化合物，其中Rb是(C1-C4)烷基。
26.根据权利要求1到25中任一项所述的化合物，其中Re是(C1-C4)烷基。
27.根据权利要求1到26中任一项所述的化合物，其中Rf是(C1-C4)烷基。
28.根据权利要求1到27中任一项所述的化合物，其中Rm是(C1-C4)烷基。
29.根据权利要求1到28中任一项所述的化合物，其中Rg是卤素。
30.根据权利要求1到28中任一项所述的化合物，其中R6是Cl、F、CF3、-C(O)N(Me)2、-OCH3、-C(O)CH3或任选地被1或2个CH3取代的吡唑基。
31.一种药物组合物，其包括根据权利要求1到30中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐；以及药学上可接受的载体。
32.一种治疗受试者的对抑制TREX1有应答的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1到30中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或根据权利要求31所述的组合物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述疾病是癌症。
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