CN114159581B - 一种多肽水凝胶及其在制备肿瘤治疗药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多肽水凝胶及其在制备肿瘤治疗药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明采用固相合成法合成一种将抗癌药物氯尼达明共价连接到多肽分子上的药物多肽偶联物LND‑GFFYKD，并调节pH使其自组装成胶或与增效剂维拉帕米共组装形成水凝胶。该水凝胶可以提高药物的溶解性，降低药物对全身的毒副作用，并且对于脑胶质瘤细胞的生长抑制作用明显优于氯尼达明纯药。

Description

一种多肽水凝胶及其在制备肿瘤治疗药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种多肽水凝胶及其在制备肿瘤治疗药物中的应用。
背景技术
氯尼达明（LND）是一种作用于线粒体的广谱抗肿瘤药物，通过抑制肿瘤细胞的糖酵解，干扰细胞能量代谢，从而起到杀伤肿瘤细胞的作用，被广泛应用于多种肿瘤（如肺癌、乳腺癌、前列腺癌及脑胶质瘤等）的治疗。该药由于独特的作用机制，可以避免骨髓抑制、脱发及胸腺萎缩等传统化疗药物常见的不良反应，具有极高的应用价值。然而，水溶性差、剂型单一、生物利用度低等缺点，严重限制了其在临床的应用。因此，如何改善氯尼达明的溶解性，提高药物在肿瘤部位的有效聚集浓度，从而增强其抗癌疗效，成为当前亟待解决的一大问题。
多肽药物偶联物（PDC）是一种新型的偶联药物，通常是将十个左右氨基酸的肽链与药物分子共价结合，通过设计不同的氨基酸序列实现不同的功能化，如调节亲疏水性和电离性质、实现分子靶向效果等，提高药物的生物利用度和药效，减少药物对肝肾的毒副作用。PDC可在体内经代谢分解，产物为具有药理活性的药物分子和不产生免疫反应和炎症反应的氨基酸，具有良好的生物可降解性和生物安全性。特别是两亲性的低分子量疏水性药物和亲水性肽段的组合，在生理环境可以通过疏水作用、离子键、π-π堆叠或氢键等非共价作用自组装形成超分子水凝胶。基于多肽水凝胶的局部给药系统，可提高药物在肿瘤部位的有效积累，增强药物治疗效果的同时降低对正常器官、组织的全身毒性。例如，胶质母细胞瘤（GBM）是脑胶质瘤的最常见和最致命形式，目前临床常用手术切除与化疗、放疗相结合的治疗技术，但GBM极易在原始切除腔附近迅速复发。利用自组装两亲性多肽药物偶联物（PDC），构建一种可注射于胶质母细胞瘤术后切除腔的局部给药体系，因其形状自适应性及生物相容性，可以实现目标区域内长时间的药物缓释，有效抑制切除部位残余细胞的增殖，防止肿瘤复发，具有潜在的临床转化可行性，显现出重要的研究价值。
此外，多药耐药（MDR）是导致许多化疗过程失败的主要原因，MDR的产生常与肿瘤细胞过度表达外排蛋白（如糖蛋白等）有关。维拉帕米是一种常用的P糖蛋白（P-gp）抑制剂，可以减少肿瘤细胞对化疗药物的外排，增加药物在胞内的积蓄，从而逆转耐药性。
发明内容
本发明的目的是提供一种多肽水凝胶及其制备方法和在制备肿瘤治疗药物中的应用，该多肽水凝胶由氯尼达明-多肽偶联物（LND-Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys-Asp-OH）自组装形成，亦可加入增效剂维拉帕米。该水凝胶可以提高药物的溶解性和生物利用度，降低药物对全身的毒副作用，具有良好的生物相容性、可注射性、药物缓释效果和肿瘤抑制作用，可用于胶质母细胞瘤的术后原位给药等肿瘤治疗方向，具有广阔的临床应用前景。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种多肽药物偶联物，其序列为氯尼达明-Gly-Phe-Phe-Tyr-Lys-Asp-OH；
其结构式如式Ⅰ所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
一种多肽水凝胶，由上述多肽药物偶联物经自组装形成。
上述多肽药物偶联物或多肽水凝胶在制备脑胶质瘤治疗药物中的应用。
一种脑胶质瘤治疗药物，包括上述多肽水凝胶。
进一步地，所述脑胶质瘤治疗药物还包括维拉帕米。
更进一步地，所述脑胶质瘤治疗药物的制备方法为：将上述多肽药物偶联物溶解于PBS溶液中，用0.1 M或1 M NaOH溶液促溶，加入维拉帕米（VER）水溶液（18mg/mL）使VER含量为多肽含量的0~0.5 eq，再用0.1 M或1 M HCl 调节溶液pH至7.4，涡旋混匀后，于37℃条件下静置，即得。
有益效果：
1. 本发明合成了一种氯尼达明-多肽偶联物，有效提高了药物的溶解性和安全性，该药物多肽偶联物可自组装形成具有纳米纤维结构的水凝胶，起到局部药物缓释的作用，促进了肿瘤细胞对药物的摄取，明显提高了对于脑胶质瘤细胞的生长抑制作用；
2. 本发明的氯尼达明-多肽偶联物可与增效剂维拉帕米共组装形成载药多肽水凝胶，体外细胞实验证明，该共组装水凝胶可进一步提高纯药及单一分子水凝胶的抗肿瘤活性；
3. 本发明的水凝胶药物具有良好的生物相容性、可注射性、适宜可调的机械性能以及形状自适应特性，可用于脑胶质瘤术后切除腔内的局部药物缓释，从而防止肿瘤复发，具有极大的临床应用前景。
4. 本发明的水凝胶药物合成工艺和制备方法简便，具有工业化扩大生产的潜力。经过真空冷冻干燥后，加入纯化水复溶后即可重新得到水凝胶，具有便于储存和运输的现实意义。
附图说明
图1为LND-1的质谱图（A）和液相色谱图（B）。
图2为水凝胶的TEM图，A为LND-1，B为LND-1+0.1 eq VER。
图3为LND-1和LND-1+VER的CD图谱。
图4为临界聚集浓度（CAC）的测量结果，A为LND-1，B为LND-1 + 0.1 eq VER。
图5为LND-1水凝胶的流变图，包括时间扫描、频率扫描和应变扫描，A、B、C为LND-1，D、E、F为NBD-1+ 0.1 eq VER。
图6为LND-1水凝胶的体外释放曲线。
图7为LN18细胞与LND、LND-1、LND-1+VER共孵育48小时的存活率图。
图8为LN18细胞与LND-1、LND-1+VER、VER共孵育48小时的存活率图。
图9为激光扫描共焦显微镜下的NBD-1+VER的1小时细胞摄取图像。
具体实施方式
目前，临床常使用赋形剂来改善氯尼达明等疏水性化疗药物的溶解性，但亦会引入新的毒副作用，例如用于溶解紫杉醇（Taxol）的表面活性剂Cremophor EL可能导致严重的过敏反应，并且存在一定神经毒性。另外，全身给药（如口服、静脉注射）的方式使得药物到达肿瘤部位的浓度不足，从而对肿瘤细胞的杀伤能力有限，若提高剂量则可能对正常器官或组织产生损伤，如氯尼达明片剂可能会对患者造成严重的肝损伤。其次，药物渗透进入细胞膜被内化的能力有限，且小分子药物极易被P-gP等外排泵排出，从而出现耐药性，多药耐药（MDR）是导致许多化疗药物失败的重要原因，尤其是对于复发病人而言。同时，单一药物作用于肿瘤细胞的效果往往有限，如果两种药物分别给药，则二者到达肿瘤部位的时间不同，难以达到最优效果，而将性质不同的两种或多种药物装载至同一药物递送体系内具有一定挑战性。
针对上述问题，采用固相合成法合成一种将抗癌药物氯尼达明共价连接到多肽分子上的药物多肽偶联物LND-GFFYKD，并调节pH使其自组装成胶或与增效剂维拉帕米共组装形成水凝胶。该水凝胶可以提高药物的溶解性，降低药物对全身的毒副作用，并且对于脑胶质瘤细胞的生长抑制作用明显优于氯尼达明纯药。
在本发明中，LND-1即代表LND-GFFYKD。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
LND-GFFYKD的Fmoc-固相合成
以固相合成管为反应容器，取代度为0.85 mmol/g的2-氯三苯甲基氯（2-CTA）树脂为反应载体。具体操作步骤如下：
（1）树脂的溶胀：称取2-CTA树脂0.2mmol于固相合成管中，加入5 mL二氯甲烷（DCM），置于摆床摇摆30 min使之充分溶胀，抽滤除去；再加入5 mL DCM，置于摆床摇摆2min，抽滤除去DCM，重复洗涤5次；
（2）第一个氨基酸的连接：称取Fmoc保护的天冬氨酸（Fmoc-Asp(OtBu)-OH）0.3mmol，以DCM溶解后加入至固相合成管中，再加入N,N-二异丙基乙胺（DIPEA） 0.3 mmol，摇摆反应3 h；抽滤除去反应液，以DCM洗涤5次（每次2min），以充分除去未反应的氨基酸；
（3）封闭树脂：配制封闭液（甲醇：DIPEA：DCM=15：5：80，v/v/v）10 mL，分两次加入，各反应10 min；以DCM洗涤5次（每次2min），以充分除去剩余的封闭液；
（4）脱保护基：用脱保护液（20%V/V 哌啶/DMF）脱去氨基酸N端的Fmoc保护基团，第一次加入5 mL脱保护液摇摆反应5 min，第二次加入5 mL脱保护液摇摆反应25 min；以DMF洗涤5次（每次2min），以充分除去剩余的脱保护液；
（5）第二个氨基酸的连接：称取Fmoc保护的赖氨酸（Fmoc-Lys(BOC)-OH）、TBTU、HOBt各0.6mmol，以DMF溶解后加入至固相合成管中，再加入DIPEA 0.6mmol，摇摆反应3h；抽滤除去反应液，以DCM洗涤5次（每次2min）；
（6）肽链的延长：重复步骤（4）、（5），脱保护基，DMF洗涤五次，依次称取Fmoc保护的酪氨酸（Fmoc-Tyr(tBu)-OH）、苯丙氨酸（Fmoc-Phe-OH）、苯丙氨酸（Fmoc-Phe-OH）、和甘氨酸（Fmoc-Gly-OH），TBTU、HOBt和DIPEA 0.6 mmol，加入固相合成管中反应3 h，DMF洗涤5次；
（7）切割：反应结束后，将树脂抽滤，转移至50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL三氟乙酸（TFA），置于磁力搅拌器上反应3 h，将肽段与树脂切割分离，同时脱去侧链保护基团；
（8）后处理：真空泵抽滤圆底烧瓶内反应液，60 ℃水浴旋蒸除去TFA。加入7 mL冰乙醚，用药匙将沉淀分散，转移至10 mL EP管中，2000 rpm离心10 min。弃去上层乙醚，再加入7 mL冰乙醚，均匀分散后离心(2000 rpm,10 min)，重复洗涤3次，以充分除去剩余TFA。将样品置于通风橱中过夜，挥干剩余乙醚；加入少量超纯水分散样品，真空冷冻干燥24 h，即得多肽粗品。
结果分析：理论精确分子量为1077.36，ESI-MS m/z: Calcd. [M+H]+ 1078.8，[M+Na]+ 1100.9，与目标分子量相符，证明化合物合成正确（图1A）。HPLC结果表明化合物保留时间为11.385 min，纯度为95.93 %（图1B）。
实施例2
1. 水凝胶的制备
多肽水凝胶（以1%为例）：称取2mg多肽粉末溶于100μL pH7.4的PBS中，加入1 M 或0.1M的NaOH溶液促溶，并用1M或0.1M的HCl溶液调节pH至7.4，补足总体积至200μL，于37℃条件下静置，等待成胶。
多肽/VER水凝胶（以1%，0.1eq为例）：称取2mg多肽粉末溶于100μL pH 7.4的PBS中，加入1 M 或0.1M的NaOH溶液促溶，加入维拉帕米（VER）水溶液（18mg/mL）使VER含量为多肽含量的0.1eq，并用1M或0.1M的HCl溶液调节pH至7.4，补足总体积至200μL，于37℃条件下静置，等待成胶。结果如表1：
表1. 化合物最低成胶浓度结果
多肽序列 最低成胶浓度（MGC） 加入0.1eq维拉帕米最低成胶浓度（MGC）
LND-GFFYKD 1% 0.6%
如表1所示，多肽LND-GFFYKD的最低成胶浓度（MGC）为1%，加入0.1eq维拉帕米后的最低成胶浓度（MGC）可降至0.6%，说明维拉帕米可以与多肽LND-GFFYKD共组装，促进水凝胶的形成。
进一步对水凝胶的成胶性能进行考察，主要分为“涡旋-恢复”和“冻干-恢复”两个方向。将已制水凝胶涡旋5 s，可观察到样品发生“凝胶-溶液”的状态转变，将其静置10-30min，即可观察到“溶液-凝胶”的状态转变，该可逆性为水凝胶的可注射性提供了基础。将已制水凝胶置于-20℃条件下3小时，经过真空冷冻干燥后，加入纯化水复溶后，至于37℃条件下静置，即可重新得到水凝胶，具有便于储存和运输的现实意义。
2. 多肽水凝胶的微观形貌表征
制备浓度为2 wt%的多肽水凝胶，以PBS稀释10倍，取15 μL滴加至涂覆碳层的铜网上，静置3-5 min。用滤纸将过量液体吸净，再滴加5 μL磷钨酸染色，静置2~4 min。将样品转移至滤纸上，置于红外灯下干燥5 min。用透射电子显微镜（TEM）进行微观形态的观察。
如图2所示，LND-1自组装形成水凝胶，可观察到纳米纤维及部分纳米球，而LND-1和维拉帕米共组装形成的水凝胶纳米纤维网络致密，表明维拉帕米的加入增强了LND-1的自组装性能。
3. 多肽水凝胶的二级结构表征
制备浓度为2 wt%的多肽水凝胶，以超纯水稀释4倍，置于0.5 mm石英比色皿中，采用Jasco J-810圆二色谱仪分析扫描190~260 nm范围内的圆二色谱，如图3所示。
对CD图谱进行解析，LND-1为100% Antiparallel结构，LND-1+VER为87%Antiparallel结构以及13%的其他类型结构，说明VER可与LND-1共组装，在一定程度上影响LND-1的二级结构。
4. 最低聚集浓度（CAC）的测定
分别配制浓度为2 mg/mL的LND-1、LND-1+0.1 eq VER，并逐级稀释为梯度浓度样品。在室温（25℃）下，利用马尔文激光粒度仪对各组样品的光散射强度（Kcps）依次进行测定，对所得数据进行绘图分析。
如图4所示，LND-1的CAC为200.73 μM，LND-1+0.1eq VER的CAC为108.28 μM，表明加入维拉帕米后可以明显降低LND-1的最低聚集浓度，促进LND-1的自组装行为。
5. 流变学实验
制备LND-1浓度为3 wt%的LND-1水凝胶，LND-1浓度为3 wt%、维拉帕米浓度为0.1当量的LND-1/VER水凝胶，利用流变仪测试水凝胶的机械强度和粘弹特性。
如图5所示，A、D为动态时间扫描图，LND-1/VER水凝胶的储能模量（G’）高于LND-1水凝胶的储能模量（G’），表明多肽与维拉帕米共组装后具有更高的机械强度。B、E为动态频率扫描，LND-1和LND-1/VER水凝胶的G’始终大于G’’，且不同频率（100-0.1 rad/s）条件下的G’和G’’变化均不大，表明水凝胶的粘弹性能较好，且内部结构稳定。C、F为动态应变扫描，LND-1和LND-1/VER水凝胶的G’均随应力值（0.1-100%）的增大而逐渐降低，表现出典型的剪切变稀特性，提示其具有可注射性的特点。
6. 体外释放实验
制备LND-1浓度为1.5 wt%的LND-1水凝胶，以PBS为释放介质，至于37℃恒温振荡箱中进行体外释放试验。平行设置三组，在1 h、2 h、4 h、8 h、24 h、48 h时各取出500 μL释放介质待测，并补加500 μL PBS。利用紫外分光光度法建立LND-1的标准曲线，并测定各组样品中LND-1的含量，经计算可得各组样品在每个时间点的累计释放率，释放曲线如图6所示。由图可知，LND-1水凝胶在72h内仅释放不到7%的LND-1，在生理条件下具有较好的稳定性和药物缓释能力。
实施例3
1. 体外抗肿瘤实验
具体实验步骤如下：
（1）在培养条件为37℃，5% CO2的培养箱内，利用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基培养LN18（胶质母细胞瘤）细胞；配制细胞悬浮液，接种于96孔板中，每孔接种体积为100 μL，接种细胞数约为6000个，培养过夜；
（2）以DMEM培养基为溶剂，配制浓度梯度为63~500 μM的氯尼达明（LND）、LND-1、LND-1+0.1 eq VER溶液，浓度梯度为6.3~50 μM的VER溶液，以及浓度梯度为25~400 µM的NBD-1溶液，分别加入至孔板中，每孔体积为100 μL，每组浓度设置5个复孔；以等体积的DMEM培养基作为对照组，于培养箱内孵育48 h；
（3）配制浓度为5mg/mL的MTT溶液，加入孔板中，每孔体积为20 μL，于培养箱内避光孵育4 h；弃去上层培养液，每孔加入200 μL DMSO，10 min后利用酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度；平行测定3次。
实验结果如图7和图8所示。在63~500 μM浓度范围内，48小时条件下，各实验组基本呈现浓度依赖性的细胞毒性作用。在相同摩尔浓度的条件下，与氯尼达明纯药（LND）相比，LND-1水凝胶及LND-1/VER水凝胶对于LN18的细胞毒性更大，尤其是LND-1/VER水凝胶，在各浓度下均显示出更强的细胞生长抑制作用。经单因素T检验分析，该结果具有显著性差异（*P ＜0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001）。而维拉帕米在实验浓度范围内（6.3~50 μM）对于LN18并未表现出明显的毒性，细胞存活率均高于95%，表明VER为一种优良安全的增效剂。
经计算可得各组药物实验组对于LN18细胞的IC50值，如表1所示。当作用时间为48h时，与氯尼达明纯药相比，LND-1水凝胶对LN18的IC50值有所降低，而LND-1/VER水凝胶的IC50值明显降低，表明LND-1与维拉帕米共组装后显著增强了药物对于LN18细胞的生长抑制效果，具有良好的抗肿瘤作用。
表2. 药物作用于T24细胞的IC50值
实验组 IC50 (μM)
LND 488.7
LND-1 444.6
LND-1/VER 281.3
2. 体外药物摄取实验
为了利用激光共聚焦显微镜进行体外药物摄取实验，将LND-1结构中的氯尼达明替换为荧光基团NBD，利用NBD-1进行后续实验。配制浓度为15万个/mL的细胞悬浮液，接种于激光共聚焦小皿内。避光配制NBD-1浓度为400 μM，维拉帕米浓度为40 μM的DMEM培养基溶液。待细胞贴壁后弃去培养基，加入1 mL药物溶液孵育1 h，弃去培养基，用PBS清洗后，以Lyso-Tracker Red染色45 min，Hoechst 33342染色10 min。
将样品置于激光共聚焦显微镜下观察，结果如图9所示。Lyso-Tracker的红色荧光定位溶酶体，Hoechst 33342的蓝色荧光定位细胞核，由NBD-1的绿色荧光可知，NBD-1在短时间（1小时）内即可被细胞良好摄取，且与溶酶体共定位。该药物-多肽偶联物在蛋白酶丰富的溶酶体区域可发生生物降解，产物为具有药理活性的氯尼达明分子和不产生免疫反应和炎症反应的氨基酸，起到肿瘤细胞毒性药效的同时具有良好的生物安全性。

Claims (1)

1.一种脑胶质瘤治疗药物，其特征在于：包括多肽水凝胶和维拉帕米，所述多肽水凝胶由式Ⅰ所示的多肽药物偶联物自组装形成，
Figure QLYQS_1
；
所述维拉帕米的含量为多肽药物偶联物含量的0 .1eq。
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