CN114159458A - 四面体框架核酸在治疗癫痫的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了四面体框架核酸在治疗癫痫的药物中的用途。所述四面体框架核酸由4条单链DNA经碱基互补配对形成；所述4条单链DNA的序列分别一对一地选自SEQ ID NO.1～4的所述序列。四面体框架核酸能够通过减轻脑部海马区内胶质细胞的增生以及炎症因子释放所导致的神经炎症，抑制炎性胶质细胞内谷氨酰胺合成酶的下调，从而利于兴奋性谷氨酸的代谢，减轻谷氨酸的累积及由此造成的神经兴奋性。因此，四面体框架核酸能够有效控制癫痫的异常放电，具有潜在的临床应用前景。

Description

四面体框架核酸在治疗癫痫的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及四面体框架核酸在治疗癫痫的药物中的用途。

背景技术

癫痫是一类以神经元异常放电引起的全是或局部肢体不自主抽搐或扭动为主要临床表现的神经系统疾病，严重者常伴有意识的丧失，甚至危及患者生命，大多数患者多转为慢性癫痫患者，严重影响了患者的日常工作、生活和社会交际。目前全世界大约有700万的癫痫患者，其治疗主要以药物治疗为主，然而目前约有150万的癫痫患者对于现有的抗癫痫药出现耐受或反应不佳，最终不得不接受手术治疗。同时长期服药抗癫痫药给患者带来不同程度药物副反应的同时，也给其家庭和社会带来巨大的经济负担。

目前临床所用的抗癫痫药主要的作用机理是对于神经元膜上离心通道的干预、膜上兴奋性谷氨酸受体的的抑制以及参与神经递质水平的调节。例如临床上常用的丙戊酸钠、卡马西平、氯硝西泮、托吡酯等。这些药物在临床上确实能够取得较好的疗效，但药物作用的机制、靶点大多集中在神经元上，且相对单一，常常需要联合用药和长疗程服药，由此不可避免的带来不同程度的药物耐受和相关的副作用，同时这些药长期服用不同程度的抑制中枢神经系统的兴奋性，导致的患者抑郁或自杀也鲜有报道。

越来越多的研究证实，癫痫并不单单是一种神经元异常所导致的疾病，胶质细胞的异常改变在这一过程中也有着极为重要的作用。改善胶质细胞的病理改变有助于更好地控制癫痫的临床症状。

因此，目前仍亟需研究新型的能够作用于胶质细胞的抗癫痫药物，从而更好的实现癫痫的药物治疗。

发明人前期研究证实，四面体框架核酸能够有效治疗脱髓鞘疾病，例如最常见的脱髓鞘疾病——多发性硬化(multiple sclerosis，MS)，而癫痫是该病的伴随症状之一，但由于MS伴发癫痫症状主要是由于脱髓鞘的神经元失去了髓鞘的绝缘作用，在神经信号传导过程中，当大量神经元出现脱髓鞘病变的时候，导致轴突膜电位容易去极化，同时引起周围相邻神经元的同步兴奋，就会出现同步放电，临床上便会出现癫痫样的表现，因而当四面体能够有效缓解脱髓鞘的病变时，MS伴发的癫痫症状也能够得到改善。然而，临床上最常见的癫痫疾病，系由神经元本身膜电位出现异常去极化所导致的同步放电，与MS所伴发的癫痫症状在发病及治疗机制上具有本质的区别，通过修复神经元髓鞘的丢失并不能从根本上治疗癫痫，因而对四面体框架核酸在癫痫中的作用进一步进行探索依然具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种。

本发明提供了四面体框架核酸在治疗癫痫的药物中的用途，所述四面体框架核酸由4条单链DNA经碱基互补配对形成；所述4条单链DNA的序列分别一对一地选自SEQ IDNO.1～4的所述序列。

进一步地，上述四面体框架核酸由如下方法制备而成：将四面体框架核酸的4条单链DNA置于足以使其变性的温度下维持10min以上，再将温度降低到2～8℃维持20min以上。

更进一步地，上述四面体框架核酸由如下方法制备而成：将DNA四面体的4条单链置于95℃下维持10min，再将温度降低到4℃维持20min以上。

进一步地，上述药物是治疗癫痫的药物。

更进一步地，上述药物是治疗神经元膜电位异常去极化所致癫痫的药物。

更进一步地，上述药物是减轻神经炎症的药物。

更进一步地，上述药物是减轻胶质细胞增生的药物。

更进一步地，上述减轻胶质细胞增生的药物是减轻小胶质细胞增生和/或星形胶质细胞增生的药物。

更进一步地，上述药物是缓解神经超兴奋性的药物。

更进一步地，上述药物是降低海马区谷氨酸水平的药物。

更进一步地，上述药物是减轻海马区氧化应激损伤和/或提高海马区谷氨酸代谢的药物。

实验结果表明，本发明提供了四面体框架核酸在治疗癫痫的药物中的新用途。四面体框架核酸能够通过减轻胶质细胞增生及炎症因子的释放，减少病灶区的神经炎症；并通过减轻氧化应激损伤引起的谷氨酰胺合成酶的下降，加快兴奋性的谷氨酸代谢，从而降低病灶区谷氨酸的水平，降低由此引起的神经超兴奋性。因此，四面体框架核酸能够有效治疗癫痫，具有良好的临床应用前景。

本发明的术语：癫痫：指临床上最常见的癫痫疾病，系由神经元本身膜电位出现异常去极化所导致的同步放电，与MS所伴发的癫痫症状在发病及治疗机制上具有本质的区别；本发明所述的癫痫与实验所用的动物模型均是由神经元本身膜电位出现异常去极化所导致的同步放电引起的癫痫疾病模型。

神经超兴奋性是指：神经元在受到损伤或炎症刺激后，兴奋性异常升高的一种状态，它以自发放电发生率增加、刺激阚值普遍降低以及出现交感敏化现象为主要特点。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是四面体框架核酸及其单链的PAGE电泳图。

图2是四面体框架核酸及其单链的毛细管电泳图。

图3是四面体框架核酸的粒径图。

图4是四面体框架核酸的Zeta电位图。

图5是四面体框架核酸的透射电镜图。

图6是各组小鼠海马区小胶质细胞数量的荧光图和统计分析图(Ctrl：正常组；Ctrl+tFNA：四面体对照组；SE：造模组；SE+tFNA：治疗组)。

图7是各组小鼠海马区星型胶质细胞数量的荧光图和统计分析图(Ctrl：正常组；Ctrl+tFNA：四面体对照组；SE：造模组；SE+tFNA：治疗组)。

图8是各组小鼠海马区炎症因子的WB图和统计分析图(Ctrl：正常组；Ctrl+tFNA：四面体对照组；SE：造模组；SE+tFNA：治疗组)。

图9是各组小鼠海马区谷氨酸和谷氨酰胺水平的统计分析图(Ctrl：正常组；Ctrl+tFNA：四面体对照组；SE：造模组；SE+tFNA：治疗组)。

图10是各组小鼠海马区谷氨酰胺合成酶以及抗氧化蛋白MnSOD的WB图和统计分析图(Ctrl：正常组；Ctrl+tFNA：四面体对照组；SE：造模组；SE+tFNA：治疗组)。

图11是各组小鼠海马区癫痫波的脑电图和统计分析图(Ctrl：正常组；Ctrl+tFNA：四面体对照组；SE：造模组；SE+tFNA：治疗组)。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

实施例1、DNA四面体的合成

将四条DNA单链(S1、S2、S3、S4)溶解于TM Buffer(10mM Tris-HCl,50mM MgCl2,pH＝8.0)中，四条DNA单链的终浓度为1μM，充分混合，迅速加热至95℃保持10分钟，之后迅速降温至4℃并维持20分钟以上，即可得到四面体框架核酸。

四条单链的序列如下：

合成后的四面体框架核酸，PAGE凝胶电泳(图1)和毛细管电泳(图2)可见四面体骨架核酸大小约为180KD，可认为四面体框架核酸已成功合成。四面体粒径大小约为20.12nm(图3)，电位为-6.29mV(图4)。使用透射电镜观察，镜下可见特征的四面体结构(图5)。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、四面体框架核酸对脱髓鞘疾病模型的治疗效果

1、实验方法

模型动物：采用Pilocarpine诱导ICR小鼠制备癫痫持续状态的模型，探究四面体框架核酸调控胶质增生及神经炎症以及神经元兴奋性的效果及可能的机制。取10周龄ICR雄性小鼠，共38只。分为正常组9只，四面体对照组9只，模型组10只，治疗组10只。治疗组于癫痫发作后4小时开始给予尾静脉注射四面体框架核酸(1000nM)，间隔24小时注射一次，连续注射14天。四面体对照组给予等剂量的四面体框架核酸每天注射，正常组和模型组给予等剂量的生理盐水，每天注射。

相关指标检测：四面体注射结束后第二天，取小鼠脑组织切片进行免疫荧光染色，分别用Iba-1、GFAP标记海马区小胶质细胞和星型胶质细胞的数量变化。WB检测小鼠海马内炎症因子(IL-1β，IL-6，TNFα)水平的变化。同时，利用高效液相的方法检测海马组织内神经递质谷氨酸和其代谢产物谷氨酰胺水平的变化，并用WB的方法进一步检测谷氨酰胺合成酶水平以及氧化应激水平相关的蛋白MnSOD的水平变化，最后我们通过脑电图检测的方式记录并分析比较各组小鼠海马区癫痫波的频率。

2、实验结果

(1)免疫荧光发现造模组小鼠海马区小胶质细胞出现明显的增多，而治疗组对比其变化，有明显减少的小胶质细胞，说明四面体框架核酸减轻了小胶质细胞的增生(图6)。

(2)免疫荧光发现造模组小鼠海马区星型胶质细胞出现明显的增多，而治疗组对比其变化，有明显减少的星型胶质细胞数量，说明四面体框架核酸减轻了星型胶质细胞的增生(图7)。

(3)WB检测发现治疗组小鼠海马区内炎症因子(IL-1β，IL-6，TNFα)的表达水平较造模组出现明显的下降，说明四面体框架核酸减轻了癫痫小鼠海马区内炎症因子的水平(图8)。

(4)高效液相检测发现，小鼠海马组织内谷氨酸的水平在治疗组出现明显下降，而其代谢产物谷氨酰胺的水平较造模组明显升高，说明四面体框架核酸促进了谷氨酸代谢成谷氨酰胺(图9)。

(5)氧化应激损伤引起的谷氨酰胺合成酶的下降被认为是癫痫患者病灶区谷氨酸异常累积的重要原因。我们通过WB检测发现，与造模组相比，治疗组海马区内抑制氧化应激的MnSOD蛋白的表达水平出现明显的增高，说明四面体框架核酸减轻了氧化应激的损伤，由此缓解了谷氨酰胺合成酶的下降，并进一步减轻了谷氨酸的堆积(图10)。

(6)脑电图监测小鼠海马区内的癫痫波发现，治疗组的小鼠海马区异常的癫痫波频率较造模组明显降低，说明四面体框架核酸能够有效控制癫痫的发作，具有很好的抗癫痫的作用(图11)。

综上，本发明提供了四面体框架核酸在治疗癫痫的药物中的新用途。四面体框架核酸能够通过抑制胶质细胞的增生以及炎性因子的释放，减轻神经炎症；同时通过减轻氧化应激损伤，抑制了谷氨酰胺合成酶的减少，从而有效地促进了谷氨酸的代谢，减轻了谷氨酸的异常堆积，降低了其调节的神经超兴奋性，最终减少了癫痫波的频率。因此，四面体框架核酸能够有效治疗癫痫，具有良好的临床应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 四面体框架核酸在治疗癫痫的药物中的用途

<130> GYKH1118-2021P0114265CC

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<170> PatentIn version 3.5

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acggtattgg accctcgcat gactcaactg cctggtgata cgaggatggg catgctcttc 60

ccg 63

Claims (10)

1.四面体框架核酸在治疗癫痫的药物中的用途，其特征在于，所述四面体框架核酸由4条单链DNA经碱基互补配对形成；所述4条单链DNA的序列分别一对一地选自SEQ ID NO.1～4的所述序列。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述四面体框架核酸由如下方法制备而成：将四面体框架核酸的4条单链DNA置于足以使其变性的温度下维持10min以上，再将温度降低到2～8℃维持20min以上。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述四面体框架核酸由如下方法制备而成：将DNA四面体的4条单链置于95℃下维持10min，再将温度降低到4℃维持20min以上。

4.如权利要求1～3任一项所述的用途，其特征在于，所述药物是治疗癫痫的药物。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物是治疗神经元膜电位异常去极化导致的癫痫的药物。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物是减轻神经炎症的药物。

7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物是减轻胶质细胞增生的药物；优选地，所述减轻胶质细胞增生的药物是减轻小胶质细胞增生和/或星形胶质细胞增生的药物。

8.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物是缓解神经超兴奋性的药物。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药物是降低海马区谷氨酸水平的药物。

10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药物是减轻海马区氧化应激损伤和/或提高海马区谷氨酸代谢的药物。

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