CN114144187A - 含有药物药剂和/或营养药剂的脂质纳米颗粒及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了纳米颗粒，所述纳米颗粒包含：活性化合物、或其药学上可接受的盐或前药，所述活性化合物包含与ω‑3多不饱和脂肪酸部分共价连接的核碱基类似物部分；聚乙二醇化维生素E化合物；和至少一种油相组分。还公开了用于治疗患有疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所公开的纳米颗粒。组合物和方法通过递送一系列活性化合物，包括例如4‑(N)‑二十二碳六烯酰2',2'‑二氟脱氧胞苷(DHA‑dFdC)或其他疏水性和/或亲脂性抗癌剂，可用于治疗疾病，例如肿瘤。所述组合物和方法进一步可用于经由多种施用途径来递送药物药剂和/或营养药剂。还公开了制备所述纳米颗粒的方法。

Description

含有药物药剂和/或营养药剂的脂质纳米颗粒及其方法
关于联邦政府赞助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的第CA179362号政府拨款的支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。
技术领域
本公开大体上涉及纳米颗粒，更具体是基于脂质的纳米颗粒和/或固体脂质纳米颗粒，特别是可以掺入和递送药物药剂和/或营养药剂的纳米颗粒。在一些实施例中，纳米颗粒非常适合于掺入和递送在一些情况下可用作抗癌治疗剂的ω-3脂肪酸、核苷类似物和/或其衍生物。纳米颗粒通常能够可控且持续地释放这些有益的药剂，将药剂递送至所需的组织，例如肿瘤，并且通常可以增加药剂的水溶性和生物利用度，从而稳定和增加在所施用的制剂中使用的药剂的有效量。
背景技术
将药物体内递送至所需组织存在许多挑战。例如，必须克服与溶解性、毒性、组织靶向、稳定性、清除、给药和许多其他复杂情况相关的问题。疏水性和/或亲脂性化合物的递送存在独特的挑战，因为此类化合物在体液中不易溶解或保持稳定。因此，本领域需要可递送多种化合物的递送载体，包括疏水性和/或亲脂性化合物。
吉西他滨(2',2-二氟脱氧胞苷，dFdC)是一种核苷类似物，被批准用于通过缓慢静脉内输注来治疗胰腺癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌(Carmichael,等人，British J.Cancer,1996,73,(1),101-105；Hoang,等人，Lung Cancer 2003,42,(1),97-102；Albain,等人，J.Clin.Oncol.,2008,26,(24),3950-3957；Ozols,等人，Seminars Oncology,2005；Elsevier:pp 4-8)。为了提高吉西他滨的疗效，通过将二十二碳六烯酸(DHA)(一种ω-3多不饱和脂肪酸(PUFA))偶联至dFdC的4-N位，合成了一种新化合物DHA-dFdC(Naguib,等人，Neoplasia,2016,18,(1),33-48)。DHA-dFdC对NCI-60DTP人肿瘤细胞系显示出强效和广谱的抗肿瘤活性，并且在控制几种胰腺癌小鼠模型(包括自发地发展出类似于人胰腺导管腺癌(PDA)的胰腺肿瘤的基因工程化小鼠模型和原位植入对吉西他滨具有耐药性的人胰腺肿瘤细胞的无胸腺小鼠)中的胰腺肿瘤生长方面比摩尔等效剂量的吉西他滨更有效。出处同前。在DBA/2小鼠中，在水溶液中DHA-dFdC的重复剂量-最大耐受剂量为50mg/kg(Valdes,等人，Pharm.Res.,2017,34,(6),1224-1232)。然而，DHA-dFdC难溶于水(固有溶解度，约25μg/mL)。DHA-dFdC已被配制成Tween 80-乙醇水溶液，但该制剂缺乏化学稳定性(Naguib,等人，Neoplasia,2016,18,(1),33-48)。
可以通过多种途径进行药物施用，其中一些途径比其他途径更理想。如果药物可以配制用于多种施用途径，特别是包括经口服施用，则是有利的。由于无痛、易于自我施用、给药方案灵活、方便和患者依从性高等优点，经口服途径通常是药物施用的首选(Thanki,等人，J.Controlled Release 2013,170,(1),15-40)。此外，口服产品的制造不需要旨在用于经肠胃外施用的产品所必需的无菌条件(Date,等人，J.Controlled Release,2016,240,504-526)。
在癌症化疗中，据报道癌症患者更喜欢经口服施用而不是静脉内输注，尤其是当化疗是一种姑息治疗时(Thanki,等人，J.Controlled Release 2013,170,(1),15-40；Liu,等人，J.Clin.Oncol.,1997,15,(1),110-115；Eek,等人，Patient PrefererenceAdherence,2016,10,1609)。然而，癌症化疗药剂的经口服施用具有挑战性，部分原因是胃肠(GI)道存在各种生理、酶和化学的屏障，阻碍了有效的口服吸收(Thanki,等人，J.Controlled Release 2013,170,(1),15-40；Lin,等人，J.Food Drug Analysis,2017,25,(2),219-234)。此外，低溶解度、肠道通透性差和GI道中高水平的P-糖蛋白(P-gp)等因素也限制了诸如紫杉醇、多西他赛、多柔比星、他莫西芬等许多癌症化疗药剂的口服生物利用度(Thanki,等人，J.Controlled Release 2013,170,(1),15-40)。
发明内容
本公开通过提供纳米颗粒和有效地将一种或多种活性化合物递送至靶组织的使用纳米颗粒的方法，解决了本领域中关于活性化合物体内递送的问题。纳米颗粒适用于掺入多种活性化合物，包括药物和营养药物化合物。纳米颗粒特别适合于掺入和递送亲脂性化合物，例如含ω-3脂肪酸的化合物。本发明人进一步发现了增强纳米颗粒的抗氧化性能同时增加纳米颗粒和掺入其中的活性化合物的整体稳定性的方法。纳米颗粒可以进一步增加所掺入的活性化合物的溶解度和口服生物利用度，从而促进更有效的给药能力。本公开还提供了制造本发明纳米颗粒的方法，其可适于提供一系列纳米颗粒组合物。还公开了使用所公开的纳米颗粒的疾病治疗方法，其可用于治疗例如癌症或肿瘤。
一方面，本文公开了一种纳米颗粒组合物，其包含1)活性化合物，或其药学上可接受的盐或前药；2)聚乙二醇化维生素E化合物；和3)至少一种油相组分。
另一方面，本文公开了一种纳米颗粒组合物，其包含活性化合物，或其药学上可接受的盐或前药；聚乙二醇化维生素E化合物；和至少一种油相组分，该活性化合物包含与ω-3多不饱和脂肪酸部分共价连接的核碱基类似物部分。
在一些实施例中，核碱基类似物部分包含吉西他滨。在一些实施例中，ω-3多不饱和脂肪酸部分包含二十二碳六烯酸。在一些实施例中，活性化合物包含具有式I的化合物：
Figure BDA0003485228070000031
其中R1、R2和R3独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、硫醇、硫代烷基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、环烷基、杂环烷基、烷基芳基、芳基、烷基杂芳基、杂芳基或ω-3多不饱和脂肪酸，其中的任一个任选地被乙酰基、烷基、氨基、酰胺基、烷氧基、烷基羟基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羰基、卤素、羟基、硫醇、氰基或硝基取代；其中R1、R2或R3中的至少一个包含ω-3多不饱和脂肪酸。
在一些实施例中，活性化合物包含4-(N)-二十二碳六烯酰2',2'-二氟脱氧胞苷(DHA-dFdC)。在一些实施例中，纳米颗粒组合物包含至多约1重量百分比(w/v)或至多约0.65重量百分比(w/v)的量的活性化合物。在一些实施例中，聚乙二醇化维生素E化合物包含具有在约200g/mol至约6000g/mol的范围内的分子量的聚乙二醇，其中聚乙二醇被酯化为维生素E琥珀酸酯。在一些实施例中，聚乙二醇化维生素E化合物包含D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)。在一些实施例中，油相组分包含卵磷脂。在一些实施例中，组合物进一步包含另外的油相组分，其可以是单硬脂酸甘油酯。在一些实施例中，组合物进一步包含另外的乳化剂，其可以是聚山梨醇酯。在一些实施例中，纳米颗粒具有200nm或更小的平均直径。
另一方面，本文公开了一种治疗患有疾病的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的纳米颗粒组合物，该纳米颗粒组合物包含活性化合物，或其药学上可接受的盐或前药；聚乙二醇化维生素E化合物；和至少一种油相组分，该活性化合物包含与ω-3多不饱和脂肪酸部分共价连接的核碱基类似物部分。
在一些实施例中，组合物经肠胃外施用，或可以经口服施用。在一些实施例中，疾病包括肿瘤。在一些实施例中，该方法降低肿瘤生长的速率。在一些实施例中，该方法增加肿瘤包囊。在一些实施例中，该方法增加荷瘤受试者的存活率。
又一方面，本文公开了一种将活性化合物递送至生物细胞的方法，其包括使生物细胞与纳米颗粒组合物接触，该纳米颗粒组合物包含活性化合物，或其药学上可接受的盐或前药；聚乙二醇化维生素E化合物；和至少一种油相组分，该活性化合物包含与ω-3多不饱和脂肪酸部分共价连接的核碱基类似物部分。
又一方面，本文公开了一种制备纳米颗粒组合物的方法，其包含将以下项组合：活性化合物，或其药学上可接受的盐或前药；聚乙二醇化维生素E化合物；和至少一种油相组分，该活性化合物包含与ω-3多不饱和脂肪酸部分共价连接的核碱基类似物部分。在一些实施例中，该方法中不使用有机溶剂。
本公开的其他方面和优点的一部分将在详细说明和任何随后的权利要求中阐述，并且一部分将从详细说明中推导得出或可以通过本公开的各个方面的实践而习得。下文所述的优点将通过随附权利要求中特别指出的要素与组合来实现和获得。应理解，以上一般描述和以下详细描述两者仅是示例性和解释性的并且并不限制本公开。
附图说明
并入在本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图阐明本公开的某些示例，并且与说明书一起用于非限制性地解释本公开的原理。类似的编号在整个附图中代表相同的要素。
图1A-1C是显示DHA-dFdC的量对所得DHA-dFdC-SLN的稳定性的影响的图表和图像。在4℃下储存6天后，分析所得DHA-dFdC-SLN的颗粒大小(图1A)、多分散指数(图1B)和zeta电位(图1C)。所示数据是平均值±SD(n＝3)。图1D显示了用5.2mg DHA-dFdC制备的DHA-dFdC-SLN的代表性颗粒大小分布曲线。图1E显示了用5.2mg DHA-dFdC制备的DHA-dFdC-SLN的代表性TEM图像(比例尺＝200nm)。图1F显示了用5.2mg DHA-dFdC制备的DHA-dFdC-SLN的代表性凝胶渗透色谱。DHA-dFdC-SLN上样到Sepharose 4B柱，洗脱级分为0.5mL。
图2A-2C是显示DHA-dFdC和DHA-dFdC-SLN作为冻干粉末的稳定性的图。在将DHA-dFdC-SLN(由5.2mg DHA-dFdC制成)冻干并在室温下储存后0、7和30天，分析DHA-dFdC-SLN的颗粒大小(图2A)和剩余在DHA-dFdC-SLN中的DHA-dFdC的浓度(图2B)。图2C显示了在室温下储存14天时，在含有5.047％(w/w)维生素E的干燥蜡状固体中的DHA-dFdC的化学稳定性。***p<0.001。数据是平均值±S.D.。(n＝3)。
图3是显示DHA-dFdC从DHA-dFdC-SLN(由5.2mg DHA-dFdC制成)的体外释放曲线的图。还测量了DHA-dFdC(在Tween 20胶束中)穿过透析膜的扩散。数据是平均值±SD(n＝3)。
图4A-4C是显示DHA-dFdC-SLN(由5.2mg DHA-dFdC制成)对以下细胞的细胞毒性的图：M-Wnt细胞(图4A)、B16-F10细胞(图4B)和TC-1细胞(图4C)。将纳米颗粒与M-Wnt细胞孵育24小时，并与B16-F10细胞或TC-1细胞孵育48小时。作为对照，细胞还与不含DHA-dFdC的SLN(“空白-SLN”)、溶解在DMSO中的DHA-dFdC(“DHA-dFdC”)或等浓度的DMSO(“DMSO”)，或单独的细胞培养基一起孵育。所示数据是平均值±SD(n>3)。
图5是显示在将DHA-dFdC-SLN的悬浮液静脉内注射到C57BL/6小鼠中之后的不同每小时(h)时间点，血浆DHA-dFdC浓度(μg/mL)的图。DHA-dFdC的剂量是每只小鼠2mg。使用PKSolver拟合数据，假设为两室模型。
图6A和6B是显示DHA-dFdC-SLN对小鼠中B16-F10肿瘤的抗肿瘤活性的图。在第0天，向C57BL76小鼠经皮下(s.c.)注射B16-F10肿瘤。在第7天，将小鼠随机分为5组(n＝5-6)，并在第7、10、13和16天静脉内(i.v.)注射DHA-dFdC-SLN、载体中的DHA-dFdC、空白-SLN(不含DHA-dFdC的SLN)。DHA-dFdC的剂量为50mg/kg。在治疗的静脉内注射后，对肿瘤生长(图6A)和体重变化(图6B)进行分析。作为对照，一组小鼠未经治疗。所示的数据示是平均值±SEM。p<0.05；a DHA-dFdC-SLN相比于未治疗；b DHA-dFdC-SLN相比于DHA-dFdC；c DHA-dFdC-SLN相比于空白-SLN；d DHA-dFdC-SLN相比于载体。
图7A-7G是被静脉内注射DHA-dFdC-SLN、不含DHA-dFdC的SLN、载体中的DHA-dFdC、单独的载体的C57BL76小鼠或未治疗的对照中，B16-F10肿瘤的一组代表性H&E图像。在第17天对小鼠实施安乐死以收集肿瘤组织。未治疗(图7A)、载体(图7B)和空白-SLN(图7C)组的肿瘤组织以200X的放大倍数展示；而DHA-dFdC(图7D和7E)和DHA-dFdC-SLN(图7F和7G)组的肿瘤组织由两种不同的放大倍数(100X(图7D和7F)、200X(图7E和7G))展示。100X图像中的比例尺代表100μm，200X图像中的比例尺代表50μm。黑色圆圈代表肿瘤区域，虚线代表坏死区域，黑色箭头代表凋亡细胞，星号代表结缔组织生成，白色箭头代表血管，乘号代表浸润区域，黑色方块代表结缔组织区域，而星星代表坏死细胞。
图8A-8G显示DHA-dFdC-SLN在模拟胃肠液中的稳定性。DHA-dFdC-SLN与模拟胃液(SGF)(pH 1.2)或模拟肠液(SIF)(pH 6.8)在37℃下孵育。在第0、1、2、4和6小时收集样品，并测量颗粒直径(图8A)。作为对照，还将DHA-dFdC-SLN与PBS孵育。数据表示为平均值±SD(n＝3)。图8B-8G中显示的是与PBS孵育0小时和6小时的DHA-dFdC-SLN(分别为图8B和8C)、与SIF孵育0小时和6小时的DHA-dFdC-SLN(分别为图8D和8E)或与SGF孵育0小时和6小时的DHA-dFdC-SLN(分别为图8F和8G)的代表性TEM图像。比例尺＝500nm。
图9是显示DHA-dFdC在模拟胃肠液中从DHA-dFdC-SLN的体外释放曲线的图。作为对照，还监测了DHA-dFdC(在Tween 20胶束中的DHA-dFdC)穿过透析膜的扩散。数据是平均值±SD(n＝3)。
图10是显示在健康C57BL/6小鼠中经口服施用DHA-dFdC-SLN的悬浮液或DHA-dFdC的Tween 20-乙醇-水溶液或静脉内施用DHA-dFdC-SLN的悬浮液后，血浆DHA-dFdC浓度-时间曲线的图。DHA-dFdC的剂量是每只小鼠2mg。数据表示为平均值±S.D.。(n＝3)。
图11是显示用DHA-dFdC-SLN口服治疗后B16-F10荷瘤小鼠的存活曲线的图。在第0天注射(s.c.)肿瘤细胞。在第7天，小鼠被随机分组，并用DHA-dFdC-SLN的悬浮液或DHA-dFdC的Tween 80-乙醇水溶液经口服灌胃。作为对照，小鼠接受不含DHA-dFdC的SLN(空白-SLN)或未治疗。*p<0.05，DHA-dFdC-SLN相对于所有其他组(对数秩Mantel-Cox检验。所示的数据示是平均值±S.D.。(n＝7-8)。
图12A-12C是显示DHA-dFdC-SLN的代表性颗粒大小分布曲线的图，DHA-dFdC-SLN是采用以下不同浓度的D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)制备：0.4375mg TPGS(图12A)；0.875mg TPGS(图12B)；1.75mg TPGS(图12C)。
图13是用5.31mg DHA制备的DHA-SLN的代表性TEM图像(比例尺＝100nm)。
图14是用2.5mg多西他赛制备的多西他赛-SLN的代表性TEM图像(比例尺＝100nm)。
具体实施方式
本公开的以下描述被提供作为本公开在其当前已知的最好实施例中的可行教导。为此，相关领域的技术人员将认识到并理解，可以对本文描述的本发明的各种实施例进行许多改变，同时仍然获得本公开的有益结果。还显而易见的是，通过选择本公开的一些特征而不采用其他特征，可以获得本公开的一些期望的益处。因此，本领域技术人员将认识到，对本公开的许多修改和变动是可能的，并且在某些情况下甚至可能是合乎需要的并且是本公开的一部分。因此，提供以下描述来说明本公开的原理，但不对其进行限制。
术语
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科技术语都与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。提供以下定义是为了充分理解本说明书中使用的术语。
本发明公开了用于制备本发明所公开的组合物，以及在本文所公开的方法中使用的组合物本身。本文公开了这些及其他材料，并且应当理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、基团等时，虽然可能未明确公开这些化合物的各种不同的个体和集体组合和排列的具体参考，但是其中每一个在本文中均予以特别考虑和描述。例如，如果公开并且讨论了特定纳米颗粒并且讨论了可以对纳米颗粒进行的许多修改，除非指明是相反情况，否则具体考虑到纳米颗粒的每种组合和排列以及可能的修改。因此，如果公开了一类纳米颗粒A、B和C以及一类纳米颗粒D、E和F以及组合纳米颗粒的示例，或者例如公开了包含A-D的组合纳米颗粒，那么即使未单独引用其中每一项，也认为公开了单独和集体设想的含义组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F。同样，还公开了这些组合的任何子集或组合。因此，例如，将认为公开了A-E、B-F和C-E的子组。该概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用本发明所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的各种附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每一个均可用本发明所公开的方法的任何特定实施例或实施例的组合来执行。
应当理解，本文所公开的组合物具有某些功能。本文公开了用于执行本发明所公开的功能的某些结构要求，并且应当理解，存在可执行与本发明所公开的结构相关的相同功能的各种结构，并且这些结构将最终实现相同的结果。
除非另外明确指明，否则决不旨在将本文所述的任何方法解释为要求以特定顺序执行其步骤。因此，在方法权利要求实际上并未表述其步骤所遵循的顺序或者在权利要求书或说明书中没有特别指出该步骤将被限制为特定顺序的情况下时，则决非旨在在任何方面推断出某一顺序。这适用于任何可能的非表述的解释基础，包括：关于步骤或操作流程的排列的逻辑问题；源于语法组织或标点符号的普通含义；以及说明书中描述的实施例的数量或类型。
如本说明书和权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。例如，术语“药剂”包括多种药剂，其中包括它们的混合物。
如本文所用，术语“可”、“任选地”和“可任选地”可互换使用，并且意指包括发生疾病的情况以及不发生疾病的情况。因此，例如，制剂“可包含赋形剂”的陈述意在包括其中制剂包含赋形剂的情况以及制剂不包含赋形剂的情况。
向受试者“给药/施用”包括向受试者引入或递送药剂的任何途径。可通过任何合适的途径进行施用，包括口服、局部、静脉内、皮下、经皮、穿皮、肌肉内、关节内(intra-joint)、肠外、小动脉内、皮内、脑室内、颅内、腹腔内、病变内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入、通过植入的存贮器、肠外(例如，皮下、静脉内、肌肉内、关节内(intra-articular)、滑膜内、胸骨内、鞘内、腹腔内、肝内、病变内和颅内注射或输注技术)等。如本文所用的“并行施用”、“联合施用”、“同时施用”或“同时地施用”是指将多种化合物在相同的时间点或基本上一种紧接着一种地施用。在后一种情况下，该两种化合物的施用时间足够接近，以至于观察到的结果与在同一时间点施用化合物时获得的结果不可区分。“全身施用”是指通过将药剂引入或递送到受试者身体的广泛区域(例如，超过身体的50％)的途径，例如通过进入循环或淋巴系统，将药剂引入或递送给受试者。相比之下，“局部施用”是指通过一条途径向受试者引入或递送药剂，该途径将该药剂引入或递送到紧邻施用点的一个或多个区域，并且不以治疗上显著的量系统地引入该药剂。例如，局部施用的药剂在局部施用点的附近很容易被检测到，但在受试者身体的远侧部分不可检测到或检测到的量可以忽略不计。施用包括自我施用和他人施用。
短语“和/或”的使用表示可以使用选项列表中的任何一个或任何组合。例如，“A、B和/或C”表示“A”或“B”或“C”，或“A和B”，或“A和C”，或“B和C”，或“A和B和C”。
“药学上可接受的”组分可指并非生物学上或以其他方式不可取的组分，例如，该组分可掺入本发明的药物制剂中并施用于如本文所述的受试者，而不引起显著的不良生物效应或以有害的方式与包含该组分的制剂的任何其他组分相互作用。当用于提及对人类的施用时，该术语通常意味着该组分已达到毒理学和制造试验的要求标准，或者它被包括在美国食品药品监督管理局所制定的非活性成分指南中。
“药学上可接受的载体”(有时称为“载体”)意指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括兽医和/或人类药用或治疗用的可接受的载体。术语“载体”或“药学上可接受的载体”可包括但不限于磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液(诸如油/水或水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用，术语“载体”包括但不限于任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、脂质或本领域中熟知的用于药物制剂的其他材料，并且如本文中进一步描述。
“治疗剂”是指任何具有有益生物效应的组合物。有益的生物效应包括治疗效应和预防效应，其中治疗效应例如治疗障碍或其他不良生理病症，而预防效应例如预防障碍或其他不良生理病症(例如，类风湿性关节炎、癌症)。该术语还涵盖本文中具体提及的有益药剂在药学上可接受的药理活性衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前体药剂、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“治疗剂”时，或者当明确标识特定的药剂时，应当理解，该术语包括药剂本身以及在药用的药理活性盐、酯、酰胺、前体药剂、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。
组合物(例如，包含药剂的组合物)的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指有效地达到所需的治疗结果的量。在一些实施例中，所需的治疗结果是控制肿瘤生长。给定治疗剂的治疗有效量通常将根据诸如所治疗的障碍或疾病的类型和严重程度以及受试者的年龄、性别、体重和总体状况等因素而变化。因此，并不总是能够指定量化的“治疗有效量”。然而，任何受试者病例中的适当的“治疗有效量”可由本领域的普通技术人员使用常规实验方法确定。术语还可指有效促进所需的治疗效应(诸如疼痛缓解)的治疗剂的量或治疗剂的递送速率(例如，随时间推移的量)。精确的所需治疗效应将根据待治疗的病症、受试者的耐受性、待施用的药剂和/或药剂制剂(例如，治疗剂的效力、制剂中的药剂浓度等)，以及本领域中的普通技术人员所理解的各种其他因素而变化。应理解，除非另外具体说明，治疗剂的“治疗有效量”还可指预防有效量的量。在一些情况下，在向受试者连续几天、几周或几年施用多种剂量的该组合物后，可获得所需的生物或医学反应。
“治疗(Treat、treating或treatment)”及其在本文中使用的语法变体包括组合物的施用，其目的在于部分或完全延迟、治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改进、改善、稳定、减缓和/或降低一种或多种疾病或病症的强度或频率，一种疾病或病症的症状，或一种疾病或病症的根本原因。根据本发明所述的治疗可预防性、姑息性或补救性地应用。预防性治疗是在发病前(例如，在出现明显的癌症迹象之前)、在早期发作期间(例如，在癌症的初始体征和症状之后)或在癌症的确定发展之后施用到受试者。预防性施用可在感染症状出现之前一天或数天至数年发生。
范围可以在本文中表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一特定值。当表达此类范围时，另一实施例包括从一个特定值和/或至另一个特定值。相似地，在利用前词“约”将值表示为近似值时，应当理解，该特定值形成另一个实施例。还应当理解，每一个范围的端点在相对于另一个端点和独立于另一个端点方面都是显著的。还应当理解，本文公开了许多值，并且每一个值在本文中除值本身之外还被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。
如在本文中所使用的术语“被取代的”预期包括有机化合物的所有可允许的取代基。从广义方面，可允许的取代基包括有机化合物的无环和环状的、支化和非支化的、碳环和杂环的及芳香族和非芳香族的取代基。示例性取代基包括例如下面描述的那些。对于合适的有机化合物，可允许的取代基可以是一个或多个并且是相同或不同的。出于本公开的目的，杂原子(诸如氮)可以具有氢取代基和/或本文所述的满足杂原子价态的有机化合物的任何可允许的取代基。本公开并不旨在以任何方式受限于有机化合物的可允许的取代基。此外，术语“取代”或“被……取代”包括这样的隐含条件，即这种取代遵循被取代原子和取代基所允许的价，并且该取代产生稳定的化合物，例如不会自发地通过例如重排、环化、消除等进行转化的化合物。
“Z1”、“Z2”、“Z3”和“Z4”在本文中用作表示各种特定的取代基的通用符号。这些符号可以是任何取代基，不限于本文公开的那些，并且它们在一种情况下被定义为某些取代基，而在另一种情况下又可以被定义为一些其他的取代基。
如本文所用，术语“脂族”是指非芳族烃基并且包括有支链和无支链的烷基、烯基或炔基基团。
如本文所用，术语“烷基”是具有1至24个碳原子(例如1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10或1至15个碳原子)的有支链或无支链的饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。烷基基团还可以是被取代的或未被取代的。烷基基团可以被一个或多个基团取代，其包括但不限于烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、甲酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、磺基-氧代、磺酰基、砜、亚砜或硫醇，如下文所述。
在整个说明书中，“烷基”通常用于指代未取代的烷基基团和取代的烷基基团二者；然而，取代的烷基基团在本文中也通过识别烷基基团上的特定取代基而具体地指代。例如，术语“卤代烷基”具体是指被一种或多种卤化物(例如氟、氯、溴或碘)取代的烷基基团。术语“烷氧基烷基”具体是指被一种或多种烷氧基基团取代的烷基基团，如下所述。术语“烷基氨基”具体是指被一种或多种氨基基团取代的烷基基团，如下所述，等等。当在一种情况下使用“烷基”而在另一种情况下使用特定术语如“烷基醇”时，这并不意味着暗示术语“烷基”无法同样指代诸如“烷基醇”等的特定术语。
这种实践也用于本文所述的其他基团。也就是说，虽然诸如“环烷基”等的术语指的是未取代的和取代的环烷基部分，但是取代的部分可以另外在本文中具体识别；例如，特定取代的环烷基可以是指例如“烷基环烷基”。类似地，取代的烷氧基可以具体地是指例如“卤代烷氧基”，特定取代的烯基可以是例如“烯基醇”等。同样，使用通用术语如“环烷基”和特定术语如“烷基环烷基”的实践并不意味着暗示该通用术语无法同时包括该特定术语。
如本文所用，术语“烷氧基”是通过单个末端醚键连接的烷基基团；即，“烷氧基”基团可定义为-OZ1，其中Z1是如上定义的烷基。
如本文所用，术语“烯基”是具有2至24个碳原子(例如2至5、2至10、2至15或2至20个碳原子)的烃基，其结构式包含至少一个碳-碳双键。不对称结构如(Z1Z2)C＝C(Z3Z4)旨在包括E异构体和Z异构体二者。这可以在其中存在不对称烯烃的本文结构式中推定，或者可以通过键符号C＝C明确表示。烯基基团可以被一个或多个基团取代，其包括但不限于烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、甲酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、磺基-氧代、磺酰基、砜、亚砜或硫醇，如下所述。
如本文所用，术语“炔基”是具有2至24个碳原子(例如2至5、2至10、2至15或2至20个碳原子)的烃基，其结构式包含至少一个碳-碳三键。炔基基团可以被一个或多个基团取代，其包括但不限于烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、甲酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、磺基-氧代、磺酰基、砜、亚砜或硫醇，如下文所述。
如本文所用，术语“芳基”是包含任何基于碳的芳族基团的基团，包括但不限于苯、萘、苯基、联苯基、苯氧基苯等。术语“杂芳基”定义为包含芳族基团的基团，该芳族基团具有掺入芳族基团的环内的至少一个杂原子。杂原子的示例包括但不限于氮、氧、硫和磷。包括在术语“芳基”中的术语“非杂芳基”定义了包含不含杂原子的芳族基团的基团。芳基或杂芳基基团可以是被取代的或未被取代的。芳基或杂芳基基团可以被一个或多个基团取代，其包括但不限于烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、甲酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、磺基-氧代、磺酰基、砜、亚砜或硫醇，如本文所述。术语“联芳基”是特定类型的芳基基团并且包括在芳基的定义中。联芳基是指经由稠环结构连接在一起的两个芳基基团，如在萘中，或是经由一个或多个碳-碳键附接的两个芳基基团，如在联苯中。
如在本文中所使用的术语“环烷基”是由至少三个碳原子组成的不基于芳香族碳的环。环烷基基团的示例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。术语“杂环烷基”是如上定义的环烷基基团，其中环的至少一个碳原子被杂原子(诸如，但不限于氮、氧、硫或磷)取代。环烷基基团和杂环烷基基团可以是被取代的或未被取代的。环烷基基团和杂环烷基基团可以被一个或多个基团取代，其包括但不限于烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、甲酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、磺基-氧代、磺酰基、砜、亚砜或硫醇，如本文所述。
如本文所用，术语“环烯基”是由至少三个碳原子组成并包含至少一个双键(即C＝C)的非芳族碳基环。环烯基基团的示例包括但不限于环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、环己二烯基等。术语“杂环烯基”是如上定义的一类环烯基基团，并且包括在术语“环烯基”的含义内，其中环的至少一个碳原子被杂原子(诸如，但不限于氮、氧、硫或磷)取代。环烯基基团和杂环烯基基团可以是被取代的或未被取代的。环烯基基团和杂环烯基基团可以被一个或多个基团取代，其包括但不限于烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、甲酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、磺基-氧代、磺酰基、砜、亚砜或硫醇，如本文所述。
术语“环状基团”在本文中用于指芳基基团、非芳基基团(即环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基基团)或这两者。环状基团具有一个或多个可以被取代或未被取代的环系。环状基团可包含一个或多个芳基基团、一个或多个非芳基基团或一个或多个芳基基团和一个或多个非芳基基团。
如本文所用，术语“羰基”由式–C(O)Z1表示，其中Z1可以是上述的氢、羟基、烷氧基、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基基团。在整个说明书中，“C(O)”或“CO”是C＝O的简写符号。
如本文所用，术语“醛”由式—C(O)H表示。
如本文所用，术语“胺”或“氨基”由式—NZ1Z2表示，其中Z1和Z2可各自为如本文所述的取代基，例如上述的氢、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基基团。“酰胺基”是—C(O)NZ1Z2。
如本文所用，术语“甲酸”由式—C(O)OH表示。如本文所用，“甲酸根”或“羧基”基团由式—C(O)O-表示。
如本文所用，术语“酯”由式—OC(O)Z1或—C(O)OZ1表示，其中Z1可以是上述的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基基团。
如本文所用，术语“醚”由式Z1OZ2表示，其中Z1和Z2可以独立地是上述的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基基团。
如本文所用，术语“酮”由式Z1C(O)Z2表示，其中Z1和Z2可以独立地是上述的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基基团。
如本文所用，术语“卤化物”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
如本文所用，术语“羟基”由式—OH表示。
如本文所用，术语“硝基”由式—NO2表示。
如本文所用，术语“甲硅烷基”由式—SiZ1Z2Z3表示，其中Z1、Z2和Z3可以独立地是上述的氢、烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基基团。
本文中使用术语“磺酰基”来指代由式—S(O)2Z1表示的磺基-氧代基团，其中Z1可以是上述的氢、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基基团。
如本文所用，术语“磺酰氨基”或“磺酰胺”由式—S(O)2NH—表示。
如本文所用，术语“硫醇”由式—SH表示。
如本文所用，术语“硫基”由式—S—表示。
如本文所用，“R1”、“R2”、“R3”、“Rn”等(其中n是一些整数)可独立地具有一个或多个下列基团。例如，如果R1是直链烷基基团，则该烷基基团的一个氢原子可以任选地被羟基基团、烷氧基基团、胺基基团、烷基基团、卤化物等取代。根据所选择的基团，第一基团可以掺入第二基团内，或者替代地，第一基团可以悬挂(即，附接)到第二基团。例如，对于短语“包含氨基基团的烷基基团”，氨基基团可以掺入烷基基团的主链内。替代地，氨基基团可以附接到烷基基团的主链。所选择的基团的性质将决定第一基团是嵌入第二基团还是附接到第二基团。
除非另有相反的说明，化学键仅以实线表示而不以楔形或虚线表示的式考虑了每种可能的异构体，例如每种对映体、非对映体和内消旋化合物，以及异构体的混合物，诸如外消旋或部分消旋混合物。
纳米颗粒组合物
应当理解，本公开的纳米颗粒可以与本文公开的各种组合物、方法、产品和应用组合使用。
通过提供具有较高的药物化合物和/或营养化合物掺入效率并且其中当在体内施用时这些化合物缓慢释放的纳米颗粒，本公开满足了本领域的需求。纳米颗粒可以掺入大量的药物化合物和/或营养化合物，用于在靶组织(例如肿瘤)处递送，同时减少对非靶组织的递送。纳米颗粒主要由属于公认为安全(GRAS)的组分的组分组成，从而便于其在药物应用和/或营养应用中的使用。纳米颗粒可以理想地增加活性化合物在体内的口服生物利用度。在肿瘤模型中，载药纳米颗粒可以有效杀死肿瘤细胞并降低肿瘤生长速率，或延长荷瘤受试者的存活期。非常出乎意料的是，纳米颗粒的一些实施例可以促进结缔组织包裹肿瘤，从而减缓所述肿瘤的生长速率。
固体脂质纳米颗粒(SLN)可用作水溶性差的药物的递送系统(Feng,等人，CancerLetters,2013,334,(2),157-175；
Figure BDA0003485228070000141
等人，Euro.J.Pharma.Biopharma.,2000,50,(1),161-177；Geszke-Moritz,等人，Mater.Science Engineering,C 2016,68,982-994)。
DHA-dFdC具有优异的抗肿瘤特性，但水溶性较差。为了提高水溶性差的化合物如DHA-dFdC的水溶性和化学稳定性，本文公开了一种新型固体脂质纳米颗粒(SLN)制剂，其可以包含DHA-dFdC(本文称为“DHA-dFdC-SLN”)。该制剂进一步包含聚乙二醇化维生素E化合物，例如D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)。TPGS是天然维生素E的水溶性衍生物，由维生素E琥珀酸酯与聚乙二醇(PEG)酯化而成(Zhang,等人，Biomat.,2012,33,(19),4889-4906)。TPGS在药物制剂中用作乳化剂、增溶剂、吸收促进剂、渗透促进剂和/或稳定剂(Zhang,等人，Biomat.,2012,33,(19),4889-4906；Mu,等人，J.Controlled Release,2002,80,(1),129-144；Cho,等人，Intl.J.Nanomed.,2014,9,495；Muthu,等人，Intl.J.Pharma.,2011,421,(2),332-340)。TPGS还可比α-生育酚或维生素E具有更强的抗氧化活性(Carini,等人，Biochem.Pharma.,1990,39,(10),1597-1601；Anstee,等人，J.Hepatology,2010,53,(3),542-550)。此外，TPGS是一种P-gp抑制剂，可以帮助克服肿瘤细胞的多药耐药性(Zhang,等人，Biomat.,2012,33,(19),4889-4906；Muthu,等人，Intl.J.Pharma.,2011,421,(2),332-340；Li,等人，Intl.J.Pharma.,2016,512,(1),262-272；Zhu,等人，Biomat.,2014,35,(7),2391-2400)。此外，TPGS可诱导凋亡，并与某些癌症化疗药物如多西他赛、紫杉醇和多柔比星具有协同作用(Zhu,等人，Biomat.,2014,35,(7),2391-2400；Mi,等人，Biomat.,2011,32,(16),4058-4066；Youk,等人，J.Controlled Release,2005,107,(1),43-52；Assanhou,等人，Biomat.,2015,73,284-295；Yu,等人，Acta Biomaterialia,2015,14,115-124)。
本文公开了一种纳米颗粒组合物，其包含1)活性化合物，或其药学上可接受的盐或前药；2)聚乙二醇化维生素E化合物；和3)至少一种油相组分。“活性化合物”是指当以足以实现治疗和/或营养益处的剂量向受试者施用时，该化合物可以提供治疗和/或营养益处，而不会引起显着的副作用。活性化合物可以是能够掺入所公开的纳米颗粒中的任何活性化合物。特别理想的活性化合物包括疏水性和/或亲脂性活性化合物，或通常水溶性差的化合物。在一些实施例中，活性化合物可包含烷基基团，其可为不饱和烷基基团。在一些实施例中，烷基基团可包含至多50个碳原子。在一些实施例中，烷基基团可包含至多40个碳原子、至多30个碳原子、至多25个碳原子、至多20个碳原子、至多15个碳原子或至多10个碳原子。在一些实施例中，烷基基团可包含约10至约50个碳原子、约10至约40个碳原子、约15至约30个碳原子或约20至约25个碳原子。在一些实施例中，活性化合物可包含多不饱和脂肪酸(PUFA)部分。
可掺入所公开的纳米颗粒中的活性化合物的非限制性示例包括DHA-dFdC、多西他赛、视黄酸、二十二碳六烯酸、维生素A、阿替洛尔、奥美沙坦酯、甲芬那酸、双氯芬酸钠、塞来昔布、吲哚美辛、雷洛昔芬、氟他胺、替硝唑、氯硝西泮、酮洛芬、氟康唑、布洛芬、美洛昔康、泼尼松龙、醋氯芬酸、茶碱、头孢克肟、依托考昔、替米沙坦、尼美舒利、厄贝沙坦、环糊精、比卡鲁胺、草酸艾司西酞普兰、格列吡嗪、地塞米松、樟脑、萘普生、丙酸、姜黄素、氧氟沙星、诺氟沙星、依泽替胺、茚地那韦、他林洛尔、阿仑膦酸盐、阿昔洛韦、地西泮、灰黄霉素、阿苯达唑、达那唑、酮康唑、伊曲康唑、阿托伐醌、曲格列酮、缬沙坦、尼美舒利、氯雷他定、非洛地平、普罗布考、泛醌、头孢克肟呋塞米、水杨酸、氢氯噻嗪、奈韦拉平、氯氮平、利福平、芬太尼、甲氧氟太尼、普萘洛尔、丙泊酚、硫喷妥钠、米诺地尔、它们的组合以及许多其他活性化合物。
在一些实施例中，活性化合物包含与ω-3多不饱和脂肪酸部分共价连接的核碱基类似物部分，或其药学上可接受的盐或前药。包含与ω-3多不饱和脂肪酸部分共价连接的核碱基类似物部分的活性化合物是已知的，并在美国专利申请公开2017/0157162中公开，其通过引用整体并入本文。
核碱基类似物部分可以是能够取代核酸中的正常核碱基的任何化学化合物。核碱基是在脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、核苷酸和核苷中发现的含氮生物化合物(例如，含氮碱基)。主要的核碱基是胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。腺嘌呤和鸟嘌呤属于被称为嘌呤的双环类分子。胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶都是嘧啶。修饰的核碱基包括次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。
核碱基类似物可包含抗代谢物。抗代谢物是一种抑制代谢物使用的化学物质，而代谢物是另一种化学物质，是正常代谢的一部分。这些物质通常与它们所干扰的代谢物在结构上相似。抗代谢物的存在可对细胞产生毒性作用，例如阻止细胞生长和细胞分裂，因此这些化合物可用作癌症的化学疗法或治疗病毒感染。
当核碱基与核糖或脱氧核糖的1'异头碳形成糖苷键时所形成的化合物被称为核苷，而在5'碳上附接一个或多个磷酸基团的核苷称为核苷酸。因此，如本文所用，核碱基类似物包括嘌呤类似物、嘧啶类似物、核苷类似物和核苷酸类似物。
嘌呤类似物是模拟代谢嘌呤的结构的抗代谢物。嘌呤类似物的示例包括但不限于硫唑嘌呤、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、氟达拉滨、喷司他丁和克拉屈滨。嘧啶类似物是模拟代谢嘌呤的结构的抗代谢物。示例包括但不限于5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷和6-氮杂尿嘧啶。
核苷类似物是在RNA或DNA合成中发挥类似核苷的作用的分子。一旦被磷酸化，它们就可以作为抗代谢物发挥作用，由于与核苷酸相似而可被掺入正在生长的RNA或DNA链中；但它们可以作为链终止剂。示例核苷类似物包括但不限于(脱氧)腺苷类似物、(脱氧)胞苷类似物、(脱氧)鸟苷类似物、(脱氧)胸苷类似物、(脱氧)尿苷类似物或其组合。如本文所用，例如，术语“(脱氧)腺苷”包括腺苷、脱氧腺苷及其组合。核苷类似物的其他示例包括但不限于吉西他滨、氟尿嘧啶、地达诺新、阿糖腺苷、阿糖胞苷、恩曲他滨、拉米夫定、扎西他滨、阿巴卡韦、恩替卡韦、司他夫定、替比夫定、齐多夫定、碘尿苷、三氟尿苷、阿普他滨或其组合。
多不饱和脂肪酸(PUFA)是具有长脂族尾部的脂肪酸，例如甲酸，其在主链中包含超过一个双键。脂肪酸有两个末端，即甲酸末端和甲基末端，其中甲酸末端被认为是链的开始，因此是“α”，而甲基末端被认为是链的尾部，因此是“ω”。脂肪酸的命名取自第一个双键的位置，从甲基末端，即ω端开始计数。因此，ω-3多不饱和脂肪酸是在碳链末端起的第三个碳原子处具有双键的多不饱和脂肪酸。ω-3PUFA的示例包括但不限于，α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。在一些实施例中，ω-3多不饱和脂肪酸选自二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、α-亚麻酸或其任何组合。在其他示例中，ω-3多不饱和脂肪酸选自十六碳三烯酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十一碳五烯酸、二十四碳五烯酸和二十四碳六烯酸或其任何组合。
包括ω-3、ω-6和ω-9脂肪酸在内的多不饱和脂肪酸(PUFA)对日常生活和功能至关重要。例如，ω-3脂肪酸如全顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(EPA)和全顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)降低血清甘油三酯的有益效果已得到充分证实。全顺式-9,12,15-十八碳三烯酸(ALA)是EPA和DHA的前体必需脂肪酸。全顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸(AA)及其前体全顺式-6,9,12-十八碳三烯酸(GLA)和全顺式-9,12-十八碳二烯酸(LA)已证明对婴儿有益。
ω-3多不饱和脂肪酸部分可以是合成的或可以来自(或衍生自)天然来源，例如来自鱼、藻类、乌贼、酵母和植物来源。
还已知多种这些化合物具有其他心脏保护益处，例如预防心律失常、稳定动脉粥样硬化斑块、减少血小板聚集和降低血压。例如，参见Dyrberg等人,In:Omega-3 FattyAcids:Prevention and Treatment of Vascular Disease。Kristensen等人,eds.,Bi&GiPubl.,Verona-Springer-Verlag,London,pp.217-26,1995；O’Keefe and Harris,Am.J.Cardiology2000,85:1239-41；Radack等人,Arch Intern Med 151:1173-80,1991；Harris,Curr Atheroscler Rep 7:375-80,2005；Holub,CMAJ 166(5):608-15,2002。实际上，美国心脏协会也报告说，ω-3脂肪酸可以降低心血管和心脏病的风险。PUFA的其他益处涉及预防和/或治疗炎症和神经退行性疾病以及改善认知发展。例如，参见Sugano andMichihiro,J.Oleo.Sci.,50(5):305-11,2001。
鉴于PUFA的健康益处，需要找到将这些和其他有益材料递送给受试者的新方法。然而，与许多PUFA相关的疏水性和氧化稳定性(例如，PUFA对氧化敏感)特性给将它们掺入组合物中带来了重大挑战。
应理解，本文提及的与核碱基类似物部分结合的特定PUFA可以是PUFA的混合物。例如，某些鱼油、乌贼油、海豹油、磷虾油、菜籽油、亚麻、真菌油和藻油可含有ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸和/或ω-9脂肪酸的混合物。如本文所公开的，可以使用这些混合物并将其与核碱基类似物缀合。
在一些实施例中，ω-3多不饱和酸部分可以直接结合到核碱基类似物部分。例如，如本文所公开的化合物可由下式表示：CH3-CH2-CH＝CH-Z-C(O)-XZ1，其中Z是包含至少一个双键的C3-C40烷基或烯基基团，Z1是核碱基类似物部分，并且X是NH或O。在一些实施例中，在核碱基类似物部分与ω-3多不饱和酸部分之间存在额外的配体或间隔基。因此，Z1可以是1到10个原子的连接基和之后的核碱基部分。
在一些示例中，核碱基类似物包含吉西他滨。在化学上，吉西他滨是一种核苷类似物，具体是一种脱氧胞苷类似物，其中脱氧胞苷(一种脱氧核糖核苷，DNA的一种组分)的2'碳上的氢原子被氟原子替换，如下所示。
Figure BDA0003485228070000181
与氟尿嘧啶和其他嘧啶类似物一样，吉西他滨的三磷酸类似物在DNA复制过程中取代核酸的一种构建单元，在这种情况下是胞苷。该过程会阻止肿瘤生长，因为只有一种额外的核苷可以附接到“错误的”核苷，从而导致凋亡。吉西他滨的另一个靶标是核糖核苷酸还原酶(RNR)。二磷酸类似物与RNR活性位点结合并使酶不可逆地失活。一旦RNR被抑制，细胞就不能产生DNA复制和修复所需的脱氧核糖核苷酸，从而诱导细胞凋亡。
本文公开的组合物可包含具有式I的化合物：
Figure BDA0003485228070000191
其中R1、R2和R3独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、硫醇、硫代烷基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、环烷基、杂环烷基、烷基芳基、芳基、烷基杂芳基、杂芳基或ω-3多不饱和脂肪酸，其中的任一个任选地被乙酰基、烷基、氨基、酰胺基、烷氧基、烷基羟基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羰基、卤素、羟基、硫醇、氰基或硝基取代；
条件是R1、R2或R3中的至少一个包含ω-3多不饱和脂肪酸；或其药学上可接受的盐或前药。
在一些示例中，一种或多种ω-3多不饱和脂肪酸与吉西他滨型化合物直接结合。在一些实施例中，在一种或多种ω-3多不饱和脂肪酸与吉西他滨型化合物之间存在额外的配体或间隔基。
在一些示例中，R1、R2和R3各自独立地包含ω-3多不饱和脂肪酸。在一些示例中，R1、R2或R3中的至少一个是CH3-CH2-CH＝CH-Z-C(O)-X-，其中Z是包含至少一个双键的C3-C40烷基或烯基基团并且X是NH或O。在其他示例中，R1、R2或R3中的至少一个是CH3-CH2-CH＝CH-Z-C(O)-X-L-，其中Z是包含至少一个双键的C3-C40烷基或烯基基团，并且L是1-10个原子的连接基，例如烷基或烷氧基连接基，并且X是NH或O。在一些示例中，R1和R2各自独立地包含ω-3多不饱和脂肪酸，而R3不包含ω-3多不饱和脂肪酸。在一些示例中，R2和R3各自独立地包含ω-3多不饱和脂肪酸，而R1不包含ω-3多不饱和脂肪酸。在一些示例中，R1和R3各自独立地包含ω-3多不饱和脂肪酸，而R2不包含ω-3多不饱和脂肪酸。在一些示例中，R2包含ω-3多不饱和脂肪酸，而R1和R3不包含ω-3多不饱和脂肪酸。在一些示例中，R3包含ω-3多不饱和脂肪酸，而R1和R2不包含ω-3多不饱和脂肪酸。在一些示例中，R1包含ω-3多不饱和脂肪酸，而R2和R3不包含ω-3多不饱和脂肪酸。
在式I的一些示例中，其中R2和R3是氢，化合物具有式IIA：
Figure BDA0003485228070000201
其中R1包含任选地被乙酰基、烷基、氨基、酰胺基、烷氧基、烷基羟基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羰基、卤素、羟基、硫醇、氰基或硝基取代的ω-3-多不饱和酸；或其药学上可接受的盐或前药。例如，公开了式IIA化合物，其中R1是CH3-CH2-CH＝CH-Z-C(O)-X-，其中Z是包含至少一个双键的C3-C40烷基或烯基基团，并且X是NH或O。
在式I的一些示例中，其中R1和R3是氢，化合物具有式IIB：
Figure BDA0003485228070000202
其中R2包含任选地被乙酰基、烷基、氨基、酰胺基、烷氧基、烷基羟基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羰基、卤素、羟基、硫醇、氰基或硝基取代的ω-3-多不饱和酸；或其药学上可接受的盐或前药。例如，公开了式IIB化合物，其中R2是CH3-CH2-CH＝CH-Z-C(O)-X-，其中Z是包含至少一个双键的C3-C40烷基或烯基基团，并且X是NH或O。
在式I的一些示例中，其中R1和R2是氢，化合物具有式IIC：
Figure BDA0003485228070000211
其中R3包含任选地被乙酰基、烷基、氨基、酰胺基、烷氧基、烷基羟基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羰基、卤素、羟基、硫醇、氰基或硝基取代的ω-3-多不饱和酸；或其药学上可接受的盐或前药。例如，公开了式IIC化合物，其中R3是CH3-CH2-CH＝CH-Z-C(O)-X-，其中Z是包含至少一个双键的C3-C40烷基或烯基基团，并且X是NH或O。
还公开了式I的化合物，其中R1、R2和R3中的超过一个包含任选地被乙酰基、烷基、氨基、酰胺基、烷氧基、烷基羟基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羰基、卤素、羟基、硫醇、氰基或硝基取代的ω-3-多不饱和酸；或其药学上可接受的盐或前药。
在式IIA的一些示例中，R1包含二十二碳六烯酸，化合物具有式IIIA：
Figure BDA0003485228070000212
或其药学上可接受的盐或前药。式IIB和IIC的其他示例是式IIIB和IIIC。
Figure BDA0003485228070000221
在式IIA的一些示例中，R1包含二十碳五烯酸，化合物具有式IV：
Figure BDA0003485228070000222
或其药学上可接受的盐或前药。式IIB和IIC的其他示例是式IVB和IVC。
Figure BDA0003485228070000223
本文公开的组合物还可包含所公开化合物的药学上可接受的盐和前药。药学上可接受的盐包括用酸或碱制备的所公开的化合物的盐，取决于化合物上发现的特定取代基。在本文公开的化合物具有足够碱性或酸性以形成稳定的无毒酸式盐或碱式盐的条件下，以盐的形式施用化合物可能是合适的。药学上可接受的碱加成盐的示例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐或镁盐。生理学上可接受的酸加成盐的示例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐和有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、丙二酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐、α-糖基磷酸盐、马来酸盐、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐等。因此，本文公开的是盐酸盐、硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、丙二酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐、α-糖基磷酸盐、马来酸盐、甲苯磺酸盐和甲磺酸盐。可以使用本领域熟知的标准方法获得化合物的药学上可接受的盐，例如，通过将足够碱性的化合物(诸如胺)与提供生理学上可接受的阴离子的合适的酸反应。也可以制备甲酸的碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)盐。
式I-IVC的化合物可以从盐酸吉西他滨开始制备。例如，可以保护吉西他滨的羟基基团，从而允许吉西他滨的胺基与多不饱和脂肪酸的甲酸基团之间发生亲核酰基取代。然后可以去除保护基团以得到吉西他滨-多不饱和脂肪酸化合物。
纳米颗粒组合物可包含至多约0.8重量百分比(w/v)的量的活性化合物，例如包含与ω-3多不饱和脂肪酸部分共价连接的核碱基类似物部分的活性化合物。如本文所用，“重量百分比(w/v)”是指溶液体积中溶质的百分比(固体克数/100mL溶液)。在一些实施例中，纳米颗粒组合物可包含至多约0.75重量百分比(w/v)、至多约0.7重量百分比(w/v)、至多约0.65重量百分比(w/v)、至多约0.6重量百分比(w/v)、至多约0.52重量百分比(w/v)、至多约0.5重量百分比(w/v)、至多约0.4重量百分比(w/v)、至多约0.3重量百分比(w/v)、至多约0.2重量百分比(w/v)或至多约0.1重量百分比(w/v)的量的活性化合物。在一些实施例中，组合物可包含从约0.1重量百分比(w/v)至约0.8重量百分比(w/v)、从约0.2重量百分比(w/v)至约0.7重量百分比(w/v)或从约0.3重量百分比(w/v)至约0.52重量百分比(w/v)的范围的量的活性化合物。
纳米颗粒组合物包含聚乙二醇化维生素E化合物。“聚乙二醇化维生素E化合物”指与一个或多个聚乙二醇(PEG)部分共价连接的一个或多个含维生素E的部分。维生素E部分是由一种或多种维生素E化合物组成的部分，可以表现出维生素E的一些特征特性，例如抗氧化特性。天然维生素E化合物大多是脂溶性的，并且包括生育酚和生育三烯酚。生育酚和生育三烯酚均可具有α、β、γ或δ同等型(例如，α-生育酚、γ-生育三烯酚等)。
与维生素E部分共价连接的聚乙二醇(PEG)没有特别限制，其大小范围可高达约10,000g/mol。在一些实施例中，PEG可具有至多约7,500g/mol、至多约5,000g/mol、至多约2,500g/mol、至多约2,000g/mol、至多约1,500g/mol或至多约1,000g/mol的大小。在一些实施例中，PEG可具有从约100g/mol至约10,000g/mol、从约200g/mol至约7,500g/mol、从约250g/mol至约6,000g/mol、从约400g/mol至约4,000g/mol、从约600g/mol至约3,000g/mol或从约750g/mol至约2,000g/mol的范围的大小。在一些实施例中，PEG可具有约1,000g/mol的大小。
聚乙二醇化维生素E化合物的一种特定形式是生育酚聚乙二醇，其有多种形式可商购获得。通常，生育酚聚乙二醇是通过用聚乙二醇(例如，PEG-1000)酯化D-α-生育酚酸琥珀酸酯制备的天然来源的维生素E的水溶性衍生物，通常被称为维生素E TPGS或简称为TPGS。各种形式的维生素E TPGS是已知的，并且在美国专利号2,680,749和10,213,490以及美国专利申请公开2007/0184117中公开，这些专利均通过引用而整体并入。在一些实施例中，聚乙二醇化维生素E化合物包含D-α-生育酚聚乙二醇，或更具体地包含D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯。
纳米颗粒组合物可包含至多约1.0重量百分比(w/v)的量的聚乙二醇化维生素E化合物。在一些实施例中，纳米颗粒组合物可包含至多约0.9重量百分比(w/v)、至多约0.8重量百分比(w/v)、至多约0.5重量百分比(w/v)、至多约0.2重量百分比(w/v)、至多约0.175重量百分比(w/v)、至多约0.1重量百分比(w/v)、至多约0.75重量百分比(w/v)、至多约0.5重量百分比(w/v)、至多约0.25重量百分比(w/v)、至多约0.1重量百分比(w/v)、至多约0.09重量百分比(w/v)、至多约0.0875重量百分比(w/v)、至多约0.08重量百分比(w/v)、至多约0.07重量百分比(w/v)、至多约0.05重量百分比(w/v)、至多约0.044重量百分比(w/v)或至多约0.02重量百分比(w/v)的量的聚乙二醇化维生素E化合物。在一些实施例中，纳米颗粒组合物可包含从约0.01重量百分比(w/v)至约1重量百分比(w/v)、从约0.02重量百分比(w/v)至约0.5重量百分比(w/v)、从约0.05重量百分比(w/v)至约0.25重量百分比(w/v)或从约0.0875重量百分比(w/v)至约0.175重量百分比(w/v)的范围的量的聚乙二醇化维生素E化合物。
活性化合物的量与聚乙二醇化维生素E化合物的量的比率可能很重要，特别是对于由此制成的所得纳米颗粒的总体大小和形态。在一些实施例中，活性化合物和聚乙二醇化维生素E化合物可以以从约1:10至约10:1的范围的重量比存在于纳米颗粒组合物中。在一些实施例中，活性化合物和聚乙二醇化维生素E化合物可以以从约1:1至约8:1、从约2:1至约6:1或从约3:1至约6:1的范围的重量比存在。
该组合物进一步包含至少一种油相组分。多种油相组分与所公开的纳米颗粒相容。油相组分可以是有支链或无支链的，并且任何给定的酰基链通常可以含有4至28个碳原子。油相组分的非限制性示例包括己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、木蜡酸、蜡酸、肉豆蔻油酸、棕榈油酸、十六碳烯酸、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、反式亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸、甘油单酯和甘油二酯、蒸馏单甘油酯、单硬脂酸甘油酯、己糖醇酐的脱水山梨糖醇酯、蔗糖酯、己糖醇酐的聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯，以及它们的化学衍生物和组合。
在一些实施例中，油相组分包含甘油磷脂的混合物。甘油磷脂的混合物可以来自天然来源或是商业生产的。此类甘油磷脂可包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和/或磷脂酸。在一些实施例中，油相组分包含卵磷脂。卵磷脂可以是动物衍生的或植物衍生的，并且可以来自特定来源，例如但不限于大豆、蛋、奶、鱼、油菜籽、棉籽和葵花籽油。
纳米颗粒组合物可包含至多约10重量百分比(w/v)的量的油相组分。在一些实施例中，组合物可包含至多约8重量百分比(w/v)、至多约6重量百分比(w/v)、至多约5重量百分比(w/v)、至多约4重量百分比(w/v)、至多约2重量百分比(w/v)、至多约1重量百分比(w/v)、至多约0.8重量百分比(w/v)、至多约0.75重量百分比(w/v)、至多约0.6重量百分比(w/v)、至多约0.5重量百分比(w/v)、至多约0.4重量百分比(w/v)、至多约0.25重量百分比(w/v)、至多约0.2重量百分比(w/v)或至多约0.1重量百分比(w/v)的量的油相组分。在一些实施例中，纳米颗粒组合物可包含从约0.01重量百分比(w/v)至约10重量百分比(w/v)、从约0.05重量百分比(w/v)至约5重量百分比(w/v)、从约0.1重量百分比(w/v)至约1重量百分比(w/v)、从约0.25重量百分比(w/v)至约0.75重量百分比(w/v)或从约0.3重量百分比(w/v)至约0.5重量百分比(w/v)的范围的量的油相组分。
任选地，纳米颗粒组合物可包含一种或多种另外的乳化剂。在一些实施例中，组合物可包含一种另外的乳化剂、两种另外的乳化剂、三种另外的乳化剂、四种另外的乳化剂或五种或更多种另外的乳化剂。一种或多种另外的乳化剂可以通过增加乳液的动力学稳定性来稳定乳液并且被认为是表面活性剂或表面活化剂。一种或多种另外的乳化剂有助于乳化纳米颗粒的非极性、亲脂性和/或疏水性组分。
一种或多种另外的乳化剂没有特别限制并且可以是阴离子乳化剂、阳离子乳化剂、非离子乳化剂或两性离子乳化剂。一种或多种另外的乳化剂也可以是另外的油相组分。在一些实施例中，作为非限制性示例，一种或多种另外的乳化剂选自磷脂酰胆碱；环氧乙烷共聚物、环氧丙烷共聚物、泊洛沙姆、脱水山梨糖醇环氧乙烷/环氧丙烷共聚物、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、脱水山梨醇酯、span 20、span 40、span 60、span 80、烷基芳基聚醚醇聚合物、泰洛沙泊、胆汁盐、胆酸盐、甘胆酸盐、牛磺胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐；双子表面活性剂和醇；改性淀粉或树胶混合物，例如阿拉伯树胶、黄原胶、瓜尔胶、改性阿拉伯树胶，和/或酯胶；金合欢胶、阴离子乳化蜡、硬脂酸钙、卡波姆、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、胆固醇、二乙醇胺、棕榈硬脂酸乙二醇酯、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、水合羊毛脂、羊毛脂醇、卵磷脂、中链甘油三酯、甲基纤维素、矿物油和羊毛脂醇、磷酸二氢钠、单乙醇胺、非离子乳化蜡、油酸、泊洛沙姆、泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、海藻酸丙二醇酯、自乳化单硬脂酸甘油酯、脱水柠檬酸钠、月桂基硫酸钠、脱水山梨糖醇酯、硬脂酸、葵花籽油、黄蓍胶、三乙醇胺、黄原胶、C14-C22脂肪醇，C14-C22脂肪醇的非限制性示例选自1-十四醇(肉豆蔻醇)、1-十六烷醇(鲸蜡醇)、顺式-9-十六烯-1-醇(棕榈油醇)、1-十八烷醇(硬脂醇)、顺式-9-十八烯-1-醇(油醇)、反式-9-十八烯-1-醇(反油醇)、1-二十烷醇(花生醇)和1-二十二烷醇(山嵛醇)。乳化剂的其他非限制性示例包括C14-C22脂肪醇与无机酸的酯，其选自二-1-十四烷基磷酸酯(二肉豆蔻基磷酸酯)、二-1-十六烷基磷酸酯(二鲸蜡基磷酸酯)、二-顺式-9-十六烯-1-基磷酸酯(二棕榈油基磷酸酯)、二-1-十八烷基磷酸酯(二硬脂基磷酸酯)、二-顺式-9-十八烯-1-基磷酸酯(二油烯基磷酸酯)、二-反式-9-十八烯-1-基磷酸酯(二反烯油基磷酸酯)、二-1-二十烷基磷酸酯(二花生醇磷酸酯)、二-1-二十二烷基磷酸酯(二山嵛基酯磷酸)、1-十四烷基硫酸酯(肉豆蔻基硫酸酯)、1-十六烷基硫酸酯(鲸蜡基硫酸酯)、顺式-9-十六烯-1-基硫酸酯(棕榈油基硫酸酯)、1-十八烷基硫酸酯(硬脂基硫酸酯)、顺式-9-十八烯-1-基硫酸酯(油烯基硫酸酯)、反式-9-十八烯-1-基硫酸酯(反烯油基硫酸酯)、1-二十烷基硫酸酯(花生醇硫酸酯)和1-二十二烷基硫酸酯(山嵛基酯硫酸)、单棕榈酸甘油酯、单油酸甘油酯等；单硬脂酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、单油酸甘油酯、脂肪酸甘油单酯和甘油二酯的乳酸酯、脂肪酸甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯、脂肪酸甘油单酯和甘油二酯的单乙酰酒石酸酯和二乙酰酒石酸酯、脂肪酸的蔗糖酯，例如蔗糖与脂肪酸的单酯、二酯和三酯；丙烷-1,2-二醇的脂肪酸酯，例如1-羟基丙-2-基十二酸酯、2-羟基丙基十二酸酯、丙烷-1,2-二基双十二酸酯、1-羟基丙-2-基十四酸酯、2-羟基丙基十四酸酯、丙烷-1,2-二基双十四酸酯、1-羟基丙-2-基十六酸酯、2-羟基丙基十六酸酯和丙烷-1,2-二基双十六酸酯；聚氧乙烯醇烷基醚；丙二醇、1,3-丁二醇、甘油、聚乙二醇、脱水山梨糖醇脂肪酸酯，以及它们的组合。
在一些实施例中，另外的乳化剂包括单硬脂酸甘油酯或聚山梨醇酯20。在一些实施例中，组合物包含两种另外的乳化剂，其可任选地包含单硬脂酸甘油酯和聚山梨醇酯20。
纳米颗粒组合物可包含至多约10重量百分比(w/v)的量的乳化剂。在一些实施例中，纳米颗粒组合物可包含至多约8重量百分比(w/v)、至多约6重量百分比(w/v)、至多约5重量百分比(w/v)、至多约4重量百分比(w/v)、至多约2重量百分比(w/v)、至多约1重量百分比(w/v)、至多约0.8重量百分比(w/v)、至多约0.75重量百分比(w/v)、至多约0.6重量百分比(w/v)、至多约0.5重量百分比(w/v)、至多约0.4重量百分比(w/v)、至多约0.25重量百分比(w/v)、至多约0.2重量百分比(w/v)或至多约0.1重量百分比(w/v)的量的另外乳化剂。在一些实施例中，纳米颗粒组合物可包含从约0.001重量百分比(w/v)至约10重量百分比(w/v)、从约0.005重量百分比(w/v)至约5重量百分比(w/v)、从约0.01重量百分比(w/v)至约1重量百分比(w/v)、从约0.01重量百分比(w/v)至约0.1重量百分比(w/v)或从约0.025重量百分比(w/v)至约0.075重量百分比(w/v)的范围的量的另外乳化剂。在一些另外的实施例中，纳米颗粒组合物可包含从约0.1重量百分比(w/v)至约10重量百分比(w/v)、从约0.5重量百分比(w/v)至约5重量百分比(w/v)、从约0.75重量百分比(w/v)至约2重量百分比(w/v)或从约0.8重量百分比(w/v)至约1.5重量百分比(w/v)的范围的量的另外乳化剂。在使用超过一种乳化剂(例如，第一另外乳化剂和第二另外乳化剂)的情况下，组合物内各种另外乳化剂的量可以相同、重叠或不同。作为非限制性示例，第一另外乳化剂可以以从约0.01重量百分比(w/v)至约0.1重量百分比(w/v)的范围的量存在，而第二另外乳化剂可以以从0.5重量百分比(w/v)至约5重量百分比(w/v)的范围的量存在。
所公开的纳米颗粒可以形成粉末、丸剂、胶囊或其他固体形式。例如，溶液中的所公开的纳米颗粒可以冻干成干粉形式。包含冻干保护剂(例如，蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、山梨糖醇)可以在冻干期间和固体形式中进一步稳定纳米颗粒。在此类实施例中，以占固体的重量百分比来描述组分成分可能是有用的，本文缩写为“重量百分比(b.o.s.)”。如本文所用，术语“占固体的重量百分比”或“重量百分比(b.o.s.)”是指固体组分在由活性化合物、聚乙二醇化维生素E化合物和油相组分组成的总固体中的百分比。公开的重量百分比(b.o.s.)不考虑可能存在或可能不存在的溶剂或任选的固体(例如，另外的乳化剂)。值得注意的是，重量百分比(b.o.s.)值的用途不限于纳米颗粒的粉末形式，并且同样适用于纳米颗粒的体积溶液制剂，或者指的是纳米颗粒的组分，而不考虑纳米颗粒所处的物理制剂。
纳米颗粒可包含至多约65重量百分比(b.o.s.)的量的活性化合物，例如包含与ω-3多不饱和脂肪酸部分共价连接的核碱基类似物部分的活性化合物。在一些实施例中，纳米颗粒可包含至多约62重量百分比(b.o.s.)、至多约60重量百分比(b.o.s.)、至多约55重量百分比(b.o.s.)、至多约50重量百分比(b.o.s.)、至多约45重量百分比(b.o.s.)或至多约40重量百分比(b.o.s.)的量的活性化合物。在一些实施例中，纳米颗粒物可包含从约35重量百分比(b.o.s.)至约65重量百分比(b.o.s.)、从约40重量百分比(b.o.s.)至约62重量百分比(b.o.s.)、从约50重量百分比(b.o.s.)至约62重量百分比(b.o.s.)、从约50重量百分比(b.o.s.)至约60重量百分比(b.o.s.)或从约50重量百分比(b.o.s.)至约55重量百分比(b.o.s.)的范围的量的活性化合物。在一些实施例中，纳米颗粒物可包含约62重量百分比(b.o.s.)、约61重量百分比(b.o.s.)、约60重量百分比(b.o.s.)、约59重量百分比(b.o.s.)、约58重量百分比(b.o.s.)、约57重量百分比(b.o.s.)、约56重量百分比(b.o.s.)、约55重量百分比(b.o.s.)、约54重量百分比(b.o.s.)、约53重量百分比(b.o.s.)、约52重量百分比(b.o.s.)、约51重量百分比(b.o.s.)或约50重量百分比(b.o.s.)的量的活性化合物。
纳米颗粒可包含至多约20重量百分比(b.o.s.)的量的聚乙二醇化维生素E化合物。在一些实施例中，纳米颗粒可包含至多约15重量百分比(b.o.s.)、至多约10重量百分比(b.o.s.)、至多约9重量百分比(b.o.s.)、至多约8重量百分比(b.o.s.)、至多约7重量百分比(b.o.s.)、至多约6重量百分比(b.o.s.)、至多约5重量百分比(b.o.s.)的量的聚乙二醇化维生素E化合物。在一些实施例中，纳米颗粒可包含从约1重量百分比(b.o.s.)至约20重量百分比(b.o.s.)、从约2重量百分比(b.o.s.)至约15重量百分比(b.o.s.)、从约3重量百分比(b.o.s.)至约10重量百分比(b.o.s.)或从约4重量百分比(b.o.s.)至约9重量百分比(b.o.s.)的范围的量的聚乙二醇化维生素E化合物。纳米颗粒可包含至多约80重量百分比(b.o.s.)的量的油相组分。在一些实施例中，纳米颗粒可包含至多约70重量百分比(b.o.s.)、至多约60重量百分比(b.o.s.)、至多约50重量百分比(b.o.s.)、至多约40重量百分比(b.o.s.)、至多约35重量百分比(b.o.s.)、至多约30重量百分比(b.o.s.)或至多约25重量百分比(b.o.s.)的量的油相组分。在一些实施例中，纳米颗粒可包含从约10重量百分比(b.o.s.)至约80重量百分比(b.o.s.)、从约15重量百分比(b.o.s.)至约60重量百分比(b.o.s.)、从约20重量百分比(b.o.s.)至约50重量百分比(b.o.s.)、从约25重量百分比(b.o.s.)至约45重量百分比(b.o.s.)或从约30重量百分比(b.o.s.)至约40重量百分比(b.o.s.)的范围的量的油相组分。
与活性化合物的固有水溶性(作为游离化合物)相比，所公开的纳米颗粒可增加活性化合物的水溶性。在一些实施例中，与活性化合物的固有水溶性相比，纳米颗粒可增加活性化合物的水溶性至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少150倍或至少200倍或更多。
所公开的纳米颗粒可进一步包含另外的治疗剂或诊断剂。例如，治疗剂或诊断剂可以是小分子或药物、化合物、氨基酸或多肽、核酸或多核苷酸、脂质、碳水化合物、糖脂、聚合物等。在一些实施例中，治疗剂或诊断剂可施用至受试者。
任选地，纳米颗粒可包含靶向分子以促进纳米颗粒在体内靶向特定区域。靶向分子通过特异性结合存在于特定组织或细胞类型中的配体，或通过被该特定组织或细胞类型中存在的细胞、分子或状况特异性改变，将纳米颗粒靶向被特定组织或细胞类型。靶向分子可以是任何肽、多肽、核酸、多核苷酸、碳水化合物、脂质、小分子或合成分子。例如，抗体可以将纳米颗粒靶向具有该抗体特异性结合的配体的细胞类型。抗体靶向分子可以是多克隆的、单克隆的、片段、重组的或单链的，其中许多是可商购的或使用标准技术容易地获得。靶向分子可以经由例如与纳米颗粒缔合的疏水连接基，或经由与表面分子(例如，乳化剂)的连接(例如，共价连接)而附接至纳米颗粒。
纳米颗粒的直径可在纳米范围内(例如，从1至1,000nm)。在一些实施例中，纳米颗粒具有1,000nm或更小、500nm或更小、300nm或更小或200nm或更小的直径。在一些实施例中，纳米颗粒具有从10nm至500nm、从10nm至300nm、从10nm至250nm、从10nm至200nm或从50nm至200nm的直径。通常，配制用于摄取或注射的纳米颗粒理想地具有200nm或更小的直径，这有利于纳米颗粒的体内吸收和循环。配制用于非摄入和非注射施用(例如，局部施用)的纳米颗粒可具有大于纳米范围(例如，从大于1,000nm到10,000nm)的直径。
如通过动态光散射法测量的，纳米颗粒可具有±5mV或更高的zeta电位。如通过动态光散射法测量的，纳米颗粒具有±10mV或更高、±15mV或更高、±20mV或更高、±25mV或更高、±30mV或更高、±40mV或更高、±50mV或更高、±60mV或更高或±70mV或更高的zeta电位。在实施例中，纳米颗粒具有约-20至约-70mV、约-30至约-60mV或约-50至约-60mV的zeta电位。
纳米颗粒可对活性化合物具有有效或有利的包封效率。如本文所用，术语“包封效率”是指在与聚乙二醇化维生素E化合物和油相组分的混合物中提供的活性化合物最终被由此形成的纳米颗粒包封的百分比。纳米颗粒可具有大于10％的活性化合物的包封效率，或大于25％、大于50％、大于75％、大于90％、大于95％、大于97％或大于98％的活性化合物的包封效率。
纳米颗粒可具有有利的突释(例如，有利的低程度突释)，其是在37℃下经一段时间从水溶液(例如，pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS))中的纳米颗粒释放的活性化合物的百分比。在一些实施例中，在37℃的水溶液中24小时后，纳米颗粒具有50％或更小、25％或更小、10％或更小或5％或更小的活性化合物的突释。
在一些实施例中，可将纳米颗粒配制在药物中。纳米颗粒可以配制在任何合适的药物中，例如包括但不限于固体、半固体、液体和气态(吸入剂)剂型，诸如片剂、丸剂、粉剂、液体溶液或悬浮液、栓剂、注射剂、输注剂、吸入剂、水凝胶、局部凝胶、喷雾剂等。任选地，药物包含药学上可接受的赋形剂。任选地，药物包含治疗有效剂量的活性化合物。
治疗方法
本文还公开了治疗患有疾病的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的纳米颗粒组合物，该纳米颗粒组合物包含活性化合物(例如，包含与ω-3多不饱和脂肪酸部分共价连接的核碱基类似物部分的活性化合物)，或其药学上可接受的盐或前药；聚乙二醇化维生素E化合物；和至少一种油相组分。纳米颗粒可以是在本发明的精神内的本文公开的任何纳米颗粒。
出于多种原因，在所公开的方法中使用纳米颗粒是有利的，包括纳米颗粒兼容的多种施用途径，以及使用公认为安全的组分(GRAS)来形成纳米颗粒。因此，纳米颗粒可以以多种方式施用以治疗各种病况和疾病。纳米颗粒被所施用的受试者良好耐受，并且与活性化合物的游离形式相比，可以有利地增加活性化合物的生物利用度。
施用步骤可包括将颗粒引入适合颗粒制剂的受试者的任何方法。在一些实施例中，组合物经肠胃外施用，或可以经口服施用。
施用步骤可包括至少一次、二次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次，或至少十次的剂量。施用步骤可以在受试者表现出疾病症状之前(例如，预防性地)或者在疾病症状发生期间或之后执行。该施用步骤可以在将其他试剂施用于受试者之前，同时或之后执行。施用步骤可以以与或不与另外的药剂(例如，抗癌剂)共同施用的方式进行。在一些实施例中，施用的纳米颗粒的量(以及因此施用的活性化合物的量)是治疗有效量。
施用至受试者的纳米颗粒的量可以以根据体重的剂量表示，其可以根据纳米颗粒或纳米颗粒内的活性化合物计算。施用给受试者的所公开的组合物的量将因受试者而变化，具体取决于所公开的组合物和/或制剂的性质、受试者的物种、性别、年龄、体重和总体状况、施用模式，等等。可以凭经验确定施用组合物的有效剂量和时间表，并且进行这种确定在本领域技术范围内。用于施用所公开的组合物的剂量范围是大到足以产生期望的效应(例如，减小肿瘤大小)的那些剂量范围。剂量不应太大以致引起的不利副作用，例如不希望的交叉反应、过敏反应等超过益处。如果有任何禁忌症，也可以由个别临床医生来调整剂量。通常，将所公开的组合物和/或制剂以在0.1μg/kg体重至100g/kg体重范围内的活性组分剂量施用于受试者。在一些实施例中，将所公开的组合物和/或制剂以在1μg/kg体重至10g/kg体重、10μg/kg体重至1g/kg体重、10μg/kg体重至500mg/kg体重、10μg/kg体重至100mg/kg体重、10μg/kg体重至10mg/kg体重、10μg/kg体重至1mg/kg体重、10μg/kg体重至500μg/kg体重，或10μg/kg体重至100μg/kg体重范围内的活性组分剂量施用于受试者。如果需要的话，可以将高于或低于上述范围的剂量施用于个别受试者。
受试者可以是任何哺乳动物受试者，例如人、狗、牛、马、小鼠、兔等。在一些实施例中，受试者是灵长类动物，特别是人。受试者可以是任何年龄、种族、信仰、民族、社会经济地位或其他一般分类的男性或女性。
在一些实施例中，疾病是细胞周期调节障碍。在一些实施例中，疾病包括肿瘤或癌症。癌症的非限制性示例包括急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病(AML)、腺癌、腺肉瘤、肾上腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、间变性星形细胞瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、B细胞淋巴瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌骨髓癌、肠癌、脑癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、类癌瘤、宫颈癌、胆管细胞癌、软骨肉瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤淋巴瘤、皮肤黑素瘤、弥漫性星形细胞瘤、导管原位癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮样肉瘤、食道癌、尤文肉瘤、肝外胆管癌、眼癌、输卵管癌、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病(GTD)、多形性胶质母细胞瘤(GBM)、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈部癌、血管内皮瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、浸润性导管癌(IDC)、浸润性小叶癌(ILC)、炎性乳腺癌(IBC)、肠癌、肝内胆管癌、侵袭性/浸润性乳腺癌、胰岛细胞癌、颌/口腔癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、平滑肌肉瘤、软脑膜转移瘤、白血病、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、原位小叶癌、低级别星形细胞瘤、肺癌、淋巴结癌、淋巴瘤、男性乳腺癌、髓样癌、髓母细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、默克尔细胞癌、间充质软骨肉瘤、间质瘤、间皮瘤、转移性乳腺癌、转移性黑素瘤、转移性鳞状颈癌、混合胶质瘤、口腔癌、黏液癌、黏膜黑素瘤、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、鼻腔癌、鼻咽癌、颈癌、神经母细胞瘤、神经内分泌肿瘤(NET)、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、燕麦细胞癌、眼部癌、眼部黑素瘤、少突胶质细胞瘤、口癌、口腔癌、口咽癌、成骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢原发性腹膜癌、卵巢性索间质瘤、佩吉特病、胰腺癌、乳头状癌、鼻窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、外周神经癌、腹膜癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、纤维性星形细胞瘤、松果体区肿瘤、松果体瘤、垂体癌、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、鼻窦癌、皮肤癌、小细胞肺癌(SCLC)、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓癌、脊柱癌、脊髓癌、脊髓肿瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤/胸腺癌、甲状腺癌、舌癌、扁桃体癌、移行细胞癌、移行细胞癌、三阴性乳腺癌、输卵管癌、管状癌、输尿管癌、尿道癌、子宫腺癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、维尔姆斯瘤、华氏巨球蛋白血症等，以及它们的组合。
所公开的纳米颗粒的施用可用于将活性化合物(例如，包含与ω-3多不饱和脂肪酸部分共价连接的核碱基类似物部分的活性化合物)递送至肿瘤或肿瘤环境。在一些实施例中，该方法降低肿瘤生长的速率。在一些实施例中，该方法减小肿瘤大小。在一些实施例中，该方法减少肿瘤转移。在一些实施例中，该方法减少肿瘤复发。在一些实施例中，该方法增加患有肿瘤的受试者(例如，荷瘤小鼠或人类肿瘤患者)的存活。在一些实施例中，该方法减少活性化合物在非靶组织(例如，治疗癌症的方法中的非癌组织)中的释放。在一些实施例中，该方法增加活性化合物的生物利用度。在一些实施例中，该方法减少活性化合物的毒性。
一个令人惊讶的发现包括，在一些实施例中，所公开的方法可以增加肿瘤微环境内纤维结缔组织的量。肿瘤微环境包括肿瘤和可能影响肿瘤或受肿瘤影响的周围组织。肿瘤周围纤维结缔组织的量增加，有时称为纤维结缔组织包膜，可以限制或阻碍包裹在其中的肿瘤的生长。这种现象可以称为“肿瘤包裹”并且可以为癌症患者产生治疗上有益的结果。因此，如本文所用，增加“肿瘤包裹”的量是指增加围绕肿瘤的肿瘤微环境内纤维结缔组织的量。
可以将纳米颗粒施用后获得的结果与对照进行比较。任选地，对照是生物学样品。替代地，对照可以是一组值，用作适用于一个或多个受试者的标准(例如，在使用样品的方法中已知但未识别的一般数字或平均值)。在一些实施例中，对照包括在施用步骤之前从受试者获得的血液、血浆、血清、黏膜或胃肠液样品(例如，基线样品)。在一些实施例中，对照可以包括受试者的已知不是或怀疑不是癌性的生物学样品。
纳米颗粒可以任选地在药物中施用。药物可进一步包含药学上可接受的赋形剂。任选地，药物包含治疗有效剂量的活性化合物。
又一方面，本文公开了一种将活性化合物递送至生物细胞的方法，其包括使生物细胞与纳米颗粒组合物接触，该纳米颗粒组合物包含活性化合物(例如，包含与ω-3多不饱和脂肪酸部分共价连接的核碱基类似物部分的活性化合物)，或其药学上可接受的盐或前药；聚乙二醇化维生素E化合物；和至少一种油相组分。纳米颗粒可以是在本发明的精神内的任何本文公开的纳米颗粒。在一些实施例中，使纳米颗粒与生物细胞接触会从纳米颗粒释放活性化合物。在一些实施例中，使纳米颗粒与生物细胞接触会导致该细胞死亡。在一些实施例中，生物细胞是癌性细胞。
制备纳米颗粒的方法
本文还公开了制备所公开的纳米颗粒的方法。这些方法是有利的，至少是因为它们产生的颗粒具有1)较高的活性化合物包封效率，2)降低的活性化合物突释，3)小直径(例如，约50-200nm)，这对于向例如肿瘤靶向递送药剂是理想的，4)负zeta电位，表明在体外和体内具有高稳定性和较低的毒性，和5)与游离形式的活性化合物相比，增加的活性化合物口服生物利用度。
因此，本文公开了一种制备纳米颗粒的方法，其包含将以下项组合：活性化合物(例如，包含与ω-3多不饱和脂肪酸部分共价连接的核碱基类似物部分的活性化合物)，或其药学上可接受的盐或前药；聚乙二醇化维生素E化合物；和至少一种油相组分。在一些实施例中，该方法中不使用有机溶剂。在一些实施例中，聚乙二醇化维生素E化合物和至少一种油相组分是公认为安全(GRAS)的组分。在一些实施例中，该方法进一步包括将一种或多种另外的乳化剂组合。在一些实施例中，一种或多种另外的乳化剂是公认为安全(GRAS)的组分。
组合步骤可以通过任何可用于组合所记载的组分的方法来执行。例如，可以通过添加、倾倒、滴定、混合、溶解、注入等来组合组分。可以通过添加到第二组分中来组合第一组分，反之亦然。替代地，许多组分可以彼此组合或组合到另一组分中。任选地，在搅拌或混合组分(例如，在通风橱或化学罩中经由搅拌棒以100rpm搅拌)的同时进行任何一个或多个组合步骤。
在一些或进一步的实施例中，该方法可以包括收集或浓缩纳米颗粒。纳米颗粒可以通过例如离心或超滤来收集。纳米颗粒可以被洗涤并以期望的浓度重新悬浮在期望的缓冲溶液中。在一些实施例中，纳米颗粒可被冻干成干粉或湿粉形式。
实例
为了进一步说明本公开的原理，提出以下实例以便向本领域普通技术人员提供关于如何制备和评价本文要求保护的组合物、制品和方法的完整公开和描述。这些实例意在纯粹作为本发明的示例，并不意在限制发明人所认为的公开内容的范围。这些实例并非旨在排除对本领域的技术人员显而易见的本发明的等同物和变型。除非另有说明，否则温度为℃或处于环境温度，并且压力为大气压或接近大气压。有多种工艺条件的变化和组合可用于优化产品质量和性能。只需要通过合理的常规实验即可优化此类工艺条件。
实例1.具有强效的广谱抗肿瘤活性的4-(N)-二十二碳六烯酰2',2'-二氟脱氧胞苷的固体脂质纳米颗粒制剂。
本实例公开了一种固体脂质纳米颗粒(SLN)制剂，其包含具有改善的表观水溶性和化学稳定性的DHA-dFdC。SLN进一步包含用D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)和Tween 20乳化的水包卵磷脂/单硬脂酸甘油酯乳液。所得DHA-dFdC-SLN的直径为102.2±7.3nm，并将DHA-dFdC在水中的溶解度增加到至少5.2mg/mL，比其固有水溶性高超过200倍。作为比较，DHA-dFdC的蜡状固体即使在作为抗氧化剂的维生素E存在下，在室温下储存时也不稳定。然而，在相同条件下储存一个月后，冻干DHA-dFdC-SLN粉末中的DHA-dFdC没有明显降解。DHA-dFdC-SLN还显示出比DHA-dFdC增加的对某些肿瘤细胞的细胞毒性。被静脉注射分散的DHA-dFdC-SLN的小鼠中DHA-dFdC的血浆浓度遵循双指数模型，半衰期为约44小时。在患有预先建立的B16-F10鼠黑素瘤的小鼠中，DHA-dFdC-SLN在控制肿瘤生长方面明显比游离DHA-dFdC更有效。此外，组织学结果显示，经DHA-dFdC-SLN治疗的小鼠的肿瘤中有高水平的凋亡和肿瘤包裹。
材料和方法
非标准缩写列表。DHA-dFdC，4-(N)-二十二碳六烯酰2',2’-二氟脱氧胞苷；PUFA，多不饱和脂肪酸；dFdC，2',2'-二氟脱氧胞苷；IV，静脉内；DHA，二十二碳六烯酸；SLN，固体脂质纳米颗粒，GMS，单硬脂酸甘油酯；TPGS，D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯或维生素ETGPS。
材料和细胞系。甘露醇、Tween 20、单硬脂酸甘油酯(GMS)、D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)、Tween80、甘露醇和蔗糖购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。盐酸吉西他滨来自Biotang,Inc.(Lexington,MA)。大豆卵磷脂来自Alfa Aesar(Ward Hill,MA)。乙酸乙酯(EtOAc)、二甲基亚砜、四氢呋喃(HPLC级)、异丙醇和甲醇(HPLC级)来自Thermo Fisher(Waltham,MA)。
Figure BDA0003485228070000351
G2透析设备(MWC 50kD)来自Spectrum Inc.(New Brunswick,NJ)
B16-F10鼠黑素瘤细胞和TC-1鼠肺癌细胞系来自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)。M-Wnt细胞(鼠乳腺细胞系)来自北卡罗来纳大学教堂山分校的StephenD.Hursting博士的实验室。B16-F10和TC-1细胞分别在DMEM和RPMI 1640中生长(Invitrogen,Carlsbad,CA)。M-Wnt细胞在与TC-1类似的培养基中生长，该培养基中另外补充1％Glutamax(GlutaMAXTMSupplement,
Figure BDA0003485228070000352
)。所有培养基均补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，它们全来自(Carlsbad,CA)。
DHA-dFdC-SLN的制备。DHA-dFdC是按照先前报道的缀合方案合成的(Naguib,等人，Neoplasia,2016,18,(1),33-48)。所得DHA-dFdC的纯度由NMR和质谱确认。例如，通过将3.5mg大豆卵磷脂、0.5mg单硬脂酸甘油酯(GMS)和0.875mg D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)组合到玻璃小瓶中来制备固体脂质纳米颗粒(SLN)。将800μL去离子且过滤的(0.22μm)水(80℃)添加到卵磷脂/GMS/TPGS混合物中，然后涡旋并超声处理3分钟，直到形成均匀的浆液。将混合物在80℃的热板表面上保持5分钟。制备Tween 20溶液(在1mL水中55mg)，并将200μL该溶液滴加到混合物中，以达到1％(v/v)的最终浓度。在搅拌的同时使所得乳液冷却至室温以形成SLN。为了将DHA-dFdC掺入SLN中，在添加水之前，将不同量(例如，5.2mg、8.3mg、9.8mg或14.3mg)的DHA-dFdC添加到卵磷脂/GMS/TPGS混合物中。不含DHA-dFdC的SLN的制备遵循相同的程序，但不添加DHA-dFdC。
短期稳定性研究。用0mg、5.2mg、8.3mg、9.8mg或14.3mg的DHA-dFdC制备的DHA-dFdC-SLN的稳定性在4℃下评估6天。使用Malvern Zetasizer Nano ZS测量所得SLN的大小和zeta电位(Westborough,MA)。
透射电子显微镜检查(TEM)。使用得克萨斯大学奥斯汀分校的细胞和分子生物学显微镜和成像设施研究所中可用的透射电子显微镜检查DHA-dFdC-SLN的大小和形态。对碳膜包覆的铜网格进行2分钟的辉光放电。将悬浮在水中的10μL DHA-dFdC-SLN样品沉积在网格上并静置1分钟。用滤纸除去多余的样品。在网格上添加一滴1％的醋酸双氧铀持续30秒。在用滤纸去除多余的醋酸双氧铀液体后，在TEM下观察样品(Zhu等人，BioconjugateChem.,2012,23(5):966-980)。
包封效率(EE)。DHA-dFdC在SLN中的包封效率通过超滤方法确定。将1mL DHA-dFdC-SLN添加到超滤离心管(30kD,Amicon Ultra-4,Millipore)中，并在2844rcf下离心10分钟。从超滤离心管底部取出100μl滤液，以用高效液相色谱法(HPLC)测量DHA-dFdC浓度。为了印证该检测方法，根据先前描述的程序，将超滤离心管中的剩余悬浮液(约50μl)用950μl水重新溶解以提取DHA-dFdC。
凝胶渗透色谱法(GPC)。为了从DHA-dFdC-SLN中分离潜在胶束，使用6mm x 30cm
Figure BDA0003485228070000361
4B柱进行GPC(Sloat等人，Intl.J.Pharma.,2011；409(1):278-288)。将样品(100μL)施加至柱中并用去离子且过滤的(0.22μm)水洗脱。收集了500μL的洗脱级分。使用Malvern Zetasizer Nano ZS测量每个级分中的颗粒浓度(测量为千计数/秒；Kcps)，并在提取后使用HPLC确定每个级分中DHA-dFdC的浓度。
DHF-dFdC-SLN的冻干及其在冻干粉中的稳定性。用去离子且过滤(0.2μm)的水制备30％(w/v)蔗糖储备溶液作为冻干保护剂。将900μL DHA-dFdC-SLN水悬浮液与100μL蔗糖溶液混合以获得含有3％(w/v)蔗糖的最终悬浮液。DHA-dFdC-SLN悬浮液在-20℃下储存30分钟，转移到-80℃下60分钟，最后转移到VirTis Advantage台式托盘冻干机(The VirTisCompany,Inc.Gardiner,NY)。冻干在低于200mTorr的压力下在氮气气氛下进行超过72小时(h)。搁置温度从-40℃逐渐升高到26℃。冻干后，将样品密封并在室温下储存在干燥器中，避光。
为了评估DHA-dFdC-SLN在冻干粉中的物理和化学稳定性，在储存后0、7和30天从粉末中提取DHA-dFdC。将冻干样品在1mL去离子且过滤(0.2μm)的水中重构。将重构的DHA-dFdC-SLN悬浮液(100μL)与100μL异丙醇混合，涡旋30秒，并在室温下保持5分钟。添加600μl乙酸乙酯，并将样品涡旋30秒并以11,000rcf离心20分钟。将上清液收集到玻璃小瓶中并在氮气下进行蒸发。将样品重新溶解在100μL THF中，并通过HPLC测量浓度。
作为对照，将DHA-dFdC溶解在乙醇中并与最终浓度为5.047％(w/w)的维生素E混合(Naguib等人，Neoplasia,2016；18(1):33-48)。将溶液在氮气下干燥、密封并在室温下避光储存，并在不同时间点测量DHA-dFdC的含量
DHA-dFdC-SLN在模拟生物介质中的体外稳定性。为了评估DHA-dFdC-SLN在模拟生物介质中的稳定性，将SLN悬浮液在含有10％FBS(v/v)的磷酸盐缓冲盐水(PBS,10mM,pH7.4)中稀释，并在MaxQ 4000Floor Shaker Incubator(Thermo Fisher Scientific,100rpm)中于37℃下孵育18小时。使用Malvern Zetasizer在不同时间点测量颗粒大小。
DHA-dFdC从DHA-dFdC-SLN中的体外释放。DHA-dFdC从SLN中的释放曲线通过将DHA-dFdC-SLN以127μg/mL的示例浓度悬浮在释放介质(PBS中的1％(w/v)Tween 20)中，然后将其置于来自Spectrum Chemicals&Laboratory Products(New Brunswick,NJ)的1mL纤维素酯透析管(MWC 50,000)中而进行评估。将透析管放入含有13mL释放介质的塑料锥形管中以创造漏槽条件，将其在MaxQ 5000Floor Shaker Incubator中于37℃和100rpm下孵育8小时。在预定时间点，取出200μL释放介质并替换为200μL新鲜释放介质。作为对照，还测量了溶解在Tween 20溶液中的DHA-dFdC(1％Tween 20水溶液中的127μL g/mL DHA-dFdC)穿过透析膜的扩散。DHA-dFdC的浓度通过HPLC确定。
HPLC。使用配备RP-C18柱(Zorbax Eclipse,5μm,4.5mm×150mm,Santa Clara,CA)的Agilent Infinity 1260(Santa Clara,CA)进行DHA-dFdC的HPLC分析。流动相为甲醇和水(90:10,v/v)。流速为1.0ml/min，并且检测波长和进样量分别为248nm和5μL(Naguib等人，Neoplasia,2016；18(1):33-48)。
体外细胞毒性测定。DHA-dFdC-SLN的细胞毒性在TC-1细胞、B16-F10细胞和M-Wnt细胞中评估。将细胞接种到96孔板中(TC-1细胞和B16-F10细胞为4000个细胞/孔，M-Wnt细胞为1000个细胞/孔)并在37℃、5％CO2下孵育过夜。细胞用不同浓度的DHA-dFdC、DHA-dFdC-SLN、不含DHA-dFdC的SLN或二甲基亚砜(DMSO)处理至多48小时。作为对照，细胞用新鲜培养基处理。使用MTT测定来确定细胞存活(Naguib等人，Mol.Pharma.,2014；11(4):1239-1249)。将DHA-dFdC溶解在DMSO中并用细胞培养基稀释，而DHA-dFdC-SLN和不含DHA-dFdC的SLN直接分散在细胞培养基中。
DHA-dFdC-SLN中的DHA-dFdC的血浆药代动力学(PK)。动物方案获得了德克萨斯大学奥斯汀分校的机构动物护理和使用委员会的批准。为了评估PK参数，健康雌性C57BL/6小鼠(6-8周，Charles River Laboratories，Wilmington，MA)以每只小鼠2mg DHA-dFdC的剂量静脉注射分散在5％(w/v)无菌甘露醇中的DHA-dFdC-SLN。在不同的时间点(0.25、0.5、1、2、4、8、24和48小时)对小鼠实施安乐死。将血液收集到涂有肝素的管中，然后在13000rcf下离心20分钟以分离血浆。将200μL血浆与200μL异丙醇和200μL冷PBS混合。将混合物涡旋并在4℃孵育5分钟。孵育后，添加1000μL乙酸乙酯，将混合物涡旋5分钟，然后以18,000rcf离心5分钟。收集上清液并在氮气下干燥。最后，将残留物重新溶解在100μL THF中，然后使用HPLC进行分析(Naguib等人，Neoplasia,2016；18(1):33-48)。作为内部对照，在提取前将通过将硬脂酸盐缀合至dFdC的4-(N)位置上而合成的4-(N)-硬脂酰dFdC添加到样品中(Sloat等人，Intl.J.Pharma.,2011；409(1):278-288)。使用PK
Figure BDA0003485228070000381
分析数据，假设为两室模型(Zhang等人，Comp.Meth.Prog.Biomed.,2010；99(3):306-314)。
在小鼠模型中评估DHA-dFdC-SLN的抗肿瘤活性。第0天，雌性C57BL/6小鼠(18-20g，6-8周)在右侧皮下(s.c.)注射了B16-F10(5x 105个细胞/小鼠)。七天后，小鼠被随机分为5组(n＝5-6)并静脉注射溶于载体溶液(Tween 80(10％,w/v)、乙醇(5.2％,v/v)和甘露醇(5％,w/v))中的DHA-dFdC(1mg/小鼠，相当于50mg/kg)、载体溶液(作为对照)(Naguib等人，Neoplasia,2016；18(1):33-48；Valdes等人，Pharma.Res.,2017；34(6):1224-1232)、DHA-dFdC-SLN(相当于1mg DHA-dFdC/小鼠)或同等剂量的不含DHA-dFdC的SLN；两种SLN都分散在5％(w/v)无菌甘露醇中。作为对照，一组小鼠未经治疗。每3天重复一次治疗，共4次。每天监测小鼠健康和肿瘤生长。每周测量肿瘤大小2-3次，并且肿瘤体积计算为：体积(mm3)＝(长x宽2)/2。在注射B16-F10细胞后17天，对小鼠实施安乐死，并收集肿瘤组织进行组织学研究。对于未经治疗的小鼠，一些肿瘤的长度在第17天前达到了15mm，因此不得不提前实施安乐死。
组织学。在德克萨斯大学奥斯汀分校的戴尔儿科研究所的组织学和组织分析设施中，将肿瘤组织在福尔马林中固定、包埋并用苏木精和伊红(H&E)染色。
数据分析。统计分析通过单向方差分析和随后的Bonferroni事后检验来完成。≤0.05(双尾)的p值被认为是显着的。使用GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.,LaJolla,CA)进行大多数分析。PK参数使用PK Solver获得(Zhang等人，Comp.Meth.Prog.Biomed.,2010；99(3):306-314)。
结果和讨论
DHA-dFdC-SLN的制备和表征。DHA-dFdC是一种亲脂性化合物，对培养的各种癌细胞系(例如，胰腺癌、白血病、肾癌)以及胰腺癌和白血病的小鼠模型具有强大的抗肿瘤活性(Naguib等人，Neoplasia,2016；18(1):33-48；Valdes等人，Pharma.Res.,2017；34(6):1224-1232)。但该化合物的溶解性和稳定性有待提高(Naguib等人，Neoplasia,2016；18(1):33-48)。本文公开了一种固体脂质纳米颗粒制剂，其可以增加诸如DHA-dFdC等亲脂性化合物的水溶性并改善其化学稳定性。
负载不同浓度/量的DHA-dFdC的DHA-dFdC-SLN的颗粒直径、多分散指数和zeta电位如表1所示。统计分析未显示用不同量的DHA-dFdC制备的SLN的颗粒大小和zeta电位有任何显着差异。然而，在4℃的短期稳定性研究中，用较低量(例如，5.2mg)的DHA-dFdC制备的DHA-dFdC-SLN在6天后保持稳定(图1A至图1C)，因此被选择用于进一步研究。示例SLN制剂将DHA-dFdC的表观水溶性增加到至少5.2mg/ml。进一步增加DHA-dFdC溶解量的其他方法包括浓缩纳米颗粒。图1D中显示的是用5.2mg DHA-dFdC制备的DHA-dFdC-SLN的动态光散射光谱。DHA-dFdC-SLN的TEM图像显示它们是球形的(图1E)，其颗粒大小小于动态光散射确定的颗粒大小(图1D)。DHA-dFdC-SLN中DHA-dFdC的包封率接近100％，因为在超滤后的滤液中未检测到DHA-dFdC。为了印证这一结果，将留在超滤离心管中的悬浮液重新溶解在水中以提取DHA-dFdC，并回收了97％±21.4(n＝6)的DHA-dFC。有报道称TPGS作为载有紫杉醇的聚合物纳米颗粒的乳化剂有助于将紫杉醇的包封效率提高到100％(Zhang等人，Biomat.,2012；33(19):4889-4906；Mu等人，J.Controlled Release,2002；80(1):129-144；Mu等人，J.Controlled Release,2003；86(1):33-48)。由于所公开的示例DHA-dFdC-SLN制剂中存在Tween 20和TPGS，因此一定比例的DHA-dFdC可能存在于胶束中。例如，TPGS具有在37℃下为0.02％(w/w)的相对低的临界胶束浓度，在20℃下为～1％(w/v)的Tween 20(Wu等人，Pharma.Tech.,1999,23(10):52-68；Kim等人，Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering aspects,2001；187:385-397)。使用凝胶渗透色谱(GPC)来确定DHA-dFdC能够掺入胶束中的程度(Sloat等人，Intl.J.Pharma.,2011；409(1):278-288)。然而，在GPC谱中仅识别出一个明显的DHA-dFdC峰(图1F)，它与颗粒计数谱重叠，从而提供了额外的证据来表明几乎所有的DHA-dFdC都被包封在DHA-dFdC-SLN中。
表1.用不同量DHA-dFdC制备的DHA-dFdC-SLN的表征。所示的数据示是平均值±S.D.。(n＝3)。
Figure BDA0003485228070000401
冻干后DHA-dFdC-SLN中的DHA-dFdC的化学稳定性。为了选择冻干保护剂，筛选了各种糖，包括蔗糖、甘露醇和海藻糖，浓度范围为2.5％(w/v)至5％(w/v)。在DHA-dFdC-SLN进行冻干和重构后，浓度在2.5％到3％之间的蔗糖可以有效地防止颗粒大小变化。因此，将3％(w/v)的蔗糖用作进一步研究的冻干保护剂。在室温下作为冻干粉储存30天后，DHA-dFdC-SLN的颗粒大小没有显着变化(图2A)。重要的是，冻干的DHA-dFdC-SLN粉末中DHA-dFdC的含量在30天的储存期间保持不变(图2B)。作为比较，在相同条件下储存14天后，DHA-dFdC-维生素E蜡状固体混合物中仅剩下19.1％±7.0的DHA-dFdC(p<0.0001)(图2C)。
Tween 80-乙醇-水溶液中的DHA-dFdC在室温下储存不稳定，半衰期为～14小时(Naguib等人，Neoplasia,2016；18(1):33-48)。DHA-dFdC-SLN干粉中DHA-dFdC化学稳定性的提高可能归因于以下三个原因。首先，SLN可保护掺入其中的DHA-dFdC免受化学降解(Geszke-Moritz等人，Mat.Science Engineering:C.,2016,68:982-994)。例如，据报道，负载在SLN中的β-胡萝卜素提高了稳定性，因为β-胡萝卜素可防止氧化(Geszke-Moritz等人，Mat.Science Engineering:C.,2016,68:982-994；2.Yi等人，J.Agricultural FoodChem.,2014,62(5):1096-1104)。其次，在制剂中掺入TPGS可提供了抗氧化特性，因为TPGS含有α-生育酚或维生素E，并且据报道TPGS比游离α-生育酚具有更高的抗氧化活性(Carini等人，Biochem.Pharma.,1990,39(10):1597-1601；Anstee等人，J.Hepatology,2010,53(3):542-550)。第三，SLN被冻干成干粉(Vighi等人，Eu.J.Pharma.Biopharma.,2007；67(2):320-328；Varshosaz等人，Carbohydrate Polymers.2012；88(4):1157-1163；do ValeMorais等人，Intl.J.Pharma.,2016；503(1-2):102-114)。
DHA-dFdC-SLN的体外表征。在PBS中含有10％FBS的模拟生物介质中，在37℃下孵育18小时后，DHA-dFdC-SLN的颗粒大小没有增加，这表明静脉内施用后，DHA-dFdC-SLN不太可能聚集。图3显示了DHA-dFdC从DHA-dFdC-SLN的释放曲线。在8小时内，仅8.6％±1.9的DHA-dFdC从SLN中释放。
DHA-dFdC-SLN对培养的肿瘤细胞的细胞毒性。DHA-dFdC-SLN的细胞毒性通过使用MTT测定确定与SLN孵育后肿瘤细胞的存活来评估。在M-Wnt(图4A；比较IC50值0.92μM与2.15μM，p<0.05，24h孵育)和B16F10细胞(图4B；比较IC50值0.085μM与1.81μM，p<0.0001，48h孵育)中，DHA-dFdC-SLN的细胞毒性强于DHA-dFdC。在TC-1细胞中，DHA-dFdC-SLN的细胞毒性与DHA-dFdC没有显着差异(图4C)。在所有三种细胞系中，在测试的浓度下，不含DHA-dFdC的SLN和二甲基亚砜(DMSO)载体均未显示出显着的细胞毒性(图4A-4C)。
DHA-dFdC-SLN中的DHA-dFdC的血浆药代动力学。图5显示了在静脉内注射DHA-dFdC-SLN后不同时间点，小鼠血浆样品中的血浆DHA-dFdC水平。小鼠血浆中DHA-dFdC的消除遵循双指数模型。表2包括DHA-dFdC的选定PK参数。DHA-dFdC的AUC0-∞值为677.3μg/ml*h，DHA-dFdC在消除阶段的血浆半衰期为约44小时。相比之下，当DHA-dFdC在Tween 80-乙醇-水溶液中给予小鼠时，血浆半衰期仅为约58分钟(Naguib等人，Neoplasia,2016；18(1):33-48)。
表2：DHA-dFdC-SLN静脉内给予小鼠时的血浆PK参数。
Figure BDA0003485228070000411
Figure BDA0003485228070000421
DHA-dFdC-SLN在小鼠中的抗肿瘤活性。在具有预先建立的B16-F10肿瘤的小鼠中评估了DHA-dFdC-SLN的抗肿瘤活性。当小鼠未经治疗或仅用水中的Tween 80-乙醇载体治疗时，肿瘤迅速生长(图6A)。在测试的给药方案中，DHA-dFdC溶液和缺乏DHA-dFdC的空白-SLN将肿瘤生长延迟了4天，但在比较的所有天数中，用DHA-dFdC溶液或空白-SLN治疗的小鼠的肿瘤大小与未经治疗的小鼠的肿瘤大小之间没有显着差异(图6A)。DHA-dFdC-SLN治疗在抑制肿瘤生长方面最有效。DHA-dFdC-SLN纳米颗粒制剂将肿瘤生长延迟了约8天，并且经DHA-dFdC-SLN治疗的小鼠的肿瘤大小明显小于未治疗小鼠或用DHA-dFdC溶液治疗小鼠的肿瘤大小(图6A)。治疗期间各组小鼠的体重没有显着差异(图6B)，表明在测试的给药方案下DHA-dFdC-SLN的耐受性良好。
图7显示了不同组中来自小鼠的B16-F10肿瘤的代表性H&E图像。未治疗(图7A)或用载体(图7B)或不含DHA-dFdC的SLN(图7C)治疗的小鼠中的肿瘤处于具有大管腔的大血管的晚期肿瘤阶段。此外，这些组中的肿瘤显示出大的坏死区域、结缔组织增生增加和血管塌陷(图7A-7C)。在黑素瘤等实体瘤中，高组织间液构成了化疗的重要障碍，因为它会导致血管受压，将血液从肿瘤中心转移到外周，从而减少化疗药物的经毛细血管运输(Pautu等人，Pharma.Res.,2017)。用DHA-dFdC-SLN治疗的肿瘤显示出大量具有小管腔的血管(图7G)。此外，在用DHA-dFdC-SLN治疗的小鼠的肿瘤区域周围可以观察到结缔组织的水平增加(图7F)。这种纤维结缔组织可能具有肿瘤包裹作用，从而针对肿瘤局部和血管侵袭提供保护屏障(Ng等人，Cancer,1992；70(1):45-49)。作为肿瘤包裹的保护作用的一个示例，当通过形成纤维化包膜而发生转移包裹时，肝转移患者有更好的预后(Morino等人，Clinico-pathological features of liver metastases from colorectal cancer in relationto prognosis.1991.Ohlsson等人，World J.Surgery,1998；22(3):268-277；Lunevicius等人，J.Cancer Res.Clin.Oncology,2001；127(3):193-199)。实际上，包膜的形成保护肝实质免受癌症侵袭(Lunevicius等人，J.Cancer Res.Clin.Oncology,2001；127(3):193-199)。因此，DHA-dFdC-SLN可用于治疗黑素瘤，例如通过诱导保护性肿瘤包裹，这有助于避免转移并有利于手术切除。
相比之下，单独用DHA-dFdC治疗的小鼠肿瘤显示血管塌陷、高结缔组织增生和坏死区域(图7D和图7E)。与单独用DHA-dFdC溶液治疗的小鼠或未治疗对照中的肿瘤相比，用DHA-dFdC-SLN治疗的小鼠的肿瘤显示出更多的细胞凋亡，但更少的细胞坏死。与未治疗组相比，不含DHA-dFdC的SLN(空白-SLN)显示出延迟肿瘤生长的趋势(图6A)。据体内和体外的研究报道，TPGS作为单一药剂具有抗癌活性，能够抑制人前列腺癌和肺癌细胞的生长(Youk,等人，J.Controlled Release,2005,107,(1),43-52；Vighi,等人，Eu.J.Pharma.Biopharma.,2007,67,(2),320-328)。此外，TPGS可通过诱导氧化应激途径而选择性诱导T细胞急性淋巴细胞性白血病(ALL)或Jurkat克隆E6-1细胞的凋亡(Ruiz-Moreno,等人，Apoptosis,2016,21,(9),1019-1032)。此外，据报道，TPGS在乳腺癌细胞系(如MCF7和MDA-MB-231)中选择性诱导细胞周期停滞和凋亡，但在“正常”永生化细胞(如MCF-10A和MCF-12F)中不会进行诱导(Neophytou,等人，Biochem.Pharma.,2014,89,(1),31-42)。最后，报道了在MCF-7细胞系中TPGS2k与多西他赛之间有协同作用，其中在没有多西他赛的情况下MCF-7细胞与TPGS2k胶束的孵育诱导细胞毒性(Mi,等人，Biomat.,2011,32,(16),4058-4066)。可以解释不含DHA-dFdC的SLN在培养细胞中缺乏细胞毒性的一个原因是制剂中使用的TPGS浓度低(≈1.5mM)。实际上，更高浓度的TPGS在培养中被用于诱导细胞毒性(例如，>10mM)，并在动物研究中用于抑制肿瘤生长(≈40mM)(Youk,等人，J.ControlledRelease,2005,107,(1),43-52；Constantinou,等人，Nutrition Cancer,2012,64,(1),136-152；Ruiz-Moreno,等人，Apoptosis,2016,21,(9),1019-1032；Neophytou,等人，Biochem.Pharma.,2014,89,(1),31-42)。
总之，本文公开了一种包含DHA-dFdC的固体脂质纳米颗粒，其中用于制剂的所有材料都是生物相容的。实际上，卵磷脂、GMS和Tween 20是经胃肠外施用的GRAS材料(Rowe,等人，Pharmaceutical Press,6th ed.；2009)。TPGS已被FDA批准为一种安全的药物佐剂，允许其用于肠胃外药物制剂。出处同前。此外，制备SLN制剂的方法是直接的，可扩展用于工业制造。此外，较小的DHA-dFdC-SLN小大(102.2±7.3nm)有利于通过过滤来灭菌(0.2μm)。最后，在乳液制备过程中制备SLN时不使用有毒有机溶剂，从而避免了蒸发过程和制剂中的残留溶剂。至于在测试的动物模型中DHA-dFdC-SLN的抗肿瘤活性增加的机制，原因可能是增强渗透性和保留效应(EPR)(Bazak,等人，Mol.Clin.Oncol.,2014,2,(6),904-908)。
实例2.具有改善的DHA-dFdC生物利用度的口服SLN制剂。
某些纳米载体(例如，SLN、脂质体、纳米乳剂、胶束和聚合物纳米颗粒)通过增加药物的表观溶解度、减少药物在胃肠道内的降解和/或改善药物吸收而改善了抗癌药物的口服递送，因此获得了一些关注(Date,等人，J.Controlled Release,2016,240,504-526；Thanki,等人，J.Controlled Release 2013,170,(1),15-40；Lin,等人，J.Food DrugAnalysis,2017,25,(2),219-234)。该实例公开了DHA-dFdC-SLN令人惊讶地能够口服施用一种高度亲脂性的化合物DHA-dFdC。
材料和方法
材料和细胞系。甘露醇、Tween 20、GMS、TPGS、氯化钠(NaCl)、盐酸(HCl,37％)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、氢氧化钠(NaOH)和Tween 80来自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。盐酸吉西他滨来自Biotang,Inc.(Lexington,MA)。大豆卵磷脂来自Alfa Aesar(Ward Hill,MA)。乙酸乙酯(EtOAc)、四氢呋喃(HPLC级)、异丙醇和甲醇(HPLC级)来自Thermo FisherScientific(Waltham,MA)。
Figure BDA0003485228070000441
G2透析设备(MWC 50kD)来自Spectrum Inc.(NewBrunswick,NJ)。
鼠黑素瘤(B16-F10)癌细胞系来自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)。B16-F10细胞在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(它们全来自Invitrogen(Carlsbad,CA))的DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中生长。
4-(N)-二十二碳六烯酰2',2'-二氟脱氧胞苷(DHA-dFdC)的合成。根据公开内容进行DHA-dFdC合成(Naguib,等人，Neoplasia,2016,18,(1),33-48)。所得DHA-dFdC的纯度由NMR和质谱分析确认。
4-(N)-二十二碳六烯酰2',2'-二氟脱氧胞苷纳米颗粒(DHA-dFdC-SLN)的制备和表征。如实例1中所述地制备固体脂质纳米颗粒(SLN)。
从纳米颗粒中提取DHA-dFdC以确定浓度。简而言之，将100μL DHA-dFdC-SLN与100μL异丙醇混合，涡旋30秒，并保持在室温下。五分钟后，添加600μL乙酸乙酯。混合物每30秒涡旋一次，并以11,000rcf离心20分钟。将上清液收集到玻璃小瓶中。在氮气下蒸发溶剂后，将样品重新溶解在100μL THF中，并通过HPLC测量DHA-dFdC的浓度(Naguib,等人，Neoplasia,2016,18,(1),33-48)。
DHA-dFdC-SLN在刺激胃肠液中的稳定性。评估了DHA-dFdC-SLN在没有酶的情况下在模拟胃液(SGF,pH 1.2)和模拟肠液(SIF,pH 6.8)中的稳定性。SGF和SIF根据USP XXVI制备。SGF的制备是通过将2g NaCl溶解在7mL HCl中，并用去离子水定容至1000mL(Wang,等人，Oncotarget,2017,8,(52),89876)。通过将6.8g KH2PO4和896mg NaOH添加到1000mL去离子水中制备SIF。出处同前。将DHA-dFdC-SLN在SGF或SIF介质中在37℃搅拌(100rpm)下孵育。在不同的时间点(例如，0、1、2、4和6小时)，取得样品并稀释到水中以使用MalvernZetasizer Nano ZS测量颗粒大小。作为对照，将DHA-dFdC-SLN在磷酸盐缓冲盐水(PBS,10mM,pH 7.4)中孵育。
透射电子显微照片(TEM)。如实例1中所述，使用透射电子显微镜来检查在SGF和SIF中孵育之前和之后DHA-dFdC-SLN的大小和形态。
在模拟胃肠液中的体外释放。为了测试在SGF和SIF中DHA-dFdC从DHA-dFdC-SLN的释放行为，将SGF或SIF中的DHA-dFdC-SLN置于1mL纤维素酯透析管中(151μg/mL的DHA-dFdC)，然后将其置于含有13mL溶解介质(SGF或SIF，含2.5％的Tween 20)的塑料锥形管中，以创造漏槽条件。将塑料管置于37℃、100rpm的恒温振荡器中(Max Q 200,Thermo FisherScientific)。在预定时间点，取出200μL释放介质，随后用等体积的新鲜介质替换。使用HPLC确定介质中DHA-dFdC的浓度。作为对照，将151μg DHA-dFdC溶解在2.5％的Tween 20中，以确认DHA-dFdC穿过透析管膜的扩散不是限速的。
药代动力学研究。德克萨斯大学奥斯汀分校的机构动物护理和使用委员会批准了动物方案。雌性C57BL/6小鼠(6-8周，Charles River Laboratories，Wilmington，MA)禁食3小时。随意饮水。小鼠用溶解在载体溶液(在无菌水中的Tween 80(10％,w/v)、乙醇(5.2％v/v)和甘露醇(5％,w/v))中的DHA-dFdC经口服灌胃(Naguib,等人，Neoplasia,2016,18,(1),33-48；Valdes,等人，Pharma.Res.,2017,34,(6),1224-1232)，或用悬浮在无菌甘露醇溶液(5％,w/v)中的DHA-dFdC-SLN经口服灌胃，或静脉注射悬浮在无菌甘露醇溶液(5％,w/v)中的DHA-dFdC-SLN。DHA-dFdC的剂量是每只小鼠2mg。在不同的时间点(例如，0.25、0.5、1、2、5、8、12和24小时)对小鼠(n＝3)实施安乐死。将血液收集到涂有肝素的管中，然后在13,000rcf下离心20分钟以分离血浆。将血浆(200μL)与200μL异丙醇和200μL冷PBS混合，涡旋，然后在4℃下孵育5分钟。孵育后，添加1000μl乙酸乙酯。将混合物涡旋5分钟，然后以18,000rcf离心5分钟。收集上清液并在氮气下干燥。最后，将残留物重新溶解在100μl THF中，然后使用HPLC进行分析(Naguib等人，Neoplasia,2016,18,(1),33-48)。提取前，在样品中添加4-(N)-硬脂酰2',2'-二氟脱氧胞苷(GemC18)作为内部对照(Sloat,等人，Intl.J.Pharma.,2011,409,(1),278-288)。使用PK
Figure BDA0003485228070000461
分析数据，假设为两室模型(Wang,等人，Oncotarget,2017,8,(52),89876)。
经口服施用的DHA-dFdC-SLN在荷瘤小鼠模型中的抗肿瘤活性。第0天，雌性C57BL/6小鼠(18-20g)在右侧皮下(s.c)注射了B16-F10(5x105个细胞/小鼠)。七天后，小鼠被随机分为4组(n＝7-8)并经口服灌胃溶解在载体中的DHA-dFdC(250μg/小鼠)(Naguib,等人，Neoplasia,2016,18,(1),33-48；Valdes,等人，Pharma.Res.,2017,34,(6),1224-1232)、分散在5％甘露醇中的DHA-dFdC-SLN(250μg DHA/小鼠)或分散在5％甘露醇中的不含DHA-dFdC的SLN。作为对照，一组小鼠未经治疗。每天重复治疗，直到第11天。让小鼠休息两天，并在第13天恢复治疗并持续到第20天。每天监测小鼠直至终点(例如，死亡、肿瘤大小达到15mm、肿瘤溃疡、体重减轻超过20％或其他严重痛苦和不适的迹象)。
统计分析。统计分析通过单向方差分析和随后的Bonferroni事后检验来完成。使用Mantel-Cox对数秩方法比较小鼠存活曲线。≤0.05(双尾)的p值被认为是显着的。使用GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)进行大多数分析。药代动力学参数使用PK
Figure BDA0003485228070000462
获得(Zhang等人，Comp.Meth.Prog.Biomed.,2010,99,(3),306-314)。
结果和讨论
将固体脂质纳米颗粒用于口服施用具有若干优势，例如提高稳定性、提高药物的生物利用度和降低其毒性(Lin,等人，J.Food Drug Analysis,2017,25,(2),219-234；
Figure BDA0003485228070000463
等人，Intl.J.Pharma.Sci.,2005,60,(8),577-582；Lim,等人，J.ControlledRelease,2004,100,(1),53-61；Yuan,Intl.J.Nanomed.,2014,9,4829；
Figure BDA0003485228070000464
等人，Euro.J.Pharma.Biopharma.,2000,50,(1),161-177)。通过将DHA-dFdC掺入用大豆卵磷脂、GMS、TPGS和Tween 20制备的固体脂质纳米颗粒中，DHA-dFdC-SLN克服了DHA-dFdC的不良水溶性和化学不稳定性，如实例1中所述。DHA-dFdC-SLN的主要特征总结在表3中。纳米颗粒的直径为101±8nm。颗粒大小(直径)显着影响胃肠道吸收，并且颗粒直径小于300nm的纳米颗粒是口服施用的良好候选物(Thanki,等人，J.Controlled Release 2013,170,(1),15-40)。实际上，对培养中的Caco-2细胞对聚合物纳米颗粒(例如，维生素E TPGS包覆的PLGA纳米颗粒或PVA包覆的PLGA纳米颗粒)的细胞摄取的评估表明，最理想的颗粒大小范围为100-200nm(Win,等人，Biomat.,2005,26,(15),2713-2722)。DHA-dFdC-SLN的zeta电位为-44±2mV，表明它们在水悬浮液中的稳定性(Win,等人，Biomat.,2005,26,(15),2713-2722；Aditya,等人，J.Agri.Food Chem.,2013,61,(8),1878-1883)。
表3.用于胃肠道研究的DHA-dFdC-SLN的表征。
Figure BDA0003485228070000471
所示的数据示是平均值±S.D.。(n＝3)
DHA-dFdC-SLN在刺激胃肠液中的稳定性。检查了DHA-dFdC-SLN在模拟胃肠(GI)流体(例如，SGF或SIF)中的体外稳定性。作为对照，还包括DHA-dFdC-SLN在PBS(10mM,pH 7.4)中的稳定性。在SGF或SIF中孵育6小时(h)期间，如通过DLS测量的DHA-dFdC-SLN的颗粒直径没有增加(图8A)。实际上，颗粒大小略有下降(与在PBS中相比，SIF中为～5.4％，SGF中为6.1％)(图8A)。图8B-8G中显示的是纳米颗粒在SGF或SIF中孵育6小时之前和之后的代表性TEM图像。总体而言，孵育后纳米颗粒的形状没有显着变化；然而，在SIF中孵育6小时后，DHA-dFdC-SLN的表面显得粗糙(图8E，插图)。在SGF中孵育DHA-dFdC-SLN后，没有观察到这种粗糙外观(图8G，插图)。检查胃肠流体中的SLN降解的研究表明，由于包覆在纳米颗粒表面的表面活性剂的损失，SLN的降解导致颗粒大小减小，但最终因在没有表面活性剂的情况下产生聚集而导致颗粒直径增大(Aditya,等人，J.Agri.Food Chem.,2013,61,(8),1878-1883；Müller,等人，Intl.J.Pharma.,1996,144,(1),115-121)。非离子表面活性剂，如Tween 80、Tween 20、Tween 60和PVA可在酸性pH条件下为颗粒提供空间稳定性(Van Aken,等人，Food Hydrocolloids,2011,25,(4),781-788)。Tween 20被用作DHA-dFdC-SLN中的表面活性剂，这可能解释了这些纳米颗粒在SGF中的稳定性。TPGS也是一种非离子表面活性剂，DHA-dFdC-SLN中TPGS的存在也可能有助于纳米颗粒在模拟胃肠流体中的稳定性。
在模拟胃肠液中的体外释放。在模拟胃肠流体中DHA-dFdC从DHA-dFdC-SLN的体外释放曲线示于图9.6小时后，SIF和SIG中DHA-dFdC的累积释放量分别达到～8.9％和～3.2％。DHA-dFdC-SLN中DHA-dFdC的释放仅监测了6小时，因为小鼠的胃肠转换时间为6-8小时(Zhao,等人，J.Pharma.Sci.,2010,99,(8),3552-3560)。如图8E中的插图所示，在SIF中孵育6小时后SLN的表面不光滑，表明颗粒被侵蚀，这可能解释了SIF中SLN更快释放DHA-dFdC。
DHA-dFdC-SLN中的DHA-dFdC的口服生物利用度。在以每只小鼠2mg DHA-dFdC的剂量经口服施用或静脉内注射DHA-dFdC-SLN悬浮液后的不同时间点，DHA-dFdC的血浆浓度示于图10.DHA-dFdC的选定药代动力学参数总结在表4中。
表4.在静脉施用DHA-dFdC-SLN或口服施用在Tween 80/乙醇/水溶液中的DHA-dFdC或在DHA-dFdC-SLN中DHA-dFdC后，DHA-dFdC在血浆中的选定药代动力学参数。
Figure BDA0003485228070000481
AUC：从时间0到24小时，血浆浓度-时间曲线下的总面积；Cmax：峰值血浆浓度；Tmax：达到Cmax的时间；Frel％：相对口服生物利用度百分比；Fab％：绝对口服生物利用度百分比。
在健康小鼠中静脉施用DHF-dFdC-SLN后的血浆DHA-dFdC水平遵循两室模型，AUC0-24h值为210.58μg*h/mL。另一方面，在小鼠中经口服施用DHA-dFdC-SLN后的血浆DHA-dFdC水平遵循明显的吸附阶段和随后的清除阶段，Cmax为17.01μg/mL，Tmax为1.73h，AUC0-24h143.44μg*h/mL。基于表4中的AUC0-24h值，DHA-dFdC-SLN中DHA-dFdC的绝对口服生物利用度为68.12％。
相比之下，在经口服施用Tween 80-乙醇-水溶液中的DHA-dFdC后，DHA-dFdC血浆浓度-时间曲线示于图10.Tmax为～1.7小时，与口服SLN中的DHA-dFdC该值相近(表2)。然而，发现DHA-dFdC溶液的Cmax和AUC0-24h值分别为10.50μg/mL和113.55μg*h/mL。因此，DHA-dFdC-SLN中DHA-dFdC的生物利用度相对于Tween 80-乙醇水溶液中DHA-dFdC的生物利用度为126.4％。
在经口服管饲法后DHA-dFdC-SLN中的DHA-dFC被吸收到血液循环中的确切机制尚不清楚。通常，经口服施用的SLN可以作为完整的颗粒通过派伊尔结中的微褶细胞被吸收，然后运输到淋巴系统(Li,等人，J.Controlled Release,2009,133,(3),238-244)。然而，其他研究显示，SLN在胃肠道中会受到消化或降解，并且只有很小一部分(如果有的话)经口服施用的SLN可以完整地到达血液循环(Hu,等人，Nanoscale,2016,8,(13),7024-7035)。当然，DHA-dFdC可以从胃肠道中的SLN释放(如图9中体外所示)，尤其是在存在来自胰腺的脂肪酶和辅脂肪酶的情况下。DHA-dFdC然后可以通过被动扩散或在胃肠道中的胆汁的帮助下被吸收(Thomson,等人，Canad.J.Phys.Pharma.,1989,67,(3),179-191；Porter,等人，Nat.Rev.Drug Disc.,2007,6,(3),231)。
至于SLN中DHA-dFdC的生物利用度高于Tween 80/乙醇/水溶液中的DHA-dFdC，DHA-dFdC溶液在经口服施用时可能容易沉淀，这可能导致生物利用度降低(Naguib,等人，Neoplasia,2016,18,(1),33-48)。相对于胃肠道中的内源性溶解组分，消化(例如，通过外源性溶解组分)后来自SLN的更高水平的外源性脂质可能导致胃肠液性质的变化并增强DHA-dFdC溶解(Porter,等人，Nat.Rev.Drug Disc.,2007,6,(3),231)。然而，DHA-dFdC溶液含有Tween 80，这可以解释在测试溶液中的DHA-dFdC的相对较高的口服生物利用度(Seeballuck,等人，Pharma.Res.,2004,21,(12),2320-2326)。Tween 80可被肠细胞消化而释放出油酸，油酸可用于增加乳糜微粒等富含甘油三酯的脂蛋白的基底外侧分泌，从而增加亲脂性药物的淋巴吸收。出处同前。此外，Tween 80可抑制肠道P-gp外流，从而增加P-gp底物进入肠细胞的浓度和停留时间(Nerurkar,等人，Pharma.l Res.,1996,13,(4),528-534)。虽然Tween 80可以抑制肠道P-gp活性，但抑制效果逊于TPGS(Guo,等人，Euro.J.Pharma.Sci.,2013,49,(2),175-186)。TGPS作为紫杉醇聚合物纳米颗粒制剂中的乳化剂有助于将紫杉醇的口服生物利用度与口服Taxol相比提高10倍(Zhao,等人，J.Pharma.Sci.,2010,99,(8),3552-3560)。此外，TPGS1000乳化的SLN改善了大鼠中多西他赛的肠道吸收和相对口服生物利用度(Cho,等人，Intl.J.Nanomed.,2014,9,495)。当然，DHA-dFdC是否是P-gp的底物尚不得而知。因此，DHA-dFdC-SLN中DHA-dFdC的高口服生物利用度也可能部分归因于制剂中TPGS的存在。
DHA-dFdC-SLN在荷瘤小鼠模型中的抗肿瘤活性。在小鼠黑素瘤模型中评估了DHA-dFdC-SLN的抗肿瘤活性。在实例1中显示，当静脉内给予时，DHA-dFdC-SLN显着抑制培养中和小鼠中的B16-F10肿瘤细胞的生长。因此，当经口服给予时，B16-F10荷瘤小鼠被用于测试DHA-dFdC-SLN的抗肿瘤活性。
DHA-dFdC-SLN以每只小鼠250μg DHA-dFdC的剂量每天经口服灌胃，持续共12天(中间停药两天)。未治疗组中百分之五十(50％)的小鼠在第16天达到终点(图11)。与未治疗组相比，口服DHA-dFdC-SLN显着提高了存活率(p<0.05)。与未治疗的小鼠相比，口服Tween 80/乙醇/水溶液中的DHA-dFdC没有显着影响小鼠的存活率，这是令人惊讶的，因为Tween 80/乙醇/水溶液中DHA-dFdC的生物利用度为约54％(表2)。与重复给药在Tween 80/乙醇/水溶液中的DHA-dFdC相关的毒性可能与DHA-dFdC溶液相对于未治疗小鼠缺乏存活优势有关，因为62.5％的经口服灌胃在Tween 80/乙醇/水溶液中的DHA-dFdC的小鼠显示出毒性迹象，例如体重下降超过20％(一只小鼠)或严重的肿瘤溃疡(四只小鼠)。Tween 80/乙醇-水溶液中DHA-dFdC的毒性的确切原因仍然未知，但可能与Tween 80-乙醇-水溶液有关，然而小鼠从Tween 80/乙醇/水溶液中的DHA-dFdC服用的Tween 80和乙醇的量处于推荐用于临床前动物研究的正常范围内(例如，含有最多10％Tween 80和5％乙醇的水具有良好的耐受性)(Gad,等人，Intl J.Toxicol.,2006,25,(6),499-521；Shimizu,等人，Labor.Mouse,2004,527-541)。因此，小鼠存活数据清楚地表明SLN制剂也降低了DHA-dFdC的口服毒性。
实例3.另外的SLN制剂。
DHA-dFdC与不同浓度的TPGS
将DHA-dFdC(5mg)、3.5mg大豆卵磷脂、0.5mg单硬脂酸甘油酯和不同量(0.4375mg、0.875mg或1.75mg)的TPGS混合并分散在800μl去离子且过滤(0.22μm)的热水(80℃)中。将混合物涡旋，超声10分钟，然后保持在80℃的热板上，同时以800rpm搅拌5分钟。另外，将55mg Tween 20溶解在1ml热水中，然后将200ml该溶液滴加到混合物中，直至最终浓度为1％(v/v)Tween 20。在搅拌的同时将乳液冷却至室温以形成纳米颗粒。
使用Malvern Zeta Sizer Nano ZS(Westborough,MA)确定纳米颗粒的颗粒直径、多分散指数(PDI)和zeta电位。结果总结在图12A-12C和表5中。用0.4375mg TPGS制备的纳米颗粒过大(超过50％的颗粒大于400nm，图12A)，而用0.875mg TPGS制备的纳米颗粒具有理想的颗粒直径、大小分布和多分散指数(图12B，表5)。
表5：具有0.875mg TPGS的DHA-dFdC-SLN的表征。
TPGS(mg) 颗粒直径(nm) PDI Zeta电位(mV)
0.875 102.2±7.3 0.23±0.01 -55.3±3.0
DHA-卵磷脂-GSM-TPGS
将二十二碳六烯酸(DHA)(5.5mg)、3.5mg大豆卵磷脂、0.5mg单硬脂酸甘油酯和1.75mg维生素E-TPGS(TPGS)混合在800μl去离子且过滤(0.22μm)的热水(80℃)中。将混合物涡旋，超声10分钟，然后保持在80℃的热板上，同时以800rpm搅拌5分钟。在搅拌的同时将乳液冷却至室温以形成纳米颗粒。最后，将混合物超声处理10分钟。颗粒的直径为120nm，PDI为0.233，而zeta电位为-52mV。
在第二个制剂中，将DHA(5.31mg)、3.5mg大豆卵磷脂、0.5mg单硬脂酸甘油酯和1.75mg维生素E-TPGS(TPGS)混合并分散在1ml去离子且过滤(0.22μm)的热水(80℃)中。将混合物涡旋，超声10分钟，然后保持在80℃的热板上，同时以800rpm搅拌5分钟。在搅拌的同时将乳液冷却至室温以形成纳米颗粒，将其进一步超声处理3分钟。使用Malvern ZetaSizer Nano ZS(Westborough,MA)确定纳米颗粒的颗粒大小、多分散指数(PDI)和zeta电位。结果总结在表6中。使用透射电子显微镜(TEM)检查纳米颗粒的形态，示于图13.
表6：DHA-SLN的表征。
颗粒直径(nm) PDI Zeta电位(mV)
128.6±3.0 0.244±0.010 -52.0±7.4
DHA-卵磷脂-GSM-TPGS-Tween 20
将二十二碳六烯酸(DHA，5.4mg)、3.5mg大豆卵磷脂、0.5mg单硬脂酸甘油酯和0.875mg维生素E-TPGS(TPGS)混合并分散在800μl去离子且过滤(0.22μm)的热水(80℃)中。将混合物涡旋，超声10分钟，然后保持在80℃的热板上，同时以800rpm搅拌5分钟。将几种浓度的Tween 20(1mg、13.8mg、27.5mg和55mg)分别溶解在1ml热水中，然后将200μl这些溶液分别滴加到DHA混合物复制品中，以达到0.1％、0.25％、0.5％和1％(v/v)Tween 20的最终浓度。如所述通过添加1ml去离子且过滤(0.22μm)的热水(80℃)来制备不含Tween 20的样品。
使用Malvern Zeta Sizer Nano ZS(Westborough,MA)确定颗粒直径、多分散指数(PDI)和zeta电位。结果总结在表7中。增加Tween 20的量会减少所得DHA-SLN的大小。然而，用低浓度Tween 20(例如，0％、0.1％和0.25％)制备的DHA-SLN不稳定，并在1小时后沉淀。在Tween 20为1％时，样品的质量不佳，无法供Zeta Sizer Nano ZS测量zeta电位。
表7：具有不同浓度Tween 20的DHA-SLN的表征。
Tween 20(％) 颗粒直径(nm) PDI Zeta电位(mV)
0 140.8±12.2 0.200±0.04 -48.2±7.1
0.1 132.3±3.6 0.227±0.05 -54.8±3.7
0.25 121.8±1.8 0.205±0.01 -50.2±5.1
0.5 95.7±1.6 0.236±0.01 -43.9±4.1
1 47.6±1.6 0.268±0.01
DHA-卵磷脂-TPGS
将5.2mg DHA、3.5mg大豆卵磷脂和1.75mg维生素E-TPGS(TPGS)混合在800μl去离子且过滤(0.22μm)的热水(80℃)中。将混合物涡旋，超声5分钟，然后保持在80℃的热板上，同时以800rpm搅拌5分钟。在搅拌的同时将乳液冷却至室温以形成纳米颗粒。最后，将混合物超声处理3分钟。颗粒的直径为122.7nm，PDI为0.233，而zeta电位为-52.7mV。
单独的DHA和TPGS
将5mg DHA和20mg维生素E-TPGS(TPGS)混合在1000μl去离子且过滤(0.22μm)的热水(80℃)中。将混合物涡旋，超声5分钟，然后保持在80℃的热板上，同时以1000rpm搅拌5分钟。在搅拌的同时将混合物超声处理2分钟并冷却至室温以形成纳米颗粒。20分钟后，用0.22μm的PVDF过滤纳米颗粒。颗粒的直径为52.4nm，PDI为0.229。
实例4.具有替代活性化合物的SLN制剂。
多西他赛
将多西他赛(2.5mg)、3.5mg大豆卵磷脂、0.5mg单硬脂酸甘油酯和0.875mg维生素E-TPGS(TPGS)混合并分散在800μl去离子且过滤(0.22μm)的热水(80℃)中。将混合物涡旋，超声10分钟，然后保持在80℃的热板上，同时以800rpm搅拌5分钟。将55mg Tween 20溶解在1ml热水中，然后将200ml该溶液滴加到多西他赛混合物中，直至最终浓度为1％(v/v)Tween20。在搅拌的同时将乳液冷却至室温以形成纳米颗粒，将其进一步超声处理30至45分钟。
使用Malvern Zeta Sizer Nano ZS(Westborough,MA)确定颗粒直径、多分散指数(PDI)和zeta电位。结果总结在表8中。使用透射电子显微镜(TEM)检查多西他赛-SLN的形态，报告于图14.用2.5mg多西他赛制备的纳米颗粒具有良好的颗粒大小(直径)和多分散指数(表8)。多西他赛-SLN的TEM图像显示这些颗粒是球形的(图14)，其颗粒直径小于动态光散射确定的颗粒直径(表8)。
表8：多西他赛-SLN的表征。
颗粒直径(nm) PDI Zeta电位(mV)
280.03±16.07 0.131±0.02 -36.90±3.50
DHA-视黄酸
5mg DHA、20mg维生素E-TPGS(TPGS)和250μg视黄酸在1000μl去离子且过滤(0.22μm)的热水(80℃)中。将混合物涡旋，超声3分钟，然后保持在80℃的热板上，同时以1000rpm搅拌5分钟。在搅拌的同时将混合物超声处理3分钟并冷却至室温以形成纳米颗粒。20分钟后，用0.22μm的PVDF过滤纳米颗粒。颗粒的直径为55.9nm，PDI为0.233。
实例5.比较制剂。
DHA-dFdC-PEG
将DHA-dFdC(0mg、4.56mg或3.5mg)、3.5mg大豆卵磷脂、0.5mg单硬脂酸甘油酯和0.875mg 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)混合并分散在800μl去离子且过滤(0.22μm)的热水(80℃)中。将混合物涡旋，超声10分钟，然后保持在80℃的热板上，同时以800rpm搅拌5分钟。另外，将55mg Tween 20溶解在1ml热水中，然后将200ml该溶液滴加到混合物中，直至最终浓度为1％(v/v)Tween 20。在搅拌的同时将乳液冷却至室温以形成纳米颗粒，将其进一步超声处理30至45分钟。使用Malvern Zeta Sizer Nano ZS(Westborough,MA)确定纳米颗粒的颗粒直径和多分散指数(PDI)。结果总结在表9中。当使用超过4mg的DHA-dFdC时，得到了不想要的结果，例如颗粒大小大于200nm，多分散指数高于0.4。
表9：含有DSPE-PEG2000的DHA-dFdC-SLN的表征。
DHA-dFdC的量(mg) 颗粒直径(nm) PDI
4.56 268.6 0.413
3.55 188.8 0.293
0 196.5 0.345
DHA-dFdC-维生素E
维生素E具有抗氧化活性。检查了在DHA-dFdC-固体脂质纳米颗粒中包含维生素E的可行性。将DHA-dFdC(4.83mg或5mg)、3.5mg大豆卵磷脂、0.5mg单硬脂酸甘油酯、0.1mg维生素E和0.875mg DSPE-PEG2000混合并分散在800μl去离子且过滤(0.22μm)的热水(80℃)中。将混合物涡旋，超声10分钟，然后保持在80℃的热板上，同时以800rpm搅拌5分钟。另外，将55mg Tween 20溶解在1ml热水中，然后将200ml该溶液滴加到混合物中，直至最终浓度为1％(v/v)Tween 20。在搅拌的同时将乳液冷却至室温以形成纳米颗粒，将其进一步超声处理30至45分钟。使用Malvern Zeta Sizer Nano ZS(Westborough,MA)确定纳米颗粒的颗粒大小、多分散指数(PDI)和zeta电位。结果总结在表10中。颗粒直径大，且多分散指数高于0.2。
表10：含有维生素E的DHA-dFdC-SLN的表征。
DHA-dFdC的量(mg) 颗粒直径(nm) PDI Zeta电位(mV)
5 290.6 0.303 -0.172
4.83 201.7 0.445 -0.262
本文所引用的出版物据此全文或至少引用的所述出版物所针对的材料以引用方式并入。
应当理解，虽然已经对本公开的某些说明性和特定方面提供了详细描述，但不应认为本公开仅限于此，因为在不脱离如所附权利要求中所限定的本公开的广泛精神和范围的情况下可以进行多种修改。因此，所附权利要求旨在覆盖属于本发明的真实精神和范围内的所有此类等效的变型。

Claims (25)

1.一种纳米颗粒组合物，其包含：
活性化合物，所述活性化合物包含与ω-3多不饱和脂肪酸部分共价连接的核碱基类似物部分，或其药学上可接受的盐或前药；
聚乙二醇化维生素E化合物；和
至少一种油相组分。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述核碱基类似物部分包含吉西他滨。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的纳米颗粒组合物，其中所述ω-3多不饱和脂肪酸部分包含二十二碳六烯酸。
4.根据权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述活性化合物包含具有式I的化合物：
Figure FDA0003485228060000011
其中R1、R2和R3独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、硫醇、硫代烷基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、环烷基、杂环烷基、烷基芳基、芳基、烷基杂芳基、杂芳基或ω-3多不饱和脂肪酸，其中的任一个任选地被乙酰基、烷基、氨基、酰胺基、烷氧基、烷基羟基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羰基、卤素、羟基、硫醇、氰基或硝基取代；
其中R1、R2或R3中的至少一个包含ω-3多不饱和脂肪酸。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述活性化合物包含4-(N)-二十二碳六烯酰2',2'-二氟脱氧胞苷(DHA-dFdC)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的纳米颗粒组合物，其进一步包含溶剂。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物包含至多约0.8重量百分比(w/v)的量的所述活性化合物。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒组合物的纳米颗粒包含占固体的至多约65重量百分比的量的所述活性化合物。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述聚乙二醇化维生素E化合物包含具有在约200g/mol至约6000g/mol的范围内的分子量的聚乙二醇，其中所述聚乙二醇被酯化为维生素E琥珀酸酯。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述聚乙二醇化维生素E化合物包含D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述油相组分包含卵磷脂。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的纳米颗粒组合物，其进一步包含另外的油相组分。
13.根据权利要求12所述的纳米颗粒组合物，其中所述另外的油相组分包含单硬脂酸甘油酯。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的纳米颗粒组合物，其进一步包含另外的乳化剂。
15.根据权利要求14所述的纳米颗粒组合物，其中所述另外的乳化剂包含聚山梨醇酯。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒具有200nm或更小的平均直径。
17.一种治疗患有疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的纳米颗粒组合物，所述纳米颗粒组合物包含：
活性化合物，所述活性化合物包含与ω-3多不饱和脂肪酸部分共价连接的核碱基类似物部分，或其药学上可接受的盐或前药；
聚乙二醇化维生素E化合物；和
至少一种油相组分。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述组合物经肠胃外施用。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述组合物经口服施用。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述疾病包括肿瘤。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法降低肿瘤生长的速率。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中所述方法增加肿瘤微环境内纤维结缔组织的量。
23.一种将活性化合物递送至生物细胞的方法，其包括使所述生物细胞与纳米颗粒组合物接触，所述纳米颗粒组合物包含：
所述活性化合物，所述活性化合物包含与ω-3多不饱和脂肪酸部分共价连接的核碱基类似物部分，或其药学上可接受的盐或前药；
聚乙二醇化维生素E化合物；和
至少一种油相组分。
24.一种制备纳米颗粒的方法，其包括将以下项组合：
活性化合物，所述活性化合物包含与ω-3多不饱和脂肪酸部分共价连接的核碱基类似物部分，或其药学上可接受的盐或前药；
聚乙二醇化维生素E化合物；和
至少一种油相组分。
25.根据权利要求24所述的方法，其中在所述方法中不使用有机溶剂。
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