CN114134021B - 一种无视觉反馈的单细胞自动转运方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种无视觉反馈的单细胞自动转运方法，包括如下步骤：S1，通过微管堵塞实验，确定细胞卡住时产生可检测的管内压强变化下所需的微管内径范围；S2，筛选直径大于该范围内最小微管内径的细胞类型作为无视觉反馈单细胞自动转运方法的适用对象；S3，制作适用于步骤S2所确定的细胞类型的转运用双层微管；S4，进行细胞吸入与注出实验，确定细胞被卡住以及注出过程中双层微管内的压强变化曲线；S5，建立机器人化的无视觉反馈细胞转运流程，实现细胞自动转运。本发明通过微管堵塞实验和待操作细胞尺寸确定双层微管的内层和外层微管内径，并根据双层微管卡住与注出细胞过程中管内的压强变化曲线，首次实现了无视觉反馈的机器人化单细胞转运。
Description
技术领域
本发明涉及细胞操作领域，具体涉及一种尤其适用于大型细胞，且无需显微视觉反馈的单细胞自动转运方法。
背景技术
在胚胎冷冻与细胞清洗中，操作者需要使用玻璃微管吸入细胞然后移动至新的液滴中，再注出细胞，这种细胞转运技术是细胞处理最常见的操作步骤之一。目前，手动和自动化细胞转运操作中，均需要通过显微视觉反馈辅助判断细胞是否被吸入微管中，进而控制注射器的气压完成细胞的吸入与注出。但是，这种方法无法应用到无法提供显微视觉反馈的工作环境中。因此，开发一种新的不依赖于视觉反馈的自动化细胞转运系统对于拓宽细胞转运操作的应用领域十分有必要。
发明内容
为了克服现有细胞转运系统对显微视觉反馈的依赖，本发明提出了一种可在无显微视觉反馈的情况下，实现单细胞自动转运的方法，该方法使用特制的双层微管进行细胞转运，由压强传感器获得吸入和注出过程中的管内气压变化曲线，对细胞是否卡住与注出进行无视觉反馈的判断，最终实现无视觉反馈的自动化细胞转运。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种无视觉反馈的单细胞自动转运方法，包括以下步骤：
S1，通过微管堵塞实验，测定不同内径微管被堵住前后微管内的压强变化曲线，确定细胞卡住时产生可检测的管内压强变化下所需的微管内径范围；
S2，根据步骤S1确定的微管内径范围，筛选直径大于该范围内最小微管内径的细胞类型作为无视觉反馈单细胞自动转运方法的适用对象；
S3，制作适用于步骤S2所确定的细胞类型的转运用双层微管：所述双层微管由外层微管与内层微管套装组成；其中：外层微管的内径大于步骤S2中确定的待转移细胞的平均直径；内层微管的内径大于等于步骤S1确定的最小微管内径，小于待转移细胞的平均直径；
S4，利用步骤S3制备得到的双层微管进行细胞吸入与注出实验，确定细胞被卡住时以及注出过程中双层微管内的压强变化曲线；
S5，根据步骤S4中得到的压强变化曲线，建立机器人化的无视觉反馈细胞转运流程，实现细胞自动转运。
进一步地，步骤S1中，微管堵塞实验的具体方法为：将不同内径的玻璃微管依次与装有气压传感器的阀门式气动注射系统或活塞式注射系统相连接，通过调整阀门的开度或活塞的位置逐步增大吸入压强，使用胶皮手套的手指在细胞培养液中堵住针管，通过气压传感器分别记录不同内径微管堵塞前后的管内压强变化曲线，逐步增大微管内径，直至获取气压曲线斜率发生明显变化的微管内径范围，并将该范围作为细胞卡住时产生可检测的管内压强变化下所需的微管内径范围。
进一步地，步骤S2中，筛选得到的无视觉反馈单细胞自动转运方法的适用对象为大型细胞，包括鱼类卵细胞、两栖类动物的卵细胞和昆虫卵等。
作为优选，步骤S3中，所述外层微管的内径设置为待转移细胞平均直径的1.2-1.5倍。
进一步地，所述双层微管的制备方法如下：
S11，确定外层微管以及内层微管的内径和长度，分别拉制相应的外层微管以及内层微管；
S12，将内层微管插入外层微管内，并在外层微管入口与内层微管入口之间预留至少一个细胞平均直径的距离，以容纳吸入的细胞；
S13，在内层微管入口后侧加热外层微管，待变软后根据持针器的倾斜角度使用镊子将两个微管弯曲一定的角度，使得双层微管安装到持针器上后，针管前端处于水平状态(即：针管前端与水平面相平行)，使用胶带将露在外面的内层微管和外层微管缠绕固定，从而制成双层微管。
进一步地，步骤S4中，利用制备得到的双层微管进行细胞吸入与注出实验的具体操作方法如下：将双层微管与阀门式气动注射系统或活塞式注射系统相连接，通过控制阀门开度或控制活塞前进与后退，调整细胞吸入和注出时的吸入压和注出压强，并确定细胞卡住和注出时的双层微管管内压强变化曲线。
进一步地，步骤S5中，机器人化的无视觉反馈细胞转运流程的具体为：首先将双层微管伸入事先标定位置的存储待转运细胞的培养液滴中，通过控制阀门开度或者活塞运动施加负压吸入液体，并实时检测管内压强，当细胞卡住的压强变化曲线出现后，维持压强不变，将微管移动至已标定位置的新液滴内；将系统切换为注出细胞模式，并施加正压，当注出压强曲线出现时停止继续加压，重新将双层微管移入细胞存储液滴内，如此往复，直至所有细胞转运完毕。
本发明同现有技术相比具有以下优点及效果：
本发明所述无视觉反馈单细胞自动转运方法中，首先通过微管堵塞实验确定细胞被卡住时产生可检测的管内压强变化所需的微管内径范围，并将直径大于该范围内最小微管内径的细胞类型，确定为适用于本发明所述转运方法的转运对象；在此基础上，本发明开发了一种既可以吸入细胞，同时也可以卡住细胞的双层微管，利用所述双层微管实现细胞卡住时以及注出过程中的管内压强变化曲线的标定；通过该标定的压强变化曲线，在后续的细胞转运过程中，只需通过微动机械手臂、阀门式气动注射系统以及气压传感器即可实现无需视觉反馈的自动化细胞转运，与现有转运过程中依赖显微视觉反馈的手动或自动细胞转运系统相比，可以成功应用于无法提供显微视觉反馈的工作环境中，且转运成功率达90％，转运速度为手动操作速度的4倍。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例所述一种无视觉反馈的单细胞自动转运方法流程图。
图2为本发明实施例所述微管堵塞实验中，不同内径微管被堵住前后微管内的压强变化曲线图。
图3为本发明实施例中斑马鱼卵与微管在吸持状态下的显微图像。
图4为本发明实施例所述双层微管的显微图像和实物结构示意图。
图5为本发明实施例中斑马鱼卵吸入和注出过程中的显微图像以及获得的吸入压强变化以及注出压强变化曲线图。
标号说明：1、外层微管；2、内层微管；3、胶布。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1：如图1所示，一种无视觉反馈的单细胞自动转运方法，包括如下步骤：
S1，通过在装有气压传感器的阀门式或活塞式气泵系统上进行微管堵塞实验，测定不同内径微管被堵住前后微管内的压强变化曲线，确定细胞卡住时产生可检测的管内压强变化下所需的微管内径范围；
S2，根据步骤S1确定的微管内径范围，筛选直径大于该范围内最小微管内径的细胞类型作为无视觉反馈单细胞自动转运方法的适用对象；
S3，制作适用于步骤S2中所确定的细胞类型的转运用双层微管：所述双层微管由外层微管1与内层微管2套装组成；其中：外层微管1的内径大于步骤S2中确定的待转移细胞的平均直径；内层微管2的内径大于等于步骤S1确定的最小微管内径，小于待转移细胞的平均直径；
S4，利用步骤S3制备得到的双层微管进行细胞吸入与注出实验，确定细胞被内层微管卡住时以及被双层微管注出过程中的微管内压强变化曲线；
S5，根据步骤S4中得到的压强变化曲线，建立机器人化的无视觉反馈细胞转运流程，实现细胞自动转运。
本实施例1的步骤S1中：在进行测试实验前，选取0.1-1.5mm内径的玻璃微管进行堵塞实验，其中：0.1-1mm玻璃微管使用1mm玻璃微管拉制、锻造而成；1-1.5mm内径的玻璃微管为直接购置的玻璃微管；
微管堵塞实验的具体操作方法如下：
将不同内径的玻璃微管依次与装有气压传感器的阀门式或活塞式气泵注射器系统相连接，通过调整阀门的开度或活塞的位置逐步增大吸入压强，使用带胶皮手套的手指在细胞培养液中堵住针管，通过气压传感器分别记录不同内径微管堵塞前后的管内压强变化曲线，逐步增大微管内径，直至获取气压曲线斜率发生明显变化的微管内径范围，并将该范围作为细胞卡住时产生可检测的管内压强变化下所需的微管内径范围。如图2所示，当微管内径大于等于200μm后堵塞前后压强曲线的斜率会产生明显变化，因此要想通过压强曲线斜率的变化来判断细胞是否堵塞，使用的微针内径应该大于200μm。
本实施例1的步骤S2中，筛选待操作细胞类型时，应满足该类细胞的直径大于步骤S1确定的最小微管内径，以保证细胞可以有效地卡在微管管口。本实施例中选取24小时斑马鱼卵作为待操作的细胞类型，其中：斑马鱼鱼卵的平均直径为1mm，除了斑马鱼卵外，本实施例还可选用其它鱼类卵细胞、昆虫卵或两栖类动物的卵细胞等大型细胞(尺寸较大)，作为待转运的细胞类型。本实施例中斑马鱼卵与微管吸持状态下的显微图像，如图3所示，
本实施例1的步骤S3中：制作双层微管时，外层微管的内径设置为待转移细胞平均直径的1.2-1.5倍。具体地，根据斑马鱼卵的平均直径(1mm)，选择内径为1.2mm，外径为1.5mm长度5cm的玻璃管作为外层微管，内层微管选择内径为600μm，外径为1mm，长度为10cm的玻璃微管；制作时：内层微管2插入外层微管1内，在外层微管1入口和内层微管2入口之间留有2mm以上的距离以容纳吸入的斑马鱼卵；之后使用微型酒精灯在内层微管2入口后加热玻璃管，待其变软后使用镊子将两管弯制45°，使得安装在倾斜45°的持针器上时，微管前端处于水平状态，使用胶带3将露在外面的内层微管和外层微管缠绕固定，制作完成的双层微管显微图像和实物结构示意图如附图4所示。
本实施例1的步骤S4中：利用制备得到的双层微管进行细胞吸入与注出实验的具体操作方法如下：
如果后续转运细胞使用的是阀门式气动注射系统提供气压，则通过调整阀门开度调整管内压强，获得细胞吸入和注出时的吸入压和注出压强的变化曲线。如果后续转运细胞操作使用的是活塞式的注射系统来提供气压的话，则通过控制活塞前进与后退的速度来调整管内压强，获得细胞吸入和注出时的吸入压和注出压强变化曲线。测试实验中细胞是否卡住或者释放通过在显微镜下通过图像处理确定，后续的转运实验中不再依赖图像反馈。实验中获得细胞吸入与注出过程的压强变化曲线如附图5所示。
本实施例1的步骤5中：机器人化的无视觉反馈细胞转运流程的具体为：首先将双层微管伸入事先标定位置的存储待转运细胞的培养液滴中，通过控制阀门开度或者活塞运动吸入液体，并实时检测管内压强，当细胞卡住的压强变化曲线出现后，维持阀门开度与活塞位置不变，将微管移动至已标定位置的新液滴内；将系统切换为注出细胞模式，当注出压强曲线出现时停止阀门开度变化或活塞位置变化，重新将双层微管移入细胞存储液滴内，如此往复，直至所有细胞转运完毕。
为了验证本发明实施例1提出的无视觉反馈细胞搬运系统的转运效果，选取20个斑马鱼卵采用实施例1所述的操作方法以及现有依赖显微视觉反馈的手动以及自动细胞转运系统进行对比分析，如表1所示：
由表1可知，本发明实施例1所述的转运方法成功率达90％(18/20)，自动转运失败的2个斑马鱼卵表面含有杂质卡住过程中无法与针管形成有效密封，使得吸入后的压强变化不明显，最终导致基于压强的细胞卡住检测失败。
此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其零、部件的形状、所取名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种无视觉反馈的单细胞自动转运方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，通过微管堵塞实验，测定不同内径微管被堵住前后微管内的压强变化曲线，确定细胞卡住时产生可检测的管内压强变化下所需的微管内径范围；
S2，根据步骤S1确定的微管内径范围，筛选直径大于该范围内最小微管内径的细胞类型作为无视觉反馈单细胞自动转运方法的适用对象；
S3，制作适用于步骤S2所确定的细胞类型的转运用双层微管：所述双层微管由外层微管与内层微管套装组成；其中：外层微管的内径大于步骤S2中确定的待转移细胞的平均直径；内层微管的内径大于等于步骤S1确定的最小微管内径，小于待转移细胞的平均直径；
S4，利用步骤S3制备得到的双层微管进行细胞吸入与注出实验，确定细胞被卡住时以及注出过程中双层微管内的压强变化曲线；
S5，根据步骤S4中得到的压强变化曲线，建立机器人化的无视觉反馈细胞转运流程，实现细胞自动转运；
其中，步骤S1中，微管堵塞实验的具体方法为：将不同内径的玻璃微管依次与装有气压传感器的阀门式气动注射系统或活塞式注射系统相连接，通过调整阀门的开度或活塞的位置逐步增大吸入压强，使用胶皮手套的手指在细胞培养液中堵住针管，通过气压传感器分别记录不同内径微管堵塞前后的管内压强变化曲线，逐步增大微管内径，直至获取气压曲线斜率发生明显变化的微管内径范围，并将该范围作为细胞卡住时产生可检测的管内压强变化下所需的微管内径范围；
其中，步骤S2中，筛选得到的无视觉反馈单细胞自动转运方法的适用对象为大型细胞，包括鱼类卵细胞、两栖类动物卵细胞和昆虫卵；
其中，所述双层微管的制备方法如下：
S11，确定外层微管以及内层微管的内径和长度，分别拉制相应的外层微管以及内层微管；
S12，将内层微管插入外层微管内，并在外层微管入口与内层微管入口之间预留至少一个细胞平均直径的距离，以容纳吸入的细胞；
S13，在内层微管入口后侧加热外层微管，待变软后根据持针器的倾斜角度使用镊子将两个微管弯曲一定的角度，使得双层微管在安装到持针器上后，针管前端处于水平状态，使用胶带将露在外面的内层微管和外层微管缠绕固定，从而制成双层微管。
2.根据权利要求1所述的无视觉反馈的单细胞自动转运方法，其特征在于，步骤S3中，所述外层微管的内径设置为待转移细胞平均直径的1.2-1.5倍。
3.根据权利要求1所述的无视觉反馈的单细胞自动转运方法，其特征在于，步骤S4中，利用制备得到的双层微管进行细胞吸入与注出实验的具体操作方法如下：将双层微管与阀门式气动注射系统或活塞式注射系统相连接，通过控制阀门开度或控制活塞前进与后退，调整细胞吸入和注出时的吸入压和注出压强，并确定细胞卡住和注出时的双层微管管内压强变化曲线。
4.根据权利要求1所述的无视觉反馈的单细胞自动转运方法，其特征在于，步骤S5中，机器人化的无视觉反馈细胞转运流程的具体为：首先将双层微管伸入事先标定位置的存储待转运细胞的培养液滴中，通过控制阀门开度或者活塞运动施加负压吸入液体，并实时检测管内压强，当细胞卡住的压强变化曲线出现后，维持压强不变，将微管移动至已标定位置的新液滴内；将系统切换为注出细胞模式，并施加正压，当注出压强曲线出现时停止加压，重新将双层微管移入细胞存储液滴内，如此往复，直至所有细胞转运完毕。
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