CN114134019B - 快速单细胞转移用细颈微针及制备方法及细胞转运方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速单细胞转移用细颈微针及制备方法及细胞转运方法，其中：通过如下步骤实现单细胞快速转运：制备一根开口可以容纳细胞，细颈处可以卡住细胞的转运用细颈微针；利用细胞转运过程中微针细颈处显微图像的灰度变化，实现细胞的自动卡住与释放判断，在此基础上结合显微操作系统，建立机器人化的细胞自动转运流程，实现细胞快速转运。本发明通过实验确定所需细颈微针的形状并完成制作，进而根据细颈处的图像灰度变化实现细胞卡住与释放的自动判断，由于节省了吸入与释放过程中的细胞位置控制过程，实验结果表明单个细胞的转运速度是人工操作速度的3倍，操作成功率达95％。

Description

快速单细胞转移用细颈微针及制备方法及细胞转运方法

技术领域

本发明涉及显微操作领域，具体涉及一种通过特制的细颈微针，结合显微操作系统，实现高效单细胞自动转运的方法。

背景技术

在胚胎冷冻、细胞清洗与细胞检测中，操作者需要使用玻璃微管从一个液滴吸入细胞然后移动另一个新液滴中注出细胞，这种细胞转运技术是细胞处理最常见的操作步骤之一。为了减少对新液滴成分造成的变化，细胞转运过程中微管携带的原液滴中的液体应尽可能的少。因此，在进行细胞吸入操作时，需要通过控制管内压强使得细胞停留在针口附近位置，从而减少注出细胞过程中注出的管内原溶液。

目前，现有细胞转运操作系统中，细胞位置控制主要利用显微视觉反馈结合对液流和气压变化来实现。然而微管内气压与液流极易受毛细作用和管内气泡等意外因素影响，使得细胞位置控制难度极大，耗时较长。在实际细胞转移过程中，由于无法精确控制细胞位置，继而导致微管内原溶液注出体积较大。因此，很有必要开发一种可以有效控制细胞位置、缩短细胞平均转运时间，并尽可能减少细胞转运过程中管内原溶液注出体积的自动化细胞转运方法。

发明内容

为了克服当前细胞转运系统中细胞位置控制难度大、耗时较长，以及转运过程中的原溶液注出体积无法控制的问题，本发明提出了一种快速单细胞自动转运方法，该方法使用特制的细颈微针进行细胞转运，转移过程中微管吸入细胞后，细胞会自动卡在细颈处，无需对管内液流和压强进行控制，继而降低了细胞位置控制难度和控制时间；同时注出细胞过程中，管内原溶液的注出体积即为微针开口至细颈段之间的微管体积，有效实现了定量控制原溶液注出体积的目的。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种快速单细胞转移用细颈微针，所述细颈微针由开口段、细颈段以及后续段组成，所述开口段用于接触并容纳细胞，细颈段用于卡住细胞，后续段用于施加吸持压；其中：所述细颈段微针最小内径通过微针吸入细胞实验确定，所述微针吸入细胞实验的具体方法为：

S1，通过轮廓检测法确定若干待转移细胞的直径及平均直径；

S2，制备多个内径为0.5-1倍细胞平均直径的吸持微针，从粗到细依次对所选用的测试细胞进行吸入测试，确定不同内径微管将细胞吸入所需要的最小吸持压，并随着微针内径的减小和吸持压的增大，确定细胞被吸破前仍能卡住细胞的最大微管内径，将此微管内径作为可卡住细胞的微针细颈段最小内径d。其中：实验确定的微针细颈段最小内径，可确保微针在卡住细胞的前提下，可以最大限度的为针口提供足够的吸入力从而将细胞吸入开口段以内。

进一步地，步骤S2中，所选用测试细胞为所有待转移细胞中，弹性模量最小的细胞，也即最软的细胞。因越软的细胞被微针卡住的难度越大，本发明通过对最软的细胞进行实验，筛选得到的细颈段内径可确保微针能够卡住比其硬的任意细胞。

作为优选，微针入口处至微针细颈段最小内径处的距离L为1.2-1.5倍细胞平均直径。其中：上述距离范围的限定，可实现在减少转运中注出原溶液的同时，确保开口段微针管壁在细颈段加工过程中不受影响。

进一步地，步骤S2中，微针细颈段最小内径的确定方法为：通过曲线拟合的方式得到不同微针内径与微针吸入细胞所需最小压强的曲线关系，根据该曲线关系公式，确定吸破细胞所需的压强以及吸破细胞前仍可以卡住细胞的最大微针内径；

P＝1.234*10^-3*D³-4.170*10^-1*D²+4.696*10¹*D+1.769*10

上述公式中：D为微针内径。

进一步地，本发明还提供了一种用于制备上述快速单细胞转移用细颈微针的方法，具体步骤如下：

S11，根据检测得到的细胞直径，拉制并锻造内径大于最大细胞直径的微针；

S12，使用锻针仪在距离针口1.2-1.5倍细胞平均直径距离处的微针外壁圆周上确定四个环向相隔90°的点，依次为点A、点B、点C以及点D，并按A，C，D，B的加热顺序加热玻璃管；具体为：首先在点A处加热，使微针内径减小且向加热球一侧弯曲，通过观察角度线，待弯曲达到10°时，通过持针器上的方向标志将微针绕针管轴向旋转顺时针旋转180°在点C处加热玻璃管，使内径进一步减少，直至弯曲微管完全变直；之后将玻璃微管旋转90°在点D处继续加热使之弯曲10°，再将旋转180°加热，在点B处加热，直至微针变直，循环重复上述步骤直至该处微针内径缩小至本发明确定的微针细颈段最小内径。

作为优选，步骤S11中，微针的内径限定为1.2倍的最大细胞直径。

基于上述特制的细颈微针，本发明提供了一种快速单细胞自动转运方法，包括如下步骤：

S111，根据上述细颈微针的制备方法制备开口可以容纳细胞，细颈处可以卡住细胞的细颈微针用于细胞转运；

S112，利用微针细颈处显微图像的灰度变化，实现细胞的自动卡住与释放判断，在此基础上结合显微操作系统，建立机器人化的细胞自动转运流程，实现细胞快速转运。

进一步地，步骤S112中，通过对微针聚焦后的显微图像进行二值化以及轮廓提取，拟合出微针内径上、下边缘，通过上、下边缘的距离的极小值确定微针细颈区域位置；利用细胞内部边缘结合细胞直径确定卡住细胞的矩形区域，通过对该区域内的平均灰度进行实时检测，由灰度值下降沿确定细胞卡住，由灰度值上升确定细胞释放。

进一步地，所述机器人化的细胞自动转运流程具体为：

将制备得到的细颈微针深入事先标定位置的存储待转运细胞的培养液滴中，移动微针至显微视野内，施加吸持压，实时检测微针细颈区域的平均灰度，在细胞被卡住后保持气压不变，移动平台使得微针移动到新液滴内；然后将系统切换为注出细胞模式，施加正压，当卡住区域即：微针细颈区域内的灰度值上升时认为细胞释放成功，重新将微管移入细胞存储液滴，如此往复，直至所有细胞转运完毕。

本发明同现有技术相比具有以下优点及效果：

1、本发明所述的快速单细胞自动转运方法中，所设计的细颈微针由开口段、细颈段以及夹持段组成，所述开口段用于容纳细胞，细颈段用于卡住细胞以固定细胞位置；其中：微针细颈段最小内径需通过微针吸入细胞实验筛选确定，该处内径的设置既需要保证卡住细胞，且需要保证在吸入细胞过程中为开口段提供足够的吸持压；同时，为了保证本发明制备得到的细颈微针能够满足同批次类型所有细胞的转运需求，本发明中细颈微针细颈处内径由弹性最小的细胞个体测试确定，对于杨氏模量更大的同类型细胞，由于吸入所需要的吸持压更大，因此所述细颈微针对其也同类型细胞的转运中同样可以卡住细胞，无需更换微针或者调整其他操作参数，普适性较强。

2、本发明所述的快速单细胞自动转运方法中，通过特制的细颈微针结合显微视觉反馈的方式，实现细胞转运，在转运过程中，由于细胞卡住的位置固定，只需要使用固定的吸持压和流速进行细胞的吸入和注出即可，无需通过对压强和液流进行控制来对细胞的位置进行控制，从而节省调整时间，降低细胞转运操作难度，与传统通过控制气压和流速实现细胞转运的方法相比，操作速度快3倍，操作成功率达95％。

3、本发明所述的快速单细胞自动转运方法中，所用细颈微针开口至细颈段最小内径处的距离需在满足容纳细胞的前提下，保证管内注出原液出体积最小；其中：注出细胞过程中，管内原溶液的注出体积即为微针开口至细颈段之间的微管体积，将细颈微针开口至细颈段最小内径处的距离设置为1.2-1.5倍细胞直径时，可以实现在定量控制原溶液注出体积的同时，且原溶液注出体积最小。

4、综上，本发明所述快速单细胞自动转运方法，不赖于传统利用液流和气压实现细胞位置控制，对于降低细胞转运控制难度、缩短细胞平均转运时间，减少转运过程注出原溶液的体积将十分有益。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中细颈微针的剖面结构示意图。

图2为本发明实施例中细颈微针的立体结构示意图。

图3为本发明实施例中通过微管吸持法测量细胞弹性以及轮廓检测法测量细胞直径实验示意图。

图4为本发明实施例所述微管吸入细胞实验中，不同微针内径与吸入细胞所需最小压强的曲线关系图。

图5为本发明实施例中加工制备细颈微针的过程示意图。

图6为本发明实施例中细胞吸入与注出过程中微针细颈区域灰度变化曲线图。

图7为本发明实施例中机器人化的细胞自动转运流程图。

图8为本发明实施例中快速单细胞自动转运实验过程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例1：如图1至8所示，一种快速单细胞自动转运方法，具体包括如下步骤：

S1，制备一根细胞转运用细颈微针，如图1、图2所示，所述细颈微针由开口段、细颈段以及后续段组成，所述开口段用于接触并容纳细胞，细颈段用于卡住细胞，后续段用于施加吸持压；其中：所述细颈段微针最小内径通过微针吸入细胞实验确定，所述微针吸入细胞实验的具体方法为：

首先，确定若干待转移细胞的直径及平均直径；其次，利用拉针仪对外径1mm内径0.8mm的玻璃微管进行拉制获得内径1μm的玻璃微针，之后使用砂轮在需要内径处切割微管产生内径为0.5到1倍细胞平均直径的相应微针用于测试；然后，从粗到细依次对所选用的测试细胞进行吸入测试，确定不同内径微管将细胞吸入所需要的最小吸持压，并随着微针内径的减小和吸持压的增大，确定细胞被吸破前仍能卡住细胞的最大微管内径，将此微管内径作为可卡住细胞的微针细颈段最小内径d；

其中：将筛选得到的最大微管内径作为微针细颈段最小内径d，可确保微针在卡住细胞的前提下，可以最大限度为针口提供足够的吸入力从而将细胞吸入开口段以内；

S2，利用微针细颈处显微图像的灰度变化，实现细胞的自动卡住与释放判断，在此基础上结合显微操作系统，建立机器人化的细胞自动转运流程，实现细胞快速转运。

具体地，在本实施例1中，若干待转移细胞为家猪卵母细胞。其准备流程如下：从当地屠宰场所取的家猪卵母细胞，家猪卵巢从屠宰场取出后，在两个小时之内用装有35℃到37℃的生理盐水的保温瓶运送到实验室。然后立刻用37°的含有100IU/L的盘尼西林和50mg/L的链霉素的无菌生理盐水清洗两次。从卵巢上的2-6mm直径的卵泡中抽取卵母细胞，将抽出的细胞用TL-Hepes-PVA冲洗三次后，在39°、二氧化碳浓度5％的培养箱内进行体外成熟培养(IVM)42小时。经过IVM后，将细胞用0.1％的透明质酸酶进行脱卵。最后用M199将细胞清洗三次，得到所用的卵母细胞。

本实施例1的步骤S1中，如图3所示，进行微针吸入细胞实验前，选取至少50个卵母细胞通过轮廓检测法测定所有卵母细胞透明带直径，并计算得到细胞平均直径；然后使用同一根内径在0.3-0.4倍细胞平均直径的玻璃微管依次对待转移细胞进行吸持实验，通过施加的吸持压和显微图像处理的方式获得吸持压与细胞在微管内伸长量的曲线关系，利用Shell模型确定细胞杨氏模量。

其中：本发明实施例中，由于在同样吸持压和微管内径下，细胞越软越不容易卡住，因此本发明选取杨氏模量最小即最软的细胞进行测试，筛选得出微针细颈段内径，同样可以卡住杨氏模量更大的同类型细胞，无需更换微针或者调整其他操作参数。

进一步地，本实施例1的步骤S1中：微针细颈段最小内径d的确定方法为：通过三次曲线拟合的方式得到不同微针内径与微针吸入细胞所需最小压强的曲线关系，如图4所示，根据该曲线关系公式：

P＝1.234*10^-3*D³-4.170*10^-1*D²+4.696*10¹*D+1.769*10；

上述公式中：D为微管内径，经实验确定吸破细胞所需要压强大约为-60hPa，根据拟合曲线可以计算吸破细胞前，仍可以卡住细胞最大微针内径为77μm，作为卡住细胞的所需要微针细颈段最小内径d(即：微针细颈段最细处内径)。

具体地，在确定微针细颈段内径d的基础上，本发明实施例1所述的细颈微针的制作方法如下：

为了使其入口可以通过所有细胞，需将微针内径设为大于家猪细胞的最大直径，作为优选，可限定为1.2倍的最大细胞直径。制作流程如下：先使用拉针仪将玻璃微管拉制内径1μm的玻璃微管，之后使用砂轮在体式显微镜下需要入口内径处切割微管产生内径为1.2倍细胞最大直径的微针，之后使用锻针仪在距离针口1.2-1.5倍细胞平均直径的距离处外壁圆周上相隔90°的四个点加热玻璃管，加热顺序为A，C，D，B，如图5(a)，首先在点A加热，逐步增大温度，待微针开始弯曲停止增加温度，使其内径减小且向加热球一侧弯曲，通过观察角度线待微针弯曲达到10°时，如图5(b)所示，停止加热，通过持针器上的方向标志将微针绕针管轴向旋转顺时针旋转180°，在点C处加热玻璃管，使内径进一步减少，直至弯曲微管完全变直如图5(c)所示；之后将玻璃微管旋转90°在点4处继续加热使之弯曲10°，再将旋转180°加热，在点2处加热，直至微针变直，重复上述步骤，直至微针内径缩小为通过细胞吸入实验确定的77μm。制作得到的细颈微针显微图像如附图5(d)所示。

进一步地，如图6至8所示，本实施例1的步骤S2中，利用微针细颈处显微图像的灰度变化，实现细胞的自动卡住与释放判断的具体方法为：通过对微针聚焦后的显微图像进行二值化以及轮廓提取，拟合出微针的内径上、下边缘，通过上、下边缘的距离的极小值确定微针细颈区域位置；利用细胞内部边缘结合细胞直径确定卡住细胞的矩形区域，通过对该区域内的平均灰度进行实时检测，如图6所示，由灰度值下降沿确定细胞卡住，由灰度值上升沿确定细胞释放。

如图7、8所示，步骤S2中，所述机器人化的细胞自动转运流程具体为：

将制备得到的细颈微针深入事先标定位置的存储待转运细胞的培养液滴中如图8(a)，移动微针至显微视野内，施加负压，实时检测微针细颈区域的平均灰度，在细胞被卡住后如图8(b)，保持气压不变，移动平台使得微针移动到标定好的新液滴内；然后将系统切换为注出细胞模式，施加正压，当卡住区域即：微针细颈区域内的灰度值上升时认为细胞释放成功，细胞注出(图8(c))后，，重新将微管移入细胞存储液滴(图8(d))，如此往复，直至所有细胞转运完毕。转运过程流程图与实验图分别如附图7和8所示。

实施例2：为了验证本发明实施例1所述一种快速单细胞自动转运方法的转运效果，我们选取20个卵母细胞采用实施例所述的方法进行转运。作为对比，对这20个胚胎还使用传统的吸管和手动压强调整方法在显微镜下进行细胞运输操作，比较两种操作方法的操作速度及转运成功率。

实验表明本发明实施例1中的方法转运成功率达95％(19/20)，仅有一个卵母细胞因透明带在清洗时破裂导致被卡住失败。本发明所述方法的操作速度与同一批细胞在显微镜下通过手动调节旋钮调整气压注射器和移动微针的方法的转运速度进行对比发现，本发明方法的转运速度约为12s/细胞，为手动方法操作速度的3倍(约36s/细胞)。

表1

此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其零、部件的形状、所取名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种快速单细胞转移用细颈微针，其特征在于，所述细颈微针由开口段、细颈段以及后续段组成，所述开口段用于接触并容纳细胞，细颈段用于卡住细胞，后续段用于施加吸持压；其中：所述细颈段微针最小内径通过微针吸入细胞实验确定，所述微针吸入细胞实验的具体方法为：

S1，通过轮廓检测法确定若干待转移细胞的直径及平均直径；

S2，制备多个内径为0.5-1倍细胞平均直径的吸持微针，从粗到细依次对所选用的测试细胞进行吸入测试，确定不同内径微管将细胞吸入所需要的最小吸持压，并随着微针内径的减小和吸持压的增大，确定细胞被吸破前仍能卡住细胞的最大微管内径，将此微管内径作为可卡住细胞的微针细颈段最小内径d；

步骤S2中，所选用测试细胞为所有待转移细胞中，弹性模量最小的细胞；

步骤S2中，微针细颈段最小内径的确定方法为：通过曲线拟合的方式得到不同微针内径与微针吸入细胞所需最小压强的曲线关系，根据该曲线关系公式，确定吸破细胞所需的压强以及吸破细胞前仍可以卡住细胞的最大微针内径；

P＝1.234*10^-3*D³-4.170*10^-1*D²+4.696*10¹*D+1.769*10

上述公式中：D为微管内径。

2.根据权利要求1所述的快速单细胞转移用细颈微针，其特征在于，步骤S2中，所选用测试细胞为所有待转移细胞中，弹性模量最小的细胞。

3.一种用于制备权利要求1至2任一所述快速单细胞转移用细颈微针的方法，其特征在于，步骤如下：

S11，根据权利要求1检测得到的细胞直径，拉制并锻造内径大于最大细胞直径的微针；

S12，使用锻针仪在距离针口1.2-1.5倍细胞平均直径距离处的微针外壁圆周上确定四个环向相隔90°的点，依次为点A、点B、点C以及点D，并按A，C，D，B的加热顺序加热玻璃管；具体为：首先在点A处加热，使微针内径减小且向加热球一侧弯曲，通过观察角度线，待弯曲达到10°时，通过持针器上的方向标志将微针绕针管轴向旋转顺时针旋转180°在点C处加热玻璃管，使内径进一步减少，直至弯曲微管完全变直；之后将玻璃微管旋转90°在点D处继续加热使之弯曲10°，再将旋转180°加热，在点B处加热，直至微针变直，循环重复上述步骤直至该处微针内径缩小至权利要求1中确定的微针细颈段最小内径。

4.根据权利要求3所述的快速单细胞转移用细颈微针制备方法，其特征在于，步骤S11中，微针的内径限定为1.2倍的最大细胞直径。

5.一种快速单细胞自动转运方法，其特征在于，包括如下步骤：

S111，根据权利要求4所述的制备方法制备开口可以容纳细胞，细颈处可以卡住细胞的细颈微针用于细胞转运；

S112，利用微针细颈处显微图像的灰度变化，实现细胞的自动卡住与释放判断，在此基础上结合显微操作系统，建立机器人化的细胞自动转运流程，实现细胞快速转运；

步骤S112中，通过对微针聚焦后的显微图像进行二值化以及轮廓提取，拟合出微针的内径上、下边缘，通过上、下边缘的距离的极小值确定微针细颈区域位置；利用细胞内部边缘结合细胞直径确定卡住细胞的矩形区域，通过对该区域内的平均灰度进行实时检测，由灰度值下降沿确定细胞卡住，由灰度值上升沿确定细胞释放。

6.根据权利要求5所述的快速单细胞自动转运方法，其特征在于，步骤S112中，所述机器人化的细胞自动转运流程具体为：

将制备得到的细颈微针深入事先标定位置的存储待转运细胞的培养液滴中，移动微针至显微视野内，施加吸持压，实时检测微针细颈区域的平均灰度，在细胞被卡住后保持气压不变，移动平台使得微针移动到新液滴内；然后将系统切换为注出细胞模式，施加正压，当卡住区域即：微针细颈区域内的灰度值上升时认为细胞释放成功，重新将微管移入细胞存储液滴，如此往复，直至所有细胞转运完毕。