CN109517871B - 一种最佳去核压强的确定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种最佳去核压强的确定方法，属于细胞级别的显微操作，该方法的特点是利用弹簧模型，计算出能抽动胞质的最远气液交界面位置，根据已知的最佳去核量与去核成功率的关系，确定出最佳去核的气液交界面位置，进而确定出最佳去核压强。在本发明方法确定的最佳去核压强下进行去核实验，可以显著提高动物卵母细胞的去核成功率。

Description

一种最佳去核压强的确定方法

技术领域

本发明涉及生物实验技术领域，具体涉及一种最佳去核压强的确定方法。

背景技术

细胞的去核过程是核移植、克隆等生物操作的关键步骤。在细胞去核过程中，平衡压的大小会对去核操作的成功率造成很大影响。因为气液交界面越靠近针尖位置，平衡压越大，更容易将胞质和细胞核抽动，所以现有的方法更倾向于在平衡压大的位置进行去核操作。然而，更大的力也更容易对细胞造成伤害，且气液交界面靠近针尖位置也更容易堵针，导致了细胞存活率以及后续操作成功率的下降。因此，计算出一个最小的能够抽动细胞胞质且能抽取足够量胞质体积的平衡压，对于提高去核成功率极为重要，成功去核也将有助于后续细胞存活以及克隆操作的成功。

发明内容

本发明的目的是提供一种最佳去核压强的确定方法，在该最佳去核压强下进行去核实验，可以显著提高动物卵母细胞的去核成功率。

本发明的技术方案是：一种最佳去核压强的确定方法，属于细胞级别的显微操作技术，所述方法具体包括以下步骤：

(1)运用微针1进行胞质吸取实验，确立模型并计算出模型中系数的值；

(2)运用微针2吸取胞质进行参数标定实验，计算出实验环境下能够抽动胞质的最远气液交界面位置半径R_最远；

(3)运用步骤(2)中测量和计算得到的数值，以及已知的最佳去核量，计算最佳去核量时的气液交界面位置半径R_靠前，进而确定出最佳去核压强P_最佳。

所述步骤(1)中的模型为弹簧模型，系数为劲度系数k。

所述劲度系数k值由以下公式：

给出，其中L₁和L₂分别表示在改变去核针管1内平衡压后，胞质在针管1内的长度；S₁和S₂分别表示对应该长度的胞质边缘位置的微针1内的截面面积。P₁和P₂分别表示微针1管内当胞质长度分别为L₁和L₂时的平衡压，分别由以下公式：

P＝P_out+2σcosα/R

给出，其中P_out表示外界气压，σ表示卵母细胞操作液的表面张力系数，α表示液面与内壁的接触角，R表示气液交界面处的微管1内壁半径。

所述步骤(2)中最远气液交界面位置半径R_最远的值由以下公式：

ΔP₁＝2σcosα/R_最远-2σcosα/(R_最远+L_最远·tanβ) (a)

给出，其中σ表示卵母细胞操作液的表面张力系数；α表示液面与内壁的接触角；β表示微针2管的针壁的倾斜角度；L_最远表示当平衡压变化为ΔP₁时，气液交界面的水平距离变化；ΔP₁为想要抽动胞质需要的最小压强变化，由以下公式：

给出，其中x表示微针2刺入细胞内，在未施加平衡压时，少部分胞质进入微针2管内的长度，可由图像测出；S表示对应该长度的细胞边缘位置的微针2管内的截面面积；k为已求得的弹簧模型的弹性系数。

公式(a)中，R_最远与L_最远的关系还符合以下公式：

给出，其中R_c为微针2的针口半径；x表示微针2管刺入细胞内，在未施加平衡压时，少部分胞质进入微针2管内的长度，可由图像测出；α表示液面与内壁的接触角。

所述步骤(3)中的最佳去核压强P_最佳，由以下公式：

P_最佳＝P_out+2σcosα/R_靠前

给出，其中P_out表示外界气压；σ表示卵母细胞操作液的表面张力系数；α表示液面与内壁的接触角；R_靠前为最佳去核的气液交界面位置半径值，由以下公式：

给出，其中R_最远表示能抽动胞质的最远气液交界面位置半径，由步骤(2)求得；β表示微针2管的针壁的倾斜角度；V_{x_z}为胞质在针管内的体积，由以下公式：

V_{x_z}＝V_x/λ

给出，其中λ为胞质在针管内的扩散系数；V_x为抽取最佳去核量θ时抽出的胞质的体积，由以下公式：

V_x＝θV

给出，其中θ为抽取的最佳去核量；V为胞质体积，由以下公式：

给出，其中R_cytoplasm表示胞质半径。

所述最佳去核量θ为去核体积6.9％。

与现有技术相比，本发明提供一种最佳去核压强的确定方法，在去核过程中胞质能抽动且去核成功率最高的前提下，实现了去核压强的最小化。在本发明方法确定的最佳去核压强下进行去核实验，动物卵母细胞的去核成功率显著提高。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细地描述，其中：

图1是本发明的流程图。

图2是本发明中对消化后得到的卵母细胞胞质进行吸持的图像。

图3是本发明中对染色的卵母细胞进行去核实验的图像。

具体实施方式

下面结合实施例附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，描述的实施例仅仅是本发明的一个具体的实施例，不是全部的实施例。下述实施例是说明性的，不是限制性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

图1为本发明阐述的最佳去核压强的确定方法的流程图，具体实施情况如下：

首先，运用微针1进行胞质吸取实验，确立模型为弹簧模型，计算出弹簧模型中的劲度系数k的值。具体操作为：利用K蛋白酶将卵母细胞透明带进行消化，获得无损的卵母细胞胞质；利用玻璃微管对卵母细胞胞质进行吸持，得到细胞边缘位置的变化量与细胞受力关系，发现细胞的形变量与施加在细胞上的力近似成正比，因此将去核过程拟定为弹簧模型。利用弹簧模型，计算出弹簧模型的k值。

模型中的k值由以下公式：

给出，其中L₁和L₂分别表示在改变去核针管1内平衡压后，胞质在针管1内的长度；S₁和S₂分别表示对应该长度的胞质边缘位置的微针1内的截面面积。P₁和P₂分别表示微针1管内当胞质长度分别为L₁和L₂时的平衡压，分别由以下公式：

P＝P_out+2σcosα/R

给出，其中P_out表示外界气压，σ表示卵母细胞操作液的表面张力系数，α表示液面与内壁的接触角，R表示气液交界面处的微管1内壁半径。

然后，运用微针2吸取胞质进行参数标定实验，计算出实验环境下能够抽动胞质的最远气液交界面位置半径R_最远。此时，最远气液交界面位置半径R_最远的计算需要满足：施加在胞质上的力大于等于弹簧模型因形变产生的反向的力。

最远气液交界面位置半径R_最远的值由以下公式：

ΔP₁＝2σcosα/R_最远-2σcosα/(R_最远+L_最远·tanβ) (a)

给出，其中σ表示卵母细胞操作液的表面张力系数；α表示液面与内壁的接触角；β表示微针2管的针壁的倾斜角度；L_最远表示当平衡压变化为ΔP₁时，气液交界面的水平距离变化；ΔP₁为想要抽动胞质需要的最小压强变化，由以下公式：

给出，其中x表示微针2刺入细胞内，在未施加平衡压时，少部分胞质进入微针2管内的长度，可由图像测出；S表示对应该长度的细胞边缘位置的微针2管内的截面面积；k为已求得的弹簧模型的弹性系数。

公式(a)中，R_最远与L_最远的关系还符合以下公式：

给出，其中R_c为微针2的针口半径；x表示微针2管刺入细胞内，在未施加平衡压时，少部分胞质进入微针2管内的长度，可由图像测出；α表示液面与内壁的接触角。

最后，运用上述参数标定实验中测量和计算得到的数值，以及已知的最佳去核量，计算最佳去核量时的气液交界面位置半径R_靠前，进而确定最佳去核压强P_最佳。根据现有技术已知的去核成功率与去核量的关系可知，当去核量为胞质体积的6.9％时，去核成功率最高，因此，确定最佳去核量θ为去核体积6.9％。并计算出当抽出的体积为胞质体积的6.9％时，最佳的气液交界面位置半径R_靠前，并根据上面的平衡压公式反推出此时的平衡压大小，即为最佳去核压强P_最佳，计算公式如下；

P_最佳＝P_out+2σcosα/R_靠前

给出，其中P_out表示外界气压；σ表示卵母细胞操作液的表面张力系数；α表示液面与内壁的接触角；R_靠前为最佳去核的气液交界面位置半径值，由以下公式：

给出，其中R_最远表示能抽动胞质的最远气液交界面位置半径，由步骤(2)求得；β表示微针2管的针壁的倾斜角度，V_{x_z}为胞质在针管内的体积，由以下公式：

V_{x_z}＝V_x/λ

给出，其中λ为胞质在针管内的扩散系数；V_x为抽取最佳去核量θ时抽出的胞质的体积，由以下公式：

V_x＝θV

给出，其中θ为抽取的最佳去核量6.9％；V为胞质体积，由以下公式：

给出，其中R_cytoplasm表示胞质半径。

至此，就完成了最佳去核压强P_最佳的计算和确定过程。下面，我们利用该算法计算并确定最佳去核压强P_最佳，然后在该最佳去核压强P_最佳下对动物卵母细胞进行去核实验。

实施例1

本实施例所用的卵母细胞是从当地屠宰场所取的家猪卵母细胞。

(1)家猪卵母细胞获取

家猪卵巢从屠宰场取出后，在两个小时之内用装有35°到37°的生理盐水的保温瓶运送到实验室。然后立刻用37°的含有100IU/L的盘尼西林和50mg/L的链霉素的无菌生理盐水清洗两次。从卵巢上的2-6mm直径的卵泡中抽取卵母细胞，将抽出的细胞用TL-Hepes-PVA冲洗三次后，在39°、二氧化碳浓度5％的培养箱内进行体外成熟培养(IVM)42小时。经过IVM后，将细胞用0.1％的透明质酸酶进行脱卵。最后用M199将细胞清洗三次，得到所用的卵母细胞。

(2)胞质吸取实验和参数标定实验准备

本实施例中，采用NK-MR601显微操作系统进行操作，该装置系统包括两个三自由度的操作臂，其中一个操作臂装载用于固定细胞的吸持针，另一个操作臂装载用于去核的微针2。其中，吸持针的针口半径为50-80微米，微针2的针口半径为9-12微米。

本实施例中，采用自主研发的具有外部气源的气动注射器对去除透明带后的胞质进行吸取，用来测定参数并计算k值。所用微针1的直径为30-50微米。

(3)弹性模型k值计算

将卵母细胞利用K蛋白酶消化，得到无损的卵母细胞胞质，并用直径为30微米的微针1对胞质进行吸取实验。图2中a-d所示为得到的卵母细胞胞质的边缘变化情况。根据弹性模型计算k值：

这里，我们测得四组P值：1378.9514Pa,2068.4271Pa,4136.8542Pa,5515.8056Pa；四组S值：5150.385μm²，5538.96μm²，5671.625μm²，5805.86μm²；以及四组L值：46.875μm，91.25μm，117.5μm，173.75μm；通过拟合函数得到k值为207725N/μm。

(4)参数标定实验中能够抽动胞质的最远气液交界面位置半径R_最远值计算

参数标定实验中观测到：当微针2管刺入细胞后，胞质会有少部分进入微针2管内，形成密封，并构成弹簧模型。此时，ΔP₁为想要抽动胞质需要的最小压强变化，由以下公式得到：

其中x值可以由图像处理方法测得，本实施例中x＝1μm，此时的S值为315.417μm²，k值上面已计算出，则根据平衡压模型可以计算得到此时最远气液交界面位置半径R_最远为24.1μm。此时，对应的平衡压为6620Pa。

(5)最佳去核压强P_最佳的计算

根据上述参数标定实验获得和计算的数据，以及已知的最佳去核量进行进一步计算。现有文献表明，当去核量为胞质体积的6.9％的时候，去核成功率最大，成功率为93.3％，而去核量再提升的时候，成功率基本不变。所以，本实施例中设定的最佳去核量θ为胞质体积的6.9％。

经测量，家猪卵母细胞胞质的半径R_cytoplasm为56-61微米，根据球体体积公式：

则球体体积V的范围为：735618.58-950775.79μm³,去核的体积V_x为50772.34-65622.48μm³。因为当胞质抽到微针内体积会发生扩散，且扩散系数λ为0.8，则去核微针微针2管内胞质的体积V_{x_z}为63465.425-82028.1μm³。

假设微针内体积变化为圆台，则根据公式：

可计算出R_靠前的范围为23.16μm-23.38μm；其中β表示微针2管的针壁的倾斜角度，为2°。此时的去核平衡压P_最佳由公式：

P_最佳＝P_out+2σcosα/R_靠前

计算可得，范围为6783-6888Pa。公式中，P_out的值为1Pa，σ的值为79.3mN/m，α的值为10°。为了保证去核成功率，一般将P_最佳设为6888Pa。

(6)不同去核压强下的去核实验

对家猪卵母细胞进行荧光染色，然后在明场下分别以6620Pa和6888Pa的平衡压进行去核实验，两组实验均进行20次，去核实验后通过荧光检测两个平衡压下是否成功去除细胞核。图3显示了去核后在荧光下观察去核是否成功。a图代表染色后未进行去核时的卵母细胞图像，此时细胞核还在卵母细胞内；b图代表利用盲吸法去核后的卵母细胞图像，此时细胞核已经被去除，且出现了因盲吸后造成的胞质体积缺失。结果表明，6888Pa平衡压下的去核成功率显著高于6620Pa下的去核成功率(85％VS.0％)。

以上通过实施例对本发明进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的示例性实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。本发明的保护范围由权利要求书限定。凡利用本发明所述的技术方案，或本领域的技术人员在本发明技术方案的启发下，在本发明的实质和保护范围内，设计出类似的技术方案而达到上述技术效果的，或者对申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖保护范围之内。应当注意，为了清楚的进行表述，本发明的说明中省略了部分与本发明的保护范围无直接明显的关联但本领域技术人员已知的处理表述。

Claims (2)

1.一种最佳去核压强的确定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)运用微针1进行胞质吸取实验，确立模型并计算出模型中系数的值；其中：所述模型为弹簧模型，系数为劲度系数k，所述劲度系数k值由以下公式计算得到：

其中：L₁和L₂分别表示在改变去核微针1内平衡压后，胞质在微针针管内的长度；S₁和S₂分别表示对应该长度的胞质边缘位置的微针1内的截面面积；P₁和P₂分别表示微针1管内当胞质长度分别为L₁和L₂时的平衡压，分别由以下公式计算得到：

P＝P_out+2σcosα/R

其中：P_out表示外界气压，σ表示卵母细胞操作液的表面张力系数，α表示液面与内壁的接触角，R表示气液交界面处的微管1内壁半径；

(2)运用微针2吸取胞质进行参数标定实验，计算出实验环境下能够抽动胞质的最远气液交界面位置半径R_最远，R_最远的值由公式(a)计算得到：

ΔP₁＝2σcosα/R_最远-2σcosα/(R_最远+L_最远·tanβ) (a)

其中：σ表示卵母细胞操作液的表面张力系数；α表示液面与内壁的接触角；β表示微针2管的针壁的倾斜角度；L_最远表示当平衡压变化为ΔP₁时，气液交界面的水平距离变化；ΔP₁为想要抽动胞质需要的最小压强变化，由以下公式计算得出：

其中：x表示微针2刺入细胞内，在未施加平衡压时，少部分胞质进入微针2管内的长度，可由图像测出；S表示对应该长度的细胞边缘位置的微针2管内的截面面积；k为步骤(1)已求得的弹簧模型的弹性系数；

公式(a)中，R_最远与L_最远的关系还符合以下公式：

其中：R_c为微针2的针口半径；x表示微针2管刺入细胞内，在未施加平衡压时，少部分胞质进入微针2管内的长度，可由图像测出；α表示液面与内壁的接触角；

(3)运用步骤(2)中测量和计算得到的数值，以及已知的最佳去核量，计算最佳去核量时的气液交界面位置半径R_靠前，进而确定出最佳去核压强P_最佳；

其中：最佳去核压强P_最佳的计算公式如下：

P_最佳＝P_out+2σcosα/R_靠前

其中：P_out表示外界气压；σ表示卵母细胞操作液的表面张力系数；α表示液面与内壁的接触角；R_靠前为最佳去核的气液交界面位置半径值，由以下公式计算得出：

其中：R_最远表示能抽动胞质的最远气液交界面位置半径，由步骤(2)求得；β表示微针2管的针壁的倾斜角度，V_{x_z}为胞质在针管内的体积，由以下公式计算得出：

V_{x_z}＝V_x/λ

其中：λ为胞质在针管内的扩散系数；V_x为抽取最佳去核量θ时抽出的胞质的体积，由以下公式计算得出：

V_x＝θV

其中：θ为抽取的最佳去核量；V为胞质体积，由以下公式计算得出：

给出，其中R_cytoplasm表示胞质半径。

2.按照权利要求1所述的最佳去核压强的确定方法，其特征在于，所述最佳去核量θ为胞质体积的6.9％。

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