CN114129295A - 一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法，涉及动物模型构建方法领域。包括以下步骤：1)颈外动脉永久性结扎；2)临时阻断颈总动脉近心端；3)颈总动脉注射肿瘤细胞；4)完成后临时阻断颈总动脉远心端防止血液回流；5)水凝胶修补注射穿刺点；6)依次松开颈总动脉远心端和近心端的阻断。本申请的造模方法所需时间短，技术手段难度低，采用结扎颈外动脉的方式保留颈内动脉通畅，颅内的血流动力学无明显改变，极大的降低了传统造模过程引起的死亡率以及术后脑梗塞率，更接近于自然状态下的外周肿瘤经颈内动脉进入颅内以及定植的过程。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型构建领域，尤其涉及一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法。
背景技术
脑转移瘤(BMs)是最常见的恶性脑肿瘤，是原发性脑肿瘤的10倍。其中是癌症患者的主要死因，占所有癌症患者的10％-20％。与原发肿瘤相比，脑转移的生物学机制尚不清楚，脑转移的研究仍然充满挑战，重要原因之一是缺乏合适的实验模型来准确模拟脑转移的过程。目前广泛使用的脑转移瘤临床前动物模型主要有经尾静脉注射、心脏注射、颅内原位注射、以及经颈动脉注射等。每种模型都有其优缺点，应根据主要研究问题选择哪种模型制作方法。尾静脉注射和心脏注射的特点是操作简单，但具有颅内肿瘤形成率低的特点，而且由于在中枢神经系统以外的器官部位形成转移，许多小鼠在颅内肿瘤形成前死亡。经颈动脉注射法脑转移瘤形成率最高，由于不直接进入脑内，可纳入血脑屏障研究，但缺点是研究人员需良好的显微技术。
一般认为，脑肿瘤病灶的分布与脑血流灌注密切相关，而以往的颈内动脉注射脑转移模型需要对颈总动脉进行永久性结扎。由于wills动脉环的存在，一侧颈内动脉永久闭塞并不一定会导致脑梗塞，但颈内动脉慢性闭塞会引起颅内血流动力学发生改变，从而影响肿瘤细胞在颅内的分布，同时可能引起部分脑内星形胶质细胞的活化，或导致脑微环境发生变化，从而在一定程度上影响脑转移瘤在脑内的定植。
此外，研究发现脑微血管变化对肺癌脑转移的发展有保护作用，外周癌细胞一旦进入脑循环，可能会滞留在血管分支点毛细血管床内缓慢流动的部位，这是形成脑转移的必要步骤，然后癌细胞通过血脑屏障进入大脑的微环境。在以往的颈内动脉注射模型中，由于颈内动脉闭塞，可能会增加瘤栓的形成，即使没有严重的缺血，颅内血流动力学改变，进入后可能导致外周肿瘤细胞分布异常。在这里，外周肿瘤细胞会遇到微环境中的各种细胞和细胞因子。研究还发现，微环境中的星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元细胞和免疫细胞可能会影响肿瘤细胞。因此，理论上微环境细胞或细胞因子的变化可能导致脑转移形成的变化。
迄今为止，大多数使用颈内动脉注射模型进行脑转移的研究都忽略了颈内动脉结扎引起的一系列问题。颈内动脉慢性闭塞会引起颅内血流动力学发生改变，从而影响肿瘤细胞在颅内的分布，同时可能引起部分脑内星形胶质细胞的活化，或导致脑微环境发生变化，从而在一定程度上影响脑转移瘤在脑内的定植。
发明内容
本发明提供了一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法，通过改良，将颈总动脉进行修补，保持颈内动脉血流的通畅，从而更好的模拟自然状态下外周肿瘤细胞进入颅内并定植的过程。
为了解决上述技术问题，本发明实施例提供了一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法，包括以下步骤：
1)颈外动脉永久性结扎；
2)临时阻断颈总动脉近心端；
3)颈总动脉注射肿瘤细胞；
4)完成后临时阻断颈总动脉远心端防止血液回流；
5)水凝胶修补注射穿刺点；
6)依次松开颈总动脉远心端和近心端的阻断。
通过采用上述方案，本申请的造模所需时间短，采用结扎颈外动脉的方式保留颈内动脉通畅，颅内的血流动力学无明显改变，极大的降低了传统造模过程引起的死亡率以及术后脑梗塞率，更接近于自然状态下的外周肿瘤经颈内动脉进入颅内以及定植的过程；且本申请技术不需要缝合技术等高难度的显微操作技术，利用水凝胶的压迫及修补的作用，迅速修复血管破损处，易于在研究人员中复制和技术推广，从而提高成功率，更接近于真实自然的血行转移状态。
作为优选方案，在所述步骤3)中，所述肿瘤细胞注射量为100ul，浓度为2*105/mL，注射时间在60s以上。
作为优选方案，在所述步骤2)中，还包括在颈总动脉远心端靠近分叉处用缝线宽松系住；在所述步骤4)中，提起颈总动脉远心端的缝线打一个线结进行临时阻断血管，防止颈总动脉远心端的血液回流。
作为优选方案，在所述步骤5)中，将配置好的水凝胶1-2滴滴到穿刺点，蓝光手电筒照射后，判断水凝胶已经凝固且附着于穿刺点处。
作为优选方案，所述水凝胶为光固化甲基丙烯化水凝胶。
作为优选方案，在所述步骤6)中，先释放颈总动脉远心端的阻断，可见远心端无回血，再小心释放颈总动脉近心端的阻断，如此时无血渗出，则表示修补成功，清理血管周围无用的水凝胶。
作为优选方案，在所述步骤2)中，采用血管夹临时阻断颈总动脉近心端。
作为优选方案，在所述步骤1)前，还包括采用异氟烷气体进行麻醉。
作为优选方案，在所述步骤1)前和麻醉后，还包括暴露颈总动脉和颈总动脉分叉。
作为优选方案，所述暴露颈总动脉和颈总动脉分叉包括将动物颈部进行脱毛，消毒，采用纵行正中切口，牵开皮肤，暴露唾液腺，牵开唾液腺，暴露气管，将气管左侧的颈内动脉表面的肌肉切开，暴露颈总动脉以及颈总动脉分叉，锐性分离颈总动脉旁的迷走神经。
相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：
本申请的造模所需时间短，技术手段难度低，采用结扎颈外动脉的方式保留颈内动脉通畅，颅内的血流动力学无明显改变，极大的降低了传统造模过程引起的死亡率以及术后脑梗塞率，利用水凝胶的压迫及修补的作用，迅速修复血管破损处，易于在研究人员中复制和技术推广，更接近于自然状态下的外周肿瘤经颈内动脉进入颅内以及定植的过程。
附图说明
图1-为本发明实施例中一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法的操作示意图；
图2-为本发明实施例中一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法的小鼠脑部体外活体成像结果(注：小鼠左脑可见荧光信号，提示脑转移瘤形成)；
图3-为本发明实施例中一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法的小鼠脑部荧光显微镜检测结果(注：由于肿瘤细胞表达GFP绿色荧光蛋白，因此在体视荧光显微镜下可看到绿色荧光的病灶为肿瘤转移灶，从而判断脑转移瘤病灶的大小、数量和在大脑中的分布)；
图4-为本发明实施例中一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法的小鼠脑部IF免疫荧光染色结果(注：免疫荧光结果可见绿色荧光部分为脑转移的成瘤病灶)；
图5-为本发明实施例中一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法和现有传统模型构建方法针对死亡率的统计结果(注：左-现有传统模型构建方法，右上右下-本申请实施例)；
图6-为本发明实施例中一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法和现有传统模型构建方法针对成瘤率的统计结果(注：左上左下-现有传统模型构建方法，右上右下-本申请实施例)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法，如图1所示，包括以下步骤：
1、研究对象：选择6-10周的nod-scid小鼠。
2、肿瘤细胞准备：提前构建PC90GFP-Luc或A549-GFP-Luc细胞系，复苏后传代2-3次，在肿瘤接种当天用胰蛋白酶将肿瘤细胞消化，细胞计数，用Hanks缓冲液将肿瘤细胞稀释到2*105/mL，置于冰上备用。
3、麻醉：采用异氟烷气体对小鼠进行麻醉处理。
4、体位及切口：
A)暴露小鼠颈部的颈总动脉和颈总动脉分叉：
将小鼠颈部进行脱毛，碘伏消毒，采用纵行正中切口，长约1cm，牵开皮肤，暴露唾液腺，将唾液腺牵开，暴露气管，将气管左侧的颈内动脉表面的肌肉切开，暴露颈总动脉以及颈总动脉分叉，锐性分离颈总动脉旁的迷走神经；
B)颈外动脉永久性结扎：
游离颈总动脉分叉间的筋膜，用8-0缝线将颈外动脉结扎；
C)临时阻断颈总动脉近心端：
颈总动脉远心端靠近分叉处用8-0缝线宽松的系住，保持动脉管径无变化，离分叉处8mm的颈总动脉更近心端处用血管夹临时阻断；
D)颈总动脉注射肿瘤细胞：
准备肿瘤细胞，重悬后吸入1ml的注射器中，排净气泡，更换注射器针头为斜面34G针头，将颈总动脉下垫湿棉球抬高颈总动脉，注射器刺入颈总动脉，角度为15度左右，缓慢注射Hanks液重悬的100ul肿瘤细胞，注射时间不短于60s；
E)注射完成后临时阻断颈总动脉远心端：
注射成功后，退出注射器针头，同时提起颈总动脉远心端的8-0缝线并双手拿显微镊子打一个线结进行临时阻断血管，防止颈总动脉远心端的血液回流；
F)水凝胶修补注射穿刺点：
立刻将配置好提前吸入0.3ml微量注射器中的光固化甲基丙烯化水凝胶(HAMA)1-2滴滴到穿刺点，蓝光手电筒照射15s后，判断水凝胶已经凝固且附着于穿刺点处；
D)依次松开颈总动脉远心端和近心端的阻断：
然后，先松开颈总动脉远心端的结扎线，可见颈总动脉远心端无回血，再小心释放颈总动脉近心端的血管夹，如此时无血渗出，则表示修补成功，清理血管周围无用的水凝胶，以免压迫颈总动脉造成血管狭窄以及血流减少血流，可见颈总动脉有血流通过，且搏动良好，说明修补成功减少，常规缝合皮肤。
5、术后处理：将小鼠放置于保温垫上复温，待小鼠苏醒，术后将小鼠置于SPF屏障环境，常规进食进水，密切观察小鼠精神状态、活动能力及体重等，如有精神变差、活动能力变弱或体重减轻等情况，做体外活体成像观察是否形成肿瘤，一般在造模后1个月左右开始体外活体成像观察，随造模时间延长，肿瘤逐渐增大，按照实验目的决定造模的终点，根据实验目的是观测肿瘤成瘤大小或小鼠脑转移后的生存期，结果如图2所示；若肿瘤形成，将小鼠脱臼处死，心脏灌注PBS及PFA，取脑后在提示荧光显微镜下拍图看脑内肿瘤荧光的部位，结果如图3所示，观察肿瘤的分布，随后将小鼠脑脱水、固定、OCT包埋，进行IF免疫荧光染色，结果如图4所示。
6、结果分析：
以现有传统模型构建方法作为对照，对颈总动脉进行永久结扎处理，具体操作为注射肿瘤细胞到颈总动脉后，结扎颈总动脉而不进行修补。本申请造模所需时间短，技术熟练后，约需20分钟左右，而且保留颈内动脉通畅，颅内的血流动力学无明显改变，极大的降低了传统造模过程引起的死亡率以及术后脑梗塞率。如图5所示，对比以往造模方法37.14％死亡率，本申请造模死亡率降低到5.71％，提高了造模的成功率，同时提高了脑转移瘤的成瘤率，如图6所示，分别采用PC90GFP-Luc和A549-GFP-Luc作为肿瘤细胞样品，其中PC9肺癌细胞的成瘤率从传统造模方法的50％提高到69.23％，A549肺癌细胞的成瘤率从传统造模方法的40％提高到57.14％，更接近于自然状态下的外周肿瘤经颈内动脉进入颅内以及定植的过程。
而且本申请技术不需要缝合技术等高难度的显微操作技术，利用水凝胶的压迫及修补的作用，迅速修复血管破损处。易于在研究人员中复制和技术推广，从而提高小鼠脑转移瘤的经颈内动脉注射模型的成功率，且更接近于真实自然的血行转移状态。
另外，本技术还可以应用于不牺牲颈内动脉的经颈内动脉注射其他肿瘤细胞、神经干细胞或各种需颈内动脉注射的药物的过程，从而最大可能的保护同侧颈内动脉供血，尽可能的减小由于颈内动脉供血不足造成的对科学研究造成的干扰。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围。特别指出，对于本领域技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)颈外动脉永久性结扎；
2)临时阻断颈总动脉近心端；
3)颈总动脉注射肿瘤细胞；
4)完成后临时阻断颈总动脉远心端防止血液回流；
5)水凝胶修补注射穿刺点；
6)依次松开颈总动脉远心端和近心端的阻断。
2.如权利要求1所述的一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法，其特征在于，在所述步骤3)中，所述肿瘤细胞注射量为100ul，浓度为2*105/mL，注射时间在60s以上。
3.如权利要求1所述的一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法，其特征在于，在所述步骤2)中，还包括在颈总动脉远心端靠近分叉处用缝线宽松系住；在所述步骤4)中，提起颈总动脉远心端的缝线打一个线结进行临时阻断血管，防止颈总动脉远心端的血液回流。
4.如权利要求1所述的一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法，其特征在于，在所述步骤5)中，将配置好的水凝胶1-2滴滴到穿刺点，蓝光手电筒照射后，判断水凝胶已经凝固且附着于穿刺点处。
5.如权利要求4所述的一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法，其特征在于，所述水凝胶为光固化甲基丙烯化水凝胶。
6.如权利要求1所述的一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法，其特征在于，在所述步骤6)中，先释放颈总动脉远心端的阻断，可见远心端无回血，再小心释放颈总动脉近心端的阻断，如此时无血渗出，则表示修补成功，清理血管周围无用的水凝胶。
7.如权利要求1所述的一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法，其特征在于，在所述步骤2)中，采用血管夹临时阻断颈总动脉近心端。
8.如权利要求1所述的一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法，其特征在于，在所述步骤1)前，还包括采用异氟烷气体进行麻醉。
9.如权利要求9所述的一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法，其特征在于，在所述步骤1)前和麻醉后，还包括暴露颈总动脉和颈总动脉分叉。
10.如权利要求9所述的一种新型经颈动脉注射脑转移瘤动物模型的构建方法，其特征在于，所述暴露颈总动脉和颈总动脉分叉包括将动物颈部进行脱毛，消毒，采用纵行正中切口，牵开皮肤，暴露唾液腺，牵开唾液腺，暴露气管，将气管左侧的颈内动脉表面的肌肉切开，暴露颈总动脉以及颈总动脉分叉，锐性分离颈总动脉旁的迷走神经。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115245143A (zh) * | 2022-07-06 | 2022-10-28 | 上海市中西医结合医院 | 一种动脉闭塞性疾病动物模型的构建方法 |
| CN117402828A (zh) * | 2023-04-13 | 2024-01-16 | 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） | 一种人肺癌脑转移瘤细胞系及其应用 |
-
2021
- 2021-11-11 CN CN202111335149.1A patent/CN114129295A/zh active Pending
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