CN114126417A

CN114126417A - 口腔咀嚼物用于调节口腔微生物群和改善口腔健康的用途

Info

Publication number: CN114126417A
Application number: CN202080043260.0A
Authority: CN
Inventors: L·J·霍尔库姆; C·V·沃利斯; A·K·鲁帕尔; P·M·麦克根尼提
Original assignee: Mars Inc
Current assignee: Mars Inc
Priority date: 2019-06-06
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2022-03-01
Also published as: US20220304923A1; GB201908109D0; WO2020247959A1; EP3979788A1

Abstract

本申请公开了口腔咀嚼物用于调节犬科动物口腔微生物群的用途和相关方法。该方法可以包括向狗施用改善狗的口腔健康的有效量的口腔咀嚼物。

Description

口腔咀嚼物用于调节口腔微生物群和改善口腔健康的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年6月6日提交的英国专利申请号1908109.0的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明公开的主题涉及口腔咀嚼物用于调节动物口腔微生物群并且尤其是犬科动物口腔微生物群的用途和相关方法。

序列表

本申请包含序列列表，该序列列表已以ASCII格式以电子方式提交，并且现通过引用将其全部内容合并到本文中。该ASCII副本创建于2020年6月8日，命名为0692690413.txt，大小为15244字节。

背景技术

牙周病描述了一系列影响牙齿周围支持组织的恶化状况。临床症状各不相同，从牙龈发红和发炎(牙龈炎)到支撑牙齿的组织破坏，在某些情况下导致牙齿脱落(牙周炎)。在小动物实践中经常出现这种疾病(Lund等人1999，O.Neill等人2014)，并且数据表明44％至100％的犬科宠物群体受到影响(Gad 1968，Harvey等人1994，Hoffmann和Gaengler1996，Kyllar和Witter 2005，Kortegaard等人2008)。

牙周病的发展遵循多因素假说，其中微生物促成因素通过牙菌斑发挥基本作用。因此，科学研究阐明了关于细菌在发病机制启动中的作用的若干理论。然而，不管确切的机制如何，正是通过对口腔生态系统和相关细菌群落平衡的干扰引发了疾病级联。由于分子测序和生物信息学技术的进步，现在有可能了解微生物群的波动，这使得对犬科动物口腔牙菌斑细菌的整体观察成为可能(Riggio等人2011，Davis等人2013，Wallis等人2015)。这些进步不仅提供了跨不同时间点(例如在疾病的进展过程中)进行比较分析的能力，而且还有助于理解健康状态之间的细菌关联。迄今为止，全面的体内研究提供了这一领域的重要见解。对拥有健康牙龈、牙龈炎或轻度牙周炎的223只客户所属的狗的牙菌斑细菌物种进行横断面调查，发现健康与包括伯杰氏菌属(Bergeyella)、莫拉氏菌属(Moraxella)和卟啉单胞菌(Porphyromonas)的革兰氏阴性属相关，而轻度牙周炎与革兰氏阳性属放线菌属(Actinomyces)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)和消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)相关(Davis等人2013)。在一项专注于微型雪纳瑞犬的纵向研究中，Wallis等人2015年每六周收集一次龈下牙菌斑样本，为期长达60周。随着进展为轻度牙周炎，他们观察到特定革兰氏阴性菌即动物溃疡伯杰氏菌(Bergeyella zoohelcum)COT-186、莫拉氏菌属的种(Moraxella sp)COT-017、巴氏杆菌科的种(Pasteurellaceae sp.)COT-080和沙耶加尼奈瑟菌(Neisseria shayeganii)COT-090的丰度降低。

预防牙周病无疑比治疗的必要性更为首选。包括刷牙和定期口腔护理咀嚼在内的策略旨在通过将牙菌斑(和牙石)生长限制在低水平来维持健康的内环境平衡(Gorrel和Bierer 1999，Gorrel等人1999，Brown和McGenity 2005，Hennet等人2006，Clarke等人2011，Quest 2013，Harvey等人2015)。

维持动物的口腔健康对于维持动物的整体健康非常重要。宠物食品和咀嚼物对动物的口腔健康有一定的益处。EP专利号0575021A2中描述了此类宠物食品。其中所述的宠物食品类型也可在市场上买到(希尔斯处方饮食

t/d)。该宠物食品声称有助于保持狗的牙齿清洁。这种食物含有碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素和矿物质的营养均衡组合。食品的清洁作用是由膨胀的条状结构基质产生的，条状结构基质在被狗咀嚼时会断裂，因此通过分离的基质层和牙齿之间的研磨接触提供机械清洁作用。PCT申请公布号WO2014/155113中描述的咀嚼物也可用于帮助保持狗的牙齿清洁。尽管此类产品有助于维持动物的口腔健康，但仍需要提供改善的手段来维持动物的口腔健康，特别是调节口腔微生物群。

本发明公开的主题有利地确定，向动物喂食特定饮食(包括本文公开的口腔咀嚼物)可对其口腔微生物群产生显著影响，以促进更健康的微生物群并降低口腔疾病或紊乱发生的可能性(例如牙周病)。

发明内容

所公开主题的目的和优点将在下面的描述中阐述并从中显而易见，并且将通过所公开主题的实践来学习。所公开主题的附加优点将通过在本文的书面描述和权利要求中特别指出的方法和系统以及附图来实现和获得。

为了实现这些和其他优点，并且根据所公开主题的目的(如具体化和广泛描述的)，所公开主题在一个方面包括用于调节犬科动物口腔微生物群的口腔咀嚼物。

本发明提供了一种可食用口腔咀嚼物形式的方法，该方法在食用所述咀嚼物时调节狗的口腔微生物群。

咀嚼物可以根据其营养成分与食物相区分。具体来说，传统的狗‘食物’营养全面，并且提供全方位的狗的日常营养需求。它也是狗摄入热量的主要来源。咀嚼物不需要提供这样的营养或热量。通常情况下，咀嚼物的配方与主食不同，它不适合作为狗的唯一营养来源。

咀嚼物可以进一步从大小方面与“食物”相区分。食品中最大的块通常比咀嚼物小。例如，PCT申请公布号WO01/050882A公开了一种据报告与其他干宠物相比具有较大尺寸的食品，并公开了若干实施例。这些实施例中最大的是具有以下尺寸的三角粗磨物：厚度16mm，底部28mm，侧面32mm。这与狗咀嚼物截然不同，狗咀嚼物要大得多。本发明的口腔咀嚼物可以是最大尺寸至少约为40mm、至少，至少约为60mm或至少约为70mm的单个咀嚼块。口腔咀嚼物的大小可以根据要喂食的狗的大小而变化。例如，玩赏型和小型品种的咀嚼物比中型、大型和巨型品种的咀嚼物要小。较大品种的咀嚼物长度可以超过100mm，甚至超过120mm。

咀嚼物可以进一步从消耗一块咀嚼物所需的时间方面与食物相区分。正常情况下，消耗一块咀嚼物的时间要比消耗一块食物的时间长得多。一般来说，普通体型的狗在不到10秒钟的时间内就能消耗一块食物，而普通体型的狗消耗一块咀嚼物至少需要20秒。在一个实施方式中，普通体型的狗消耗本发明的咀嚼物通常需要至少90秒，更典型地，至少120秒。本发明的咀嚼物可以显示每克咀嚼物至少3秒的每克咀嚼物的持续时间(秒)。

本发明咀嚼物的淀粉含量可为相对于咀嚼物总重量的10％至80％或40％至70％。如本文所用，相对于咀嚼物总重量的重量与成品有关，成品可供狗食用。淀粉含量可为相对于咀嚼物总重量的45wt％至65wt％，或相对于咀嚼物总重量的45wt％至70wt％，或50wt％至65wt％，或50wt％至60wt％。本发明咀嚼物中相对较高的淀粉含量有助于咀嚼物保持其形状的能力。

在一个实施方式中，本发明的咀嚼物包括相对于咀嚼物总重量约40wt％至约70wt％的淀粉含量；相对于咀嚼物总重量的5wt％至20wt％的保湿剂含量；其中，咀嚼物具有约为1.0g cm^-3或更小的密度。

本发明的咀嚼物可具有被狗食用时有助于保持狗的口腔健康的质地。

咀嚼物可以表现出特征性的海绵状质地，例如由于其成分(尤其是保湿剂含量，它赋予保持水分的能力)和相对较低的密度。该质地允许本发明的咀嚼物在一定程度上弹性反弹，从而在咀嚼过程中拔出犬齿后，至少部分闭合犬齿形成的孔。换句话说，本发明的咀嚼物展示了在一定程度上自我疗愈(self-heal)的能力。

口腔咀嚼物可以是用于向狗施用的任何合适的口腔咀嚼物。例如，该咀嚼物可以是PCT申请公布号WO2014/155113中限定的口腔咀嚼物。

口腔微生物群可通过增加或减少特定微生物尤其是细菌物种或细菌物种群的存在或流行率(prevalence)来调节。例如，与该狗若未施用咀嚼物的预期微生物群相比，施用口腔咀嚼物的狗中的口腔微生物群可通过增加与良好口腔健康相关或密切相关的细菌物种的数量来调节。口腔微生物群也可通过增加与良好口腔健康相关的一种或多种细菌物种(尤其是一种或多种与良好口腔健康密切相关的细菌物种)的流行率(prevalence)(即存在的数量)来调节。口腔微生物群也可以通过增加口腔微生物群中与良好口腔健康相关的细菌或细菌物种和与不良口腔健康相关的细菌或细菌物种的比率来调节。

本领域已知与良好口腔健康相关或密切相关的细菌物种。与良好口腔健康相关或密切相关的细菌物种示例如图3所示。调节口腔微生物群可包括增加普雷沃氏菌属的种(Prevotella sp)COT-282、丙酸杆菌属的种(Propionibacterium sp.)COT-296、卡托纳菌属的种(Catonella sp.)COT-257、消化链球菌科细菌(Peptostreptococcaceaebacterium)FOT-054和鼬鼠棒状杆菌(Corynebacterium mustelae)中的一种、二种、三种、四种、五种或更多种的流行率。

与该狗若未施用咀嚼物的预期微生物群相比，施用咀嚼物的狗的口腔微生物群可通过减少与不良口腔健康或疾病相关的细菌物种(尤其是与不良口腔健康或疾病密切相关的细菌物种)的数量来调节。口腔微生物群也可通过降低与不良口腔健康或疾病相关的一种或多种细菌物种(尤其是与不良口腔健康或疾病密切相关的一种或多种细菌物种)的流行率或相对比例(即存在的数量)来调节。

本领域已知与不良口腔健康或疾病相关或密切相关的细菌物种。与不良口腔健康或疾病相关或密切相关的细菌物种示例如图3所示。调节口腔微生物群可包括降低傍小杆属的种(Fretibacterium sp.)FOT-218、犬奈瑟菌(Neisseria canis)、厌氧菌属(Anaerovorax sp.)的种COT-125、消化链球菌科细菌(Peptostreptococcaceaebacterium)COT-030、居鸽菌属的种(Pelistega sp.)COT-267、拟杆菌纲细菌(Bacteroidiabacterium)COT-387、口腔脱硫微菌(Desulfomicrobium orale)和创伤球菌属的种(Helococcus sp.)FOT-023中的一种、两种、三种、四种、五种或更多的的流行率。

在某些方面，所述口腔咀嚼物可以每天、每隔一天、每周或每两周施用。

在某些方面，口腔咀嚼物可施用至少5、8、10、13、15、18、20、23、25、28、35或42次。

在一个实施方式中，咀嚼物用于向具有清洁口的狗(例如在其已经接受刮治和抛光后)施用，或向具有一般健康牙龈的狗施用。在不受理论约束的情况下，认为与未施用咀嚼物的清洁口相比，咀嚼物可以促进清洁口中与牙周病无关的更多细菌的定殖。在一个实施方式中，不良口腔健康或疾病相关细菌减少定殖。

狗可以是任何品种的狗，包括玩赏型狗、小型狗、中型狗、大型狗和巨型狗。在一个实施方式中，狗是中型、大型或巨型品种。在一个实施方式中，狗是中型品种。在某些实施方式中，狗是玩赏型或小型狗。

调节口腔微生物群能够导致改善口腔健康，例如，通过降低狗患牙周病的可能性。

本发明的另一方面是用于改善狗的口腔健康的口腔咀嚼物，其中通过调节口腔微生物群来改善口腔健康。

本发明的另一方面提供了口腔咀嚼物用于改善狗的口腔健康的用途，其中通过调节口腔微生物群来改善口腔健康。

本发明的另一方面提供了一种调节狗的口腔微生物群的方法，所述方法包括向狗喂食口腔咀嚼物的步骤。

向狗喂食口腔咀嚼物的步骤可以执行，例如5、8、10、13、15、18、20、23、25、28、35、42或更多次。咀嚼物可以每天、每周两次、每周或每两周喂食狗。在狗的一生中，可以一年向狗喂食3天咀嚼物。

狗可以是具有清洁口的狗，也就是说，接受了刮治和抛光的狗，或者已经清洁了牙齿的狗，或者总体上拥有健康牙龈的狗。

该方法还可包括清洁狗的牙齿或口的步骤。

本发明的另一个方面提供了一种通过调节狗的口腔微生物群来改善狗的口腔健康的方法，包括向狗喂食口腔咀嚼物的步骤。

向狗喂食口腔咀嚼物的步骤可以执行，例如5、8、10、13、15、18、20、23、25、28或更多次。咀嚼物可以每天、每周两次、每周或每两周喂食狗。在狗的一生中，可以一年向狗喂食3天咀嚼物。

本发明的各个方面的特征可以根据本发明的第一个列出的方面来定义。

在某些方面，本发明提供了一种调节狗的口腔微生物群的方法。该方法包括以改善狗的口腔健康的有效量施用口腔咀嚼物。

在某些实施方式中，可每天、每周两次、每周或每两周向狗施用口腔咀嚼物。在某些实施方式中，在狗的一生中，一年向狗施用口腔咀嚼物3天。在具体地的方面，向狗施用至少5、8、10、13、15、18、20、23、25、28、35或42次口腔咀嚼物。

在某些方面，该方法可进一步包括在施用口腔咀嚼物之前清洁狗的口。在特定方面，可以在施用任何口腔咀嚼物之前清洁狗的口。

在某些实施方式中，狗可以来自中型、大型或巨型品种。

在某些方面，与预期微生物群相比，可通过增加与良好口腔健康相关的细菌物种的数量，或增加与良好口腔健康相关的细菌物种的细菌的流行率或相对比例来调节口腔微生物群。具体地，口腔微生物群的调节可包括增加增加普雷沃氏菌属的种(Prevotella sp)COT-282、丙酸杆菌属的种(Propionibacterium sp.)COT-296、卡托纳菌属的种(Catonellasp.)COT-257、消化链球菌科细菌(Peptostreptococcaceae bacterium)FOT-054和鼬鼠棒状杆菌(Corynebacterium mustelae)中的至少一种的流行率。

在其他方面，与预期微生物群相比，可通过减少与不良口腔健康或与疾病相关的细菌物种的数量，或减少与不良口腔健康或疾病相关的细菌物种中的细菌的流行率或相对比例来调节口腔微生物群。具体地，口腔微生物群的调节可包括降低傍小杆属的种(Fretibacterium sp.)FOT-218、犬奈瑟菌(Neisseria canis)、厌氧菌属的种(Anaerovorax sp.)COT-125、消化链球菌科细菌(Peptostreptococcaceae bacterium)COT-030、居鸽菌属的种(Pelistega sp.)COT-267、拟杆菌纲细菌(Bacteroidiabacterium)COT-387、口腔脱硫微菌(Desulfomicrobium orale)和创伤球菌属的种(Helococcus sp.)FOT-023中中的一种、两种、三种、四种、五种或更多的的流行率。

在某些方面，改善狗的口腔健康是牙周病或口腔异味的减少。

应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述都是示例性的，并且旨在提供对所要求保护的公开主题的进一步解释。

包含在本说明书中并构成本说明书一部分的附图被包括以用于说明并提供对所公开主题的试剂盒和方法的进一步理解。附图与说明书一起用于解释所公开主题的原理。

附图说明

现在将仅参考附图以示例的方式详细描述本发明，其中：

图1描述了对实施例1中所述研究中确定的所有OTU的log₁₀比例进行分析得出的主成分得分：开始预实验阶段(start pre-test phase)(红色)、结束预实验阶段(end pre-test phase)(蓝色)、28天试验阶段结束咀嚼物(黄色)和无咀嚼物(紫色)。

图2描述了根据实施例1的每个阶段的分类组成。操作分类单元(operationaltaxonomix unit，OTU)的系统发育分布基于龈上牙菌斑样本序列读取计数。星号表示候选门。

图3描述了根据实施例1的OTU 95％置信区间的平均比例，咀嚼物(黄色)和无咀嚼物(紫色)之间存在显著差异且优势比>2。

图4描述了根据实施例1的阶段组的香农多样性指数：开始预实验阶段(红色)、结束预实验阶段(蓝色)、结束28天试验阶段有咀嚼物(黄色)和无咀嚼物(紫色)。

图5是根据实施例1与健康相关和与疾病相关的物种的组合比例图，带有置信区间。

图6是根据实施例1仅基于咀嚼物组和无咀嚼物组每个健康状态的分类单元数的条形图。

图7描述了根据实施例1在咀嚼物组和无咀嚼物组中发现的细菌物种的倍数变化。

图8描述了与无qPCR结果相比，两种饮食方案下标准化为UniB Cq的COT-030Cq的平均值和95％置信区间：(2)市售主要膳食+口腔护理咀嚼物B(每日喂食处理)；和(3)仅根据实施例2的市售主要膳食(对照)。

具体实施方式

现在将详细参考公开主题的各种示例性实施方式，其示例性实施方式在附图中示出。本发明公开的主题涉及口腔咀嚼物用于调节犬科动物口腔微生物群的用途和相关方法。这种调节可以有利地改善狗的口腔健康，例如，减少牙周病、牙菌斑、牙石或牙垢。

A.定义

本说明书中使用的术语在本领域内、在本公开的上下文中以及在使用每个术语的特定上下文中通常具有其普通含义。下文或说明书中的其他地方讨论了某些术语，以在描述本公开的方法和组合物以及如何制造和使用它们时向从业者提供额外的指导。

在本说明书的整个描述和权利要求中，词语“包括(comprise)”和“包含(contain)”以及词语的变体，例如“包括(comprising)”和“包含(comprises)”，表示“包括但不限于”，并且不排除其他成分、整数或步骤。此外，除非上下文另有要求，否则单数包含复数。特别是，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则说明书应理解为考虑了复数以及单数。

如本文所用，当在权利要求书和/或说明书中与术语“包括”一起使用时，单词“一(a)”或“一(an)”的使用可以表示“一”，但它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于与一个”的含义一致。此外，术语“具有”、“包括”“包含”和“含有”是可互换的，本领域技术人员认识到这些术语是开放式术语。

术语“约”或“近似”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的限制。例如，“约”根据本领域的实践，可指3个或3个以上的标准偏差。或者，“约”可指高达给定值高达20％、高达10％、高达5％或高达1％的范围。或者，特别是对于生物系统或过程，该术语可指在一个数量级内、在一个值的5倍或2倍内。

根据本发明使用的术语“动物”指各种各样的动物，例如四足动物、灵长类动物和其他哺乳动物。例如，术语“动物”可指家畜，包括但不限于狗、猫、马、牛、雪貂、兔子、猪、大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、山羊等。术语“动物”也可指野生动物，包括但不限于野牛、麋鹿、鹿、野味(venison)、鸭、禽、鱼等。在一些实施方式中，动物是伴侣动物。在某些情况下，动物是家养狗或猫。

术语“动物饲料”、“动物饲料组合物”、“宠物食品”、“宠物食品制品”、“宠物食品产品”、“食用产品”或“宠物食品组合物”在本文中可互换使用，并指拟由动物或宠物摄入的组合物。拟由动物或宠物摄入的任何组合物均适用于本发明。此类组合物可包括粗磨物或干食品、潮湿食品或湿食品、半湿食品、冷冻或冻干食品、生食品或它们的组合。本发明的组合物可以例如用作主食、膳食补充剂、小吃(treat)或它们的组合。这些组合物可以是营养平衡的。在替代实施方式中，这些组合物不是营养平衡的。例如并且不作为限制，宠物食品可以包括而不限于，适用于日常饲料的营养平衡成分，例如粗磨物，以及可以营养平衡的补充剂和/或小吃。在替代实施方式中，补充剂和/或小吃不具有营养平衡。

术语“咀嚼物”或“口腔咀嚼剂”指的是一种可食用产品，在某些情况下，在一个方面，可根据其营养成分与食品相区分。具体来说，传统的狗“食物”营养全面，并且提供全方位的狗的日常营养需求。它也是狗摄入热量的主要来源。咀嚼物不需要提供这样的营养或热量。咀嚼物可以进一步从大小与“食物”相区分。食品中最大的块通常比咀嚼物小。咀嚼物可以从消耗一块咀嚼物所需的时间进一步与食物相区分。通常情况下，消耗一块咀嚼物的时间要比消耗一块食物的时间长得多。例如并且不作为限制，可食用咀嚼物产品可以模制、充气或挤出。

短语“预期微生物群”可指在施用可食用产品之前发现的实际微生物群。在一个实施方式中，预期微生物群可指在施用可食用产品之前以及在使用任何方法清洁动物口腔(例如刮治和抛光)之前发现的实际微生物群。或者，它可以参考基于在相同或相似物种或品种的其他动物中发现的微生物群的预测微生物群。

短语“调节口腔微生物群”是指与如果动物未被喂食本发明的可食用产品则预期会发现的口腔微生物群相比，使口腔微生物群数量发生变化。口腔微生物群的调节可包括促进与健康相关的口腔菌群。

指向组合物的术语“营养均衡”或“营养完整”是指根据在宠物营养领域的公认官方机构(包括但不限于政府机构)，例如但不限于国家研究委员会(National ResearchCouncil，NRC)和欧洲宠物食品行业(European Pet Food Industry，FEDIAF)指南(例如，http://www.fediaf.org/images/FEDIAF_Nutritional_Guidelines_2019_Update_030519.pdf)的建议，组合物(如宠物食品)具有已知维持生命所需的适当数量和比例的营养素，除了对水的额外需求以外。

如本文所用，术语“口腔疾病或紊乱”是指发生在受试者(例如动物)的口腔中且由一种或多种细菌引起或与一种或多种细菌相关的疾病或紊乱。例如，疾病或紊乱会影响受试者的牙齿或牙龈。本发明的示例性口腔疾病或紊乱包括但不限于牙周病、龋齿、牙龈口炎、成牙质细胞吸收性病变和口腔异味。

术语“口腔微生物群”指口腔中发现的微生物。特别是，它可以指在口腔中发现的细菌，更具体地说是指牙菌斑或口腔生物膜的细菌成分。它可以指牙龈线上方(龈上)和/或下方(龈下)的牙菌斑和/或龈缘牙菌斑，或口中存在的生物膜，如舌头或脸颊上的生物膜或唾液中的细菌。

如本文所用，术语“牙周病”，也称为牙龈疾病，是指影响牙齿周围组织的炎症或感染。牙周病的严重程度可以从牙龈炎(如牙菌斑引起的牙龈炎)到牙周炎不等。

如本文所使用的，并且如本领域所熟知的，“治疗”是指用于获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。就本主题而言，有益或期望的临床结果包括但不限于一个或多个症状的缓解或改善、减少紊乱程度、稳定(即不恶化)紊乱状态、预防紊乱、延迟或减缓紊乱进展和/或紊乱状态的改善或缓解。降低可以是并发症或症状的严重程度降低约0.01％、约0.1％、约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约99％。“治疗”还意味着与不接受治疗的预期生存期相比，延长生存期。本文使用的术语“预防”是指在疾病或状况发生之前部分治疗或完成治疗。

如本文所用，术语“重量百分比”意指例如在宠物食品组合物中的成分或组分的重量数量占宠物食品组合物总重量的百分比。术语“重量百分比”、“wt-％”、“wt.％”和“wt％”可互换使用。

本公开主题的每个方面的优选特征可以如所述结合任何其他方面。在本申请的范围内，明确的意图是在前述段落、在权利要求和/或在以下描述和附图中列出的各种方面、实施方式、示例和备选方案，尤其是它们的单独特征，可以独立地或以任何组合的方式来获取。也就是说，任何实施方式和/或任何实施方式的特征可以以任何方式和/或组合进行组合，除非这些特征不兼容。

B.口腔微生物群/微生物群中的细菌

本发明尤其涉及用于调节动物口腔微生物群的可食用产品和相关方法。调节的一种或多种细菌可与口腔疾病或紊乱(例如牙周病)或良好的口腔健康有关。动物可以是伴侣动物，如家养狗或猫。在特定方面，伴侣动物是家养狗。狗可以是任何品种的狗，包括玩赏型、小型、中型、大型和巨型品种。在某些实施方式中，狗是中型、大型或巨型品种。在特定实施例中，狗是中型品种。在某些实施方式中，狗是玩赏型或小型品种。

在一些实施方式中，与牙周病相关的一种或多种细菌可以是消化链球菌科的种(Peptostreptococcaceae sp.)。在一些实施方式中，与牙周病相关的一种或多种细菌选自由以下所组成的组：消化链球菌科的种(Peptostreptococcus sp)、互养菌属的种(Synergistes sp.)、梭菌属的种(Clostridiales sp.)、结瘤真杆菌(Eubacteriumnodatum)、硒单胞菌属的种(Selenomonas sp.)、拟杆菌门的种(Bacteroidetes sp.)、齿臭杆菌(Odoribacter denticanis)、卵形脱硫微菌(Desulfomicrobium ovale)、莫拉菌属的种(Moraxella sp)、齿拟杆菌(Bacteroides denticanoris)、绒毛产线菌(Fillifactorvillosus)、犬嘴卟啉单胞菌(Porphyromonas canoris)、古绿卟啉单胞菌属(Porphyromonas gulae)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)或唾液卟啉单胞菌属(Porphyromonas salivosa)。在某些实施方式中，一种或多种细菌包括消化链球菌属的种(Peptostreptococcus sp.)、挥发性有机化合物产生细菌(volatile organic compoundproducing bacteria)或两者。在进一步的实施方式中，一种或多种细菌包括消化链球菌科XIII[G-1]的种(Peptostreptococcaceae XIII[G-1]sp.)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)COT-030、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)COT-005/004、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)COT-047和/或消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)COT-019。

动物口腔微生物组内的细菌群落特征可能因动物样本来源而异。例如，三个离散的口腔生态位(oral niche)可以包括软组织表面，例如嘴唇、脸颊和舌头；硬组织表面，如牙齿；以及唾液。在一些实施方式中，口腔生态位来自硬组织表面，例如一个或多个牙齿。在一些实施方式中，口腔生态位包括牙龈边缘或龈上表面。

在某些实施方式中，口腔微生物群可通过增加或减少特定微生物、尤其是细菌物种或细菌物种群的存在或流行率来调节。在某些实施方式中，例如，并且不限于，此类细菌物种或细菌物种组可包括表3和表4中的那些细菌物种或细菌物种组。在某些实施方式中，此类物种的门可包括变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、单糖菌门(Saccharibacteria)(TM7)、螺旋体门(Spirochaetaes)、互养菌门(Synergistetes)或它们的组合。与未施用咀嚼物的狗的预期微生物群相比，施用咀嚼物的狗的口腔微生物群可通过增加与良好口腔健康相关或密切相关的细菌物种数量来调节。口腔微生物群也可通过增加与良好口腔健康相关的一种或多种细菌物种(尤其是一种或多种与良好口腔健康密切相关的细菌物种)的流行率(即存在的数量)来调节。口腔微生物群也可以通过增加口腔微生物群中与良好口腔健康相关的细菌或细菌物种和与不良口腔健康相关的细菌或细菌物种的比率来调节。

本领域已知与良好口腔健康相关或密切相关的细菌物种。图3和表3显示了与良好口腔健康相关或密切相关的细菌物种示例。例如并且不作为限制，与良好口腔健康相关或密切相关的细菌物种包括普雷沃氏菌属的种COT-282、丙酸杆菌属的种COT-296、卡托纳菌属的种COT-257、消化链球菌科细菌FOT-054和鼬鼠棒状杆菌。调节口腔微生物群可包括增加普雷沃氏菌属的种COT-282、丙酸杆菌属的种COT-296、卡托纳菌属的种COT-257、消化链球菌科细菌FOT-054和鼬鼠棒状杆菌中的一种、二种、三种、四种、五种或更多种的流行率。

与未使用咀嚼物的狗的预期微生物群相比，施用咀嚼物的狗的口腔微生物群可通过降低与不良口腔健康或疾病相关的细菌物种(尤其是与不良口腔健康或疾病密切相关的细菌物种)数量来调节。口腔微生物群也可通过降低与不良口腔健康或疾病相关的一种或多种细菌物种(尤其是与不良口腔健康或疾病密切相关的一种或多种细菌物种)的流行率或相对比例(即存在的数量)来调节。

本领域已知与不良口腔健康或疾病相关或密切相关的细菌物种。图3和表3显示了与不良口腔健康或疾病相关或密切相关的细菌物种示例。例如并且不作为限制，与不良口腔健康相关或密切相关的细菌物种包括傍小杆属的种FOT-218、犬奈瑟菌、厌氧菌属的种COT-125、消化链球菌科细菌COT-030、居鸽菌属的种COT-267、拟杆菌纲细菌COT-387、口腔脱硫微菌和创伤球菌属的种FOT-023。调节口腔微生物群可包括降低傍小杆属FOT-218、犬奈瑟菌、厌氧菌属的种COT-125、消化链球菌科细菌COT-030、居鸽菌属的种COT-267、拟杆菌纲细菌COT-387、口腔脱硫微菌和创伤球菌属的种FOT-023中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种的流行率。

C.含硫氨基酸

含硫氨基酸是有助于维持多种细胞系统完整性的氨基酸，例如细胞氧化还原状态、清除自由基(detoxification from free radicals)和活性氧(reactive oxygenspecies)。在元素周期表中，硫与氧属于同一个族，但其电负性要小得多。这种差异解释了含硫氨基酸的一些独特性质。含硫氨基酸对原核生物具有细胞毒性。

在某些实施方式中，含硫氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸。在某些实施方式中，含硫氨基酸是蛋氨酸或蛋氨酸相关氨基酸。在某些实施方式中，含硫氨基酸是半胱氨酸。在某些实施方式中，含硫氨基酸是提供半胱氨酸的衍生物。在某些实施方式中，含硫氨基酸是高半胱氨酸。在某些实施方式中，含硫氨基酸是牛磺酸。在某些实施方式中，含硫氨基酸是N-乙酰半胱氨酸。

在某些实施方式中，但不限于，含硫氨基酸可为半胱氨酸亚磺酸(cysteinesulfinic acid)、半胱磺酸(cysteic acid)、高半胱氨酸亚磺酸(homocysteine sulfinicacid)、高半胱磺酸(homocysteic acid)、丝氨酸-O-硫酸酯(serine-O-sulfate)和S-磺基-半胱氨酸(S-sulfo-cysteine)。在某些实施方式中，含硫氨基酸可以是含硫氨基酸衍生物。在某些实施方式中，含硫氨基酸衍生物可以是含有巯基(thiol-group)、硫醇基(mercaptan-group)或硫酯基(thioester-group)的蛋白质源性或非蛋白质源性氨基酸。含硫氨基酸衍生物的非限制性实例包括S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine)、胱硫醚(cystathionine)、S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine)、谷胱甘肽、N-氨基甲酰-L-半胱氨酸(N-Carbamoyl-L-cysteine)、N-乙酰半胱胺(N-Acetylcysteamine)、γ-硫代甲基谷氨酸(γ-thiomethyl glutamate)、2-氨基-Δ2-噻唑啉-4-羧酸(2-amino-Δ2-thiazoline-4-carboxylic acid)、3-甲基硫代天冬氨酸(3-methylthioaspartic acid)、3-硫代-L-天冬氨酸(3-thio-L-aspartic acid)、S-取代L-半胱氨酸(S-substituted L-cysteine)、D-青霉胺二硫化物(D-penicillamine disulfide)、L-高羊毛硫氨酸(L-homolanthionine)、L-聚高甲硫氨酸(L-polyhomomethionine)、胱氨酸、二高甲硫氨酸(dihomomethionine)、麦角硫因(ergothioneine)、六高甲硫氨酸(hexahomomethionine)、六高甲硫氨酸S-氧化物、高胱氨酸、高甲硫氨酸、五高甲硫氨酸、五高甲硫氨酸S-氧化物(hexahomomethionine S-oxide)、四高甲硫氨酸、硫代脯氨酸(thioproline)和三高甲硫氨酸。含硫氨基酸的其他非限制性示例包括蒜氨酸(alliin)、S-烯丙基半胱氨酸(S-allylcysteine)、S-氨基乙基-L-半胱氨酸(S-aminoethyl-L-cysteine)、半胱氨酸多巴(cysteinyldopa)、甲烯胱氨酸(Djenkolic acid)、乙硫氨酸(ethionine)、猫尿氨酸(felinine)、N-甲酰甲硫氨酸(N-formylmethionine)、霍金素(hawkinsin)、羊毛硫氨酸(lanthionine)和羊毛硫氨酸酮亚胺(lanthionine ketimine)。

在某些实施方式中，本公开的主题考虑含硫氨基酸的前药。例如，但不限于此，含硫氨基酸的前药可以是2-(多羟基烷基)噻唑烷-4(R)-羧酸(2-(polyhydroxy-alkyl)thizolidine-4(R)-carboxylic acid)和2-(聚乙酰氧基烷基)噻唑烷-4(R)-羧酸(2-(polyacetoxyalkyl)thizolidine-4(R)-carboxylic acid)。

在某些实施方式中，将本公开主题的含硫氨基酸以每1000kcal约0.001g至约10g的量递送至动物。例如，但不限于此，含硫氨基酸的存在量为1mg至约10g、约10mg至约10g、约100mg至约10g、约250mg至约10g、约500mg至约10g、约750mg至约10g、约1g至约10g，以及介于两者之间的值。

D.口腔咀嚼物

本公开提供了用于调节口腔微生物群(并且尤其是犬科动物口腔微生物群)的口腔咀嚼物的用途和相关方法。该方法可包括向动物(例如狗)施用有效改善动物的口腔健康的量的口腔咀嚼物。调节口腔微生物群可以改善口腔健康，例如通过降低动物患牙周病的可能性。此外，改善口腔健康可以包括减少牙周病、牙菌斑、牙石或牙垢。

本发明的口腔咀嚼物可包括任何适当的用于施用于动物(例如狗)的口腔咀嚼物。例如，并且不限于此，咀嚼物可以是PCT申请公开号WO2014/155113中限定的口腔咀嚼物。在某些实施方式中，本发明的口腔咀嚼物可以模制、充气或挤出。

在某些实施方式中，本发明的口腔咀嚼物在某些方面可以凭借其营养成分与“食物”区分。具体来说，例如，传统的狗“食物”可以是营养完整的，并且可以提供狗的日常营养需求的全部范围。狗的“食物”也可以作为狗的热量摄入的主要来源。相比之下，咀嚼物不需要提供这样的营养或热量含量。

咀嚼物可以从大小方面进一步与“食物”相区分。食品中最大的部分通常比咀嚼物小。例如，PCT申请公布号WO01/050882A公开了一种据报告与其他干燥宠物食品相比较大的食品，并公开了几个示例。这些例子中最大的一个是具有以下尺寸的三角粗磨物：厚度16mm，底部28mm，侧面32mm。相比之下，咀嚼物可以相对更大。

本发明的口腔咀嚼物可以是最大尺寸至少约40mm、至少约50mm、至少约60mm或至少约70mm的单个咀嚼物。口腔咀嚼物的大小可以根据口腔咀嚼物被喂给的狗的大小而变化。例如，玩赏型和小型品种的咀嚼物比中型、大型和巨型品种的咀嚼物要小。例如，较大品种的咀嚼物的长度可能超过100mm或120mm左右。

咀嚼物可以从消耗一块咀嚼物所需的时间于消耗一块食物所需的时间方面进一步与“食物”相区分。通常情况下，消耗一块咀嚼物的时间比消耗一块食物的时间长。一般来说，普通体型的狗在不到10秒钟的时间内就可以消耗一块食物，而普通体型的狗消耗一块咀嚼物至少需要20秒钟。在一个实施方式中，本发明的咀嚼物能花费普通体型的狗至少约90秒或至少约120秒来消耗。在某些方面，本发明的咀嚼物能呈现每克咀嚼物的持续时间为每克咀嚼物至少约3秒(以秒为单位)。

本发明的口腔咀嚼物可包括一种或多种淀粉。本领域技术人员将了解适合在本发明中使用的多种淀粉。本发明咀嚼物的淀粉含量相对于咀嚼物的总重量可为约10wt％至约80wt％或约40wt％至约70wt％。如本文所用，相对于咀嚼物总重量的重量是相对于成品的。在某些实施方式中，相对于咀嚼物的总重量，咀嚼物的淀粉含量可为约10wt％至约70wt％、约15wt％至约60wt％、约25wt％至约50wt％、约45wt％至约65wt％、约45wt％至约70wt％、约50wt％至约65wt％或约50wt％至约60wt％。在某些实施方式中，咀嚼物可包括相对于咀嚼物的总重量至少约10wt％、至少约15wt％、至少约25wt％、至少约40wt％、至少约45wt％、至少约50wt％、至少约55wt％、至少约60wt％、至少约65wt％或至少约70wt％的淀粉。在特定实施方式中，咀嚼物可包括相对于咀嚼物的总重量约40wt％、约45wt％、约50wt％、约55wt％、约60wt％、约65wt％或约70wt％的淀粉。本发明咀嚼物中相对较高的淀粉含量有助于咀嚼物保持其形状的能力。

本发明的口腔咀嚼物可包括一种或多种保湿剂。本领域技术人员将了解适合在本发明中使用的多种保湿剂。本发明咀嚼物的保湿剂含量相对于咀嚼物的总重量可为约5wt％至约20wt％、约10wt％至约20wt％、约15wt％至约20wt％、约5wt％至约15wt％或约5wt％至约10wt％。在某些实施方式中，咀嚼物可包括相对于咀嚼物的总重量至少约5wt％、至少约10wt％、至少约15wt％或至少约20wt％的保湿剂。在特定实施方式中，咀嚼物可包括相对于咀嚼物的总重量约5wt％、约10wt％、约15wt％或约20wt％的保湿剂。保湿剂的含量赋予咀嚼物保持水分的能力。

本发明的口腔咀嚼物可以具有一定的密度。在特定实施方式中，咀嚼物可具有相对低的密度。在某些实施方式中，咀嚼物的密度可为约1.0g cm^-3或更小、约0.9g cm^-3或更小、约0.7g cm^-3或更小、约0.6cm^-3或约0.5g cm^-3或更小。本领域技术人员将理解，具有多种密度的口腔咀嚼物适合用于本发明。

在某些实施方式中，本发明的口腔咀嚼物可包括一种或多种淀粉和一种或多种保湿剂。在特定实施方式中，口腔咀嚼物可具有相对于咀嚼物的总重量约10wt％至约80wt％淀粉的淀粉含量和约5wt％至约20wt％保湿剂。咀嚼物的密度约为1.0g cm^-3或更小。

本发明的口腔咀嚼物的质地在被动物(如狗)食用时有助于维持动物的口腔健康。例如，由于其成分包括保湿剂含量(赋予保持水分的能力)和相对较低的密度，咀嚼物能表现出特征性的海绵状质地。该质地允许本发明的咀嚼物在一定程度上弹性反弹，从而在咀嚼过程中拔出牙齿后，至少部分封闭动物牙齿形成的孔。因此，本发明的咀嚼物展示了在一定程度上自我愈合和恢复形状的能力。

在某些实施方式中，本发明的口腔咀嚼物可为约2kg至约25kg、约2kg至约7kg、约5kg至约10kg、约7kg至约11kg、约10kg至约25kg、约11kg至约22kg或至少约25kg。在特定实施方式中，口腔咀嚼物可为至少约2kg、至少约5kg、至少约7kg、至少约10kg、至少约11kg、至少约15kg、至少约20kg、至少约22kg或至少约25kg。在某些实施方式中，口腔咀嚼物可为约2kg、约5kg、约7kg、约8kg、约10kg、约11kg、约12kg、约15kg、约18kg、约20kg、约22kg、约25kg、约28kg或约30kg。本领域技术人员将理解，多种大小的口腔咀嚼物适合用于本发明。

E.使用或治疗方法

本发明主题的方法可包括给动物施用或喂食口腔咀嚼物以调节口腔微生物群。所公开主题的方法特别适合用于伴侣动物(例如狗、猫和其他驯养动物)。

在某些实施方式中，可根据动物(例如狗)的重量向动物施用口腔咀嚼物。在某些实施方式中，狗可以是玩赏型、小型、中型、大型或巨型品种。例如，并不限于，可以向玩赏型狗品种施用口腔咀嚼物，其大小在约2kg至约7kg的范围内；可以向小型狗品种施用口腔咀嚼物，其大小在约7kg至约11kg或约5kg至约10kg的范围内；以及可以向中型狗品种施用口腔咀嚼物，其大小在约10kg至约25kg、约10kg至约15kg或约11kg至约22kg的范围内。在某些实施方式中，例如，并不限于，可以向大型和巨型狗品种施用大小至少约为25kg的口腔咀嚼物。

在某些方面，口腔咀嚼物可用于口清洁的动物，例如，在其已经接受刮治和抛光后、清洁牙齿后或具有一般健康牙龈。不受特定理论约束，与不使用口腔咀嚼物的清洁口相比，口腔咀嚼物被认为会促进清洁口中与牙周病无关的更多细菌的定殖。在某些实施方式中，该方法可进一步包括清洁动物的牙齿或口。

在某些方面，可以每天、每周两次、每周或每两周施用口腔咀嚼物。在狗的一生中，这种咀嚼物可以一年喂食狗3天。在特定实施方式中，可向动物施用口腔咀嚼物至少5、8、10、13、15、18、20、23、25、28、35、42次或更多次。

本发明提供了可用于调节动物的口腔微生物群(例如改善动物的口腔健康)的试剂盒。该试剂盒可用于施用和跟踪向动物施用口腔咀嚼物。在某些方面，试剂盒可用于收集样本，其中检测到与口腔疾病或紊乱(例如，牙周疾病)或良好口腔健康相关的一种或多种细菌。用于调节动物口腔微生物群的试剂盒通常可包括除其他外，用于收集样品的样品收集装置、用于向动物施用的一种或多种口腔咀嚼物以及关于动物适当饮食方案的说明等。

实施例

出于理解而非限制的目的，通过参考以下实施例(作为所公开主题的示例而不是通过限制的方式提供)将更好地理解本公开主题。

实施例1：喂食试验(口腔护理咀嚼物)

本实施例描述了饮食方案中包含的口腔护理咀嚼物在调节犬科动物口腔微生物群方面的作用。

方法

研究设计

十二(12)只比格犬参加了研究，这十二(12)只比格犬由六(6)只雄性(全部绝育)和六(6)只雌性(全部完整)组成，平均年龄为2.9岁(2.6岁至3.4岁)，且体重为10kg至25kg。这些狗被成对或成群地关在一个温度可控的室内犬舍里过夜，白天则被关在外面有庇护所和玩具的围场里。水持续供应。

进行了一项随机交叉研究，其中两种饮食方案中的一种被喂养：(1)市售主要膳食+口腔护理咀嚼物；和(2)单独的市售主要膳食(对照)。进行临床观察并评估犬牙菌斑的细菌组成。市售主要膳食包括1:1比例的完整和平衡的市售干狗粮和市售湿狗粮。试验产品为挤压口腔护理咀嚼物(宝路

)。

该研究从14天的预实验阶段(pre-test phase)开始，随后是连续28天的试验阶段(test phase)。在预实验阶段的第1天，这些狗接受了全身麻醉，以进行牙齿评估(牙龈炎、牙菌斑和牙石评分)以及全口刮治和抛光(S&P)。麻醉方面，术前给药盐酸左美沙酮(0.5mg)和盐酸芬哌酰胺(fenpipramid hydrochloride)(0.025mg)，然后用丙泊酚(propofol)(4mg/kg体重)通过静脉导管诱导全身麻醉。通过气管插管吸入异氟烷(isoflurane)维持麻醉。在D&P之前，使用塑料微生物环(科学实验室供应商有限公司(Scientific LaboratorySuppliers Ltd))(开始预实验阶段)从所有牙齿的颊面收集龈上牙菌斑。在D&P试验后，在剩余的预实验阶段，这些狗每天用水刷牙。这是在喂食主食后进行的，大约在每天早上8点到9点之间，目的是在开始第一个试验阶段之前获得临床上健康的牙龈。在整个预实验阶段，所有的狗只接受主要膳食，在预实验和试验阶段，每天早上7:30至8:00喂食。

在第一个试验阶段的第1天，从全身麻醉(结束预实验阶段)下的所有狗身上采集另一个颊龈上牙菌斑样本。然后，它们接受了全口D&P，以提供清洁的牙齿表面。在试验阶段，在喂食主要膳食后大约5小时，每天给接受咀嚼物的狗喂食咀嚼物。记录拒绝主要膳食和/或咀嚼物的情况。在28天试验阶段喂食最后一顿主要膳食或咀嚼物约24小时后，对狗进行全身麻醉，在此期间收集龈上牙菌斑(咀嚼物和无咀嚼物)，并进行D&P，为下一个试验阶段做好准备。

将牙菌斑样本置于微量离心管中的400μl Tris-EDTA(TE)缓冲液(pH 8.0)中，并立即置于干冰上长达9小时，直到从所有狗身上采集到牙菌斑样本。在提取DNA之前，将样品储存在-80℃的温度下，并在运送至中心进行处理的过程中，将其置于干冰上。

DNA提取

如Davis等人之前所述(2013)，从牙菌斑样本中提取DNA，使用EpicentreMasterpure革兰氏阳性DNA纯化试剂盒(Epicentre，美国)，根据制造商的方案进行额外的夜间溶解。

16S rDNA基因的扩增

从牙菌斑DNA提取物中扩增出16S rDNA基因的可变V3-V4区。使用16S rDNA基因319F和806R的通用细菌引物(每一个引物都根据(Fadrosh等人2014)用连接序列、索引序列和异质性间隔区进行了修改)进行PCR扩增。PCR混合物(50μl)含有25μl

High-Fidelity PCR Master Mix与HF缓冲液(MO531，新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs)，英国)，5μl(1μM)每个引物，10μl模板DNA，3.5μl不含核酸酶的水和1.5μl DMSO，以96孔格式制备。PCR循环条件由在98℃(30s)的初始变性步骤，随后98℃(15s)、58℃(15s)和72℃(15s)循环30次，最后在72℃延长(60s)组成。通过PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行检测的电泳，证实其扩增成功。

文库制备和测序

进行了文库制备和测序。使用Quant-iT^TM

dsDNA检测试剂盒(英杰(Invitrogen)，英国)对16S扩增子进行预定量。然后使用片段分析仪(先进分析技术公司(Advanced Analytical Technologies,Inc))对稀释后的扩增子进行定量，然后将其汇集成121/122个样本组。在用v3化学、2x300bp运行方式进行MiSeq(因美纳(Illumina))测序之前，对文库池进行凝胶尺寸化(gel-sized)。

序列数据处理

总结

使用FLASH汇编器将正向和反向读数组装成跨越整个V3-V4区域的连续序列(Magoc和Salzberg2011)。使用标签清洁器(TagCleaner)移除标签(Schmieder等人2010)，使用split_libraries_fastq.py在QIIME中解复用序列。使用userarch61(Edgar 2010)去除嵌合序列。使用uclust在>98％的同一性对序列进行聚类(Caporaso等人2010)，以生成操作分类单元(OTU)，并选择最丰富的序列作为聚类代表。这些都是用blastall2.2.25注释的(Altschul等人1990)，其中还包含作者先前发表的犬科动物和猫科动物口腔微生物组序列(Pruesse等人2007，Dewhirst等人2012，Dewhirst等人2015)。

详细信息

采用Fadrosh等人2014年描述的双索引和组装方法，在因美纳(Illumina)的MiSeq平台上对16S基因的V3-V4区域进行测序。FASTQ格式的配对端原始序列数据如下处理：使用seqtk(v1.2-r94)的trimfq功能分离序列和12-mer条形码(https://github.com/lh3/seqtk/blob/master/README.md)。正向和反向读取使用FLASH(v 1.2.10)(

&Salzberg,2011)进行组装，最小和最大重叠分别为40和200，重叠区域的最大不匹配为1％。使用TagCleaner(v0.16)(Schmieder等人2010)移除标签，设置为-nomatch 3-tag5GGACTACHVGGGTWTCTAAT-mm5 3-tag3 CTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-mm3 3(分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)。使用QIIME(Caporaso等人，2010)的split_libraries_fastq.py(v1.9.1)将序列拆分为样本，使用30的phred分数截止值(-q 29，代表99.9％的碱基识别准确度)和24(2x 12)的条码长度。使用userarch61将嵌合序列移除，并设置为“无参考”(Edgar，2010)。

然后使用QIIME 1.9.1版本(同上)对序列进行聚类，使用pick_otus.py(v1.9.1)，它利用uclust(v1.2.22q)(Edgar，2010)将具有>98％同一性的序列(Caporaso等人，2010)聚类为操作分类单位(Operational Taxonomic Unit，OTUs)。Uclust用修改后的参数运行，空位开放罚分设置为2.0，空位扩展罚分设置为1.0以及-A标志以确保最佳的比对(Caporaso等人，2010)。对于每个OTU聚类，使用也来自QIIME的pick_rep_set.py(v 1.9.1)选择最丰富的序列作为代表性序列。

对每个OTU的相对丰度和在样本间的分布进行了评估，以便将噪声与一致但罕见的OTU分开(详细描述见统计分析部分)。使用blastall(v2.2.25)(Altschul等人，1990)根据Silva SSU数据库版本128(Pruesse等人，2007)搜索通过筛选标准的所有OTU的代表性序列。如果比对不符合≥98％序列同一性和≥98％查询序列覆盖率的截止标准，则使用属或更高级别的注释。

统计分析

如果OTU在每个阶段存在的平均比例低于0.05％，或在所有阶段存在的比例少于两个样本，则将其合并在一组“罕见”类群中。根据Davis等人2013年引用的模拟群落数据的统计分析，选择了0.05％的截止值。为了估计和比较OTU的相对丰度，使用样本中序列总数中的OTU计数，拟合具有logit链接的二项式广义线性混合模型。阶段(开始预实验阶段、结束预实验阶段、咀嚼物和无咀嚼物)作为固定效应，动物和观察水平随机效应作为随机结构(Harrison XA.(2014))。报告每个阶段95％置信区间的平均比例，并报告所有成对阶段比较95％置信区间的优势比。根据(Benjamini和Hochberg1995)的错误发现方法将所有p值调整为5％的总体测试水平。这种分析方法也适用于每个门。

以狗为分组变量，对log10的比例进行多组主成分分析(PCA)，以确定样本的聚类是否明显。为每个阶段计算代表PC1和PC2 95％双变量置信域的椭圆，并将其纳入PCA评分图中(Murdoch和Chow 2013)。

计算每个样本香农多样性指数，并采用线性混合模型对指数进行分析，其中相位为固定效应，并且动物为随机效应。以95％的置信区间报告每个阶段的平均值和所有阶段对之间的差异。

在R v3.3.3(Team 2017)中进行统计分析，使用lme4(Bates等人2015)、multcomp(Hothorn等人2008)、ggplot2(Wickham 2009)、snowfall(Knaus2013)、mixOmics(Rohart等人2017)以及ellipse库(Murdoch和Chow2013)。

向OTU分配健康关联

对于在咀嚼物和无咀嚼物比较中显示显著差异(p<0.05)和>2优势比的OTU，根据之前的研究结果分配健康关联(Davis等人2013，Wallis等人2015)。简单地说，从之前的研究中(去除罕见的OTU后)的OTU的代表性序列被连接到一个FASTA文件中。然后用QIIME对序列进行聚类。本研究中每个OTU的代表性V3-V4序列与之前使用BLAST的研究中的代表性序列(V1-V3序列)(Altschul等人2010)进行了查询。基于≥99％序列同一性的查询匹配，从本研究中推断出“匹配”OTU的健康状态与相应的OTU，从而使细菌与健康和牙周疾病的关联信息得以叠加。

根据先前研究的已知关联，OTU集群被标记为健康、健康(弱)、疾病、疾病(弱)、无(none)或未知(unknown)(参考：再一次所有的3个)。如果代表性序列只能在三项研究中的一项中被识别，或者如果个体研究中的关联显示出小趋势(优势比<2)，则分配术语“弱”。如果三项研究中的细菌相关性未形成共识，或个别研究中的信息不具有决定性，则应用“未知”状态。

结果

样品和序列质量

从十二(12)只比格犬中各抽取四次龈上牙菌斑样本：i.开始预实验阶段；ii、结束预实验阶段；iii.结束试验阶段有咀嚼物；和iv.结束试验阶段无咀嚼物。本研究共产生了47个龈上牙菌斑样本。一(1)只狗未获得基线开始预实验阶段。

通过生物信息学管道(bioinformatics pipeline)处理后，对47个龈上牙菌斑样本的16S rDNA基因V3-V4区3'端进行因美纳(Illumina)测序分析，产生6,946,238个组装读数。每个样本的最终序列读取数从55,666到302,682不等，中位数为143,299次读取。

犬科动物龈上牙菌斑的细菌组成

如方法中所述，将“罕见”序列读取过滤到一个单独的组后，将6,946,238个组装序列分配给158个OTU。罕见组占总序列的2.37％。

158个OTU中的每一个的分类学分配导致148个(93.7％)具有与Silva数据库(v128)中的16S序列≥98％的序列同一性。其余10个OTU与序列比对，其同一性在92.1％至97.9％之间。在158个OTU中，82个(51.9％)与先前确定为犬科动物口腔分类群(COT)的序列比对(Dewhirst等人2012)，并且10个(6.3％)与先前确定为猫科口腔分类群(FOT)的序列比对(Dewhirst等人2015)。其余66个OTU(41.8％)与Silva数据库中的其他分类群比对。其中16个(10.1％)为分配物种级分类法。

对158个OTU的分类组成分析表明，141个OTU属于九(9)个门：变形菌门(Proteobacteria)(40.4％)、厚壁菌门(Firmicutes)(21.1％)、拟杆菌门(Bacteroidetes)(19.9％)、放线菌门(Actinobacteria)(7.5％)、互养菌门(Synergistetes)(1.4％)、螺旋体门(Spirochaetes)(0.4％)、梭杆菌门(Fusobacteria)(0.3％)、柔膜菌门(Tenericutes)(0.06％)和绿菌门(Chlorobi)(0.06％)。其余17个OTU属于四(4)个候选门：单糖菌门(Saccharibacteria)(3.5％)、隐细菌门(Absconditabacteria)(1.8％)、纤细杆菌门(Gracilibacteria)(1.1％)和WS6(0.08％)。

最丰富的25个分类群，以≥1％存在，约占序列读取的74％(表1)。一种新的大肠杆菌属志贺菌属(Escherichia-Shigella)种(OTU#6813)是最丰富的分类群，占序列读取总数的28.7％。一种新的伯杰氏菌属(Bergeyella)种(OTU#8463)、犬齿龈液卟啉单胞菌(Porphyromonas cangingivalis)(OTU#5307)和一个种新的变形菌属(Proteocatella)种(OTU#8440)是第二丰富的，分别占序列读取的7.13％、6.27％和2.37％。一种新的放线菌属(Actinomyces)的种(OTU#2136)和短枝单胞菌属(Brachymonas)的种COT-015(OTU#2778)分别占种群的2.32％和2.03％。另外19个OTU占总群体的1.00％至2.00％，其余133个OTU低于1.00％，并且相对丰度在0.014％至0.92％之间。

表1.存在于龈上牙菌斑中的总序列读数>1％的25个

最丰富的操作分类单元(OTU)。

表1(续)存在于龈上牙菌斑中的总序列读数>1％的25个最丰富的操作分类单元(OTU)

不同阶段之间牙菌斑样本组的比较

主成分分析(PCA)用于显示阶段之间的相关性。第一组分解释了OTU log₁₀比例中40％的可变性，第二组分解释了OTU log₁₀比例中19％的可变性(图1)。在四组之间观察到明显的聚类。两个试验组的饮食方案在OTU组成方面具有最普遍的共同性，图1示出了试验阶段样品的接近程度。

在整个研究期间，龈上牙菌斑样本组在菌门水平上显示出显著差异(图2)。两个试验阶段饮食方案组的门水平组成相似，其中变形菌门(Proteobacteria)是最丰富的门，并且发现两个阶段的比例均显著高于预实验阶段样品(p<0.01)。相反，在预实验阶段结束时，拟杆菌门是基线样品中最丰富的门，而在预实验阶段开始时，厚壁菌门是基线样品中最丰富的门。发现这些比例显著高于各试验阶段组的相应比例(p<0.05)。

对于每个OTU，在阶段组之间进行成对比较，并且发现在22到102之间的比较中，类似数量的OTU显著不同(表2)。试验阶段饮食方案的样本组(无咀嚼物与咀嚼物)表明，所有比较中差异的数量最少。图3显示了无咀嚼物和咀嚼物比较的重要OTU的分类和丰度变化示意图。基于先前研究(见方法)的知识，每个分类群的健康、疾病或缺乏关联也在图3中指出。总之，与无咀嚼物相比，咀嚼物干预导致6个健康相关类群和3个疾病相关类群显著增加(见表3)。相比之下，无咀嚼物组的8个疾病相关类群和1个健康相关类群数量显著增加(表3)。在这些比较中，发现1个分类群没有健康/疾病关联，而其他3个分类群的健康/疾病关联未知。表4提供了OTU的门、纲、目、科、属和最终分类单元分类。

表2.比较龈上牙菌斑组的操作分类单元(OTU)的总结。

表明在不同阶段组之间存在显著差异的分类单元的数量

表3.用于无咀嚼物和咀嚼物比较的重要OTU的分类和在丰度上的变化.

表4.OTU分类

差异

用于分析香农多样性指数数据的线性混合模型显示，牙菌斑样本组之间存在一些显著差异(图4)。与预实验阶段样本相比，试验阶段样本的香农多样性指数显著较低(p<0.05)。两个试验阶段样品(咀嚼物和无咀嚼物)和两个预实验阶段样品的指数值没有显著差异(p>0.05)。表5中提供了OTU序列。

表5.OTU序列

讨论

对犬科动物齿咀嚼物功效的调查主要集中在临床牙菌斑和牙石指数(Gorrel和Bierer 1999，Gorrel等人1999，Brown和McGenity 2005，Hennet等人2006，Clarke等人2011，Quest 2013)。了解这两种因素与牙周病发展的关系，并了解特定产品降低其中一种或两者的潜力有助于预防。

在微生物方面，高通量分子分析工具(如16s rRNA测序)的出现使研究能够定义犬牙菌斑微生物群(Elliott等人，2005年，Dewhirst等人，2012年)，并调查特定细菌物种与健康牙龈或牙周病的关联(Riggio等人，2011年，Davis等人，2013年，Wallis等人，2015年，Davis 2016年)。通过整合迄今为止可用的信息，本研究有利地表明，微生物群的变化也可用于证明功效，说明牙菌斑内的细菌群落可通过喂食日常口腔护理咀嚼物在短时间能被朝着健康方向控制。本研究为首次演示定期喂食口腔护理咀嚼物对犬科动物口腔微生物群的影响。

考虑到本研究中使用的是单一品种，将这些发现外推到中型犬两侧的品种大小可能值得关注。例如，小的、迷你(teenie)和玩具品种被认为表现出不同的咀嚼行为，特别是在咀嚼物方面。迄今为止，关于健康和疾病相关细菌物种的关键见解来自于对纯品种和混合品种的研究(Davis等人，2013年)。本研究和其他研究主要关注龈下牙菌斑微生物种群。一项与本文进行的研究类似研究的未公布数据显示，在喂食大小合适的小型雪纳瑞咀嚼物后，对龈下和龈上牙菌斑微生物群都有积极影响。这不仅证明了研究结果可转移到其他品种，而且支持了在当前研究中仅收集和分析龈上牙菌斑微生物群的基本原理。重要的代表性健康相关物种也被证明存在于早期龈上牙菌斑生物膜中(Holcombe等人，2014年)。不仅如此，生物膜的发展以及能够测量D&P后24至48小时内微生物种群变化的相关能力也支持在微生物生物标记物检测中使用龈上牙菌斑(Holcombe等人2014)。

本研究中确定的OTU的分类分配发现，一半以上的OTU与先前特征化的COT和FOT序列比对，而31.6％的OTU在物种水平上无法区分，并被赋予了新的分类身份。与分析犬科动物口腔微生物群的其他研究相比，COT/FOT和新序列的数量分别要低得多和高得多(Davis等人2013，Wallis等人2015)。这些数字的差异可能是龈上牙菌斑收集的结果，作为龈下牙菌斑的替代物。尽管人们相信，最丰富的关键物种在每种样本类型中都得到了很好的反映，但这里的数据表明，这两个牙菌斑部位表明了微生物群的组成差异。虽然在犬科动物中几乎没有证据支持这一点，但在人类领域的研究显示了混合的结果，其中一些表明了类似的细菌成分(Sakellari等人2001年、Mayanagi等人2004年、Haffajee等人2008年、Papaioannou等人2009年、Schaumann等人2014年)，而其他研究观察到了(Riviere等人，1992年，Ximenez-Fyvie等人，2000b，Ximenez-Fyvie等人，2000a，Daniluk等人，2006年，Preza等人，2009年，He等人，2012年)在分类群和/或其各自的比例中的差异。这些观察结果还强调了分类学分配的变化能对不同时间产生的研究的荟萃分析产生的潜在影响。例如，随着人们对考虑其他口腔生态位的兴趣增加，这个问题可能会变得更加深刻。因此，可能在未来定期更新相关数据库的潜在投资可能是非常宝贵的(Dewhirst等人2012，Dewhirst等人2015)。

在整个龈上牙菌斑样本中，观察到的主要菌门是变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门。这与报道的犬齿龈下牙菌斑的主要门类一致(Davis等人2013、Sturgeon等人2013、Holcombe等人2014、Wallis等人2015)。各样本组的门比例各不相同。两个试验阶段组的变形菌门数量均显著更高。这一发现反映了另一个与最丰富的分类群有关的观察结果，这是一种新的大肠杆菌属志贺菌属的种，占总序列读数的28.7％。虽然之前对犬科动物微生物群的研究通常将犬齿龈液卟啉单胞菌(P.cangingivalis)分离为最主要的分类群(Davis等人2013年，Wallis等人2015年)，但这在本文中被列为第三大主要分类群(6.27％)。食粪癖为这两项发现提供了最清晰的解释，因为这些分类群通常居住在胃肠道(Schmitz和Suchodolski，2016)；本研究未纳入食粪癖管理制度。与环境因素相关的细菌也更可能出现在龈上牙菌斑中，而不是龈下牙菌斑中。其他门的差异包括，与结束试验前阶段样品相比，开始试验前阶段样品中厚壁菌门更丰富，拟杆菌门更少。这些主要菌门的趋势与Davis等人(2013)的观察结果一致，支持在研究试验阶段之前更倾向于疾病的牙菌斑微生物组。因此，这些迹象表明，预实验阶段的初始D&P和刷牙程序有效地将微生物群转化为更健康的成分，然后再开始研究的第一个试验阶段。

有趣的是，微生物多样性的指数值不能显著区分试验阶段有咀嚼物和无咀嚼物样品组。尽管我们提出了关于生物膜定殖差异的假设，即在不提供日常口腔护理咀嚼物的情况下，与相对早期的生物膜状态相比，生物膜定殖差异导致成熟发育，但这表明试验阶段的28天时间不足以证明此参数的差异结果。但是，由于更多的粒度(granularity)为特定细菌物种的丰度变化提供了宝贵的见解，单凭多样性参数不能很好地指示健康状况。人类文献中的趋势已经表明，与牙周病相关的细菌多样性增加的测量方法是可信的。相比之下，那些来自不断扩大的犬科动物口腔研究领域的研究者得出了混合的结论。Davis等人2013年的研究表明，轻度牙周炎患者的微生物群图谱(microbiota profiles)丰富度显著高于健康情形，轻度牙周炎患者的微生物群图谱丰富度显著高于牙龈炎情形，而Wallis等人2015年的研究发现，该参数与牙周炎的发展无显著差异。

聚类技术的使用表明，OTU样本组成在不同阶段的牙菌斑样本组之间相当离散。咀嚼物组和无咀嚼物组在各自的OTU图谱中显示出一些共性，但每个组也显示出独特的样本相关微生物群图谱。共同点很可能与正在发育的生物膜群落中的主要菌落物种有关，这些菌落物种在D&P处理后立即附着在牙齿表面。预实验阶段组表示两种非常不同的微生物群特征；这表明，两周刷牙后的D&P足以完全改变牙菌斑微生物群特征，而不反映“原始”开始预实验阶段的状态。

在OTU水平上对牙菌斑样本组的评估表明，在每一对比较中，有大量的分类群存在显著差异。考虑到试验阶段的咀嚼物和无咀嚼物样本，22个OTU显示出统计上的显著差异。其中，与无咀嚼物相比，口腔护理咀嚼物增加了6个健康相关OTU的数量，而只有3个疾病相关OTU增加。放线菌属(Davis等人2013)先前强调与轻度牙周炎相关，在疾病(弱)相关分类群中被确定，并表明至少有四倍的实质性变化。相反，当无咀嚼物与咀嚼物相比时，只有一种健康相关OTU的丰度增加，并且八种疾病相关OTU的丰度增加。与健康相关的OTU，脱硫弧菌属的种COT-070(OTU#550)，一个以前未显示与两种健康状态显著相关的属，显示其丰度增加了六倍以上。基于口腔护理咀嚼有助于维持较低的牙菌斑和牙石积累的知识，我们假设与这些生物膜群落相关的细菌保持稳定，并趋向于早期定殖物种(Holcombe等人，2014)。这一点得到了两种主要定殖物种的丰度增加的观察结果的支持，这两种主要定殖物种是：鼬鼠棒状杆菌(OTU#8491)和消化链球菌科细菌FOT-054(OTU#8712)，与无咀嚼物相比，这两种定殖物种的丰度至少增加了两倍(Holcombe等人2014)。此外，虽然消化链球菌科物种先前已发现与牙周病相关，但这完全取决于物种。

本实施例提供了口腔咀嚼物，如本研究中测试的咀嚼物，对龈上牙菌斑微生物群具有积极影响，并且细菌可以用作牙齿健康的生物标记物，而不仅仅依赖于牙菌斑和牙石的量化。

实施例2：28天喂养试验(日常口腔护理咀嚼物)

本实施例描述了日常口腔护理咀嚼物在饮食方案(28天)中调节犬科动物口腔微生物群的效果。

研究设计

十八(18)条狗参与了这项研究。研究队列包括小型(从5kg到10kg)和中型(从10kg到15kg)狗：八(8)只澳大利亚梗(Aussie Terrier)和十(10)只比格犬(Beagle)。澳大利亚梗由一(1)只雄性和七(7)只雌性组成，年龄从1岁到4.5岁，体重从6.3千克到8.7千克。这些比格犬由三(3)只雄性和七(7)只雌性组成，年龄从1岁到4岁，以及体重从10.0kg到15.4kg。

进行了一项平衡的3x 3拉丁方设计的研究，其中三种饮食方案中的一种在三个28天的阶段中喂养：其中两种饮食方案为(1)市售主要膳食+口腔护理咀嚼物B；和(2)单独的市售主要膳食(对照)。商业上可买到的主要膳食包括完整且均衡的干粮ADVANCE^TM成年玩赏型/小型品种干狗粮(鸡肉)，配方满足AAFCO对成年狗的营养要求。对犬牙菌斑的分子生物学评估仅针对后两种饮食方案进行，并且本研究中测试和报告的口腔护理咀嚼包括一种商用的每日(B)饲料小吃(feed treat)(GREENIESTM^TM Original(犬牙咀嚼物))。每天的食物摄入量是基于个人维持体重所需的能量。对于接受任何一种试验产品的狗，调整主要膳食量以补偿前者的能量含量。

在开始每个28天的试验阶段之前，这些狗在麻醉下对其牙齿进行刮治和抛光(S&P)。对于麻醉，皮下注射美沙酮(0.4mg/kg)和乙酰丙嗪(0.04mg/kg)作为预用药。通过静脉注射

诱导麻醉，并通过气管插管(chuffed endotracheal tube)吸入氧气/异氟烷维持麻醉。在整个麻醉过程中，这些狗都由一名专门的兽医护士进行监控，在此期间遵循标准程序并记录生命统计数据。

在S&P之前，使用CytoSoft^TM细胞刷(医药包装公司(Medical PackagingCorporation))从上颌和下颌牙齿的颊面收集“基线”龈上牙菌斑。使用单独的拭子采集两个样本，一个来自口腔右侧，另一个来自口腔左侧。将单个牙菌斑样品立即放入2ml冷冻管中的1.5ml Tris-EDTA(TE，10mM Tris-1mM EDTA)缓冲液(pH 8.0)中，将拭子的鬃毛端(bristle end)浸入缓冲液中，并移除塑料拭子手柄。样品在-20℃下暂时储存36小时，然后转移到在-80℃下长期储存。研究完成后，将牙菌斑样品在干冰上运输至中心进行处理。

在试验阶段，所有的狗每天下午都被喂食一次主要膳食。接受咀嚼物的狗在吃完主食后被提供以咀嚼物。用单独的围栏喂养这些狗，并称重和记录拒绝主要膳食和/或咀嚼物的情况。

DNA提取

使用Masterpure^TM革兰氏阳性DNA纯化试剂盒根据制造商的说明从牙菌斑样本中提取DNA，并添加过夜裂解(EpiCentre，目录#MGP04100)。将牙菌斑样品以5000x g离心10分钟，并通过旋涡(vortexing)将细菌颗粒重新悬浮在150μlTE缓冲液中。将Ready-Lyse^TM溶菌酶溶液(1μl；Epicentre，目录#R1804M)添加到细菌悬浮液中，然后在37℃下培养18小时。DNA提取后，将DNA颗粒重新悬浮在TE缓冲液(10mM Tris Cl和0.5mm pH 9.0EDTA)中。使用

双链DNA高灵敏度分析试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher ScientificInc.))测定DNA的数量。

定量PCR(qPCR)分析

使用针对消化链球菌科XIII[G-1]的种(COT-030)的16S rRNA基因开发的qPCR分析和内部设计和验证的通用qPCR分析(UniB)来评估该物种的水平。

每个单独的10μl定量PCR(qPCR)反应包含：5μl应用生物系统基因表达TaqmanMasterMix(Applied Biosytems Gene Expression Taqman MasterMix)(美国应用生物系统公司)，0.5μl 20X浓缩分析，1μl 1:10DNA稀释和3.5μl无核酸酶水。每个分析包含每个反应的每个引物的最终浓度为900nM，并且每个qPCR探针的最终浓度为250nM。实验分三次进行。阳性对照和阴性对照(也包括三份)分别为0.001ng/μl的物种克隆(CN030)的M13纯化扩增子和无核酸酶水。在ABI QuantStudio 7Flex实时PCR系统(美国应用生物系统公司)上收集数据，并使用GenEx软件(瑞典MultiD)进行分析。

通过对每个样品和COT030分析的平均、效率校正Cq值和COT030分析执行以下等式，计算相对于无的标准化为UniB的COT-030：

2^^{-(平均COT03Cq值-平均UniBCq值)}。

统计分析

COT-030标准化为相对于无的UniB值表示为平均+/-95％置信区间(CI)。

log10转换参数采用线性混合模型，饮食方案、阶段、双向相互作用和三向相互作用为固定效应，并且狗为随机效应。使用Shapiro和Bartlett检验来检验残差的正态性和同质性，由于不符合Bartlett的条件，因此应用方差校正。Tukey事后比较用于比较饮食方案和阶段(如果相关的话)。

所有分析均使用R版本3.6.1进行。

结果

可变研究参数的评估

由于本研究采用了平衡的3x 3拉丁方设计，因此对数据进行了初步分析，以确定饮食方案是否受到分阶段方法的影响。初步调查结果如表6所示。

表6.变量(Variant)的分析

当作为单个单独因素进行测试时，得出的p值表明饮食方案和阶段存在显著差异。饮食方案和阶段之间的相互作用没有观察到显著差异。这表明饮食结构的差异并不取决于研究设计。

饮食方案的影响

研究中测试的饮食方案的qPCR结果，表示为COT-030标准化为相对于无的UniB，然后进行成对比较，如图8所示。试验饮食方案和对照之间的对比显示两组之间存在显著差异。研究发现，以饮食方案2(图8)为代表的口腔护理咀嚼物B与对照组(饮食方案3)存在显著差异。得出的p值为p＝0.001。

讨论

多年来，通过对牙菌斑和牙石的测量，临床已经证明了犬用牙齿咀嚼的功效。这些因素与牙周病的关系已得到充分证实，因此，它们的量化为了解预防性口腔健康措施的有效性提供了一种手段。

高通量测序能使犬科动物和猫科动物牙菌斑中丰富的细菌物种与特定健康状态相关联。对于犬科动物牙周病，已证明消化链球菌科XIII[G-1]的种(COT-030)与疾病的早期阶段密切相关，因此提供了一个良好的鉴别生物学指标。

通过基于分子生物学的方法对消化链球菌科XIII[G-1]的种(COT-030)进行量化，我们已经证明了口腔护理咀嚼物和日常喂养的功效。与对照组相比，经过28天喂食阶段后，龈上牙菌斑中的疾病相关多个物种水平显著降低，已有产品功效数据得到了新的微生物测量的补充。

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***

尽管已经详细描述了当前公开的主题及其优点，但是应当理解，在不脱离所附权利要求所定义的公开主题的精神和范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和变更。此外，本申请的范围不限于说明书中描述的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法和步骤的特定实施例。如本领域的普通技术人员将容易从本发明公开的主题理解，当前存在的或稍后要开发的，与本文描述的相应实施例执行基本相同的功能或实现基本相同的结果的工艺、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤，可以根据当前公开的主题予以利用。因此，所附权利要求旨在在其范围内包括此类工艺、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤。

本申请中引用了专利、专利申请、出版物、产品说明和方案，出于所有目的，本申请通过引用将其公开内容并入本文。

SEQUENCE LISTING

<110> MARS, INCORPORATED

<120> USE OF ORAL CHEW

<130> 069269.0413

<140> PCT/US2020/036712

<141> 2020-06-08

<150> GB 1908109.0

<151> 2019-06-06

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

oligonucleotide"

<400> 1

ggactachvg ggtwtctaat 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic

oligonucleotide"

<400> 2

ctgctgcctc ccgtaggagt 20

<210> 3

<211> 429

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Unknown:

unclassified Klebsiella [novel] sequence"

<400> 3

cctgtttgct ccccacgctt tcgcacctga gcgtcagtct ttgtccaggg ggccgccttc 60

gccaccggta ttcctccaga tctctacgca tttcaccgct acacctggaa ttctaccccc 120

ctctacaaga ctctagcctg ccagtttcga atgcagttcc caggttgagc ccggggattt 180

cacatccgac ttgacagacc gcctgcgtgc gctttacgcc cagtaattcc gattaacgct 240

tgcaccctcc gtattaccgc ggctgctggc acggagttag ccggtgcttc ttctgcgggt 300

aacgtcaatc gacaaggtta ttaaccttat cgccttcctc cccgctgaaa gtactttaca 360

acccgaaggc cttcttcata cacgcggcat ggctgcatca ggcttgcgcc cattgtgcaa 420

tattcccca 429

<210> 4

<211> 410

<212> DNA

<213> Propionibacterium sp.

<220>

<221> source

<223> /note="COT-296"

<400> 4

gcctgttcgc tccccacgct ttcgcttctc agcgtcagga aaggtccaga gaaccgcctt 60

cgccaccggt gttcctcctg atatctgcgc attccaccgc tccaccagga attccgttct 120

cccctacctc cctcaagtca gcccgtatcg aaagcaagct cagagttaag ccctgagttt 180

tcactcccga cgcgacaaac cgcctacaag ctctttacgc ccaataaatc cggacaacgc 240

tcgcacccta cgtatcaccg cggctgctgg cacgtagtta gccggtgctt cttctgtcgg 300

taccgtcact cacgcttcgt cccgactgaa agcggtttac aacccgaagg ccgtcatccc 360

gcacgcggcg ttgctgcatc aggcttccgc ccattgtgca atattcccca 410

<210> 5

<211> 404

<212> DNA

<213> Catonella sp.

<220>

<221> source

<223> /note="COT-257"

<400> 5

cctgtttgct acccacgctt tcgagcctca gcgtcagttt tggtccagca agccgccttc 60

gccaccggtg ttcttcctaa tatctaagca tttcaccgct acactaggaa ttccgcttgc 120

ctctcccata ctcaagccta acagttttgg gagcagtctc ggggttgagc cccgagcttc 180

cactctcaac ttgaaaggcc gcctgcgctc cctttacacc cagtaaatcc ggataacgct 240

tgccccctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccggggcttc ttagtcaggt 300

accgtcatca tcttccctgc tgatagagct ttacataccg aaatacttct tcactcacgc 360

ggcgtcgctg catcagagtt tcctccattg tgcaatatcc ccca 404

<210> 6

<211> 416

<212> DNA

<213> Corynebacterium mustelae

<400> 6

cctgttcgct ccccatgctt tcgctcctca gcgtcagtta ctgcccagag acctgccttc 60

gccatcggtg ttcctcctga tatctgcgca ttccaccgct acaccaggaa ttccagtctc 120

ccctacagca ctccagttat gcccgtatcg cctgcaaccc cgaagttaag ccccggtatt 180

tcacagacga cgcaacaaac cacctacgag ctctttacgc ccagtaattc cggacaacgc 240

tcgcacccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccggtgctt cttctacagg 300

taccgtcacc ttaaaaaagg cttcgtccct accgaaagag gtttacaacc cgaaggccgt 360

catcccccac gcggcgtcgc tgcatcaggc ttgcgcccat tgtgcaatat tcccca 416

<210> 7

<211> 424

<212> DNA

<213> Prevotella sp.

<220>

<221> source

<223> /note="COT-282"

<400> 7

cctgtttgat acccacactt tcgagcctca gcgtcagttg tgctcccggc atatgccttc 60

gcgatcggag ttcttcgtaa tatctaagca tttcaccgct acactacgaa ttccaatgcc 120

gctgcgcaca ctcaagacaa ccagtatcaa ctgcaatttt aaggttgagc ctcaaacttt 180

cacagctgac ttaatcatcc gcctacgctc cctttaaacc caataaatcc ggataacgcc 240

cgaaccttcc gtattaccgc ggctgctggc acggaattag ccggtccttt ttcttacggt 300

acttgcaaga caccacacgt ggcgtttttt acccccgtat aaaagcagtt tacaacccag 360

agggcagtct tcctgcacgc tacttggctg gttcagactc tcgtccattg accaatattc 420

ctca 424

<210> 8

<211> 406

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Unknown:

TM7 sp. COT-305 sequence"

<400> 8

cccgttcgct ccccacgctt tcgtgcctta gcgtcagaaa tggtccagta acctgcctac 60

gccattggtg ttccttctaa tatctacgga tttcactcct acactagaaa ttccagttac 120

ctctaccact ctcgagttta gcagtttgaa taatagtctg tatggttgag ccaccaggtt 180

tcactattca cttactaaac cgcctacgca actctttacg cccagtcact ccggataatg 240

cttgcaccct acgtatgacc gcggctgctg gcacgtagtt agccggtgct tattcatgag 300

ttaccgtcat attcttcact cataaaagaa gtttacaacc cgaaggcctt catccttcac 360

gcggcgttgc tccatcaggc tttcgcccat tgtggaagat tcctca 406

<210> 9

<211> 403

<212> DNA

<213> Parvimonas sp.

<220>

<221> source

<223> /note="COT-101"

<400> 9

cctgtttgct ccccacgctt tcgtacctga gcgtcagtaa aagtccagaa agtcgccttc 60

gccaccggta ttcctcctaa tatctacgca tttcaccgct acactaggaa ttccactttc 120

ctctccttca ctcaagcctt ccagtttcaa gtgcttaatg aggttaagcc tcacgctttc 180

acacctgact taaaaggccg cctacgtacc ctttacgccc aataattccg gacaacgctc 240

gccccatacg tattaccgcg gctgctggca cgtatttagc cggggcttcc tcctatgata 300

ccgtcattat cttctcatag gacagagctt tacgactcga aagccttctt cgctcacgcg 360

gcgtcgctgc atcagggttt cccccattgt gcaatattcc cca 403

<210> 10

<211> 421

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Unknown:

unclassified Actinomyces [novel 3] sequence"

<400> 10

cctgttcgct ccccacgctt tcgctcctca gcgtcagtaa cggcccagag acccgccttc 60

gccaccggtg ttcctcctga tatctgcgca ttccaccgct acaccaggaa ttccagtctc 120

ccctaccgca ctcaagccag cccgtaccca ccgcaagccc ggagttaagc cccgggtttt 180

cacggcagac gcgacaagcc gcctacaagc cctttacgcc caataattcc ggacaacgct 240

cgcgccctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccggcgcttc tttacccact 300

accctcaact agaacaaaaa ctagccttga ccatgagcga aagaggttta caacccgaag 360

gccgtcatcc ctcacgcggc gttgctgcat caggcttgcg cccattgtgc aatattcccc 420

a 421

<210> 11

<211> 430

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Unknown:

unclassified Treponema [novel 2] sequence"

<400> 11

cctgtttgct ccccgcacct tcgcatatca gcgtcaatca tcggccagaa acccgccttc 60

gccaccggtg ttcttccaaa tatctacaga ttccacccct acacttggaa ttccggtttc 120

ccctccgtga ttcaagttaa gcagtaccca atgcagttta cgagttaagc tcgtagattt 180

cacatcaggc ttacctaacc gcctacatgc cctttacgcc caataattcc gaacaacgct 240

tggggcttac gtgttaccgc ggctgctggc acgtaattag ccgcccctta ttcgcatgat 300

taccgtcatc agataggcat tccctcctat ccttattctt catctgcaaa agaactttac 360

aacctttcgg ccttcatcgt tcacgcggcg tcgctccgtc agactttcgt ccattgcgga 420

agattcttag 430

<210> 12

<211> 403

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Unknown:

Bacterial sequence"

<400> 12

ccctttcgct ccccacgctt tcgtctctca gtgtcagtag tgttccagca agctgccttc 60

gcttttggta ttctggtatg tatcaacgga ttgcacccct actcataccg ttctgcttgc 120

ctctcccaca ctcaagttat atggttttcc gcgcaatcca gggttgagcc ctggagtttc 180

acacgaaacc tttataacca cctacagacg ctttacgccc agtaattccg gataacgctt 240

ggggccctcg tattaccgcg gctgctggca cgaagtttgc cgccccttat tcctctcgta 300

ccgtcattat cttccgagag aaaagaagtt tacaccaaca aaggcttcat ccttcacgcg 360

gtgtcgctcc atcaggcttt cgcccattgt ggaagattcc tca 403

<210> 13

<211> 429

<212> DNA

<213> Desulfovibrio sp.

<220>

<221> source

<223> /note="COT-070"

<400> 13

cctgtttgct ccccacgctt tcgcacctca gcgtcaatac cggtccaggt ggccgccttc 60

gccactgatg ttcctccaga tatctacgga tttcactcct acacctggaa ttccgccacc 120

ctctcccgga ttcaagtcac gcagtatcaa aggcagttcc acggttgagc cgtgggattt 180

cacccctgac ttacatgaca gcctacgtgc gctttacgcc cagtaattcc gattaacgct 240

cgcaccctcc gtattaccgc ggctgctggc acggagttag ccggtgcttc ctttgaaggt 300

accgtcaata cacccctgat tggcagagtg caccttcttc ccttccgaca gaggtttacg 360

atccgaaaac cttcatccct cacgcggcgt cgctgcgtca ggctttcgcc cattgcgcaa 420

tattcccca 429

<210> 14

<211> 406

<212> DNA

<213> Fretibacterium sp.

<220>

<221> source

<223> /note="FOT-218"

<400> 14

cctgtttgct ccccacgctt tcgcacctga gcgtcagtta ccgtccagca agtcgccttc 60

gccaccgatg ttcttcccaa tatctacgca tttcaccgct acactgggaa ttccacttgc 120

ctctccggta ctccagcacc tcagtctcaa ctgcataaca cggttaagcc gcatccttta 180

acagctgact tgaagcacag cctgcgtgcc ctttacgccc agtaattccg gacaacgctc 240

gccccctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cggggcttat tcatgtggta 300

ccgtcactct cttcttccca cataaaagaa ctttacgacc cgaaggcctt cttcgttcac 360

gcggcgtcgc tgggtcagga ttcctcccat tgcccaatat tcccca 406

<210> 15

<211> 403

<212> DNA

<213> Helcococcus sp.

<220>

<221> source

<223> /note="FOT-023"

<400> 15

cctgtttgct ccccacgctt tcgtacctca gcgtcagtta gattccagaa agtcgccttc 60

gccaccggta ttcctccaaa tatctacgca tttcaccgct acacttggaa ttccactttc 120

ccctcatcta ctcaagttat ccagtttcca caccttacat tggttgagcc aatgcctttt 180

aatatggact taaataaccg cctacgtacc ctttacgccc aataattccg gacaacgctc 240

gccccatacg tattaccgcg gctgctggca cgtatttagc cggggctttc ttcttggtta 300

ctgtcattat cttcaccaag gacagaactt tacaacccga aggccttctt cgttcacgcg 360

gcgtcgctgc atcagggttt cccccattgt gcaaaattcc cca 403

<210> 16

<211> 404

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Unknown:

unclassified Clostridium [novel] sequence"

<400> 16

cctgtttgct ccccacgctt tcgagcctca gcgtcagtta cagtccagag agtcgccttc 60

gccactggtg ttcttcctaa tctctacgca tttcaccgct acactaggaa ttccactctc 120

ctctcctgca ctctagataa ccagtttgga atgcagcacc caagttgagc ccgggtattt 180

cacatcccac ttaatcatcc gcctacgctc cctttacgcc cagtaaatcc ggataacgct 240

cgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccgtggcttc ctccttgggt 300

accgtcatta tcttccccaa agacagagct ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc 360

ggcgttgctg catcagggtt tcccccattg tgcaatattc ccca 404

<210> 17

<211> 430

<212> DNA

<213> Desulfomicrobium orale

<400> 17

cctgtttgct ccccacactt tcgcacctca gcgtcaatac ctgtccaggc ggccgccttc 60

gccaccggtg ttcctcctga tatctacgga tttcactcct acaccaggaa ttccgccgcc 120

ctctccagga ttcgagcccc gcagtttcaa gtgcagttcc acggttgagc cgtgggattt 180

cacacctgac ttacaaggcc gcctacgtgc gctttacgcc cagtaattcc gaataacgct 240

tgcaccctcc gtattaccgc ggctgctggc acggagttag ccggtgcttc ctttgaaggt 300

accgtcaaaa tgcgggccta ttggacccgc atcacttctt cccttctgac agaggtttac 360

gatccgaaaa ccttcatccc tcacacggcg ttgctgcgtc aggctttcgc ccattgcgca 420

atattcccca 430

<210> 18

<211> 406

<212> DNA

<213> Anaerovorax sp.

<220>

<221> source

<223> /note="COT-125"

<400> 18

cctgtttgct acccacgctt tcgtgcctca gtgtcagtta cagtccagaa agccgccttc 60

gccaccggtg ttcctcctaa tatctacgca tttcaccgct acactaggaa ttccactttc 120

ccctcctgca ctcaagctac acagttcgca gggcttacaa tggttaagcc actgcctttc 180

accccacgct tatctagcca cctacgcact ctttacgccc aataattccg gataacgctc 240

gccccctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cggggctttc ttgataggta 300

ccgtcacctt tttcttccct atcgacagag ctttacgacc caaaggcctt cttcgctcac 360

gcggcgttgc tgcatcaggc tttcgcccat tgtgcaatat tcccca 406

<210> 19

<211> 423

<212> DNA

<213> Bacteroidia bacterium

<220>

<221> source

<223> /note="COT-387"

<400> 19

cctgttcgat acccacgcct tcgtgcatca gcgtcaatga ggggctcgcg agatgccttc 60

gcaatcggtg ttctgtgtga tatctatgca tttcaccgct acaccacaca ttcctcccgc 120

ggcgccccaa ttcaagcgcg acagtttcga cggcaaaccg cgcgttgagc gcgaggattt 180

caccgccgac ttgacacgca gcctacgcac cctttaaacc caataaatcc ggataacgct 240

cgcatccccc gtattaccgc ggctgctggc acggagttag ccgatgctta ttcgaccggt 300

actctcatcg ggccaccagt ggcccttatt gctcccggtc aaaaggagtt taagacccgt 360

agggccgtcg cctccacgcg gcatggctgg atcaggctta cgcccattgt ccaatatccc 420

tca 423

<210> 20

<211> 429

<212> DNA

<213> Neisseria canis

<400> 20

cctgtttgct acccacgctt tcgagcatga acgtcagtat tatcccaggg ggctgccttc 60

gccatcggta ttcctccaca tctctacgca tttcactgct acacgtggaa ttctaccccc 120

ctctgacata ctctagttac ccagttcaga acgccgttcc caggttaagc ccggggattt 180

cacatcctgc ttaagtaacc gtctgcgctc gctttacgcc cagtaattcc gattaacgct 240

cgcaccctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccggtgctta ttcttacggt 300

accgtcataa cttcagggta ttagcccaaa gcctttcttc ccgtacaaaa gtcctttaca 360

acccgaaggc cttcttcaga cacgcggcat ggctggatca gggttccccc cattgtccaa 420

aattcccca 429

<210> 21

<211> 429

<212> DNA

<213> Pelistega sp.

<220>

<221> source

<223> /note="COT-267"

<400> 21

cctgtttgct ccccacgctt tcgtgcatga gcgtcagtat tatcccaggg ggctgccttc 60

gccatcggta ttcctccaca tctctacgca tttcactgct acacgtggaa ttctaccccc 120

ctctgacata ctctagttcg ggagttaaaa atgccgttcc aaggttgagc cctgggattt 180

cacatctttc tttccgaacc gcctgcgcac gctttacgcc cagtaattcc gattaacgct 240

tgcaccctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccggtgctta ttcttcaggt 300

accgtcatca cgcaaaggta ttaactctgc gcttttcttc cctgacaaaa gtgctttaca 360

acccgaaggc cttcatcgca cacgcgggat ggctggatca gggttccccc cattgtccaa 420

aattcccca 429

<210> 22

<211> 404

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<221> source

<223> /note="Description of Unknown:

Bacterial sequence"

<400> 22

cctgtttgct ccccacgctt tcgcgcctca gcgtcagtta atgtccagca ggccgccttc 60

gccactggtg ttcctcccta tatctacgca tttcaccgct acacagggaa ttccgcctgc 120

ctctccatca ctcaagaact acagtttcaa gtgcacgctc ggggttgagc cccgagattt 180

cacacctgac ttgcagtccc gcctacacgc cctttacacc cagtaaatcc ggataacgct 240

tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccgtggctta ttcctgaagt 300

accgtcatta tcttccctca gaaaagaagt ttacaacccg aaagccttct tccttcacgc 360

ggcgttgctg ggtcaggctt gcgcccattg cccaatattc ccca 404

<210> 23

<211> 408

<212> DNA

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gccactgatg ttcctcccaa tatcaacgca tttcaccgct ccactgggaa ttccattcgc 120

ctcttcctgt ctcaattcct gtagtttcca aagctttccc acggttgagc cgtggtcttt 180

aactaaagac ttacagaaac acctacgcat ctctatacac ccaataaatc cggataacgt 240

tcgcacccta cgcatcaccg atgcttctgg cacgtagtta gcaggtgctt attcatatgg 300

taccgtcatc tattcttccc atataaaagg agtttacaat ccgaagaccg tcatcctcca 360

cactgtgtcg ctgcgtcagg gttgccccca ttgcgcaaga ttcctaat 408

<210> 24

<211> 429

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cctgtttgct ccccacgctt tcgtgcctca gcgtcagtat aggcccagca agccgccttc 60

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ctctacctaa ctctagtctc ccagttttca aagcgttcca aagttgagct ttggatttaa 180

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ccgtcaatat catatcattt cctatacaat atgttcttcc taaataaaag aattttacgt 360

actagaagta tgtcttcatt cacgcggtat cgctcggtca gggtttcccc cattgccgaa 420

gattctcta 429

Claims

1.一种口腔咀嚼物，所述口腔咀嚼物用于调节犬科动物中口腔微生物群。

2.根据权利要求1所述的咀嚼物，其中与预期微生物群相比，通过增加与良好口腔健康相关的细菌物种的数量，或增加来自与良好口腔健康相关的细菌物种的细菌的流行率或相对比例来调节所述口腔微生物群。

3.根据权利要求2所述的咀嚼物，其中所述口腔微生物群的调节包括增加普雷沃氏菌属的种COT-282、丙酸杆菌属的种COT-296、卡托纳菌属的种COT-257、消化链球菌科细菌FOT-054和鼬鼠棒状杆菌中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种的流行率。

4.根据前述任意一项权利要求所述的咀嚼物，其中与预期微生物群相比，通过减少与不良口腔健康或疾病相关的细菌物种的数量，或减少来自与不良口腔健康或疾病相关的细菌物种的细菌的流行率或相对比例来调节所述口腔微生物群。

5.根据权利要求4所述的咀嚼物，其中调节所述口腔微生物群包括降低傍小杆属的种FOT-218、犬奈瑟菌、厌氧菌属的种COT-125、消化链球菌科细菌COT-030、居鸽菌属的种COT-267、拟杆菌纲细菌COT-387、口腔脱硫微菌和创伤球菌属的种FOT-023中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种的流行率。

6.根据前述任意一项权利要求所述的咀嚼物，其中所述咀嚼物用于以给药方案施用，所述给药方案包括每天、每隔一天、每周两次、每周或每两周给予狗所述咀嚼物。

7.根据前述任意一项权利要求所述的咀嚼物，其中所述咀嚼物用于以给药方案施用，所述给药方案包括至少5、8、10、13、15、18、20、23、25、28、35或42次给予狗咀嚼物。

8.根据前述任意一项权利要求所述的咀嚼物，其中所述咀嚼物用于给具有清洁口的狗施用。

9.如前述任何权利要求所述的咀嚼物，其中所述狗来自中型、大型或巨型品种。

10.根据前述任意一项权利要求所述的咀嚼物，其中调节所述口腔微生物群导致改善口腔健康，例如减少牙周病。

11.一种用于改善狗的口腔健康的口腔咀嚼物，其中所述口腔健康通过调节口腔微生物群来改善。

12.口腔咀嚼物用于改善狗的口腔健康的用途，其中所述口腔健康通过调节口腔微生物群来改善。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述咀嚼物是根据权利要求1至10中任一项所述的口腔咀嚼物。

14.一种调节狗的口腔微生物群的方法，所述方法包括向狗喂食口腔咀嚼物的步骤。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述向狗喂食咀嚼物的步骤进行例如5、8、10、13、15、18、20、23、25、28、35、42或更多次。

16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述向狗喂食所述咀嚼物的步骤是每天、每周两次、每周或每两周重复。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述向狗喂食咀嚼物的步骤是在狗的一生中，在一年的3天的时间内重复。

18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，所述方法进一步包括清洁狗的口的步骤，特别是在向狗喂食咀嚼物，尤其是第一个咀嚼物之前。

19.一种通过调节狗的口腔微生物群改善狗的口腔健康的方法，所述方法包括向狗喂食口腔咀嚼物的步骤。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述向狗喂食咀嚼物的步骤进行例如5、8、10、13、15、18、20、23、25、28、35、42或更多次。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述向狗喂食咀嚼物的步骤是每天、每周两次、每周或每两周重复。

22.根据权利要求19所述的方法，其中所述向狗喂食咀嚼物的步骤是在狗的一生中，在一年的3天的时间内重复。

23.一种调节狗的口腔微生物群的方法，所述方法包括施用改善狗的口腔健康的有效量的口腔咀嚼物。

24.根据权利要求23所述的方法，其中每天、每周两次、每周或每两周向所述狗施用所述口腔咀嚼物。

25.根据权利要求23所述的方法，其中在狗的一生中，在一年的3天的时间内向所述狗施用所述口腔咀嚼物。

26.根据权利要求23所述的方法，其中至少5、8、10、13、15、18、20、23、25、28、35或42次向所述狗施用所述口腔咀嚼物。

27.根据权利要求23所述的方法，所述方法还包括在施用口腔咀嚼物之前清洁狗的口。

28.根据权利要求27所述的方法，其中在施用任何口腔咀嚼物之前清洁狗的口。

29.根据权利要求23所述的方法，其中所述狗来自中型、大型或巨型品种。

30.根据权利要求23所述的方法，其中，与预期微生物群相比，所述口腔微生物群通过增加与良好口腔健康相关的细菌物种的数量，或增加来自与良好口腔健康相关的细菌物种的细菌的流行率或相对比例来调节。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述口腔微生物群的调节包括增加普雷沃氏菌属的种COT-282、丙酸杆菌属的种COT-296、卡托纳菌属的种COT-257、消化链球菌科细菌FOT-054和鼬鼠棒状杆菌中的至少一种的流行率。

32.根据权利要求23所述的方法，其中，与预期微生物群相比，所述口腔微生物群通过减少与不良口腔健康或疾病相关的细菌物种的数量，或减少来自与不良口腔健康或疾病相关的细菌物种的细菌的流行率或相对比例来调节。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述口腔微生物群的调节包括减小傍小杆属FOT-218、犬奈瑟菌、厌氧菌属的种COT-125、消化链球菌科细菌COT-030、居鸽菌属的种COT-267、拟杆菌纲细菌COT-387、口腔脱硫微菌和创伤球菌属的种FOT-023中的至少一种的流行率。

34.根据权利要求23所述的方法，其中所述狗的改善的口腔健康是牙周病或口腔异味的减少。

35.根据权利要求23所述的方法，其中所述狗来自玩赏型或小型品种。