CN114113624B - 利用免疫球蛋白关联蛋白质组开发疾病标志物的方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了利用免疫球蛋白关联蛋白质组开发疾病标志物的方法及装置。本发明提供了一种筛选疾病标志物的方法，该方法包括利用免疫球蛋白关联蛋白质组鉴定疾病标志物的过程。具体包括：采用G蛋白交联琼脂糖微珠技术分离样本中的免疫球蛋白和结合蛋白；分离的蛋白质从磁珠上洗脱下来；然后将洗脱的蛋白质进行胰蛋白酶消化和脱盐；脱盐的肽样品通过无标记定量工作流程进行LC‑MS/MS分析。本发明从血清样品中定量评估了数百种免疫球蛋白结合蛋白，测出定一系列IgAP蛋白，可对不同健康状态的个体进行分类。

Description

利用免疫球蛋白关联蛋白质组开发疾病标志物的方法及装置

技术领域

本发明是关于一种开发疾病标志物的技术，具体而言，是一种利用免疫球蛋白关联蛋白质组开发疾病标志物特别是心血管疾病标志物的方法及装置。

背景技术

动脉粥样硬化是冠状动脉疾病(CAD)病理发展的基础，而冠状动脉疾病是最常见且威胁生命的心血管疾病。免疫活动和慢性炎症在动脉粥样硬化、CAD的发展以及不良的心率过快疾病(如急性心肌梗塞)的易感性中起着关键作用。在细胞水平上，动脉粥样硬化病变的特征在于低密度脂蛋白(LDL)的沉积，导致一系列炎症反应以及先天免疫细胞(例如单核细胞/巨噬细胞)和适应性免疫细胞(例如T和B细胞)连续反应。已知活化的T细胞可介导适应性免疫并释放调节动脉粥样硬化斑块生长、不稳定和破裂的细胞因子。除了广泛研究的T淋巴细胞外，越来越多的证据表明B细胞是适应性免疫的另一个重要分支，在动脉粥样硬化的病理生理中也起着重要作用[Tsiantoulas,D.,Diehl,C.J.,Witztum,J.L.,andBinder,C.J.(2014).B cells and 365humoral immunity in atherosclerosis.Circ Res114,1743-1756]。B细胞的主要功能是分泌与免疫原结合的免疫球蛋白并引发各种炎症反应。人类免疫球蛋白根据其可结晶片段(Fc)区分为A、D、E、G和M五个主要同种型。Ig同种型在动脉粥样硬化和CAD中有差异。例如，研究表明通过中和促炎因子，IgM具有抗动脉粥样硬化作用并清除凋亡细胞[Kyaw,T.,Tay,C.,Krishnamurthi,S.,Kanellakis,P.,Agrotis,A.,Tipping,P.,Bobik,A.,and Toh,B.H.(2011)；B1a B lymphocytes areatheroprotective by secreting natural IgM that increases IgM deposits andreduces necrotic cores in atherosclerotic lesions.Circ Res 109,830-840]。相反，血脂异常男性患者的血清IgA、IgE和IgG水平升高与心肌梗塞的高风险相关。然而，在动脉粥样硬化和CAD的发展中，不同Ig类的功能和机制仍然难以捉摸。免疫球蛋白的核心功能是与触发下游免疫级联反应的特定抗原结合。已经提出了越来越多的通过抗原刺激来诱导调节动脉粥样硬化的免疫反应。例如，动脉粥样硬化/CAD患者的低密度脂蛋白通常表现出大量的氧化特异性表位(OSE)，这些表位是由脂质部分的氧化修饰而产生的，已知这些脂质表位具有免疫原性。据报道IgM和IgG重新识别这种氧化的LDL(oxLDL)分子分别对动脉粥样硬化的进展具有保护或促进作用[Tsiantoulas,D.,Diehl,C.J.,Witztum,J.L.,and Binder,C.J.(2014).B cells and humoral immunity in atherosclerosis.Circ Res 114,1743-1756.]。此外，酪氨酸硝化是一种氧化性蛋白质的修饰，在动物和患者的动脉粥样硬化病变中经常观察到。汤普森等有报告说CAD患者有显著提高了针对具有硝基酪氨酸修饰的蛋白质的反应性免疫球蛋白的血浆水平[Thomson,L.,Tenopoulou,M.,Lightfoot,R.,Tsika,E.,Parastatidis,I.,Martinez,M.,Greco,T.M.,Doulias,P.T.,Wu,Y.,Tang,W.H.,et al.(2012).Immunoglobulins against tyrosine-nitrated epitopes in coronary arterydisease.Circulation 126,2392-2401.]。这些研究指出免疫球蛋白在识别动脉粥样硬化相关抗原决定簇和调节与CAD进展相关的免疫应答中的关键作用。CAD特异性免疫球蛋白和相关抗原的鉴定将有助于开发新型疾病监测生物标志物。但是，关于除免疫球蛋白识别的动脉粥样硬化表位之外的抗原身份的了解仍然很少。此外，关于免疫球蛋白的同源特征在不良心血管事件发生过程中是否以及如何演变的问题仍然难以捉摸。

急性心肌梗塞(AMI)是全世界最常见的死亡原因。对冠状动脉疾病(CAD)患者发生AMI的风险进行可靠的评估是降低死亡率和提高生活质量的关键。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种开发疾病标志物的方法。

本发明开发了一种开发疾病标志物的新方法，该方法采用了无标记定量质谱分析免疫球蛋白关联蛋白质组(IgAP)，即免疫球蛋白及其结合蛋白。然后，通过多变量分析流程对结果进行处理，以识别各种患者组之间的差异蛋白。

在本发明的具体实施方案中，采集个体血清，并使用G蛋白交联琼脂糖微珠技术分离免疫球蛋白和相关蛋白。分离的蛋白质通过2M尿素处理从磁珠上洗脱下来。然后将洗脱的蛋白质进行胰蛋白酶消化和脱盐。脱盐的肽样品通过无标记定量工作流程进行LC-MS/MS分析。在蛋白质的定量信息的下游计算分析中使用错误发现率(FDR)<0.05作为阈值。下游分析中，对数据依次进行归一化，插补缺失值和批量效应去除。结果通常包含300～400种蛋白质，应用无监督的层次聚类可将个体分为不同的类别。另外，进行差异表达分析以鉴定蛋白质列表，用作生物标志物以对不同患者组进行分类。差异的蛋白被用于下游的基因本体分析或网络分析，以研究蛋白-蛋白相互作用。此外，还构建了逻辑回归模型，该模型确定每种差异IgAP蛋白的系数，作为诊断CAD和AMI病例的生物标记。

从AMI与CAD组的差异蛋白中选取了log fold change最大的10个蛋白，分别是P55058,P06312,A0A0A0MT36,Q8WWA0,P01743,P12259,P09871,P00736,P00742,Q08211。其中P09871与P00736的共线性大于0.5(皮尔森相关系数)，因此从列表中去掉P09871。利用剩下的9个蛋白建立逻辑回归模型区分AMI和CAD。应用向后选择法剔除对回归方程影响不显著的变量，确定4个蛋白作为最优回归模型的自变量，分别是P55058、A0A0A0MT36、P00736、P00742。

该模型的性能使用独立的数据集评估验证。应用此工作流程，本发明对来自冠心病(CAD)，急性心肌梗塞(AMI)和非CAD/AMI对照患者(NCA)的血清样本进行了分析。本发明成功地确定了一组IgAP蛋白(P55058，A0A0A0MT36，P00736，P00742)，能够可靠地区分CAD患者和AMI患者。

从而，一方面，本发明提供了一种筛选疾病标志物的方法，该方法包括利用免疫球蛋白关联蛋白质组鉴定疾病标志物的过程。

根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选疾病标志物的方法，其包括：

采用无标记定量质谱分析免疫球蛋白关联蛋白质组(IgAP)；

通过多变量分析流程对结果进行处理，以识别各种患者组之间的差异蛋白。

根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选疾病标志物的方法，其包括：

采用G蛋白交联琼脂糖微珠技术分离样本中的免疫球蛋白和结合蛋白；

将分离的蛋白质从磁珠上洗脱下来；优选地，分离的蛋白质通过2M尿素处理从磁珠上洗脱下来；

将洗脱的蛋白质进行胰蛋白酶消化和脱盐，得到脱盐的肽样品；

将脱盐的肽样品进行无标记定量LC-MS/MS分析。

根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选疾病标志物的方法中，样本为血液样本。

根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选疾病标志物的方法，其还包括对无标记定量LC-MS/MS分析获得的蛋白质的定量信息进行下游分析，在蛋白质的定量信息的下游分析中使用错误发现率(FDR)<0.05作为阈值。

根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选疾病标志物的方法，下游分析中，对无标记定量LC-MS/MS分析获得的蛋白质的定量数据依次进行归一化，插补缺失值和批量效应去除。

根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选疾病标志物的方法，其还包括：

应用无监督的层次聚类将个体分为不同的类别；(该步骤可以鉴别不同类别的样本是否能分开；)

进行差异表达分析以鉴定蛋白质列表，用作生物标志物以对不同患者组进行分类；

将差异的蛋白用于下游的基因本体分析或网络分析，以研究蛋白-蛋白相互作用。

根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选疾病标志物的方法，其还包括：

构建回归模型，该模型确定每种差异IgAP蛋白的系数，作为诊断CAD和AMI病例的生物标记。

根据本发明的具体实施方案，本发明的筛选疾病标志物的方法中，模型的性能使用独立的数据集评估验证。

另一方面，本发明提供了一种筛选疾病标志物的装置，该装置包括用于实现本发明所述的筛选疾病标志物的检测试剂材料和/或仪器设备。

本发明所述的筛选疾病标志物的装置，可以是虚拟装置，只要能实现所述筛选方法的功能即可。具体而言，所述的筛选疾病标志物的装置可以包括检测单元和数据分析处理单元。所述的检测单元可以是包括各种检测试剂材料和/或检测仪器设备等，以对样品进行处理以分离纯化其中的免疫球蛋白关联蛋白质组，并进一步获得检测结果数据。所述的数据分析处理单元可以是任何可以实现对检测单元的检测结果数据进行分析处理而筛选出生物标志物作为分析结果的运算仪器、模块或是虚拟设备。

另一方面，本发明还提供了一种IgAP蛋白作为疾病标志物的应用，其中所述疾病标志物是按照本发明的筛选疾病标志物的方法筛选确定的。具体地，所述IgAP蛋白作为疾病标志物的应用可以是通过检测所述IgAP蛋白以诊断个体是否罹患相关疾病或评估个体罹患相关疾病风险，即，本发明提供了检测来自待测个体的样本中所述IgAP蛋白的试剂在制备诊断个体是否罹患相关疾病和/或评估个体罹患相关疾病风险的检测系统中的应用。

在本发明的一具体实施例中，本发明筛选出的IgAP蛋白包括P55058、A0A0A0MT36、P00736和P00742。这组蛋白可应用于作为区分CAD患者和AMI患者的标志物。

本发明相对于市场上现有技术/产品的优势：

在当前的临床测试中，免疫测定法分析血液样品时通常一次检测一个靶标。基于质谱的血液蛋白质组学高通量分析受制于蛋白质浓度高动态范围。创新的优势之一是专注于免疫球蛋白结合蛋白，与全血/血清蛋白组相比复杂度大大降低。另外，免疫球蛋白是用于识别异常组分的B细胞来源的抗体分子。通过对免疫球蛋白差异识别的异常蛋白质进行定量分析，我们的新流程可以寻找新型生物标志物，并可以扩展以大范围用于生物医学领域。

附图说明

图1为IgAP分析流程图。

图2显示被调查者IgAP蛋白水平图示为所有被调查者分离出的IgAP蛋白的含量，单位为log2转换后的峰强度。误差棒表示标准差(SD)。

图3为IgAP蛋白的种类。饼图展示了由IgAP定量法得到的301种IgAP蛋白的不同类别，包括了97种免疫球蛋白(占32.2％)以及204种非免疫球蛋白(占67.8％)。

图4A-图4D为显示IgG亚型在患者群体中的差异表达图。

图5为IgAP分析将AMIA患者与CAD患者区分图。

图6A-图6F为患者组间IgAP蛋白的差异富集图。

图7A-图7D为P55058、A0A0A0MT36、P00736和P00742作为区分CAD患者和AMI患者的标志物的ROC分析。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

以下试验及实施例中未详细注明的方法，按照所属领域中的常规操作条件或仪器厂商的说明书建议的条件进行。

各实施例中所用主要试验材料与方法如下：

1.1 试剂与材料

蛋白质G琼脂糖，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的琼脂糖，固定的胃蛋白酶树脂和Zeba旋转柱购自Pierce(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL)。从以下获得不完全弗氏佐剂(IFA)，TRIS氢氯化物(Tris-HCl)，碳酸氢铵(NH₄HCO₃)，2,2,2-三氟乙醇(TFE)，二硫代三甲苯(DTT)，碘乙酰胺(IAM)和碘乙醇(IE)Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)。尿素和AG-5O1-X8树脂购自Bio-Rad(加利福尼亚州赫尔克里士)。LC-MS/MS样品制备中使用了Millipore(Bedford，MA)的Microcon 10kDa MWCO(Microcon-10)离心过滤器柱和ThermoScientific(IL.Rockford)的Hypersep SpinTip C18柱(C18-SpinTips)-MS级水，乙腈(ACN)和EMD(马萨诸塞州比勒里卡)的甲酸。Pierce^TMC18吸头，来自Thermo Scientific(Rockford，IL)的10μL床。

1.2 临床样本

经伦理批准，由中国人民解放军总医院(301)医院心血管科提供血清样本。IgAP调查包括一组CAD(n＝21)，AMI(n＝37)和非CAD/AMI对照个体(n＝37)。F10的ELISA分析包括一个独立的CAD队列(n＝38)，AMI(n＝25)和健康对照组(n＝30)。实验之前，将血清以等分试样的聚乙烯管保存在-80℃下直至使用。

1.3 IgAP分离

为了分离IgAP，将20μL血清用500μL磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释，并与10μLProtein G琼脂糖珠(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)于4℃孵育3小时。洗涤后，将磁珠重悬于20μL 50mM中Tris-HCl(pH 8.0)并在处理前于4℃储存。

1.4 珠粒消化和脱盐

将小珠重悬于50μL缓冲液I(50mM Tris-HCl pH 8.0；2M尿素；10μg/ml测序级胰蛋白酶；1mM DTT)中，并在30摄氏度的热混合器中以400rpm孵育1小时。保存上清液后，将小珠用25μL缓冲液II(50mM Tris-HCl pH 8.0、2M尿素，5mM碘乙酰胺)洗涤两次，并将上清液合并在一起，避光。在另外添加250ng的胰蛋白酶之后，在30℃下在热混合器中以400rpm继续反应过夜。第二天，以1:25的v：v比例将10％的甲酸添加到反应中以终止消化。然后按照制造商的规程使用C18吸头将样品脱盐。真空干燥获得的肽，重新溶解在12μL的0.1％甲酸中，并保存在-20℃。

1.5 LC-MS/MS与蛋白质组分析

所有LC-MS/MS分析均通过Easy-nLC 1200系统和Q Exactive HF(ThermoScientific)进行。对于每个样品，注入6μL肽混合物，并以250nL/min的流速在反相C18柱(75μm×15cm)上分离。使用流动相A(超纯水中的0.1％甲酸)和流动相B(超纯水中的0.1％甲酸/80％乙腈)在50分钟内建立7-25％流动相B的线性梯度。电喷雾的电离电压设定为2.3kV。质谱仪在正离子模式下以120000的分辨率运行，MS离子谱为m/z＝350-1800，使用3×10⁶的自动增益控制(AGC)靶标。高能碰撞解离(HCD)碎片用归一化碰撞能量27的前12个最强离子进行了质谱分析。MS/MS谱图的AGC目标为1×10⁵，分辨率为30000。动态排除时间设置为30秒。使用XCalibur4.0.27(Thermo Scientific)软件获取原始数据，并使用Sequest HT将这些数据用Proteome Discoverer(PD)软件套件2.2(Thermo Scientific)针对UniProt人类refseq数据库进行处理。前体和碎片的质量公差分别设置为10ppm和0.02Da。最多允许两个丢失的胰蛋白酶切割位点。修改选项被设置为包括碳酰胺基甲基化(C)作为静态基团，以及氧化(M)和乙酰基(N端)作为动态模板。使用Percolator算法确定肽谱匹配和肽鉴定的错误发现率(FDR)，并将阈值基于q值设置为1％。使用ProteomeDiscoverer 2.2.21进行蛋白质的无标记定量，其中应用Minora特征比对和特征映射来计算MS1扫描中肽的丰度。

1.6 数据处理

从检测到的蛋白质中去除检测下限(1000个离子谱计数)以外的>50％(47)测量值的蛋白质，保留的蛋白质用于后续处理。将离子谱计数中的蛋白质数据进行log2转换。使用R包“sva”(sva：替代变量分析)，使用ComBat(使用经验贝叶斯方法调整微阵列表达数据中的批次效应)对2个实验批次进行批次效应校正。随后将Z分数归一化应用于所有样本，以消除其他偏差。

1.7 差异表达蛋白的命名

在CAD和AMI，AMI和NCA，CAD和NCA之间使用R包“limma”(用于RNA测序和微阵列研究的limma powers差异表达分析)(Limma：微阵列数据的线性模型)进行差异表达的蛋白质分析。统计显著性由Benjamini-Hochberg调整(或BH调整)的P<0.05和log2倍数变化>1(称为差异蛋白)确定。

1.8 基因集合富集分析

为了获得不同组中不同生物过程的概况，通过R包“HTSanalyzeR2”进行100,000次重复的基因集富集分析。(HTSanalyzeR2[https://github.com/CityUHK-CompBio/HTSanalyzeR2])。

1.9 生物标志物鉴定

进行受试者工作特征(ROC)曲线以评估将AMI与CAD区别开来时AMI-CAD的所有上调蛋白。(pROC：R和S+的开源软件包，用于分析和比较ROC曲线)选择曲线下面积(AUC)值最高的10种蛋白质作为生物标志物候选物。从候选物中删除Pearson相关性大于0.5的蛋白质，以最大程度地减少共线性的影响并减少冗余。然后采用逻辑回归模型和后向消除方法，找出区分AMI和CAD的最重要候选者。由这4个最重要的候选者组成的小组进行了1,000次迭代的5倍交叉验证，以计算其从CAD预测AMI时的估计AUC。

1.10 IgAP中F10的ELISA分析

分离IgAP后，将G蛋白珠重悬于50μL洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl，pH＝3.0)中，并在4℃下孵育5分钟。然后将反应物用1M Tris-HCl(pH 11)滴定至pH 7，并离心收集上清液，其上清液浓度通过Bradford分析确定。按照制造商的规程，使用ELISA试剂盒确定洗脱的IgAP中F10的浓度，并标准化为输入蛋白的量。

1.11 数据分析

使用R包“ggpubr”执行了两尾wilcoxon测试(*P<0.05，**P<0.01，***P<＝0.001，****P<＝0.0001)。(ggpub[https：//github.com/kassambara/ggpubr])。

实施例1、免疫球蛋白相关蛋白质组(IgAP)的定量分析

将来自38位AMI患者，20位稳定的CAD患者以及37位被诊断患有非CAD/AMI(NCA)疾病的个体的血清样本组成一个发现队列。表1总结了CAD和AMI患者的临床特征。

表1、MS数据集的人口统计学特征

*±表示标准误(SE)。/表示数据空缺。

为了研究免疫球蛋白相关蛋白质组(IgAP)，本实施例采用了一种IgAP分析方法，该方法将免疫球蛋白复合物的纯化与无标记的定量LC-MS/MS集成在一起，如图1所示，该方法包括：

按照前述“1.3IgAP分离”中记载的操作，利用Protein G磁珠从每个个体的20μL血清中分离纯化了带有G蛋白琼脂糖珠的免疫球蛋白关联蛋白质组；

按照前述“1.4珠粒消化和脱盐”中记载的操作，将分离的蛋白质从磁珠上洗脱后进行胰蛋白酶消化并脱盐，得到脱盐的肽混合物样品；

按照前述“1.5LC-MS/MS与蛋白质组分析”中记载的操作，对脱盐的肽混合物样品采用无标记定量LC-MS/MS分析。分析获得的原始数据使用Sequest HT处理时，前体和碎片的质量公差分别设置为10ppm和0.02Da；最多允许两个丢失的胰蛋白酶切割位点；修改选项被设置为包括碳酰胺基甲基化(C)作为静态基团，以及氧化(M)和乙酰基(N端)作为动态模板。使用Percolator算法确定肽谱匹配和肽鉴定的错误发现率(FDR)，并将阈值基于q值设置为1％。使用Proteome Discoverer 2.2.21进行蛋白质的无标记定量，其中应用Minora特征比对和特征映射来计算MS1扫描中肽的丰度。

本实施例中，检查了IgAP蛋白的平均丰度，并观察到个体之间没有明显的波动，表明具有良好的技术可重复性(图2)。

本实施例中，测定了95个血浆样品，共检测到434种蛋白质。之后按照前述“1.6数据处理”中记载的操作，去除了检测下限(1000个离子谱计数)以外的>50％(47)测量值的133种蛋白质。本实施例中，经过数据处理和批次效应去除后保留的301种蛋白质的定量信息数据用于下游分析。

图3显示了本实施例中由IgAP定量法得到的301种IgAP蛋白的不同类别。在301种IgAP蛋白中，有97种是免疫球蛋白(占32.2％)，包括来自不同轻链和重链的恒定区和可变区，并通过其独特的肽段进行鉴定。在人免疫球蛋白中，已知蛋白G仅与IgG的Fc区具有高亲和力结合亚型。但是，蛋白G确实对免疫球蛋白的Fab区具有亲和力，这可能解释了IgAP中其他人免疫球蛋白亚型的存在。备选地，结合IgG的免疫原也可以被其他免疫球蛋白亚型识别，其被蛋白G以复合物的形式下拉。

图4A-图4D显示了本实施例还跨不同患者组的IgAP的不同IgG亚型的丰度。虽然未观察到IgG3水平的显着差异(图4C)，但AMI和CAD组的富集IgG4水平均高于NCA个体(图4D)。CAD组中IgG2的水平明显高于AMI和NCA组(图4B)。相反，与AMI和NCA组相比，CAD个体中IgG1的水平较低(图4A)。IgG亚型的这种差异富集表明AMI、CAD和NCA患者中免疫球蛋白的效应器反应复杂，这与B细胞免疫在动脉粥样硬化和CAD形成中的重要性日益显现。

实施例2、通过IgAP区分AMI患者的CAD

本发明使用无监督的层次聚类分析评估了IgAP配置文件是否可以区分AMI、CAD和NCA个体。结果，将95个患者样本分为四个主要类，分别将其命名为类I至IV(图5)。CAD个体在第IV组中聚集良好，并与AMI病例完全分离，而AMI病例分别分布在第II组(21例)和III组(16例)。CAD组与AMI患者的完全分离表明，CAD和AMI患者的IgAP配置文件之间存在很大差异。至于NCA样本，虽然群集I仅包含18个NCA样本，但是群集II，III和IV分别包含10、5和4个NCA样本(图5)。NCA患者由于不同的原因而来诊所，因此其独特的聚集可能是由于独立于CAD/AMI的不确定的临床特征所致。

实施例3、患者群体中IgAP蛋白的差异富集

患者组之间IgAP蛋白的差异富集从AMI样品中完全分离CAD表明，存在IgAP蛋白可以区分有和没有心肌梗塞的动脉粥样硬化患者。因此，本发明进行了IgAP蛋白之间的成对比较。三个病人组。将所有AMI患者与CAD患者进行比较，发现了17种IgAP蛋白在AMI患者中显着升高(图6A-图6B)。这些AMI升高的IgAP的基因本体论(GO)分析确定了补体和凝血级联途径(FDR＝1.24×10^-6)的富集，其中不同的补体(C1s和C1r)和凝血因子(F10和F5)代表蛋白质(图6A-图6B)。AMI患者的IgAP中免疫球蛋白的几个可变区(IGKV6D-21，IGHV1-69，IGKV1-12，IGHV1-46)也升高。该结果表明，免疫球蛋白在CAD-AMI发展过程中介导针对凝血途径组分的炎症反应。此外，AMI和NCA患者之间IgAP蛋白的成对比较得出AMI患者中22种蛋白质的富集度更高(图6C、图6D)。类似于AMI-CAD的区别，GO项分析中最富集的途径是补体和凝血级联反应(FDR＝1.79×10^-5)。这进一步支持了AMI患者对凝血途径的免疫球蛋白反应增强。接下来，本发明比较了CAD患者与所有NCA患者之间的IgAP蛋白，并揭示了34种CAD患者中的IgAP蛋白含量更高(图6E、图6F)。经过GO项分析后，最丰富的三个途径是补体和凝血级联，胆固醇代谢和血小板活化。该结果表明，CAD患者的免疫球蛋白从这些复杂的动脉粥样硬化相关通路中识别出异常成分。与此相一致，对蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)的分析揭示了来自上述途径的蛋白质的高度连接网络，包括各种纤维蛋白原和载脂蛋白。富含CAD的IgAP蛋白包括载脂蛋白C的所有四个亚型(Apo-CI，II，III和IV)和Apo-AII。据报道，主要由Apo-B构成的针对氧化的LDL的免疫球蛋白(主要是IgG)可以在任何个体中被检测到，并且已经对其与CAD和心血管事件的关联进行了广泛的研究。与Apo-B相反，Apo-C主要分布在富含甘油三酸酯的乳糜微粒和VLDL的表面，而Apo-A2是HDL中的丰富蛋白质。这些载脂蛋白在CAD的IgAP中的富集表明，动脉粥样硬化涉及异常部分，在各种脂蛋白颗粒中都可以被免疫球蛋白系统识别。

本实施例中，筛选出的IgAP蛋白包括P55058、A0A0A0MT36、P00736和P00742。本发明进行了受试者工作特征曲线(ROC)分析，通过改变模型阈值(预测正负的分界点)，得到不同的特异性和灵敏度，将其绘制在横坐标为1-特异性，纵坐标为灵敏度的坐标系中，得到的一系列点连成的曲线即为应用其曲线下面积(AUC)用以衡量模型分类准确性的高低。ROC分析(图7A～7D)显示这组蛋白具有高度的特异性和灵敏度(其中，P55058的AUC为0.776、A0A0A0MT36的AUC为0.809、P00736的AUC为0.878、P00742的AUC为0.883，AUC介于0.776～0.883)，可应用于作为区分CAD患者和AMI患者的标志物。

Claims (1)

1.检测来自待测个体的样本中免疫球蛋白关联蛋白质组的试剂在制备诊断个体是否罹患相关疾病和/或评估个体罹患相关疾病风险的检测系统中的应用，所述的免疫球蛋白关联蛋白质组包括P55058、A0A0A0MT36、P00736和P00742，所述的检测系统用于区分CAD患者和AMI患者。