CN114107164B - 一种用于无血清下细胞贴壁生长的表面的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及表面处理技术领域，提供一种用于无血清下细胞贴壁生长的表面的制备方法。通过超声波雾化对培养皿表面进行涂覆以及等离子体聚合得到聚丙烯酸‑脯氨酸复合涂层，水接触角小于10°，其中脯氨酸起到增大丙烯酸单体接枝量的作用，亲水性能更优异，且生物相容性好，能够满足无血清下的细胞贴壁培养需求。聚丙烯酸‑脯氨酸复合涂层与表面的结合牢固，亲水性能有效时间长，能达到一年以上，可显著提升培养器皿的保质期。另外，采用超声波雾化喷涂机进行单体的涂覆，培养器皿表面的单体浓度分布均匀，通过等离子体聚合反应合成的聚丙烯酸‑脯氨酸复合涂层均匀度高，且在等离子体作用下的固化过程不起泡。
Description
技术领域
本发明涉及表面处理技术领域，特别是涉及一种用于无血清下细胞贴壁生长的表面的制备方法。
背景技术
细胞培养作为细胞生物学研究方法中的重要和常用技术，指的是细胞在体外条件下的生长，且在培养过程中细胞不再形成组织。根据细胞类型来划分，细胞培养可以分为悬浮细胞培养和贴壁细胞培养两类。对于贴壁细胞培养而言，需要培养表面具有一定的亲水性。但常用的培养器皿材料聚苯乙烯是一种疏水性材料，因此需要对基材表面进行亲水改性，以实现细胞的贴附生长。目前常见的表面处理方法有两种，一是用聚-D-赖氨酸或胶原蛋白包被培养表面，另一种则是利用电晕放电和真空等离子体处理等表面改性技术(Tissue culturetreated，简称为TC处理)。
真空等离子体处理能将聚苯乙烯表面由疏水性转化为亲水性，可满足大多数细胞的贴壁培养需求。但该技术在高端细胞培养领域仍存在不少短板。例如无血清下的细胞培养，对体外培养的表面亲水性要求极高，常规的表面改性技术无法满足此类细胞贴壁的要求。传统方法是在培养表面涂覆粘连蛋白或表面活性因子，但由于胶原蛋白来源于动物，其高昂的成本限制了涂覆有粘连蛋白的培养器皿的大规模生产。另一方面，真空等离子体处理所引入的含氧官能团与表面的结合并不牢固。随着存放时间的延长，表面的含氧官能团易发生脱离，从而使接触角增大，其亲水性能有效时间通常仅为半年。这也无疑会影响到细胞培养器皿的保质期。CN104788707A公开了一种等离子体接枝工艺，来提升培养表面的亲水效果和有效时间。通过喷雾引入丙烯酸单体，在Ar和O2混合气体中进行等离子体处理，使聚苯乙烯基层的表面接枝丙烯酸单体，形成超亲水细胞生长表面。但在实际的工艺操作中，仍然容易出现接枝单体分布不均匀、聚苯乙烯基底的透明性较差等问题，且在无血清下的细胞贴壁培养效果仍待测试。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种用于无血清下细胞贴壁生长的表面的制备方法，解决表面超亲水涂层不均匀易导致涂层在等离子体作用下的固化过程发生起泡现象，生物相容性好，满足无血清下的细胞贴壁培养需求的同时降低大规模生产的成本。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于无血清下细胞贴壁生长的表面的制备方法，包括如下步骤：
1)等离子体清洗处理：将培养器皿置于等离子体腔体中进行预处理；
先将腔体抽至真空，利用腔体内的稀薄空气进行放电处理。在放电过程中通入低质量流量的空气，并始终开启真空泵，将腔体压力保持在一定范围内。该步骤的目的是去除培养器皿表面的脱模剂和碳氢化合物，使表面粗糙化并引入含氧官能团，提升表面的亲水性。
优选的，等离子体清洗的工作参数为：真空度5-15Pa，等离子体功率10-100W，射频频率13.56MHz，空气流量10sccm-100sccm，处理时间2-10min。
2)超声波雾化工艺涂覆丙烯酸与L-脯氨酸的混合溶液：将步骤1)处理后的培养器皿从等离子体腔体中取出，置于超声波雾化喷涂机中，将一定浓度的丙烯酸水溶液与L-脯氨酸的混合溶液通过超声雾化的方式均匀地涂覆在培养器皿表面；
这种超声雾化的方式可以形成尺寸10-40μm的液滴，均匀地涂覆在培养器皿表面，之后进行自然干燥，可避免由液滴在表面产生的斑点痕迹。
优选的，丙烯酸单体水溶液浓度20％-50％，L-脯氨酸纯度99％，丙烯酸水溶液与L-脯氨酸混合的质量比例为2:1～5:1。
优选的，超声雾化工艺参数为：超声频率50-120kHz，喷涂距离20-30cm，喷涂流量10-50mL/min，自然干燥时间10-30min。
3)等离子体聚合制备超亲水涂层：将步骤2)涂布后的培养器皿重新置于等离子体腔体中，抽真空后进行等离子体聚合，最终形成聚丙烯酸-脯氨酸复合涂层。
培养器皿表面的丙烯酸单体会在等离子体作用下发生聚合反应，从而在表面形成致密、结合力好的聚丙烯酸-脯氨酸复合涂层，其中脯氨酸起到增大丙烯酸单体接枝量的作用。
优选的，等离子体聚合的工艺参数为：真空度5-15Pa，等离子体功率30-100W，射频频率13.56MHz，空气流量10sccm-100sccm，时间5-10min。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明中的等离子体清洗和聚合反应过程在通入少量空气的条件下即可进行，代替了Ar、O2等气体的使用，可有效降低大规模生产下的气体成本。
(2)聚丙烯酸-脯氨酸复合涂层的水接触角小于10°，其中脯氨酸起到增大丙烯酸单体接枝量的作用，具有比脯氨酸涂层或聚丙烯酸涂层更优异的亲水性能，且生物相容性好，能够满足无血清下的细胞贴壁培养需求。
(3)聚丙烯酸-脯氨酸复合涂层与表面的结合牢固，亲水性能有效时间长，能达到一年以上，可显著提升培养器皿的保质期。
(4)采用超声波雾化喷涂机进行单体的涂覆，培养器皿表面的单体浓度分布均匀，通过等离子体聚合反应合成的聚丙烯酸-脯氨酸复合涂层均匀度高，且在等离子体作用下的固化过程不起泡。
附图说明
图1：表面的接触角对比图，其中图1A、图1B和图1C分别表示未处理、真空等离子体处理和实施例1涂覆聚丙烯酸-脯氨酸复合涂层表面的接触角图；
图2：实施例1所得聚丙烯酸-脯氨酸复合涂层表面的老化测试结果图；
图3：表面的24h细胞培养测试效果对比图，图3A、图3B和图3C分别为未处理、真空等离子体处理和实施例1涂覆聚丙烯酸-脯氨酸复合涂层表面的培养皿24h细胞培养测试效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
(1)等离子体清洗处理：将培养器皿置于等离子体腔体后，抽真空至真空度为5Pa。开始在等离子体功率50W，射频频率13.56MHz，空气流量50sccm的条件下，对聚苯乙烯基材进行等离子体放电处理，处理时间3min。该步骤可去除培养器皿表面的脱模剂和碳氢化合物，使表面粗糙化并引入含氧官能团，提升表面的亲水性。
(2)超声波雾化工艺涂覆丙烯酸与L-脯氨酸的混合溶液：将步骤(1)处理后的培养器皿从等离子体腔体中取出，置于超声波雾化喷涂机中。将浓度为30％的丙烯酸水溶液和纯度99％的L-脯氨酸以2：1的质量比混合，混合后的溶液以50mL/min的喷涂流量，经超声雾化后均匀地涂覆在基材表面。所选超声频率为100kHz，喷涂距离30cm。进行10min的自然干燥后得到无液滴、单体分布均匀的培养器皿表面。
(3)等离子体聚合制备超亲水涂层：将步骤(2)涂布后的培养器皿重新置于等离子体腔体中，抽真空至真空度为5Pa。随后在等离子体功率40W，射频频率13.56MHz，空气流量50sccm的条件下，开始进行5min的等离子体聚合沉积过程。培养器皿表面的丙烯酸单体会在等离子体作用下发生聚合反应，脯氨酸则起到增大丙烯酸单体接枝量的作用，从而得到形成致密、结合力好的超亲水涂层。所述涂层的成分为聚丙烯酸-脯氨酸，水接触角小于10°，达到超亲水效果，经美标ASTM G154的老化测试结果表明亲水有效时间长于1年。经本发明的方法处理后的培养器皿表面适合用于无血清条件下的细胞贴壁培养。
对实施例1所得表面的接触角和老化测试的结果分析
如图1所示，未处理的聚苯乙烯基材表面是疏水的，接触角大于90°；经过第一步等离子体清洗处理后的接触角降至40°左右，而通过等离子体聚合沉积制备的聚丙烯酸-脯氨酸复合涂层的接触角可降至10°以下，达到超亲水效果。显然，同真空等离子体处理技术相比，本发明的超亲水涂层制备方法能够进一步降低基材表面的接触角，提高其亲水性能。
基于美标ASTM G154对本发明制备的聚丙烯酸-脯氨酸复合涂层进行了老化测试。本测试30min的测试结果对应1.76个月佛罗里达户外暴晒所吸收的紫外能量，3小时的UVA灯辐照能模拟培养皿1年的日常使用。如图2所示，结果显示在经过3小时的辐照后，表面能仍能达到60mN/m，表明培养皿的亲水性能未发生衰退，该涂层的亲水性能有效时间长于1年。
图3显示为未处理、真空等离子体处理和涂覆聚丙烯酸-脯氨酸复合涂层的培养皿，接种半贴壁细胞293t培养24h后的细胞观察照片。与真空等离子体处理的培养效果相比，涂覆聚丙烯酸-脯氨酸复合涂层后的细胞增殖能力与贴壁效果显著提升。
实施例2
(1)等离子体清洗处理：将培养器皿置于等离子体腔体后，抽真空至真空度为15Pa。开始在等离子体功率80W，射频频率13.56MHz，空气流量50sccm的条件下，对聚苯乙烯基材进行等离子体放电处理，处理时间6min。该步骤可去除培养器皿表面的脱模剂和碳氢化合物，使表面粗糙化并引入含氧官能团，提升表面的亲水性。
(2)超声波雾化工艺涂覆丙烯酸与L-脯氨酸的混合溶液：将步骤(1)处理后的培养器皿从等离子体腔体中取出，置于超声波雾化喷涂机中。将浓度为20％的丙烯酸水溶液和纯度99％的L-脯氨酸以4：1的质量比混合，混合后的溶液以50mL/min的喷涂流量，经超声雾化后均匀地涂覆在基材表面。所选超声频率为100kHz，喷涂距离20cm。进行20min的自然干燥后得到无液滴、单体分布均匀的培养器皿表面。
(3)等离子体聚合制备超亲水涂层：将步骤(2)涂布后的培养器皿重新置于等离子体腔体中，抽真空至真空度为5Pa。随后在等离子体功率40W，射频频率13.56MHz，空气流量50sccm的条件下，开始进行5min的等离子体聚合沉积过程。培养器皿表面的丙烯酸单体会在等离子体作用下发生聚合反应，脯氨酸则起到增大丙烯酸单体接枝量的作用，从而得到形成致密、结合力好的超亲水涂层。所述涂层的成分为聚丙烯酸-脯氨酸，水接触角小于10°，达到超亲水效果，经美标ASTM G154的老化测试结果表明亲水有效时间长于1年。经本发明的方法处理后的培养器皿表面适合用于无血清条件下的细胞贴壁培养。
实施例3
(1)等离子体清洗处理：将培养器皿置于等离子体腔体后，抽真空至真空度为8Pa。开始在等离子体功率100W，射频频率13.56MHz，空气流量10sccm的条件下，对聚苯乙烯基材进行等离子体放电处理，处理时间10min。该步骤可去除培养器皿表面的脱模剂和碳氢化合物，使表面粗糙化并引入含氧官能团，提升表面的亲水性。
(2)超声波雾化工艺涂覆丙烯酸与L-脯氨酸的混合溶液：将步骤(1)处理后的培养器皿从等离子体腔体中取出，置于超声波雾化喷涂机中。将浓度为50％的丙烯酸水溶液和纯度99％的L-脯氨酸以5：1的质量比混合，混合后的溶液以30mL/min的喷涂流量，经超声雾化后均匀地涂覆在基材表面。所选超声频率为50kHz，喷涂距离25cm。进行10min的自然干燥后得到无液滴、单体分布均匀的培养器皿表面。
(3)等离子体聚合制备超亲水涂层：将步骤(2)涂布后的培养器皿重新置于等离子体腔体中，抽真空至真空度为15Pa。随后在等离子体功率30W，射频频率13.56MHz，空气流量10sccm的条件下，开始进行10min的等离子体聚合沉积过程。培养器皿表面的丙烯酸单体会在等离子体作用下发生聚合反应，脯氨酸则起到增大丙烯酸单体接枝量的作用，从而得到形成致密、结合力好的超亲水涂层。所述涂层的成分为聚丙烯酸-脯氨酸，水接触角小于10°，达到超亲水效果，经美标ASTM G154的老化测试结果表明亲水有效时间长于1年。经本发明的方法处理后的培养器皿表面适合用于无血清条件下的细胞贴壁培养。
实施例4
(1)等离子体清洗处理：将培养器皿置于等离子体腔体后，抽真空至真空度为12Pa。开始在等离子体功率10W，射频频率13.56MHz，空气流量100sccm的条件下，对聚苯乙烯基材进行等离子体放电处理，处理时间2min。该步骤可去除培养器皿表面的脱模剂和碳氢化合物，使表面粗糙化并引入含氧官能团，提升表面的亲水性。
(2)超声波雾化工艺涂覆丙烯酸与L-脯氨酸的混合溶液：将步骤(1)处理后的培养器皿从等离子体腔体中取出，置于超声波雾化喷涂机中。将浓度为50％的丙烯酸水溶液和纯度99％的L-脯氨酸以3：1的质量比混合，混合后的溶液以10mL/min的喷涂流量，经超声雾化后均匀地涂覆在基材表面。所选超声频率为120kHz，喷涂距离25cm。进行30min的自然干燥后得到无液滴、单体分布均匀的培养器皿表面。
(3)等离子体聚合制备超亲水涂层：将步骤(2)涂布后的培养器皿重新置于等离子体腔体中，抽真空至真空度为10Pa。随后在等离子体功率100W，射频频率13.56MHz，空气流量100sccm的条件下，开始进行7min的等离子体聚合沉积过程。培养器皿表面的丙烯酸单体会在等离子体作用下发生聚合反应，脯氨酸则起到增大丙烯酸单体接枝量的作用，从而得到形成致密、结合力好的超亲水涂层。所述涂层的成分为聚丙烯酸-脯氨酸，水接触角小于10°，达到超亲水效果，经美标ASTM G154的老化测试结果表明亲水有效时间长于1年。经本发明的方法处理后的培养器皿表面适合用于无血清条件下的细胞贴壁培养。
Claims (4)
1.一种用于无血清下细胞贴壁生长的表面的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)等离子体清洗处理：将培养器皿置于等离子体腔体中进行预处理；
2)超声波雾化工艺涂覆丙烯酸与L-脯氨酸的混合溶液：将步骤1)处理后的培养器皿从等离子体腔体中取出，置于超声波雾化喷涂机中，将一定浓度的丙烯酸水溶液与L-脯氨酸的混合溶液通过超声雾化的方式均匀地涂覆在培养器皿表面；
3)等离子体聚合制备超亲水涂层：将步骤2)涂布后的培养器皿重新置于等离子体腔体中，抽真空后进行等离子体聚合，最终形成聚丙烯酸-脯氨酸复合涂层；
步骤2)中丙烯酸单体水溶液浓度20％-50％，L-脯氨酸纯度99％，丙烯酸水溶液与L-脯氨酸混合的质量比例为2:1～5:1；
步骤2)中超声雾化工艺参数为：超声频率50-120kHz，喷涂距离20-30cm，喷涂流量10-50mL/min，自然干燥时间10-30min；
步骤3)中等离子体的工作参数为：真空度5-15Pa，等离子体功率30-100W，射频频率13.56MHz，时间5-10min；
所述培养器皿材质为聚苯乙烯。
2.根据权利要求1所述的用于无血清下细胞贴壁生长的表面的制备方法，其特征在于，步骤1)放电过程中通入空气，空气流量10sccm-100sccm。
3.根据权利要求1所述的用于无血清下细胞贴壁生长的表面的制备方法，其特征在于，步骤1)等离子体的工作参数为：真空度5-15Pa，等离子体功率10-100W，射频频率13.56MHz，处理时间2-10min。
4.根据权利要求1所述的用于无血清下细胞贴壁生长的表面的制备方法，其特征在于，步骤3)等离子体聚合过程中通入空气，空气流量10sccm-100sccm。
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