CN114106329A - 一种用于纳米孔基因测序的磷脂双层膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种由带有烯基的磷脂单体和带有巯基的磷脂单体自组装而成的磷脂双层膜，可进一步通过点击化学反应使得成膜后的磷脂单体原位聚合，并成功镶嵌跨膜蛋白形成纳米孔，大幅提高磷脂双层膜的稳定性和使用寿命，具有非常好的应用于纳米孔基因测序的潜力，有利于更加准确、稳定地进行基因测序工作。

Description

一种用于纳米孔基因测序的磷脂双层膜及其制备方法

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种用于纳米孔基因测序的磷脂双层膜及其制备方法。

背景技术

近年来，伴随着“精准医疗”概念的提出，基因测序技术得到飞速发展，逐渐成为临床诊断和研究的热点。从第一代双脱氧链测序技术到如今第四代固态纳米测序技术，基因测序的迅速发展为人们带来了大量准确的基因组信息，帮助人们认识到基因变异与疾病发生之间的关系，因此，基因测序技术有望在疾病的临床诊断与治疗领域得到广泛应用。

前三代基因测序技术都是利用昂贵的光学检测系统捕获光信号得到测序结果，并且需要通过DNA聚合酶以读取待测样品碱基序列，以上因素导致前三代基因测序技术价格昂贵，难以普及。因此，开发不依赖生物化学试剂就能直接读取基因序列的新型测序方法成为第四代基因测序技术的主要思想。

如今普遍认可的第四代基因测序技术又称纳米孔测序技术，其原理是构建直径在1～100nm的纳米孔结构，基因序列通过纳米孔时，由于A、T、G、C四种碱基存在电荷差异，因此会产生不同的电流信号，通过检测电流信号的变化便能鉴定出通过纳米孔的碱基序列。现有报道的纳米孔包括生物纳米孔、固态纳米孔以及上述两种相结合的杂化纳米孔。生物纳米孔是当将跨膜蛋白(如溶血素蛋白)嵌入脂质双分子层中从而形成纳米孔通道，固态纳米孔则是通过工业加工硅基材料、SiN_x等人为构造出纳米尺寸的孔结构。相比于固态纳米孔和杂化纳米孔，生物纳米孔具有精确和高度重现的纳米孔尺寸和结构，这是通过现有加工技术制备的固态、杂化纳米孔仍较难复制的，而且，生物纳米孔还易于通过基因工程技术进行修饰，调控纳米孔的物理化学性质。

但是，对于生物纳米孔而言，负责镶嵌跨膜蛋白的磷脂双层膜稳定性往往较差，因而容易产生电流信号噪音，严重影响测序的准确率和工作稳定性。因此，如何有效提高磷脂双层膜的稳定性成为如今基因测序技术发展中需要攻克的一大技术壁垒。

发明人在之前的研究(CN113416344A)中，采用二硬脂酰磷脂酰胆碱和疏水烷基链端带有碳碳双键的磷脂酰胆碱混合并引发交联，得到一种新型磷脂双层膜，可镶嵌跨膜蛋白构成生物纳米孔；然而，即使在可以形成交联结构的含碳碳双键的磷脂酰胆碱用量高达不可交联的二硬脂酰磷脂酰胆碱的6倍的情况下，双层膜的寿命也仅能达到101h，说明该双层膜的稳定性仍有待进一步提升。

因此，提供一种稳定性优异，不影响跨膜蛋白的嵌入和功能的新型磷脂双层膜，仍具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定性优异，且不影响跨膜蛋白的嵌入和功能的新型磷脂双层膜。

本发明提供了一种磷脂双层膜，它由带有烯基的磷脂单体和带有巯基的磷脂单体自组装而成。

进一步地，上述带有烯基的磷脂单体为带有2个烯基的磷脂酰胆碱DBPPC，述带有巯基的磷脂单体为带有2个巯基的磷脂酰胆碱DTPPC。

优选地，所述带有2个烯基的磷脂酰胆碱DBPPC的结构为：

所述带有2个巯基的磷脂酰胆碱DTPPC的结构为：

更进一步地，上述带有烯基的磷脂单体和带有巯基的磷脂单体的摩尔比为(1～5):(1～5)，优选为1:1。

本发明还提供了一种稳定的磷脂双层膜，它是上述的磷脂双层膜发生单体间聚合反应而成，所述聚合反应是烯基和巯基的反应。

进一步地，上述单体间聚合反应是：在光引发剂和紫外光作用下，全部或部分单体通过化学键连接；优选地，所述光引发剂为安息香二乙醚。

本发明还提供了一种含有纳米孔的磷脂双层膜，它由跨膜蛋白和上述的稳定的磷脂双层膜组成，所述跨膜蛋白镶嵌在稳定的磷脂双层膜上，优选地，所述跨膜蛋白镶嵌数量为1个。

进一步地，上述跨膜蛋白是：α-溶血素、丙甲苷肽、耻垢分枝杆菌孔蛋白A或噬菌体phi29连接器马达蛋白，优选为α-溶血素。

进一步地，上述制备方法是在电解池中制备，所述电解池被纳米孔基材分隔成两个电解室，所述纳米孔基材是光刻胶处理并表面氟化处理后的聚碳酸酯膜，膜上有1个孔径为纳米级的孔，包括如下制备步骤：

(1)将带有烯基的磷脂单体和带有巯基的磷脂单体的混合溶液I涂抹于纳米孔基材的孔周围，干燥除去溶剂；

(2)在纳米孔基材两侧电解室中加入缓冲液复溶纳米孔基材的孔周围涂附的磷脂单体；所述缓冲液含有：1M KCl和5mM HEPES，pH为7.4；

(3)取带有烯基的磷脂单体、带有巯基的磷脂单体和光引发剂的混合溶液II在纳米孔基材的孔周围复涂成膜，用紫外光照射引发原位聚合；

(4)向一侧电解室中加入跨膜蛋白，对电解池施加偏置电压使跨膜蛋白嵌入到磷脂膜中。

进一步地，上述纳米孔基材为Su-8处理并接枝了十七氟十一酰氯的聚碳酸酯膜；

步骤(1)所述带有烯基的磷脂单体和带有巯基的磷脂单体的摩尔比为1:1；所述混合溶液I的溶剂为正癸烷；

步骤(3)所述带有烯基的磷脂单体、带有巯基的磷脂单体和光引发剂的摩尔比为20:20:1；所述混合溶液II的溶剂为正癸烷；所述紫外光照射时间为20min；

步骤(4)所述跨膜蛋白的为α-溶血素。

本发明还提供了上述的含有纳米孔的磷脂双层膜在纳米孔测序中的应用。

本发明的有益效果：本发明创新性地合成了两种改性磷脂单体：烯基修饰的磷脂酰胆碱、巯基修饰的磷脂酰胆碱，从而将点击化学引入到磷脂双层膜的制备中，在光引发剂的协助下，通过外加紫外辐照使磷脂单体在成膜后聚合，可进一步成功镶嵌跨膜蛋白形成生物纳米孔，不但比固态纳米孔具有更高的精度和重现性，同时克服了生物纳米孔磷脂双层膜不稳定的缺陷，大幅提高了磷脂双层膜的稳定性和使用寿命，具有非常好的应用于纳米孔基因测序的潜力，有利于更加准确、稳定地进行基因测序工作。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明稳定的磷脂双层膜的单体间通过点击反应聚合的原理示意图。

具体实施方式

除另有说明外，本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。实施例、实验例中监测在纳米孔基材两侧加压，监测电阻、电流等变化以及监测稳定性时的操作的具体对象两侧电解室中的缓冲液。

本发明实施例所用的两种新型磷脂单体的制备方法如下，

1、取2-羟基棕榈酸(2.72g,0.01mol)、巯基乙酸(0.92g,0.01mol)、环己烷(20mL)至三口烧瓶中，以强酸性离子交换树脂作为催化剂，在搅拌条件下将体系升温至114℃，回流反应24h以上。随后通过减压蒸馏分离出环己烷和过量的酸，得到粗产品。进一步，利用强碱性树脂固定床对粗产品进行脱酸，得到精制2-巯基乙酸棕榈酸酯。

同样地，取2-羟基棕榈酸(2.72g,10mmol)、3-丁烯酸(0.86g,10mmol)、环己烷(20mL)至三口烧瓶中，以强酸性离子交换树脂作为催化剂，在搅拌条件下将体系升温至114℃，回流反应24h以上。随后通过减压蒸馏分离出环己烷和过量的酸，得到粗产品。进一步，利用强碱性树脂固定床对粗产品进行脱酸，得到精制2-正丁烯酸棕榈酸酯。

2、取2-巯基乙酸棕榈酸酯(1.038g,3.00mmol)、(R)-(+)-3-苄基-1,2-丙二醇(0.273g,1.50mmol)、二氯甲烷(15ml)于50mL圆底烧瓶中，随后加入二环己基碳二亚胺(DCC，0.618g,3.00mmol)和二甲胺吡啶(DMAP，0.183g,1.50mmol)，在室温下搅拌过夜。过滤产物，真空除去挥发物，随后利用快速柱层析法(20％正己烷/乙酸乙酯)得到精制的苄氧基保护的丙二醇二酰化(2-巯基乙酸)棕榈酸脂。

进一步，取2-正丁烯酸棕榈酸酯(1.020g,3.00mmol)、甲苯(10mL)、2,4,6-三氯苯甲酰氯(0.500mL,3.00mmol)于50mL圆底烧瓶中，室温搅拌下滴加三乙胺(1.00mL,6.60mmol)，搅拌1.5小时。取(R)-(+)-3-苄基-1,2-丙二醇(0.273g,1.50mmol)、甲苯(5ml)和二甲胺吡啶(DMAP，0.183g,1.50mmol)，室温搅拌至DMAP溶解，将该溶液缓慢滴加至上述50ml圆底烧瓶中，并在室温下搅拌过夜。滴加NH₄Cl溶液(50mL)淬灭反应，产物用乙醚(50mL)萃取3次，并在MgSO₄上干燥，随后利用快速柱层析法(10％乙酸乙酯/正己烷)得到精制的苄氧基保护的丙二醇二酰化(2-正丁烯酸)棕榈酸脂。

3、向10mL圆底烧瓶中加入苄氧基保护的丙二醇二酰化(2-巯基乙酸)棕榈酸脂(0.704g，0.840mmol)、二氯甲烷(2mL)，并置于干冰-丙酮中，向其中滴加三氯化硼庚烷溶液(1M，3.40mL，3.40mmol)，在-78℃下反应2h，随后滴加pH 7缓冲液(1mL)淬灭反应，待反应体系升至室温，继续加入15mL缓冲液，用10mL乙醚萃取3次，并用MgSO₄干燥，真空除去挥发物,得到脱保护的丙二醇二酰化(2-巯基乙酸)棕榈酸脂。向25mL圆底烧瓶中加入上述脱保护的丙二醇二酰化(2-巯基乙酸)棕榈酸脂、苯(10mL)、2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷(87.0mL,0.950mmol)，然后滴加三乙胺(220μL,1.58mmol)，体系在室温下反应2h后，过滤除去胺盐，真空除去挥发物。向压力瓶中加入反应中间体，乙腈(10mL)，并将反应置于干冰-丙酮浴中，鼓入三甲胺气体(85.0mL,3.46mmol)，密封压力瓶并外加防爆罩后在65℃下反应48h。反应结束后，待反应冷却至室温，小心打开压力瓶并真空除去挥发物，随后利用快速柱层析法(氯仿/甲醇/水＝65:25:2)得到精制二(2-巯基乙酸棕榈酸脂)酰磷脂酰胆碱(DTPPC)。

同样地，向10mL圆底烧瓶中加入苄氧基保护的丙二醇二酰化(2-正丁烯酸)棕榈酸脂(0.694g，0.840mmol)、二氯甲烷(2mL)，并置于干冰-丙酮中，向其中滴加三氯化硼庚烷溶液(1M，3.40mL，3.40mmol)，在-78℃下反应2h，随后滴加pH 7缓冲液(1mL)淬灭反应，待反应体系升至室温，继续加入15mL缓冲液，用10mL乙醚萃取3次，并用MgSO₄干燥，真空除去挥发物,得到脱保护的丙二醇二酰化(2-正丁烯酸)棕榈酸脂。向25mL圆底烧瓶中加入上述脱保护的丙二醇二酰化(2-巯基乙酸)棕榈酸脂、苯(10mL)、2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷(87.0mL,0.950mmol)，然后滴加三乙胺(220μL,1.58mmol)，体系在室温下反应2h后，过滤除去胺盐，真空除去挥发物。向压力瓶中加入反应中间体，乙腈(10mL)，并将反应置于干冰-丙酮浴中，鼓入三甲胺气体(85.0mL,3.46mmol)，密封压力瓶并外加防爆罩后在65℃下反应48h。反应结束后，待反应冷却至室温，小心打开压力瓶并真空除去挥发物，随后利用快速柱层析法(氯仿/甲醇/水＝65:25:2)得到精制二(2-正丁烯酸棕榈酸脂)酰磷脂酰胆碱(DBPPC)。

反应式如下：

需要特别说明的是，带有烯基的磷脂单体和带有巯基的磷脂单体混合自组装，均可得到本发明的磷脂双层膜结构，通过紫外光引发烯基和巯基聚合，即可得到本发明稳定的磷脂双层膜，并且可以嵌入蛋白形成纳米孔，而并非必须为上述特定结构的DBPPC和DTPPC。

实施例1、本发明磷脂双层膜的制备

S1：选取聚碳酸脂作为纳米孔基材，对其进行Su-8预处理，并进一步对其进行环氧开环处理，以接枝十七氟十一酰氯，大幅提升纳米孔基材的疏水性。

S2：在避光环境下，取等摩尔比(1:1)的固体DTPPC和DBPPC，用氩气干燥并于真空干燥箱中干燥过夜，随后将其溶解于正癸烷中，最终浓度为10mM，得到磷脂单体混合溶液Ⅰ。

S3：将磷脂单体混合溶液Ⅰ涂抹至改性纳米孔基材的纳米孔周围，并用氩气干燥使溶剂挥发。

S4：各取1mL缓冲液(1M KCl和5mM HEPES，pH为7.4)加至改性纳米孔基材两侧电解室中，使干燥后的混合磷脂分子复溶。

S5：在避光环境下，取一定摩尔比的DTPPC、DBPPC和BDK(DTPPC:DBPPC:BDK＝20：20：1),用氩气干燥并于真空干燥箱中干燥过夜，随后将其溶解于正癸烷中，最终溶液中磷脂浓度为10mM，得到磷脂单体混合溶液Ⅱ。

S6：利用2μL移液枪吸取微量磷脂单体混合溶液Ⅱ在纳米孔基材的纳米孔周围吹扫复涂成膜。通过监测纳米孔基材两侧电阻变化确认成膜。

实施例2、本发明稳定的磷脂双层膜的制备

在实施例1的S1～S6步骤基础上，继续进行如下步骤：

S7：将紫外灯(λ_ex＝365nm)固定在距纳米孔基材的纳米孔1-2cm的地方对其进行UV照射20min，使混合磷脂中的双键和巯基发生聚合，形成稳定的新型聚合磷脂双层膜。聚合反应示意图如图1所示。

实施例3、本发明含有纳米孔的磷脂双层膜的制备

在实施例2通过S1～S7步骤制得的稳定的聚合磷脂双层膜基础上，继续进行如下步骤：

S8：在纳米孔基材一侧的缓冲液中加入2μL的α-溶血素(α-HL)溶液(1mg/mL)，并在纳米孔两侧缓冲液施加+60mV的偏置电压以推动蛋白嵌入磷脂膜中。通过监测纳米孔两侧电阻的变化以确定跨膜蛋白是否成功嵌入。通过电流变化监测蛋白嵌入量，一般在嵌入一个蛋白后就停止施加偏置电压。

实施例4、本发明含有纳米孔的磷脂双层膜的制备

与实施例3相比，区别在于磷脂单体混合溶液Ⅱ中DTPPC:DBPPC:BDK的摩尔比为10：10：1(溶液中磷脂浓度为10mM)，其余制备步骤相同。

实施例5、本发明含有纳米孔的磷脂双层膜的制备

与实施例3相比，区别在于磷脂单体混合溶液Ⅱ中DTPPC:DBPPC:BDK的摩尔比为50：50：1(溶液中磷脂浓度为10mM)，其余制备步骤相同。

实施例6、本发明含有纳米孔的磷脂双层膜的制备

与实施例3相比，区别在于对磷脂膜进行紫外辐照的时间减至10min，其余制备步骤相同。

实施例7、本发明含有纳米孔的磷脂双层膜的制备

与实施例3相比，区别在于对磷脂膜进行紫外辐照的时间增至30min，其余制备步骤相同。

实施例8、本发明含有纳米孔的磷脂双层膜的制备

与实施例3相比，区别在于选取耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)代替α-HL作为跨膜蛋白嵌入磷脂膜中，其余制备步骤相同。

对比例1、二棕榈酰磷脂酰胆碱磷脂双层膜的制备

与实施例3相比，区别在于用没有烯基、巯基修饰的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)溶液(10mM)替代磷脂单体混合溶液Ⅰ和Ⅱ，作为空白对照组，通过比较其他实例与该实例的成膜性能来验证本发明的效果。

对比例2、纳米孔基材不同的磷脂双层膜的制备

与实施例3相比，区别在于选取经Su-8预处理后的聚碳酸酯作为纳米孔基材，不对其进行环氧开环及氟化处理，其余制备步骤相同。

对比例3、制备工艺不同的含有纳米孔的磷脂双层膜的制备

与实施例3相比，区别在于先进行步骤S8(即嵌入跨膜蛋白)，再进行步骤S7(即紫外引发聚合)。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、

1、实验方法

通过测量实施例和对比例制得的膜的击穿电压(VB)和寿命来表征其稳定性。VB值是膜发生不可逆破裂的最低电压，在确定成膜之后，通过在纳米孔基材两侧施加从0到2000mV的递增电压(以10mV为增量，持续50ms)，得到磷脂膜的VB值，多次测量后得到的平均VB值能够很好地反映膜的电稳定性。膜寿命是指其在±5mV 20Hz方波作用下，膜破裂所需的平均时间。

2、实验结果

如表1所示：

从表1可以看出，本发明采用Su-8预处理并氟化的聚碳酸酯作为纳米孔基材，并且在恰当的光引发剂用量(DTPPC:DBPPC:BDK＝(10～50):(10～50):1)、恰当的紫外聚合时间(10～30min)下制备的磷脂双层膜能够成功嵌入跨膜蛋白(α-HL、MspA)，且具有非常好的稳定性。尤其是采用Su-8预处理并氟化的聚碳酸酯作为纳米孔基材，在光引发剂用量满足DTPPC:DBPPC:BDK＝20:20:1，紫外聚合20min并采用α-HL作为跨膜蛋白嵌入时，具有最优的稳定性，击穿电压高达2000mV，磷脂膜的寿命长达113h。

综上，本发明提供了一种基于烯基修饰的磷脂单体和巯基修饰的磷脂单体制得的磷脂双层膜，将点击化学引入到磷脂双层膜的制备中，在光引发剂的协助下，通过外加紫外辐照使磷脂单体在成膜后聚合，可进一步成功镶嵌跨膜蛋白形成纳米孔，同时大幅提高磷脂双层膜的稳定性和使用寿命，具有非常好的应用于纳米孔基因测序的潜力，有利于更加准确、稳定地进行基因测序工作。

Claims (10)

1.一种磷脂双层膜，其特征在于，它由带有烯基的磷脂单体和带有巯基的磷脂单体自组装而成。

2.如权利要求1所述的磷脂双层膜，其特征在于，所述带有烯基的磷脂单体为带有2个烯基的磷脂酰胆碱，述带有巯基的磷脂单体为带有2个巯基的磷脂酰胆碱；

优选地，所述带有2个烯基的磷脂酰胆碱的结构为：

所述带有2个巯基的磷脂酰胆碱的结构为：

3.如权利要求1或2所述的磷脂双层膜，其特征在于，所述带有烯基的磷脂单体和带有巯基的磷脂单体的摩尔比为(1～5):(1～5)，优选为1:1。

4.一种稳定的磷脂双层膜，其特征在于，它是权利要求1或2所述的磷脂双层膜发生单体间聚合反应而成，所述聚合反应是烯基和巯基的反应。

5.如权利要求4所述的磷脂双层膜，其特征在于，所述单体间聚合反应是：在光引发剂和紫外光作用下，全部或部分单体通过化学键连接；优选地，所述光引发剂为安息香二乙醚。

6.一种含有纳米孔的磷脂双层膜，其特征在于，它由跨膜蛋白和权利要求4或5所述的稳定的磷脂双层膜组成，所述跨膜蛋白镶嵌在稳定的磷脂双层膜上，优选地，所述跨膜蛋白镶嵌数量为1个。

7.如权利要求6所述的含有纳米孔的磷脂双层膜，其特征在于，所述跨膜蛋白是：α-溶血素、丙甲苷肽、耻垢分枝杆菌孔蛋白A或噬菌体phi29连接器马达蛋白，优选为α-溶血素。

8.权利要求6或7所述的含有纳米孔的磷脂双层膜的制备方法，其特征在于，在电解池中制备，所述电解池被纳米孔基材分隔成两个电解室，所述纳米孔基材是光刻胶处理并表面氟化处理后的聚碳酸酯膜，膜上有1个孔径为纳米级的孔，包括如下制备步骤：

(1)将带有烯基的磷脂单体和带有巯基的磷脂单体的混合溶液I涂抹于纳米孔基材的孔周围，干燥除去溶剂；

(2)在纳米孔基材两侧电解室中加入缓冲液复溶纳米孔基材的孔周围涂附的磷脂单体；所述缓冲液含有：1M KCl和5mM HEPES，pH为7.4；

(3)取带有烯基的磷脂单体、带有巯基的磷脂单体和光引发剂的混合溶液II在纳米孔基材的孔周围复涂成膜，用紫外光照射引发原位聚合；

(4)向一侧电解室中加入跨膜蛋白，对电解池施加偏置电压使跨膜蛋白嵌入到磷脂膜中。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述纳米孔基材为Su-8处理并接枝了十七氟十一酰氯的聚碳酸酯膜；

步骤(1)所述带有烯基的磷脂单体和带有巯基的磷脂单体的摩尔比为1:1；所述混合溶液I的溶剂为正癸烷；

步骤(3)所述带有烯基的磷脂单体、带有巯基的磷脂单体和光引发剂的摩尔比为20:20:1；所述混合溶液II的溶剂为正癸烷；所述紫外光照射时间为20min；

步骤(4)所述跨膜蛋白的为α-溶血素。

10.权利要求6或7所述的含有纳米孔的磷脂双层膜在纳米孔测序中的应用。

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