CN114099490A - 卡巴拉汀在制备促进缺血超长随意皮瓣存活的药物的作用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及卡巴拉汀在制备促进缺血超长随意皮瓣存活的药物的作用,在促进缺血随意皮瓣存活的过程中采用灌胃的方式，通过大量的动物实验得出结论，使用卡巴拉汀可以使得皮瓣的成活面积比明显提高，能够很好地促进缺血随意皮瓣存活。

Description

卡巴拉汀在制备促进缺血超长随意皮瓣存活的药物的作用
技术领域
本发明涉及卡巴拉汀的新用途，具体是卡巴拉汀在制备促进缺血超长随意皮瓣存活的药物的作用。
背景技术
随意型皮瓣由于设计有较大的灵活性，在整形外科修复组织缺损、畸形时应用最为广泛。但皮瓣坏死是整形外科中常见并发症,为了使皮瓣在转移过程中能顺利成活，设计皮瓣时对其长度和宽度比例有一定的限制，如果长宽比例超过了规定的1.5-2：1的限制，皮瓣转移术后就可能发生远端部分皮瓣组织营养代谢障碍导致坏死。由于皮瓣受个体差异、皮瓣供区、受区血流因素和局部缺血时间、炎症反应等因素的影响，其坏死机制至今仍未完全阐明，从而影响了皮瓣修复的临床应用。因此，研究皮瓣远端坏死的发生机制，进一步提高皮瓣的成活率已成为目前皮瓣修复的研究重点，这对临床上提高皮瓣应用范围有重要的意义。如何能改善随意皮瓣远端的血供状况以及组织对缺血的耐受能力，有效减少可能发生的缺血坏死，成为创面治疗修复中核心问题之一，具有较强的社会价值、经济价值和理论、实践研究价值。
卡巴拉汀，一种经典的广泛用于治疗阿尔兹海默症的药物，是一种选择性胆碱酯酶抑制剂，可以增加脑内乙酰胆碱的水平，改善患者认知功能。此外，卡巴拉汀还被证明对亨廷顿舞蹈症、血管性痴呆和多发性硬化症患者的认知障碍具有潜在的治疗作用。卡巴拉汀为治疗阿尔兹海默症的经典药物，研究其新的疗效具有广阔的经济、社会效益。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供卡巴拉汀新作用，克服现有治疗手段的不足，为缺血超长随意皮瓣存活临床治疗开拓了更多的选择。
为实现上述目的，本发明提供本发明涉及卡巴拉汀在制备促进缺血超长随意皮瓣存活的药物的作用。
进一步的，所述缺血超长随意皮瓣的规格为3cmX9cm。
进一步的，药物为经胃肠道给药口服液药物。
进一步的，所述口服液药物载体成分包括纯化水、玉米油。
进一步的，所述口服液药物的浓度为0.25mg/ml。
进一步的，单位口服液药物中卡巴拉汀的含量为50-140mg。
在促进缺血超长随意皮瓣存活的过程中采用灌胃的方式，使用方法为每日灌胃预先配置浓度为0.25mg/ml卡巴拉汀溶液1.0mg/kg或2.0mg/kg，每日一次，5-7天为一疗程。
本发明具有如下优点：通过大量的动物灌胃实验得出结论，使用卡巴拉汀可以减少炎症反应以及促进血液灌注水平，使得皮瓣的的成活面积比明显提高，能很好地促进缺血超长随意皮瓣存活。
附图说明
图1卡巴拉汀(Rivastigmine)的化学结构式。
图2 A.缺血随意皮瓣模型建立；B.离断双侧髂血管。
图3 A.术后7d大鼠背部皮瓣存活情况对比图；B.皮瓣平均存活率对比。
图4.A.显微镜下对照组与实验组皮瓣中端H&E染色观察情况；B.皮瓣Ⅱ区中性粒细胞密度对比。
图5 A.对照组和实验组超氧化物歧化酶(SOD)平均水平对比；B.对照组和实验组丙二醛(MDA)平均水平对比。
图6 A.术后七天对照组与实验组激光多普勒血流评估；B.皮瓣平均血液灌注水平对比。
图7 A.在200倍放大下获取的IL-1β和IL-18的皮瓣表达情况；B.皮瓣中端IL-1β和IL-18积分吸光度。
图8 A.在200倍放大下获取的CD34、HIF-1α的皮瓣表达情况；B.皮瓣中端CD34、HIF-1α积分吸光度。
具体实施方式
下面将结合实施例和效果例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明的范围。
实施例1：卡巴拉汀胃灌液的制备方法
其制备方法步骤如下
50mg的卡巴拉汀溶于20ml的DMSO，配成2.5mg/ml的母液，容器外包裹锡纸置于4℃冰箱内冷藏。使用时加入所取母液9倍体积的玉米油稀释至0.25mg/ml的浓度。
其中卡巴拉汀的化学结构式如下所示：
Figure BDA0003446235460000031
实施例2：缺血随意皮瓣模型建立
60只SD大鼠，由温州医科大学实验动物中心提供，清洁级，体重200-250g，2—3个月龄。随机分为对照组(control group)、卡巴拉汀低剂量组(Riv-L group)和高剂量组(Riv-H group)，每组20只。大鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠(40mg/Kg)麻醉，俯卧位固定四肢和牙齿。在大鼠背部建立改良的麦克法兰皮瓣。设计以中线为尾端轴蒂，髂嵴线为9cmx3cm矩形超长随机皮瓣底侧。保持皮下毛细血管网络，分离并结扎两条髂动脉，如图2B所示。实验过程中结扎创面出血点。皮瓣完全揭开后，立即用4-0医用慕斯缝线原位闭合。手术后，在伤口处涂抹红霉素软膏，以防止感染。整个手术过程严格遵守无菌原则。为防止大鼠手术后的“自伤”影响实验结果的准确性，将大鼠戴上研究组成员设计的头套，单独饲养在笼子里。为减少外科手术造成的失误，所有手术均由一人完成。Riv-L组每天一次给卡巴拉汀胃灌液1.0mg/Kg。Riv-H组卡巴拉汀胃灌液2.0mg/Kg每天一次。对照组给予1ml由10％DMSO和90％玉米油组成的溶液以除去DMSO对皮瓣存活的影响。为方便术后观察,根据皮瓣血供特点,将皮瓣三等分为皮瓣近端区(I区)、皮瓣中间区(II区)和皮瓣远端区(III区)，如图2A所示。大鼠的水的和食物由实验室统一提供,并控制实验室的温度(25摄氏度、湿度40-60％)及光照条件适宜且相同。腹腔注射生理盐水(50ml/kg)抗休克。
高、低剂量卡巴拉汀组：分别以1.0mg/kg和2.0mg/kg卡巴拉汀灌胃；对照组灌胃1ml由体积比为10％DMSO和90％玉米油构成的混合溶剂。均每日1次，时间段相同，连续7天。因大鼠有自残现象，为避免其术后回头撕咬伤口影响皮瓣存活，均为其带上防止其自残的“颈套”，并独笼喂养。
实施例3：皮瓣存活面积比与皮瓣存活状况检测
皮瓣存活面积比与皮瓣存活状况检测术后1～7d，每大肉眼观察大鼠皮瓣色泽、质地、组织弹性以及有无毛发生长或坏死现象。术后7d，采用100g/L水合氯醛麻醉大鼠(8mL/kg)并处死，以透明纸准确描记大鼠皮瓣成活面积及皮瓣总面积并裁剪，以电子秤称质量。计算皮瓣成活面积百分比[皮瓣成活面积透明纸质量÷皮瓣总表面积透明纸质量×100％]。每只大鼠测量两次，取其平均值。存活区域呈现粉红色，质地柔软，有新毛发生长；坏死区域呈黑褐色，结痂，质地坚硬，没有毛发生长。
结果：术后7天，卡巴拉汀高剂量组和低剂量组的中间区域皮瓣颜色淡红，表面无痂壳形成，弹性较好，远端区域颜色发黑，表明有痂壳，弹性差，原位掀起皮瓣时见皮瓣出血活跃，出血量多，肉膜下无积血，积液，血管丰富。对照组皮瓣中间区域及远端区域颜色均发黑，表面有痂壳形成，弹性极差，原位掀起皮瓣见皮瓣出血较少，肉膜下炎性分泌物较多，血管相对较疏，其结果如图3A所示。
术后第七天，对照组(50.44±1.30％)与Riv-L组(70.12±4.30％)和Riv-H组(89.16±1.60)皮瓣成活率相比较，数据差异有统计学意义(p＜0.01)，结果如图3B所示。
实施例4：皮瓣组织病理学检测
皮瓣术后第7天，从每个皮瓣的II区获得1.0cm×1.0cm的皮瓣组织，经4％多聚甲醛浸泡24小时处理后将组织包埋在石蜡中，制成厚度为4μm的切片用于组织学指标的检测。切片使用苏木精和伊红(HE)染色，并在光学显微镜下观察皮瓣的组织学特点。评估皮瓣中性粒细胞浸润、组织水肿、肉芽组织厚度等。观察中性粒细胞的浸润程度是在×100倍光镜下进行的。
HE染色的组织切片在光学显微镜下观察。各组缺血皮瓣Ⅱ区均有不同程度的炎性改变：组织水肿、大量中性粒细胞浸润、纤维增生，结果如图4A所示。Riv-H的中性粒细胞浸润密度为(83.16±10.53/mm2)，较Riv-L组(120.35±9.07/mm2)和对照组(165.79±12.93/mm2)显着降低，(P<0.01)，差异有统计学意义，结果如图4B所示，卡巴拉汀作用于缺血皮瓣时，能够减少缺血皮瓣的组织水肿、中性粒细胞浸润、纤维增生，降低了缺血皮瓣的炎症反应。
实施例5：皮瓣组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)表达的检测
术后第7天，每组随机挑选出6只大鼠，在II区皮瓣中央部位分离0.5cm×0.5cm皮瓣组织，除去肌层，在冰水浴中制成体积分数为10％的组织匀浆液，然后离心、保留上清液。按照试剂盒制造商的说明，黄嘌呤氧化酶发测量超氧化物歧化酶(SOD)的含量，丙二醛(MDA)含量的测定是基于硫代巴比妥酸(TBA)法。
Riv-H组SOD活性为78.57±7.00单位·mg-1·蛋白质-1，显着高于Riv-L组(50.74±4.73单位·mg-1·蛋白质-1)和对照组为21.73±2.59单位·mg-1·蛋白质-1，(P＜0.0.1)，结果如图5A所示。Riv-H组MDA水平为24.7±2.33单位·mg-1·蛋白质-1，显着低于Riv-L组MDA水平50.92±4.93单位·mg-1·蛋白质-1和对照组MDA水平为75.16±3.28单位·mg-1·蛋白质-1)，结果如图5B所示。卡巴拉汀以剂量依赖性方式增加SOD活性并降低MDA水平，卡巴拉汀减轻了氧化应激，发挥抗氧化作用，保护皮瓣对抗缺血再灌注损伤。
实施例6：皮瓣组织皮瓣血液灌注量的检测
术后第7天，每组随机选择6只大鼠麻醉后固定，使用激光多普勒流量计(LDF)测定皮瓣各个区域(I区、II区和III区)的血流量。以灌注单位(PU)为基本指标，代表多普勒下红细胞流动产生的位移值，间接反应皮瓣新生血管。使用MoorLDIReviewV6.1软件获取并分析皮瓣血液灌注图片，结果如图6A所示，根据激光多普勒血流成像显示，其结果统计分析如图6B所示，Riv-H组(215.32±19.37PU)和Riv-L组(132.02±20.49PU)较对照组(75.02±44.86PU)显着改善皮瓣的血流灌注。
实施例7：皮瓣组织免疫组化检测IL-1β、IL-18、CD34、HIF-1α、含量的测量
使用已制备好的石蜡切片，按照链霉亲和素-过氧化物酶法进行免疫组织化学染色。显微镜下观察,细胞内有棕黄色颗粒者为阳性。测定每个皮瓣组织的阳性颗粒的累积吸光度IA值,以均值作为该样本IL-1β、IL-18、CD34、HIF-1α的相对表达。在×200倍光镜下随机选择5个区域拍照，并将图片保存在Image－Pro Plus v6.0软件，计算上述物质的表达水平。
采用免疫组化法检测缺血皮瓣Ⅱ区促炎细胞因子的表达水平，如图7A和B所示。IL-1β的表达量，高剂量组(422.17±39.04IA)和低剂量组(699.83±59.00IA)的IL-1β显着低于对照组(1601.50±126.33IA)。IL-18的表达量，与对照组(2201.67±154.66IA)相比，高剂量组(879.67±49.45IA)和低剂量组(1618.83±180.28IA)IL-18的表达水平显着降低。缺血皮瓣Ⅱ区CD34、HIF-1α的表达水平如图8A和B所示，Riv-H组(3132.83±120.10IA)和Riv-L组(2385.83±348.72IA)皮瓣组织中HIF-1α的含量高于对照组(1003.17±58.57IA)，这是剂量依赖性的。此外，在CD34的表达水平上，我们也发现高剂量卡巴拉汀使用明显提高了CD34的阳性率(2750.67±304.44IA)，低剂量Riv组为1797.67±91.65IA，对照组为843.67±71.29IA，实验组与对照组间差异有意义，高低剂量组别之间也有显著区别(P＜0.01)。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.卡巴拉汀在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的用途。
2.根据权利要求1所述的卡巴拉汀在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的用途，其特征在于：所述缺血超长随意皮瓣的规格为3cm X 9cm。
3.根据权利要求1所述的卡巴拉汀在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的用途，其特征在于：药物为经胃肠道给药口服液药物。
4.根据权利要求3所述的卡巴拉汀在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的用途，其特征在于：所述口服液药物载体成分包括纯化水、玉米油。
5.根据权利要求3所述的卡巴拉汀在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的用途，其特征在于：所述口服液药物的浓度为0.25mg/ml。
6.根据权利要求3所述的卡巴拉汀在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的用途，其特征在于：单位口服液药物中卡巴拉汀的含量为50-140mg。
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