CN114096272A - mRNA制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及mRNA制剂的领域，并且特别地提供了下列组分的组合：一种或多种编码功能性免疫刺激蛋白CD40L、CD70和caTLR4的mRNA分子；和一种或多种编码抗原的mRNA分子。特别地，本发明的组合的特征在于，所述mRNA分子包含5’CAP‑1结构并且可以进一步包含一个或多个经修饰的核苷，例如假尿苷。本发明还提供了包含所述组合的组合物及其用途，特别是在疫苗接种和治疗细胞增殖性病症中的用途。
Description
发明领域
本发明涉及mRNA制剂的领域，并且特别地提供了下列组分的组合：一种或多种编码功能性免疫刺激蛋白CD40L、CD70和caTLR4的mRNA分子；和一种或多种编码抗原的mRNA分子。特别地，本发明的组合的特征在于，所述mRNA分子包含5’CAP-1结构并且可以进一步包含一个或多个经修饰的核苷，例如假尿苷。本发明还提供了包含所述组合的组合物及其用途，特别是在疫苗接种和治疗细胞增殖性病症中的用途。
发明背景
由mRNA疫苗引发的T细胞应答的大小程度和功能特征受到施用途径、递送载料和mRNA的内在特性之间的复杂相互作用支配。施用途径将会决定mRNA在器官和细胞水平上的生物分布。在这方面，用复合入纳米载体中的mRNA进行静脉内免疫接种已出现成为用于引发高大小程度/高质量T细胞应答的特别有力的方法，然而免疫原性关键性地取决于递送载料的物理化学特性。最后，mRNA形式本身可能对于免疫原性具有巨大影响。取决于其5'帽结构以及取决于ssRNA和dsRNA序列基序的存在，体外转录(IVT)出的RNA确实可以被各种RNA感受器所识别。然而，这些RNA感受器的触发会引发必需的细胞因子应答以支持T细胞分化，它也会引发旨在降解mRNA和关闭翻译停止的抗病毒标记。因此，在mRNA疫苗的情况下，需要紧密地平衡先天激活以使得由mRNA所编码的抗原能够充分表达。
在本文中，我们探讨了不同mRNA形式对于由疫苗所引发的T细胞应答的大小程度和功能特性的影响。在该研究中探讨三种不同的mRNA形式，其在它们被先天免疫系统识别的程度方面有所不同：1)经ARCA加帽的、未修饰的mRNA，2)经CleanCap加帽的、未修饰的mRNA，3)经CleanCap加帽的、经修饰的mRNA。经ARCA加帽的mRNA具有所谓的5’Cap-0结构，其使mRNA稳定并且驱动翻译起始，但是被几个驱动RNA降解和翻译停止的RNA感受器所识别。而经CleanCap加帽的mRNA具有Cap-1结构，其致使mRNA对于数种RNA感受器(MDA-5、RIG-I和IFIT-1)是不可见的。真核生物mRNA通常具有各种内置的核苷修饰(例如，假尿苷、5-甲基胞苷、N1-甲基假尿苷)，其降低它们与Toll-样受体(TLR)3、7和8的相互作用。对于所有三种mRNA形式，我们评估了TriMix(编码功能性免疫刺激蛋白CD40L、CD70和caTLR4的mRNA分子)对于所引发的T细胞应答的大小程度以及对于所引起的早期细胞因子应答的影响。
我们的研究揭示了在T细胞应答和早期炎症应答方面在不同的mRNA形式之间的重大差异。经ARCA加帽的、未修饰的mRNA在静脉内注射后引发最突出的炎症应答。血清细胞因子滴度通过转换至经CleanCap加帽的mRNA而显著降低，并且通过伴随的将尿苷置换为N1-甲基假尿苷而进一步减小。对于所测试的mRNA形式，TriMix的添加均未加重全身细胞因子应答。
在T细胞应答的大小程度方面，在TriMix不存在下(仅抗原)在三种不同的mRNA形式之间未观察到显著差异。虽然如此，在添加TriMix后，在mRNA形式之间出现T细胞应答的强烈差异。然而，在经ARCA加帽的、未修饰的mRNA的情况下TriMix未改善T细胞应答的大小程度，和在经CleanCap加帽的、未修饰的mRNA和经CleanCap加帽的、经修饰的mRNA的情况下TriMix强烈地增强T细胞应答的大小程度。总之，在用比例为5:5的E7:TriMix和以经CleanCap加帽的未修饰的mRNA和经CleanCap加帽的经修饰的mRNA形式进行免疫接种的情况下，T细胞应答升高最多，高至所有特异于E7的循环CD8 T细胞的80％。
发明概述
在第一个方面，本发明提供了组合，其包含：
-一种或多种编码功能性免疫刺激蛋白CD40L、CD70和caTLR4的mRNA分子；和
-一种或多种编码抗原的mRNA分子，
其中所述mRNA分子中的至少一种以具有5’CAP-1结构为特征。
在本发明的一个特别的实施方案中，至少2种、至少3种或所有所述mRNA分子具有5’CAP-1结构。
在另一个特别的实施方案中，所述mRNA分子进一步包含至少一个经修饰的核苷，其例如选自包括下列各项的列表：假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基胞苷、2-硫代尿苷和N6-甲基腺苷。
在一个进一步的特别的实施方案中，所述经修饰的核苷可以为从包括下列各项的列表中选择的假尿苷：4-硫代假尿苷、2-硫代假尿苷、1-羧甲基假尿苷、1-丙炔基假尿苷、1-牛磺酸甲基假尿苷、N1-甲基假尿苷、4-硫代-1-甲基假尿苷、2-硫代-1-甲基假尿苷、1-甲基-1-脱氮假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮假尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、4-甲氧基假尿苷和4-甲氧基-2-硫代假尿苷。在一个非常特别的实施方案中，所述至少一个经修饰的核苷为N1-甲基假尿苷。
在另一个特别的实施方案中，在所述mRNA分子中的尿苷的大约100％被N1-甲基假尿苷替代。
本发明进一步提供了药用组合物，其包含在本文中所定义的组合和至少一种在药学上可接受的试剂。
在另一个特别的实施方案中，在本文中所定义的组合被配制成纳米颗粒，例如脂质纳米颗粒或聚合物纳米颗粒。
在一个进一步的实施方案中，在本文中所定义的组合物被配制成用于静脉内、结内、肿瘤内、皮下、真皮内或肌内制剂。
在另外一个进一步的特别的实施方案中，根据本发明的组合物可以以疫苗的形式。
在本发明的一个特别的实施方案中，所述抗原为癌症抗原。
本发明进一步提供了在本文中所定义的组合或组合物，其用于在人或兽医医学中使用，更特别地用于在疫苗接种中使用和/或用于在治疗细胞增殖性病症中使用。
本发明还提供了用于治疗细胞增殖性病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用在本文中所定义的组合或组合物。
附图简述
现在具体参考附图，要强调的是，所显示的细节是作为例子的，并且是仅为了本发明的不同实施方案的举例说明性讨论的目的。为了提供被认为是本发明的原理和概念方面的最有用且容易的描述的内容而呈现了它们。在这点上，并不尝试以比基本理解本发明所需要的更详细地显示本发明的结构细节。结合附图进行的描述使得本领域技术人员明白本发明的几种形式如何可以在实践中实施。
图1：mRNA形式和TriMix对于全身炎症应答的影响。在用所示mRNA LNP对小鼠进行静脉内注射后6小时测量血清细胞因子滴度。将E7/TriMix mRNA以10:0、7.5:2.5、5:5的比例包囊入LNP(50/10/39.5/0.5)中。mRNA要么是经ARCA加帽的而没有核苷修饰(“ARCA/未修饰”)，要么是经CleanCap加帽的而没有核苷修饰(“CleanCap/未修饰”)，要么是经CleanCap加帽的并且包含N1-甲基假尿苷(“CleanCap/经修饰”)。n＝6；双因素ANOVA分析。ns＝不显著的；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图2：对于“CleanCap/经修饰”mRNA LNP的炎症应答的动力学。将E7和TriMix mRNA以所示比例包囊入LNP中并且以10μg的总mRNA剂量进行静脉内施用。所有mRNA都包含CleanCap和100％的被N1-甲基假尿苷的尿苷置换。在注射后6小时和24小时测量血清细胞因子。
图3：A)mRNA形式对于在以10:0(无TriMix)和5:5的E7/TriMix比例用E7/TriMixmRNA LNP进行免疫接种后E7-特异性T细胞应答的大小程度的影响。B)在以所示的E7与TriMix的比例用“ARCA/未修饰”mRNA和“CleanCap/经修饰”mRNA进行免疫接种的情况下，TriMix对于E7-特异性T细胞应答的大小程度的影响。双因素ANOVA分析，随后为Tukey多重比较检验。ns＝不显著的。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图4：在以10:0(无TriMix)和5:5的E7/TriMix比例用E7E7/TriMix mRNA LNP进行第3次免疫接种后，通过ELISPOT评估的IFN-γT细胞应答的大小程度。mRNA要么是经ARCA加帽的而没有核苷修饰(“ARCA/未修饰”)，要么是经CleanCap加帽的而没有核苷修饰(“CleanCap/未修饰”)，要么是经CleanCap加帽的并且包含N1-甲基假尿苷(“CleanCap/经修饰”)。n＝6；双因素ANOVA分析。ns＝不显著的；*p<0.05，**p<0.01。
图5：A)在用所示的mRNA形式用E7 mRNA LNP对小鼠进行注射后，表示为初始体重的％的小鼠重量。在第0、7和14天静脉内注射LNP。B)在分别对于“ARCA/未修饰”mRNA、“CleanCap/未修饰”mRNA和“CleanCap/经修饰”mRNA以所示的E7/TriMix mRNA LNP用LNP对小鼠进行注射后，表示为初始体重的％的小鼠重量。
图6：在用PBS或所示的mRNA LNP进行第三次注射后在小鼠血清中的ALT/AST水平。双因素ANOVA分析，随后为Tukey多重比较检验。ns＝不显著的。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
发明详述
如在本文中上面已经详细说明的，本发明提供了组合，其包含：
-一种或多种编码功能性免疫刺激蛋白CD40L、CD70和caTLR4的mRNA分子；和
-一种或多种编码抗原的mRNA分子，
其中所述mRNA分子中的至少一种以具有5’CAP-1结构为特征。
在整个本发明之中，术语“TriMix”表示编码CD40L、CD70和caTLR4免疫刺激蛋白的mRNA分子的混合物。CD40L和caTLR4的组合的使用产生成熟的分泌细胞因子/趋化因子的DC，如已经通过添加可溶性CD40L和LPS对于CD40和TLR4连接所显示的。将CD70引入到DC中通过抑制经激活的T-细胞凋亡和通过支持T-细胞增殖而对于CD27+幼稚T-细胞提供了共刺激信号。作为对于caTLR4的备选方案，可以使用其他Toll-样受体(TLR)。对于每种TLR，已知组成性的活性形式，并且可能可以将其引入到DC中以便引发宿主免疫应答。但是，在我们看来，caTLR4是最强有力的激活性分子并且因此是优选的。
在本文中所使用或提及的mRNA或DNA可以是裸mRNA或DNA，或者经保护的mRNA或DNA。对于DNA或mRNA的保护增加其稳定性，然而保持使用所述mRNA或DNA用于疫苗接种目的的能力。mRNA和DNA两者的保护的非限制性例子可以为：脂质体包囊，鱼精蛋白保护，(阳离子)脂质脂复合物化(Lipoplexation)，脂质的、阳离子的或聚阳离子的组合物，甘露糖基化的脂复合物化，气泡脂质体化，聚乙烯亚胺(PEI)保护，脂质体加载的微泡保护，等等。
虽然本发明特别适合于与肿瘤特异性抗原相关联地进行使用，但是本发明也可以合适地与其他类型的靶标特异性抗原相关联地进行使用。
在整个说明书之中所使用的术语“靶标”不限于可能在本文中进行了描述的特定例子。可以靶向任何感染因子，例如病毒、细菌或真菌。另外，可以靶向任何肿瘤或癌细胞。在整个说明书之中所使用的术语“靶标特异性抗原”不限于可能在本文中进行了描述的特定例子。对于技术人员来说将会是清楚的是，本发明涉及在APC中的免疫刺激的诱导，不管所呈递的靶标特异性抗原。待呈递的抗原将会取决于意欲在受试者中对于其引发免疫应答的靶标类型。靶标特异性抗原的典型例子为表达的或分泌的标志物，其特异于肿瘤、细菌和真菌细胞或者特异于特定的病毒蛋白质或病毒结构。并不想要限制本发明的保护范围，下面列出了可能的标志物的一些例子。
在整个说明书之中所使用的术语“赘生物”、“癌(症)”和/或“肿瘤”并不意欲限制于可能已例示的癌症或肿瘤的类型。因此，该术语包括所有增值性病症，例如赘生物、发育异常、恶性前或癌变前损害、异常的细胞生长、良性肿瘤、恶性肿瘤、癌症或转移，其中所述癌症可以选自下组：白血病、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、CNS癌、黑素瘤、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、结肠癌、膀胱癌、肉瘤、胰腺癌、结肠直肠癌、头颈癌、肝癌、骨癌、骨髓癌、胃癌、十二指肠癌、食道癌、甲状腺癌、血液癌和淋巴瘤。癌症的特异性抗原可以例如为MelanA/MART1、癌症种系抗原、gp100、酪氨酸酶、CEA、PSA、Her-2/neu、存活蛋白、端粒酶。
在本发明的疫苗的一个优选的实施方案中，所述mRNA或DNA分子编码CD40L和CD70免疫刺激蛋白。在本发明的疫苗的一个特别优选的实施方案中，所述mRNA或DNA分子编码CD40L、CD70和caTLR4免疫刺激蛋白。
所述编码免疫刺激蛋白的mRNA或DNA分子可以是单个mRNA或DNA分子的一部分。优选地，所述单个mRNA或DNA分子能够同时表达两种或更多种蛋白质。在一个实施方案中，编码免疫刺激蛋白的mRNA或DNA分子在单个mRNA或DNA分子中通过内部核糖体进入位点(IRES)或自切割2a肽编码序列而分隔开。
在一些优选的实施方案中，在本发明的方法中使用的mRNA具有有着所谓的CAP-1结构(CleanCap)的5’帽结构，这意味着在相关于帽核苷酸而言的倒数第二个核苷酸中的核糖的2′羟基是经甲基化的，如下面所图解说明的那样：
在另一个特别的实施方案中，本发明的所使用的mRNA分子中的两种、三种、四种、......或所有具有有着所谓的CAP-1结构的5’帽结构。
在一个进一步的实施方案中，本发明的mRNA分子中的一种或多种可以进一步包含至少一个经修饰的核苷。在另一个特别的实施方案中，本发明的所使用的mRNA分子中的两种、三种、四种、......或所有具有至少一个经修饰的核苷。
在本发明的另一个特别的实施方案中，所述mRNA分子进一步包含至少一个经修饰的核苷，其例如选自包括下列各项的列表：假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基胞苷、2-硫代尿苷和N6-甲基腺苷。
在本发明的一个特别的实施方案中，所述至少一个经修饰的核苷可以为假尿苷，其例如选自下述列表：4-硫代假尿苷、2-硫代假尿苷、1-羧甲基假尿苷、1-丙炔基假尿苷、1-牛磺酸甲基假尿苷、N1-甲基假尿苷、4-硫代-1-甲基假尿苷、2-硫代-1-甲基假尿苷、1-甲基-1-脱氮假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮假尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、4-甲氧基假尿苷和4-甲氧基-2-硫代假尿苷。在一个非常特别的实施方案中，所述至少一个经修饰的核苷为N1-甲基假尿苷。
适合于在本发明的情景下使用的备选的核苷修饰包括：吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂尿苷、2-硫代-5-氮杂尿苷、4-硫代假尿苷、2-硫代假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基尿苷、1-羧甲基假尿苷、5-丙炔基尿苷、1-丙炔基假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、1-甲基假尿苷、4-硫代-1-甲基假尿苷、2-硫代-1-甲基假尿苷、1-甲基-1-脱氮假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代尿苷、4-甲氧基假尿苷和4-甲氧基-2-硫代假尿苷。在一些实施方案中，所述mRNA包含至少一个从由下列各项组成的组中选择的核苷：5-氮杂胞苷、假异胞苷、3-甲基胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基假异胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假异胞苷、2-硫代胞苷、2-硫代-5-甲基胞苷、4-硫代假异胞苷、4-硫代-1-甲基假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮假异胞苷、1-甲基-1-脱氮假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂泽布拉林、5-甲基泽布拉林、5-氮杂-2-硫代泽布拉林、2-硫代泽布拉林、2-甲氧基胞苷、2-甲氧基-5-甲基胞苷、4-甲氧基假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基假异胞苷。在一些实施方案中，所述mRNA包含至少一个从由下列各项组成的组中选择的核苷：2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基腺嘌呤和2-甲氧基腺嘌呤。在一些实施方案中，所述mRNA包含至少一个从由下列各项组成的组中选择的核苷：肌苷、1-甲基肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮鸟苷、7-脱氮-8-氮杂鸟苷、6-硫代鸟苷、6-硫代-7-脱氮鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂鸟苷、7-甲基鸟苷、6-硫代-7-甲基鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代鸟苷、7-甲基-8-氧代鸟苷、1-甲基-6-硫代鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代鸟苷。
在本发明中所使用的mRNA分子可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，在特别的实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的特定类型的核苷酸可以被替代为经修饰的核苷酸。也不排除在相同的mRNA分子中包括不同的核苷酸修饰。在本发明的一个非常特别的实施方案中，在所述mRNA分子中的尿苷的大约100％被N1-甲基假尿苷替代。
本发明进一步提供了药用组合物，其包含在本文中所定义的组合和至少一种在药学上可接受的试剂。
在一个特别的实施方案中，本发明的所述mRNA分子中的一种或多种可以进一步包含翻译增强子和/或核停留元件。合适的翻译增强子和核停留元件为在WO2015071295中所描述的那些。
在本发明的一个进一步的实施方案中，所述一种或多种mRNA分子被配制成用于肠胃外施用，更特别地用于静脉内、结内、肿瘤内、皮下、真皮内或肌内制剂。
在一个更进一步的特别的实施方案中，所述mRNA分子被配制成用于结内或肿瘤内施用，并且以在合适的注射缓冲液(例如，林格氏乳酸盐缓冲液)中的裸mRNA分子的形式。
本发明还提供了在本文中所定义的组合或组合物，其中所述mRNA中的一种或多种被包含在纳米颗粒中。
如在本文中所使用的，术语“纳米颗粒”是指任何这样的颗粒，其具有使所述颗粒适合于全身(特别地，静脉内)施用特别是核酸的直径，典型地具有小于1000纳米(nm)的直径。
在本发明的一个特别的实施方案中，所述纳米颗粒选自包括下列各项的列表：脂质纳米颗粒和聚合物纳米颗粒。
脂质纳米颗粒(LNP)通常被称为由不同脂质的组合所组成的纳米级颗粒。虽然在这样的LNP中可以包括许多不同类型的脂质，但是本发明的LNP可以例如由可离子化脂质、磷脂、固醇和PEG脂质的组合组成。
聚合物纳米颗粒通常可以为纳米球或纳米胶囊。两种主要的策略用于制备聚合物纳米颗粒，即“自上而下”方法和“自下而上”方法。在自上而下方法中，预成聚合物的分散产生聚合物纳米颗粒，而在自下而上方法中，单体的聚合导致聚合物纳米颗粒的形成。自上而下方法和自下而上方法两者都使用合成的聚合物/单体，例如聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)、聚(氰基丙烯酸乙酯)、聚(氰基丙烯酸丁酯)、聚(氰基丙烯酸异丁酯)和聚(氰基丙烯酸异己酯)；稳定剂，例如聚(乙烯醇)和二癸基二甲基溴化铵；和有机溶剂，例如二氯甲烷和乙酸乙酯、苄醇、环己烷、乙腈、丙酮等。最近，科学界一直试图找到关于合成的聚合物的备选方案(通过使用天然聚合物)和采用毒性更低的溶剂的合成方法。
本发明还提供了在本文中所定义的组合和疫苗，其用于在人或兽医医学中使用，特别地用于在治疗细胞增殖性病症中使用，更特别地用于在受试者中引发针对肿瘤的免疫应答中使用。
最后，本发明提供了用于治疗细胞增殖性病症的方法，其包括向有此需要的受试者施用本发明的组合或疫苗的步骤。
所述组合物也可以在兽医学领域中具有价值，其对于本文中的目的不仅包括预防和/或治疗动物中的疾病，而且还包括对于在经济上重要的动物例如牛、猪、绵羊、鸡、鱼类等，增强所述动物的生长和/或重量和/或获得自所述动物的肉类或其他产品的数量和/或质量。
现在，将借助于下面的合成和生物学实施例来举例说明本发明，所述实施例不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
材料和方法
小鼠
雌性C57BL/6小鼠购自Charles River Laboratories(France)，并且容纳在具有标准的垫料和笼丰富度的独个地通风的笼子中。按照关于动物实验的机构(VrijeUniversiteit Brussel)和欧盟指南来维持和处理动物。小鼠可以随意获取食物和水。实验在小鼠8周龄时开始。小鼠(n＝6/组)在第0、7和14天通过尾静脉接受3次用在LNP中的10ugmRNA(以200μL的体积)进行的静脉内注射。以相同的时间间隔用200μl PBS注射对照小鼠。每2天监测小鼠的重量。
mRNA合成和纯化
E7 mRNA由eTheRNA通过体外转录(IVT)从eTheRNA质粒pEtherna-v2来制备。将编码HPV16-E7蛋白的序列以符合读框的方式克隆在信号序列与人DC-LAMP的跨膜和细胞质区域之间。将该嵌合基因克隆到pEtherna-v2质粒(WO2015071295)中，该质粒在5'末端处富含翻译增强子并且在3'末端处富含RNA稳定序列。将CD40L、caTLR4和CD70 mRNA(TriMix组分)克隆到pEtherna-v2质粒中。在IVT后，通过纤维素纯化来去除dsRNA。纤维素粉末购自Sigma并且将其在具有16％乙醇的1xSTE(氯化钠-Tris-EDTA)缓冲液中进行洗涤。将IVT mRNA(在具有16％乙醇的1xSTE缓冲液中)添加至经洗涤的纤维素粒状沉淀并且在室温下摇动20分钟。然后，使该溶液通过真空过滤器(Corning)。洗出液包含ssRNA级分并且用于所有实验。通过毛细管凝胶电泳(Agilent,Belgium)来监测mRNA质量。
mRNA的基于脂质的纳米颗粒的生成
基于脂质的纳米颗粒通过使用NanoAssemblr Benchtop(PrecisionNanosystems)以9mL/分钟的速度按2:1体积比使在苹果酸缓冲液(20mM苹果酸(Sigma)、30mM NaCl(Sigma)，pH3)中的mRNA溶液与脂质溶液进行微流体混合来产生。所述脂质溶液包含分别以50/10/39.5/0.5的摩尔比的Coatsome-EC(NOF corporation)、DOPE(Avanti)、胆固醇(Sigma)和DMG-PEG2000(Sunbright GM-020，NOF corporation)的混合物。使用slide-a-lyzer透析盒(20KMWCO，3mL，ThermoFisher)，将LNP逆PBS(PBS体积是LNP体积的100倍)进行透析。尺寸和多分散性用Zetasizer Nano(Malvern)通过动态光散射来进行测量。
细胞因子滴度的评估
在首次mRNA LNP施用后6和24小时，在包含凝血激活剂(ref41.1500.005，Sarstedt)的管中收集50uL的来自经处理的小鼠和对照小鼠的血液。对收集管进行离心(5分钟，10000g)，并且将血清转移至Eppendorf管并贮存于-20℃直至使用。为了评估细胞因子IFN-a、IFN-g、MCP-1、IL-6、IL-12、RANTES、G-CSF和IP-10的滴度，在冰上解冻血清并且用在ProcartaPlex免疫测定法(ThermoFisher Scientific)中。该测定法按照实验方案来进行。将血清样品在通用测定法缓冲液(包括在ProcartaPlex试剂盒中)中稀释3倍，并且与经荧光标记的珠粒一起温育120分钟。Procartaplex测定法的读取在MagPix仪器(Luminex)上进行。
ALT/AST ELISA
在第三次mRNA LNP施用后24小时，在包含凝血激活剂(ref41.1500.005，Sarstedt)的管中收集50uL的来自经处理的小鼠和对照小鼠的血液。对收集管进行离心(5分钟，10000g)，并且将血清转移至Eppendorf管并贮存于-20℃直至使用。为了评估丙氨酸转氨酶1(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的血清滴度，在冰上解冻血清并且用在ALT1 ELISA(Abbexa ref.abx570182)和AST ELISA(Abbexa ref.abx255199)中。所述测定法按照试剂盒实验方案来进行，仅一处偏离：向平板添加仅一半的指定体积的血清，因为该类型的样品的限制性特性。将血清样品在包括在试剂盒中的样品稀释剂缓冲液之中稀释5倍。ELISA的读取在SpectraMax M3平板阅读器(Molecular Devices)上进行。
流式细胞术
E7-特异性T细胞的数目
在第6、13和19天从经处理的小鼠和对照小鼠中收集血清。裂解红细胞，并且将剩余的白细胞按照制造商的说明书(MBL International)用经APC标记的E7(RAHYNIVTF)-四聚体(SEQ ID No:1)进行染色。将过量的四聚体洗去，并且向细胞添加关于表面分子的抗体混合物(在表1中列出的)并在4℃下温育30分钟。在LSR Fortessa细胞计数器上获取数据并且将其用Flow Jo软件进行分析。
表1：用于E7-特异性T细胞的数目的流式细胞术分析的抗体的列表
| 抗体 | 荧光染料 | 克隆 | 公司 |
| 生存力染料 | Zombie Aqua | n.a. | BioLegend |
| CD3 | PerCPeF710 | 17A2 | eBioscience(Thermo Fisher) |
| CD8 | V450 | 53-6.7 | BD Horizon |
IFN-γELISpot评估
使用鼠类IFN-γELISpot试剂盒(Diaclone,USA)。按照制造商的说明书用抗-IFN-γ捕获抗体将微量滴定板(96-孔，Diaclone,USA)包被过夜，并且在37℃下用包含10％FBS的RPMI细胞系培养基将非特异性结合封闭2小时。在第20天，将小鼠安乐死并且收获其脾脏。制备脾细胞的单细胞悬浮液并且以10000个细胞/孔接种入微量滴定板中，有或没有肽刺激。将5ug/mL的E7肽用于在专用孔中的刺激。作为阳性对照，用抗-CD3/抗-CD28珠粒刺激T细胞。将细胞温育24小时。此后，洗涤细胞，并且按照制造商的说明书(Diaclone)对斑点进行显色。通过使用AID ELISpot阅读器(Autoimmun Diagnostika GmbH,Strassberg,Germany)来对斑点进行计数。
结果和讨论
LNP制剂和物理化学特性
通过在NanoAssemblr(PNI)上的微流体混合来产生所有mRNA LNP。简而言之，将由SS-EC、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2000组成的含乙醇脂质混合物与目的mRNA的酸性溶液相混合，如在“材料和方法”部分中所详细解释的那样。关于作为组成成分的脂质的摩尔比(％)为50％CoatsomeSS-EC、10％DOPE、39.5％胆固醇和0.5％DMG-PEG2000。随后将mRNA LNP逆PBS进行透析，并且通过动态光散射(DLS)来测量所有mRNA LNP的尺寸和多分散性(PDI)。如在表2中所示的，所有mRNA LNP都具有相似的尺寸和PDI，不管mRNA形式和E7:TriMix比例。
表2：用于静脉内免疫接种的基于脂质的纳米颗粒的尺寸和PDI(多分散性)
mRNA形式决定对于E7/TriMix mRNA LNP的炎症应答
将mRNA以共转录方式用ARCA帽或CleanCap进行加帽。没有核苷修饰掺入到ARCA帽mRNA(“ARCA，未修饰”mRNA)中。CleanCap mRNA要么不包含经修饰的核苷(“CleanCap，未修饰”mRNA)，要么展示出尿苷被N1-甲基假尿苷的100％置换(“CleanCap，经修饰”mRNA)。为了探讨mRNA形式和TriMix对于炎症应答的影响，将E7 mRNA与TriMix以所示比例相混合并且包囊入LNP中。C57BL/6小鼠接受通过尾静脉施用的10μg mRNA的总剂量。在注射后6和24小时收集血清样品，并且就IFN-a、IFN-g、IL-6、MCP-1、G-CSF和RANTES进行分析。
如从图1中可以意识到的，仅仅用CleanCap替代ARCA而没有掺入N1-甲基假尿苷导致几种(IFN-a、IFN-g、RANTES和MCP-1)而非所有所探讨的细胞因子(IL-6、G-CSF)的显著减少。伴随的尿苷被N1-甲基假尿苷的替代(“CleanCap，经修饰”)进一步减弱了炎症应答，现在相比于“ARCA，未修饰”mRNA而言，所有细胞因子都显著降低了。这些数据与通过胞质RNA感受器的经ARCA加帽的mRNA相对于经CleanCap加帽的mRNA的差异感受相一致，以及与由内体TLR对于N1-甲基假尿苷mRNA的识别降低相一致。令人惊讶地，用TriMix mRNA部分替代E7mRNA没有使炎性细胞因子的血清滴度升高。
接下来我们探讨静脉内注射的包含经CleanCap加帽的、经N1-甲基假尿苷修饰的mRNA的mRNA LNP的炎症应答的动力学(图2)。尽管所有细胞因子在注射后6小时都显示出显著的升高，但是细胞因子滴度在注射后24小时已返回至接近基线，这清楚地表明对于“CleanCap/经修饰”mRNA LNP的细胞因子应答是短暂的并且不引起细胞因子释放综合征。
mRNA形式影响抗原特异性T细胞应答的大小程度和功能性
为了评估mRNA形式对于T细胞应答的大小程度和功能特征的影响，将E7 mRNA以用于不同mRNA形式的所示比例与TriMax mRNA相混合。在第0、7和14天，以10μg的总mRNA剂量用各自mRNA LNP对小鼠进行免疫接种。在第6、13和19天，收集PBMC并且通过流式细胞术进行染色以评估E7-特异性CD8 T细胞的百分比。
如从图3中可以意识到的，用mRNA LNP进行的静脉内免疫接种引发了稳固的E7-特异性T细胞应答，在E7:TriMix比例为5:5的情况下在“CleanCap/未修饰”mRNA LNP和“CleanCap/经修饰”mRNA LNP处理组中引发了最高百分比的E7-特异性T细胞。
在TriMix mRNA不存在(E7:TriMix 10:0)下，在所述三种mRNA形式之间在所引发的T细胞应答的大小程度方面均未观察到显著差异。尽管如此，当一半的E7 mRNA被TriMix替换时(比例5:5)，用“CleanCap/未修饰”mRNA和“CleanCap/经修饰”mRNA进行免疫接种的小鼠显示出相比于用“ARCA/未修饰”mRNA进行免疫接种的小鼠而言显著更高水平的E7-特异性T细胞(图3A)。因此，TriMix的影响明显地依赖于mRNA形式，其中在“ARCA/未修饰”mRNA的情况下TriMix没有显示出益处，但在“CleanCap/经修饰”mRNA的情况下显示出高度显著的益处。
在“CleanCap/经修饰”mRNA的情况下，以5:5比例的E7/TriMix看起来引起相比于7.5:2.5比例而言更强烈的T细胞应答，因此有理由进行额外的研究以进一步优化抗原mRNA与TriMix mRNA的比例。
通过对于在第三次免疫接种后获得的脾细胞的IFN-γELISPOT来进一步分析E7-特异性T细胞应答的大小程度和功能性。像关于在血液中循环的E7-特异性CD8 T细胞我们所观察到的一样，在“ARCA，未修饰”mRNA的情况下，TriMix没有增加产生IFN-γ的脾细胞的数目，但是在“CleanCap/未修饰”mRNA和“CleanCap/经修饰”mRNA的情况下，TriMix增加了应答(图4)。
TriMix不影响体重减轻和肝损害
测量体重减轻和ALT/AST水平，作为关于毒性和肝损害的替代标志物。如从图5中可以意识到的，所有LNP都诱导了短暂的小鼠体重减轻(在注射后24小时最明显，随后迅速恢复)。mRNA形式本身看起来对于体重减轻的程度具有很少的影响，虽然经ARCA加帽的mRNA倾向于引起相比于注射PBS的小鼠而言最高的体重减轻。对于所探讨的mRNA形式，TriMix均未加重体重减轻。
最后，我们评估了静脉内mRNA LNP疫苗接种对于肝脏酶AST/ALT的血清滴度(其用作关于肝损害的替代标志物)的影响。在第三次免疫后一周通过ELISA来评估AST/ALT水平。对于处理组，ALT/AST水平均未强烈地升高。对于经E7/TriMix mRNA LNP处理的小鼠，相比于PBS小鼠而言，未测量到ALT和AST水平的在统计学上显著的增加，不管mRNA形式。令人惊讶地，用仅E7 mRNA LNP进行处理的小鼠显示出低的但是相对于PBS而言显著的AST水平的上调(图6)。
结论
在本研究中，使用事先经优化的LNP制剂，我们探讨了mRNA形式对于抗原/TriMixmRNA疫苗接种的免疫原性和炎症安全性的影响。
用CleanCap替代ARCA导致全身炎症应答的显著下降。用ARCA的共转录加帽的效率为70％左右，其余30％为所产生的具有5’三磷酸末端的mRNA，其被RIG-I所感受。另外，代替天然的经甲基化的Cap1结构，ARCA引入非甲基化的“Cap-0”结构，其再次触发驱动炎症的各种RNA感受器。CleanCap(Cap-1)以较高的效率(>90％)掺入并且引入天然Cap1结构，因此使先天识别和炎症降低。尿苷被N1-甲基尿苷的置换进一步地使IFN-a、IFN-g和IL-6的血清滴度降低，与证明了N1-甲基假尿苷置换使TLR7和RIG-I激活降低的先前报道相一致。重要的是，对于所探讨的E7/TriMix mRNA比例和mRNA形式，TriMix均未加重全身炎症应答。
关于T细胞应答的大小程度和动力学，在TriMix不存在下在mRNA形式之间未观察到显著差异。然而，在添加TriMix后，在mRNA形式之间出现强烈的差异。在高炎性的“ARCA，未修饰”mRNA形式的情况下，TriMix未能进一步增加T细胞应答的大小程度。尽管如此，在低炎性的mRNA形式即“CleanCap，未修饰”和“CleanCap，经修饰”的情况下，TriMix发挥其免疫刺激功能并且导致E7-特异性CD8 T细胞应答的大小程度的强烈增加。类似地，在用“CleanCap，未修饰”mRNA和“CleanCap，经修饰”mRNA进行免疫接种的情况下，TriMix mRNA也提高了分泌FN-γ的T细胞的数目，但在用“ARCA，未修饰”mRNA LNP进行免疫接种的情况下不是这样。
由于其中抗原mRNA被TriMix mRNA部分替换的“CleanCap/经修饰”mRNA LNP激起了最高水平的T细胞应答但最低的炎症应答，在该mRNA LNP形式下我们看起来展示出了最好的治疗指数。
序列表
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1 5
Claims (15)
1.组合，其包含：
-一种或多种编码功能性免疫刺激蛋白CD40L、CD70和caTLR4的mRNA分子；和
-一种或多种编码一种或多种抗原或表位的mRNA分子，
其中所述mRNA分子中的至少一种以具有5’CAP-1结构为特征。
2.权利要求1中所定义的组合，其中所有所述mRNA分子都具有5’CAP-1结构。
3.权利要求1或2中任一项之中所定义的组合，其中所述mRNA分子进一步包含至少一个经修饰的核苷。
4.权利要求3中所定义的组合，其中所述至少一个经修饰的核苷选自包括下列各项的列表：假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基胞苷、2-硫代尿苷和N6-甲基腺苷。
5.权利要求3或4中任一项之中所定义的组合，其中所述至少一个经修饰的核苷为从包括下列各项的列表中选择的假尿苷：4-硫代假尿苷、2-硫代假尿苷、1-羧甲基假尿苷、1-丙炔基假尿苷、1-牛磺酸甲基假尿苷、N1-甲基假尿苷、4-硫代-1-甲基假尿苷、2-硫代-1-甲基假尿苷、1-甲基-1-脱氮假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮假尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、4-甲氧基假尿苷和4-甲氧基-2-硫代假尿苷，特别地N1-甲基假尿苷。
6.权利要求5中所定义的组合，其中在所述mRNA分子中的尿苷的大约100％被N1-甲基假尿苷替代。
7.药用组合物，其包含权利要求1至6中任一项之中所定义的组合和至少一种在药学上可接受的试剂。
8.权利要求7中所定义的药用组合物，其中所述组合被配制成纳米颗粒，例如脂质纳米颗粒或聚合物纳米颗粒。
9.权利要求7或8中任一项之中所定义的药用组合物，其中所述组合物被配制成用于静脉内、结内、肿瘤内、皮下、真皮内或肌内制剂。
10.权利要求7-9中任一项之中所定义的药用组合物，其中所述组合物以疫苗的形式。
11.权利要求1至6中任一项之中所定义的组合或者权利要求7至10中任一项之中所定义的药用组合物，其用于在人或兽医医学中使用。
12.权利要求1至6中任一项之中所定义的组合或者权利要求7至10中任一项之中所定义的药用组合物，其用于在疫苗接种中使用。
13.权利要求1至6中任一项之中所定义的组合或者权利要求7至10中任一项之中所定义的药用组合物，其中所述抗原为癌症抗原。
14.权利要求1至6中任一项之中所定义的组合或者权利要求7至10中任一项之中所定义的药用组合物，其用于在治疗细胞增殖性病症中使用。
15.用于治疗细胞增殖性病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用权利要求1至6中任一项之中所定义的组合或者权利要求7至10中任一项之中所定义的药用组合物。
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