CN114088874B - 一种基于液相可视化阵列的食醋总酸含量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于液相可视化阵列的食醋总酸含量检测方法，属于食品农产品无损检测技术领域。本方法基于指示剂置换反应构建了一个3×3的液相可视化传感器阵列用于食醋总酸含量的测定，将颜色信号进行数字化，分别获取9个阵列单元的RGB值并结合化学计量学方法，实现食醋中总酸含量的定量预测。本发明中的方法具有操作简单、可视化的特点，可以对食醋品质的进行快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于液相可视化阵列的食醋总酸含量检测方法，主要是对酿造食醋的总酸含量进行测定，属于食品农产品无损检测技术领域。
背景技术
酿造食醋是以粮食或者果蔬为主要原料，经过酒精发酵和醋酸发酵酿造而成的液体调味品，在人们日常饮食中占据着重要地位。食醋作为一种酸性调味品，其酸味成分主要是有机酸，大部分的有机酸是在酒精、醋酸发酵过程中由微生物发酵形成的，另一部分来自原料本身。食醋中的主要有机酸包括乙酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等。其中，乙酸是食醋中的主要成分，根据国家标准GB/T 5009.41-2003，总酸含量是评价食醋质量的重要指标。所有不符合这些标准要求的食醋产品都可能对消费者造成健康风险。因此，迫切需要一种简单、快速、准确的方法来测定食醋中总酸含量。
食醋中总酸含量的测定方法主要是国标(GB/T 5009.41-2003)中的滴定法。然而，传统的滴定法包括许多操作步骤，如样品预处理、化学试剂的制备及仪器分析等，检测人员劳动强度大，耗时长，效率低。
比色传感器阵列(CSA)是近年来发展起来的一种基于模拟哺乳动物嗅觉和味觉系统的新型传感技术，通过比较敏感指示剂和传感器阵列中分析物之间的交叉响应形成的指纹图谱，可以实现多种物质及复杂混合物的识别。与传统检测技术相比，CSA具有方法简单、响应速度快、信息量大、成本低等优点，在有毒气体、离子、小分子的检测以及食品和饮料的质量控制(如茶叶、白酒、食醋)等方面得到了广泛应用。在所构建比色传感器的方法当中，基于指示剂置换反应(IDA)的比色传感器是一种简单有效的分析方法，其检测原理为指示剂首先与受体形成复合物，当体系中加入目标分析物时，由于与受体有更强的竞争性结合能力，指示剂被目标物替代从而产生相应的颜色响应。对每个样品反应前后图像RGB值的数字减影，可得到一个可视化的差谱图和多维的差分向量，通过差谱图和模式识别算法分析可区分多种物质。
本发明基于指示剂置换反应，以筛选出的邻苯二酚紫(PV)、二甲酚橙(XO)、灿烂黄(BY)、茜素红S(ARS)为指示剂，Cu2+、Zn2+、Ni2+为受体构建CSA。将上述四种指示剂和三种受体进行整合，并以pH指示剂甲酚红作为一个敏感点验证IDA阵列对有机酸的置换能力，得到一个3×3的传感器阵列。最后，将构建的CSA用于食醋总酸含量的测定，将颜色信号进行数字化，分别获取9个阵列单元的RGB值并结合化学计量学方法，实现食醋中总酸含量的定量测定。本发明将为食醋中总酸含量的测定提供一种简单有效方法，促进食醋行业规范发展。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种食醋总酸含量的测定方法，与传统的滴定法不同，主要是通过制备一种基于IDA的液相可视化传感阵列，并将该阵列应用于食醋总酸含量测定，提取传感器阵列反应前后的差值图像特征响应信号，并结合合适的化学计量学方法，建立传感器特征值与食醋总酸含量的相关关系，实现食醋中总酸含量的定量测定。
本发明采用的技术方案如下：一种基于液相可视化阵列的食醋总酸含量检测方法，按照下述步骤进行：
步骤1：基于IDA的液相可视化传感阵列的制备
取干净的96孔板，每孔依次加入指示剂、不同pH的N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)缓冲液和金属离子溶液，用移液枪吹吸均匀，制备3×3传感器阵列。
步骤2：根据国家标准GB/T 5009.41-2003采用滴定法测定食醋中总酸含量。
步骤3：利用步骤1制备的可视化传感器与食醋溶液反应，用扫描仪采集可视化传感器阵列反应前后的图像并保存至计算机中；
步骤4：处理采集得到的图像以获取差值图像，提取可视化阵列数据，将可视化检测结果与滴定法测定结果建立相关关系；最后，根据结果实现利用可视化技术对食醋中总酸含量进行定量预测。
其中步骤1中所述指示剂为邻苯二酚紫(PV)、二甲酚橙(XO)、灿烂黄(BY)、茜素红S(ARS)；所述金属离子为二水乙酸锌((CH3COO)2Zn·2H2O)，五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)，六水氯化镍(NiCl2·6H2O)。
其中步骤1中所述指示剂用量为30μL，浓度为0.6-1.6mM；所述HEPES缓冲液用量为210μL，浓度为10mM，pH为5-9；所述金属离子浓度为0.3-3.2mM；通过整合上述四种指示剂与三种金属离子，并再包含一个pH指示剂甲酚红，制备3×3传感器阵列。
其中步骤2中，采用滴定法测定食醋中总酸含量，具体实施步骤如下进行：
吸取10mL食醋样品，用去离子水稀释10倍，然后取20mL稀释液至200mL烧杯中，并加入60mL去离子水，用浓度为0.05M的NaOH标定液滴定上述混合液，当pH为8.2时停止滴定。记录消耗的NaOH标定液的体积，根据国标GB/T 5009.41-2003中的公式计算食醋中总酸的含量。
其中步骤3中，根据步骤1制备CAS，然后吸取30μL稀释100倍的食醋样品于传感器阵列中，平衡5min后，用平板扫描仪获取CAS反应前后的图像并保存至计算机中。
其中步骤4中，传感器阵列的图像特征提取，可按照下述步骤进行：平板扫描仪采集到的反应前后的每幅图像为RGB三通道彩色图像，利用计算机将图像分别分解为三幅单通道灰度图像，分别对应原始图像的R通道、G通道以及B通道；利用图像处理算法定位敏感单元的位置，将传感器阵列反应前后各敏感单元的灰度均值作差，得到灰度均值的差值，这些差值即为敏感单元的特征值，如，ΔR＝Ra-Rb，ΔG＝Ga-Gb,ΔB＝Ba-Bb。其中，下标为a表示反应后的值，下标为b表示反应前的值。步骤1中制备的CAS为3×3阵列，每个敏感单元获得了3个特征变量，所有敏感单元的特征值组合后即得到变量为27的特征矩阵。
其中步骤4中，所述将可视化检测结果与滴定法测定结果建立相关关系。以所有敏感单元的特征值组合为自变量，以步骤2的测定结果为因变量，利用线性的偏最小二乘法(PLS)和非线性的支持向量回归(SVR)两种模型分别建立CAS数据和总酸含量之间的相关关系。调用已建立好的模型，将未知样本的可视化数据输入模型，即可输出未知样本的总酸含量，从而实现基于液相可视化阵列的食醋总酸含量的检测。
本发明的有益效果：本发明提出的一种基于液相可视化阵列的食醋总酸含量检测方法，是将可视化技术应用于酿造食品检测的一种积极探索。较传统滴定法相比，可对食醋中总酸含量实现快速测定。本发明也可应用于食醋酿造过程中总酸含量的监测，增加食醋产业自动化程度，减少人工操作，提高生产力，增加创收。
附图说明
图1为按照实施例1制备的液相比色传感器阵列。
图2为实施例1制得的液相比色传感器阵列时间稳定性结果图(图2A为传感器与30μL 10mM乙酸反应0-35分钟的特征图像；图2B为传感器与30μL 10mM乙酸反应各个传感单元0-35min的欧氏距离)。
图3为镇江香醋总酸含量的PLS模型训练集(a)和测试集(b)预测结果
图4为镇江香醋总酸含量的SVR模型训练集(a)和测试集(b)预测结果
图5为苹果醋发酵过程中总酸含量监测的PLS模型
图6为苹果醋发酵过程中总酸含量监测的SVR模型
具体实施方式
下面通过实例进一步描述本发明，并结合附图说明使得本技术方案更加清晰易懂，显然，所列举的实施例并不是全部的实施例，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进替换或变型均属于本发明的保护范围。
实施例1：液相比色传感器阵列的制备
在干净的96孔板中制备3×3液相比色传感器阵列，每个传感单元中依次加入30μL指示剂、210μL 10mM HEPES缓冲液和30μL金属离子溶液，具体为S1：1.0mM PV+1.0mM Zn2+，HEPES缓冲液的pH为7；S2：1.0mM PV+2.0mM Ni2+，HEPES缓冲液的pH为7；S3：0.6mM PV+0.9mMCu2+，HEPES缓冲液的pH为5；S4：0.6mM XO+0.9mM Ni2+，HEPES缓冲液的pH为6；S5：0.6mM XO+0.6mM Cu2+，HEPES缓冲液的pH为6；S6：0.6mM XO+0.9mM Zn2+，HEPES缓冲液的pH为5；S7：270μL 0.23mg·mL-1的甲酚红；S8：1.6mM ARS+2.4mM Cu2+，HEPES缓冲液的pH为7；S9：1.0mM BY+1.5mM Cu2+，HEPES缓冲液的pH为9。最后用移液枪吹吸均匀，平衡5min后备用。
图2为实施例1制得的液相比色传感器阵列时间稳定性结果图。以乙酸作为目标物，将30μL 10mM的乙酸加入到制备的传感器阵列中，吹吸均匀后放入平板扫描仪中，每隔5min采集一次图像，如图2A所示，传感器阵列在前10分钟内是稳定的。虽然差值图像在10分钟之后略有变化，但在10-35分钟内保持相对恒定。每个传感单元0-35min的欧氏距离变化如图2B所示，可以看出传感器S1、S4、S6、S8和S9在35分钟内的欧氏距离相对恒定，而传感器S2、S3、S5和S7在35分钟内缓慢下降，但下降程度没有超过18％。
实施例2：液相比色传感器阵列用于测定镇江香醋中总酸含量
(1)实施样本根据GB/T 18623-2011《地理标志产品镇江香醋》，选择5种等级的镇江香醋，分别是二级、一级、优级、特级和特酿级醋。每个等级选购3个批次，每个批次5个样本，共计75个样本。
(2)根据国家标准GB/T 5009.41-2003采用滴定法测定镇江香醋中总酸含量。
(3)应用实施例1制备的液相比色传感器阵列检测食醋样品。先将传感器与去离子水反应，作为空白对照。然后，取30μL稀释100倍的食醋样品于传感器阵列中，平衡5min后，用平板扫描仪获取CAS反应前后的图像并保存至计算机中。
(4)计算机对采集的图像，进行中值滤波、阈值分割、特征区域提取，获取色敏传感器上每个敏感单元与腐乳样品反应前后的R、G、B灰度均值。并将反应前后的值做差值得到ΔR＝Ba-Bb，ΔG＝Ga-Gb，ΔB＝Ba-Bb。所得的差值即为传感器的响应值。每个传感单元获得了3个特征变量，所有传感单元的特征值组合后即得到变量为27的特征矩阵X。X为m×n的矩阵，其中m代表样品数，n代表特征变量数，在本实施例中，m＝75，n＝27。
(5)将可视化检测结果与滴定法测定结果建立相关关系。对矩阵X按照2：1比例采用随机分组算法分组，选择其中的2/3作为训练集，1/3作为测试集构建预测模型，采用PLS、SVR建立可视化特征变量与总酸含量的相关关系。图3和图4为镇江香醋总酸含量的PLS和SVR模型训练集和测试集的预测结果。两个模型的测试集的相关系数均达到了0.85以上，表明PLS模型和SVR模型均能够实现对镇江香醋总酸含量的定量预测。通过比较可知，SVR模型具有较高的相关系数与较低的均方根误差，训练集输出值与实际的滴定法测定值的相关系数RC为0.9353，RMSECV为0.3895；测试集预测值与实际的滴定法测定值的相关系数RP为0.9234，RMSEP为0.4756。
实施例3：液相比色传感器阵列用于监测苹果醋发酵过程中总酸含量的变化
(1)实施样本选自苹果醋酿造过程中自分割补料后0h，6h，12h，18h，22h，26h，28h，30h，32h，34h(发酵结束)的苹果醋样品，每个时间点取3个样本，共计30个样本。
(2)根据国家标准GB/T 5009.41-2003采用滴定法测定苹果醋中总酸含量。
(3)应用实施例1制备的液相比色传感器阵列检测食醋样品。先将传感器与去离子水反应，作为空白对照。然后，取30μL稀释100倍的食醋样品于传感器阵列中，平衡5min后，用平板扫描仪获取CAS反应前后的图像并保存至计算机中。
(4)计算机对采集的图像，进行中值滤波、阈值分割、特征区域提取，获取色敏传感器上每个敏感单元与腐乳样品反应前后的R、G、B灰度均值。并将反应前后的值做差值得到ΔR＝Ba-Bb，ΔG＝Ga-Gb，ΔB＝Ba-Bb。所得的差值即为传感器的响应值。每个传感单元获得了3个特征变量，所有传感单元的特征值组合后即得到变量为27的特征矩阵X。X为m×n的矩阵，其中m代表样品数，n代表特征变量数，在本实施例中，共计30个苹果醋样品，每个样品平行测定5次，因此，m＝150，n＝27。
将可视化检测结果与滴定法测定结果建立相关关系。对矩阵X按照2：1比例采用随机分组算法分组，选择其中的2/3作为训练集，1/3作为测试集构建预测模型，采用PLS、SVR建立可视化特征变量与总酸含量的相关关系。图5和图6为苹果醋发酵过程中总酸含量监测的PLS和SVR模型预测结果。在PLS模型中，训练集输出值与实际的滴定法测定值的相关系数RC为0.8343，RMSECV为0.2368；测试集预测值与实际的滴定法测定值的相关系数RP为0.8295，RMSEP为0.2413。在SVR模型中，训练集输出值与实际的滴定法测定值的相关系数RC为0.9806，RMSECV为0.0082；测试集预测值与实际的滴定法测定值的相关系数RP为0.8707，RMSEP为0.0545。PLS模型和SVR模型均能够实现对苹果醋发酵过程中总酸含量的监测，其中，SVR模型具有较高的相关系数与较低的均方根误差，模型更优。
Claims (3)
1.一种基于液相可视化阵列的食醋总酸含量检测方法，其特征在于：按照下述步骤进行：
步骤1：基于IDA的液相可视化传感器阵列的制备
取干净的96孔板，每孔依次加入指示剂、不同pH的N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)缓冲液和金属离子溶液，用移液枪吹吸均匀，制备3×3传感器阵列；
步骤2：根据国家标准GB/T 5009.41-2003采用滴定法测定食醋中总酸含量；
步骤3：利用步骤1制备的可视化传感器阵列与食醋溶液反应，用扫描仪采集可视化传感器阵列反应前后的图像并保存至计算机中；
步骤4：处理采集得到的图像以获取差值图像，提取可视化阵列数据，将可视化检测结果与滴定法测定结果建立相关关系；最后，根据结果实现利用可视化技术对食醋中总酸含量进行定量预测；
其中步骤1中，基于IDA的液相可视化传感器阵列的制备具体步骤如下：
在干净的96孔板中制备3×3液相比色传感器阵列，每个传感单元中依次加入30μL指示剂、210μL 10mM HEPES缓冲液和30μL金属离子溶液，具体为S1：1.0mM PV+1.0mM Zn2+，HEPES缓冲液的pH为7；S2：1.0mM PV+2.0mM Ni2+，HEPES缓冲液的pH为7；S3：0.6mM PV+0.9mM Cu2 +，HEPES缓冲液的pH为5；S4：0.6mM XO+0.9mM Ni2+，HEPES缓冲液的pH为6；S5：0.6mM XO+0.6mM Cu2+，HEPES缓冲液的pH为6；S6：0.6mM XO+0.9mM Zn2+，HEPES缓冲液的pH为5；S7：270μL 0.23mg·mL-1的甲酚红；S8：1.6mM ARS+2.4mM Cu2+，HEPES缓冲液的pH为7；S9：1.0mM BY+1.5mM Cu2+，HEPES缓冲液的pH为9；最后用移液枪吹吸均匀，平衡5min后备用；
其中步骤4中，传感器阵列的图像特征提取，可按照下述步骤进行：平板扫描仪采集到的反应前后的每幅图像为RGB三通道彩色图像，利用计算机将图像分别分解为三幅单通道灰度图像，分别对应原始图像的R通道、G通道以及B通道；利用图像处理算法定位敏感单元的位置，将传感器阵列反应前后各敏感单元的灰度均值作差，得到灰度均值的差值，这些差值即为敏感单元的特征值，如，△R＝Ra-Rb，△G＝Ga-Gb，△B＝Ba-Bb；其中，下标为a表示反应后的值，下标为b表示反应前的值；步骤1中制备的CAS为3×3阵列，每个敏感单元获得了3个特征变量，所有敏感单元的特征值组合后即得到变量为27的特征矩阵；
其中步骤4中，以所有敏感单元的特征值组合为自变量，以步骤2的测定结果为因变量，利用线性的偏最小二乘法(PLS)和非线性的支持向量回归(SVR)两种模型分别建立可视化数据和总酸含量之间的相关关系；调用已建立好的模型，将未知样本的可视化数据输入模型，即可输出未知样本的总酸含量，从而实现基于液相可视化阵列的食醋总酸含量的检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于液相可视化阵列的食醋总酸含量检测方法，其特征在于其中步骤2中，采用滴定法测定食醋中总酸含量，具体实施步骤如下进行：
吸取10mL食醋样品，用去离子水稀释10倍，然后取20mL稀释液至200mL烧杯中，并加入60mL去离子水，用浓度为0.05M的NaOH标定液滴定上述混合液，当pH为8.2时停止滴定；记录消耗的NaOH标定液的体积，根据国标GB/T 5009.41-2003中的公式计算食醋中总酸的含量。
3.根据权利要求1所述的一种基于液相可视化阵列的食醋总酸含量检测方法，其特征在于其中步骤3中，利用制备的液相可视化传感器阵列与食醋溶液反应，吸取30μL稀释100倍的食醋样品于传感器阵列中，平衡5min后，用平板扫描仪获取CAS反应前后的图像并保存至计算机中。
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