CN114085881A - 提高法夫酵母虾青素产量的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高法夫酵母虾青素产量的方法及应用。该方法包括：利用法夫酵母进行补料分批发酵培养生产虾青素，其中，补料分批发酵过程中，包括补加碳源和补加无机离子营养成分培养基的步骤，无机离子营养成分培养基的补加量通过发酵体系的电导率来调控。电导率可准确反映法夫酵母发酵体系无机离子营养物质的浓度水平和消耗情况，通过在法夫酵母补料分批发酵过程中向发酵体系补加碳源，并对发酵体系的电导率进行在线检测，并实时、直观、有效、精确地指导无机离子营养物质的补加，从而促进菌体高密度培养和虾青素产量的提高，从而能在100m3的发酵罐上实现产业化应用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，更具体地，涉及一种提高法夫酵母虾青素产量的方法及应用。
背景技术
虾青素(Astaxanthin)是一种含氧类胡萝卜素，其抗氧化能力是β-胡萝卜素的10倍，比维生素E强百倍以上，被誉为“超级维生素E”，在延缓衰老、提高免疫，防治肿瘤、心血管疾病和糖尿病等方面显示作用。出于对化学合成法有害物质残留的担忧，包括自身能合成虾青素的雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、法夫酵母(Phaffia rhodozyma)和胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)以及包括工程菌大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)在内的微生物生产系统正在或将要成为虾青素主要的商业生产方式。
法夫酵母作为虾青素的重要来源，虽然具有生长迅速、菌浓较高、安全可靠和易于产业化的特点，但仍存在培养温度低、产量低、碳源消耗大、耗氧水平高等技术瓶颈，亟需进一步提升法夫酵母虾青素的产量水平。针对此，学术界和产业界围绕基因组特性、菌株筛选、代谢改造、培养基优化、促进因子筛选、环境胁迫、发酵过程控制等方面进行了全方位、多尺度的考察。法夫酵母发酵方面的研究已相当广泛，朱晓立等运用正交设计优选培养基成份，用此优化培养基摇瓶培养法夫酵母，获得生物量16.92g/L、虾青素含量903μg/g和虾青素产量15279μg/L。AN等用含尿素和NaH2PO4的糖蜜作原料，在100L中试规模发酵罐上最大生物量为36g/L，类胡萝卜素产量为40mg/L。倪辉等报道，自动流加调控pH值比间歇调控pH值更有利于法夫酵母细胞的生长及虾青素合成，1m3发酵罐中试生产生物量及虾青素产量分别达到85.11g/L和279.96mg/L。YAMANE等认为高C/N比提高虾青素的产量，过高葡萄糖浓度将抑制细胞增殖，并提出细胞生长期控制低C/N比，虾青素生产期控制高C/N比的两阶段补糖方式。但是，上述研究均未能在产量上获得实质性突破，难以满足工业化生产的需求。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种提高法夫酵母虾青素产量的方法及应用，以解决现有技术中法夫酵母发酵生产虾青素产量低的缺陷。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种提高法夫酵母虾青素产量的方法，该方法包括：利用法夫酵母进行补料分批发酵培养生产虾青素，其中，补料分批发酵过程中，包括补加碳源和补加无机离子营养成分培养基的步骤，其中，无机离子营养成分培养基的补加量通过发酵体系的电导率来调控。
进一步地，无机离子营养成分培养基的补加量通过控制发酵体系的电导率在2.5～20.0ms/cm，优选为5.0～12.0ms/cm范围内来确定。
进一步地，发酵体系的电导率采用活细胞传感仪进行在线采集监控。
进一步地，无机离子营养成分培养基的补加方式为一次性补加、分批间歇补加或反馈连续补加。
进一步地，无机离子营养成分培养基的补加时机为发酵10～120h后，优选为发酵20～72h后，进一步优选为发酵48～72h后。
进一步地，按照g/L浓度计，无机离子营养成分培养基包括：K2SO4 5～15、Na2SO40.2～1.0、MgSO4·7H2O 6.0～18.0、CaCl2 1.0～2.0、微量金属溶液5.0～20.0、维生素溶液5.0～20.0；其中，按照g/L浓度计，微量金属溶液包括：H3BO3 0.5～5.0、CuSO4·5H2O 0.5～10.0、KI 0.05～0.5、MnCl2 0.4～8.0、Na2MoO4·2H2O 0.5～5.0、ZnSO4·7H2O 5～100、CoCl2 0.3～3.0及柠檬酸铁5～100；优选地，按照g/L浓度计，维生素溶液包括：泛酸钙2.0～40.0、生物素0.05～1.0、肌醇5～100、尼克酸0.5～5.0、对氨基苯甲酸0.1～2.0、VB6 0.1～4.0、VB1 0.1～4.0、核黄素0.2～8.0；优选地，无机离子营养成分培养基pH值为5.0～6.5。
进一步地，在补料分批发酵过程中，补加碳源采用指数补料与DO-STAT补料相结合的方式进行补加；优选地，当发酵体系的溶氧上升到60～80％后设定比生长速率μ为0.02～0.10h-1进行指数补料；当检测到进入指数补料后期且发酵液中乙醇含量为1～10g/L时，进行DO-STAT补料，DO-STAT补料的溶氧关联值为20～60％；当溶氧低于关联值时，停止补糖，当溶氧高于关联值时，开始补加补糖培养基；优选地，按照g/L浓度计，补糖培养基包括：葡萄糖75～300、麦芽糊精75～300、糖蜜20～100；更优选，补糖培养基包括：包括葡萄糖175～180、麦芽糊精175～180、糖蜜50～55。
进一步地，在补料分批发酵过程中，还包括补加乳酸，更优选在发酵36～60h和84～108h各补加3～10g/L乳酸。
进一步地，在补料分批发酵过程中，方法还包括全程用氨水控制发酵体系的pH值为4.5～6.0；优选地，在补料分批发酵之前，方法还包括：对法夫酵母依次进行固体培养和种子培养。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了上述任一种方法在法夫酵母虾青素生产中的应用。
应用本发明的技术方案，电导率可准确反映法夫酵母发酵体系无机离子营养物质的浓度水平和消耗情况，通过在法夫酵母补料分批发酵过程中向发酵体系补加碳源，并对发酵体系的电导率进行在线检测，并实时、直观、有效、精确地指导无机离子营养物质的补加，从而促进菌体高密度培养和虾青素产量的提高。该方法能在100m3发酵罐上实现产业化应用。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，现有技术中有多种不同的提高法夫酵母虾青素产量的方法，但均存在产量低的缺陷，为了改善这一现状，本申请在将现有的多种不同的方法进行结合或改良的基础上进一步地，结合发酵过程中营养成分的变化，尝试根据某种或某些营养成分的变化来补充相应量的营养成分，以维持整个发酵过程中营养成分的均衡，从而确保发酵过程的正常进行。
而在研究中发现，现有方法都主要从碳源、氮源或C/N角度进行营养补充，而没有考虑其他因素对发酵过程的影响，比如无机离子等的变化。进一步研究发现：法夫酵母发酵过程中几乎不产生有机酸，因而发酵体系中无机离子的变化基本能够体现营养成分中无机离子的消耗水平。电导率表示溶液传导电流的能力，通过利用电导率可反映无机离子的消耗水平，因而可作为法夫酵母补料工艺环节的一项指导参数。若在现有的方法中，增加对无机离子的监控将有助于保持发酵过程中的无机离子的平衡，从而促进法夫酵母的生长和繁殖，进而提高虾青素的产量。而后，发明人通过实验进一步确认了相比现有的方法，通过控制整个发酵体系的电导率来对无机离子进行合理补加，的确能够大幅提高虾青素的产量。
在上述研究结果的基础上，申请人提出了本申请的技术方案。在一种典型的实施方式中，提供了一种提供发夫酵母虾青素产量的方法，该方法包括：利用法夫酵母进行补料分批发酵培养生产虾青素，其中，补料分批发酵过程中，包括补加碳源和补加无机离子营养成分培养基的步骤，其中，无机离子营养成分培养基的补加量通过发酵体系的电导率来调控。
电导率可准确反映法夫酵母发酵体系无机离子营养物质的浓度水平和消耗情况，通过在法夫酵母补料分批发酵过程中对发酵体系的电导率进行在线检测，并实时、直观、有效、精确地指导无机离子营养物质的补加，从而促进菌体高密度培养和虾青素产量的提高。该方法能在100m3发酵罐上实现产业化应用。
需要说明的是，上述方法中并未排除现有方法中对其他营养成分的补加，而是可以与现有的补料方式进行结合来进一步提高现有方法的产量。上述采用补料分批发酵可以解除底物抑制、葡萄糖效应、代谢阻遏等问题，应用非常广泛。此外，适用于本发明方法的法夫酵母菌株，没有特别限制，可以是自然筛选菌株也可以是传统化学、物理诱变得到的突变株或应用基因工程方法改造的工程菌。
上述电导率的适用范围，可以根据具体法夫酵母菌株等来确定。在本申请一种优选的实施例中，无机离子营养成分培养基的补加量通过控制发酵体系的电导率在2.5～20.0ms/cm，优选为5.0～12.0ms/cm范围内来确定。
在一种优选的实施例中，发酵体系的电导率采用活细胞传感仪进行在线采集监控。活细胞传感仪可以同时作为活细胞和电导率的在线检测和控制手段，通过在线测定的电导率，有助于向法夫酵母培养体系中适时、适量补加无机离子营养成分培养基，维持发酵体系的营养所需，从而提高虾青素产量水平。
补料按成分可以分为单组分补料和多组分补料，按发酵体积分可以分为变体积补料和恒体积补料，按补料时间是否连续分为间隙补料和连续补料，连续补料按补料速度又分为恒速补料、指数补料和变速补料。
现有的补料策略主要有开环控制和闭环控制两种。前者主要研究补料的方式、补料时间、补料的多少以及补料速度等，而闭环控制又称反馈控制分为直接法和间接法。间接法主要通过一些能够反映微生物生长状况的理化参数和生物参数(如pH、泡沫、DO等)来反馈发酵情况，进而调整补料速率，保证发酵过程正常进行，主要有DO-stat法、pH-stat法以及PQ-stat法等。直接法直接以限制性基质浓度作为反馈参数，当基质浓度过低不足以提供菌体生产和代谢所需时，通过控制C源、N源以及C/N等方式达到发酵持续进行的目的。由于能够直接测定基质含量的传感器的缺乏，因此只有极少量的底物可以在线直接测定，因而反馈调节基本以间接法为主。
在本申请一种优选的实施例中，无机离子营养成分培养基的补加方式可以根据补加时间是否连续，选择一次性补加、分批间歇补加或反馈连续补加。在反馈连续补加这一方式中，可以利用活细胞传感仪的偶联补料泵和电导率的功能，在电导率降低时，通过活细胞传感仪控制泵的转动，实现实时反馈控制及补加控制。而前两种方法时，活细胞传感仪更多地是起检测的作用，补加量通过手动控制泵实现补加。
上述无机离子营养成分培养基根据基础发酵培养基进行合理配置。在一种优选的实施例中，无机离子营养成分培养基的补加时机为发酵10～120h后，优选为发酵20～72h后，进一步优选为发酵48～72h后。补加时机的选择以菌体繁殖量达到一定程度为再加为好，当发酵时间较短时，菌量比较少，无机离子营养成分还比较充足，此时补加效果不明显。而当补加时机过晚，菌已生长至将衰阶段，即使补加营养，也难以有明显的改善作用。
在一种优选的实施例中，按照g/L浓度计，无机离子营养成分培养基包括：K2SO4 5～15、Na2SO4 0.2～1.0、MgSO4·7H2O 6.0～18.0、CaCl2 1.0～2.0、微量金属溶液5.0～20.0、维生素溶液5.0～20.0，其中，按照g/L浓度计，微量金属溶液包括：H3BO3 0.5～5.0、CuSO4·5H2O 0.5～10.0、KI 0.05～0.5、MnCl2 0.4～8.0、Na2MoO4·2H2O 0.5～5.0、ZnSO4·7H2O 5～100、CoCl2 0.3～3.0及柠檬酸铁5～100。上述无机离子营养成分根据具体培养过程中所用基础培养基成分进行合理调整得到。同时含有上述含量和成分的无机离子营养成分培养基在合适的时机补加至发酵体系周时，能够明显促进法夫酵母的生产和繁殖，从而能够更大程度上提高虾青素的产量。
在一种优选的实施例中，按照g/L浓度计，维生素溶液包括：泛酸钙2.0～40.0、生物素0.05～1.0、肌醇5～100、尼克酸0.5～5.0、对氨基苯甲酸0.1～2.0、VB6 0.1～4.0、VB10.1～4.0、核黄素0.2～8.0；
在一种优选的实施例中，无机离子营养成分培养基pH值为5.0～6.5。
较为具体的，无机离子营养成分培养基含有如下成份及含量(g/L)：K2SO4 8、Na2SO4 0.60、MgSO4·7H2O 12.0、CaCl2 1.5、微量金属溶液2、维生素溶液2。微量金属溶液含如下成份(g/L)：H3BO3 2.67、CuSO4·5H2O 1.6、KI 0.27、MnCl2 2.70、Na2MoO4·2H2O 1.07、ZnSO4·7H2O 24、CoCl2 0.8及柠檬酸铁24；维生素溶液含如下成份(g/L)：泛酸钙5.2、生物素0.13、肌醇66.67、尼克酸5.2、对氨基苯甲酸0.53、VB6 2.67、VB1 2.67、核黄素5.2。
在一种优选的实施例中，在补料分批发酵过程中，该方法还包括对碳源进行补料，优选地，对碳源采用指数补料与DO-STAT补料相结合的方式进行补料；更优选地，当发酵体系中的溶氧上升到60～80％后设定比生长速率μ为0.02～0.10h-1进行指数补料；当检测到进入指数补料后期且发酵液中乙醇含量为1～10g/L时，进行DO-STAT补料，DO-STAT补料的溶氧关联值为20～60％；当溶氧低于关联值时，停止补糖，当溶氧高于关联值时，开始补加补糖培养基。
在一种优选的实施例中，按照g/L浓度计，补糖培养基包括：葡萄糖75～300、麦芽糊精75～300、糖蜜20～100；更优选包括葡萄糖175～180、麦芽糊精175～180、糖蜜50～55。
更优选地，采用两阶段补糖工艺补加碳源，并控制相关环境和生理等工艺参数，获得高产量虾青素法夫酵母培养液，具体地，两阶段补糖工艺包括如下步骤：
I)分批培养：发酵起始到基础料碳源消耗完毕，溶氧上升到60～80％以上期间，不补料；
II)指数补料：溶氧上升到60～80％以上之后，按指数补料补加补糖培养基，控制比生长速率μ为0.02～0.10h-1，每0.5～2.0h改变补料速率，补料速率按以下公式计算：
F＝μV0ρc0eμt/[YX/S(ρSF-ρS)]，其中：
F为补料速率(L/h)；
μ为所设定的酵母比生长速率(h-1)；
V0为补料开始罐内培养基体积(L)；
ρc0为开始补料时罐内菌体质量浓度(g/L)；
YX/S为菌体得率(％)；
ρSF为补料培养基的总糖质量浓度(g/L)；
ρS为开始补料时罐内总糖质量浓度(g/L)；
t为指数补料时间(h)；
III)DO-STAT补料：指数补料至指数补料后期，发酵液中检测到1～10g/L乙醇时，将补料方式改为DO-STAT补料，DO-STAT补料溶氧关联值为20～60％，当溶氧低于设定值时停止补糖，当溶氧高于设定值时开始补糖。
上述优选实施例中提供的补糖培养基有利于菌体生长和效价提高，适合法夫酵母高密度培养，且原料价格低廉，具有商业化应用的成本竞争优势。上述优选实施例中采用指数补料和DO-STAT补料相结合的补糖策略能降低Crabtree效应，降低碳溢流生成的乙醇含量，发酵副产物中乙醇含量降低，有利于细胞增殖和虾青素产量的提高。
在一种优选的实施例中，在补料分批发酵过程中，还包括补加乳酸，更优选在发酵36～60h和84～108h各补加3～10g/L乳酸。
在一种优选的实施例中，在补料分批发酵过程中，方法还包括全程用氨水控制发酵体系的pH值为4.5～6.0。
上述优选的实施例中，指数补料是指按照指数增加的流加速度补加补糖培养基，补料的流加速度呈指数增加，在比生产速率为恒定值的情况下，菌体浓度呈指数增加。
在进行上述补料分批发酵之前，该方法还包括：对法夫酵母依次进行固体培养和种子培养。工业发酵中利用生产菌发酵得出最终产物是一个逐级放大的过程，各个不同阶段对营养成分的要求也各有特点。根据发酵不同阶段的要求，在发酵培养之前，还包括对法夫酵母依次进行固体培养和种子培养的阶段。相应地，各阶段的培养基也有所不同。在本申请一种优选的实施例中，上述固体培养的步骤包括：取-80℃冰箱保藏的法夫酵母冷冻甘油保藏液，融化后用接种环蘸取解冻液，进行平板划线，培养温度17～24℃，培养4～8天长出较大单菌落。固体培养基：葡萄糖10、蛋白胨5、麦芽抽提物3、酵母浸粉3、琼脂20，消前(消前：高压灭菌消毒前，行业简称“消前”)pH值6.0。
种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮，成为活力强的“种子”。因此，要求营养成分丰富、完全、氮源及维生素含量也要高些。最后一级的种子培养基的成分最好能够接近发酵培养基，这样可以使种子进入发酵培养阶段后能够迅速适应，快速生长。
在本申请一种优选的实施例中，种子培养阶段包括种子瓶培养阶段和种子罐培养阶段，其中，种子瓶培养阶段包括：一级种子瓶培养时，用接种环蘸取3～5个颜色较红、菌落较大的单菌落，接种种子培养基(10mL/50mL试管)。二级种子瓶培养时，按5～20％接种比例取上述一级种子瓶培养液二次接种种子培养基(30mL/250mL三角瓶)。一级、二级种子瓶培养，培养温度17～24℃，摇床转速150～250rpm，一级种子瓶培养时间为36～72h，二级种子瓶培养时间为24～48h。种子培养基含有如下成份(g/L)：葡萄糖20、麦芽浸粉6、蛋白胨10、酵母浸粉6、CaCl2 0.1、KH2PO4 1、MgSO4·7H2O 0.5、泡敌0.2。种子培养基的消前pH值为5.0～6.5。
种子罐培养阶段包括：种子瓶培养液按照0.25～1.5％接种比例接一级种子罐，一级种子罐培养液按照5～20％移种比例移二级种子罐。种子罐培养温度为17～24℃，培养时间为16～64h。种子罐培养在小试种子罐中进行，较佳的为30L，搅拌转速150～600rpm，通气比0.3～3.0vvm。一级种子罐培养在商业化生产一级种子罐中进行，较佳的为1m3，搅拌转速50～300rpm，通气比0.25～2.5vvm。二级种子罐培养在商业化生产二级种子罐中进行，较佳的为10m3，搅拌转速50～250rpm，通气比0.1～2.5vvm。各规模种子罐培养罐压均为0.02～0.1MPa。
发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。因此，发酵培养基的组成除了有菌体生长所必须的元素和化合物外，还要有产物所需要的特定元素、前体和促进剂等。若生长或生物合成产物所需要的总的碳源、氮源、磷源等浓度太高，或者生长和合成阶段各需要的最佳条件要求不同时，则可以考虑分批补料来满足。
在本申请一种优选的实施例中，发酵罐移种比例5～20％，培养温度17～24℃，全程用氨水控制pH值为4.5～6.0，溶氧控制20～60％，罐压均为0.02～0.1MPa，并在36～60h和84～108h各补加3～10g/L(调pH值4.5～6.0，浓度按照发酵液体积计算)乳酸，发酵时间120～240h。碳源采取指数补料与DO-STAT补料相结合的补料策略：当溶氧上升到60～80％后设定比生长速率μ为0.02～0.10h-1进行指数补料，指数补料后期发酵液中检测到1～10g/L时，设定DO-STAT补料溶氧关联值为20～60％，当溶氧低于所设定的关联值时，停止补糖，当溶氧高于所设定的关联值时，开始补糖。小试发酵罐培养，较佳为70L，搅拌转速100～700rpm，通气比0.3～3.0vvm。中试发酵罐培养，较佳为10m3，搅拌转速50～250rpm，通气比0.2～2.5vvm。商业化发酵罐培养，较佳为100m3，搅拌转速15～200rpm，通气比0.1～1.5vvm。
基础发酵培养基含有如下成份(g/L)：葡萄糖25、糖蜜5、(NH4)2SO4 3、酵母浸粉5、大豆蛋白胨5、KH2PO4 1.05、Na2HPO4·12H2O 2.25、乳酸5、CaCl2 0.1、MgSO4·7H2O 2.25、泡敌0.2、微量金属溶液1、维生素溶液1。发酵培养基的消前pH值为5.0～6.5。微量金属溶液成份同无机离子营养成分培养基中的微量金属溶液；维生素溶液成份同无机离子营养成分培养基中的维生素溶液。
补糖培养基含有如下成份(g/L)：葡萄糖175、麦芽糊精175、糖蜜50。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了上述任一种方法在法夫酵母虾青素生产中的应用。通过利用电导率反映无机离子的消耗水平，基于电容法的活细胞传感仪，能在线实时检测发酵体系的电导率，因此可应用于虾青素生产的补料和细胞生长速率的控制，精确指导补料工艺进而达到进一步提升法夫酵母虾青素产量的目的。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照说明书选择。除非特殊说明，所有的百分比和份数按照重量计算。
下述实施例，所使用的主要仪器设备：BIOTECH-30JS，上海保兴生物设备工程有限公司；LiFlus SP-70L发酵罐，韩国百特伦(Biotron)公司；1m3种子罐、10m3种子罐，江苏远方迪威尔设备科技有限公司；100m3发酵罐，无锡东盛石化装备有限公司；Agilent 1200型高效液相色谱仪(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)，美国安捷伦科技有限公司；Biomass System型在线活细胞传感仪，瑞士哈美顿博纳图斯(Hamilton)股份公司。
下述实施例中，采用高效液相法(HPLC)测定虾青素产量，具体方法为：
A)细胞破碎及丙酮抽提：取1mL发酵液样品，12000rpm离心3min，去上清，用蒸馏水洗涤沉淀，菌体加入2mL预热至75℃的DMSO，立即剧烈振荡，50℃破壁5min，加入丙酮抽提，振荡摇匀，12000rpm离心3min，多次抽提，直至菌丝至白色，合并抽提液，定容到一定体积。
B)虾青素高效液相检测：色谱柱Dikma DiamonsilTM-C18，250×4.6mm i.d.，5μm；柱温25℃；流动相：甲醇，流速1mL/min；检测波长：478nm；进样量：10μL。
下述实施例，菌体浓度检测：对发酵液进行适当稀释，测定波长600nm处吸光度，根据光密度与细胞干重(g/L)的比值为2.50±0.10确定细胞干重。
下述实施例，总糖/还原糖检测：按照菲林试剂法测定。
实施例1
固体培养：取-80℃冰箱保藏的法夫酵母冷冻甘油保藏液，融化后用接种环蘸取解冻液，进行平板划线，于温度20.5℃条件下培养4～8天，长出较大单菌落。平板培养基为YM培养基(g/L)：葡萄糖10、蛋白胨5、麦芽抽提物3、酵母浸粉3、琼脂20，消前pH值6.0。
种子瓶培养：用接种环蘸取3～5个颜色较红、菌落较大的单菌落，接种种子培养基(10mL/50mL试管)，于20.5℃、200rpm条件下振荡培养36～72h。将上述成熟一级种子培养液按10％接种二级种子培养基(22.5mL/250mL三角瓶)，于20.5℃、200rpm条件下振荡培养24～48h获得成熟种子瓶培养液。种子培养基为(g/L)：葡萄糖20、麦芽浸粉6、蛋白胨10、酵母浸粉6、CaCl2 0.1、KH2PO4 1.0、MgSO4·7H2O 0.5、泡敌0.5，消前调pH值5.0～6.5。
30L种子罐培养：取二级成熟种子瓶培养液，按照1.0％接种比例接同种子瓶的种子培养基(20L/30L种子罐)，于20.5℃、搅拌转速350rpm、通气量比2vvm、罐压0.06MPa条件下培养16～64h；
70L发酵罐培养：按照12％移种比例移发酵罐(30L/70L发酵罐)，培养温度20.5℃、通气比为0.3～3.0vvm、罐压0.06MPa，全程用25％～28％氨水控制pH值为5.0，搅拌转速与溶氧联动，控制点为40％，并在48、96h各补加8g/L乳酸(按发酵液体积计算，调pH值4.5～6.0)。在基础料碳源耗尽溶氧开始回升到60～80％时，开始流加补糖培养基(每1h改变补料速率)，将比生长速率设置为0.06h-1。当活细胞传感仪指示进入指数补料后期且检测到乙醇含量为1～10g/L时，设置补糖泵与溶氧值联锁，关联值为40％，进行DO-STAT模式补糖。
随着发酵过程的进行，电导率降低，在发酵48h开始用活细胞传感仪控制补料泵自动流加无机离子营养成分培养基，维持电导率为8.5ms/cm。
发酵基础培养基(g/L)：葡萄糖25、糖蜜5、(NH4)2SO4 3、酵母浸粉5、大豆蛋白胨5、KH2PO4 1.05、Na2HPO4·12H2O 2.25、乳酸5、CaCl2 0.1、MgSO4·7H2O 2.25、泡敌0.2、微量金属溶液1、维生素溶液1，消前pH值5.0～6.5。
微量金属溶液成份为(g/L)：H3BO3 2.67、CuSO4·5H2O 1.6、KI 0.27、MnCl2 2.70、Na2MoO4·2H2O 1.07、ZnSO4·7H2O 24、CoCl2 0.8、柠檬酸铁24；
维生素溶液成份为(g/L)：泛酸钙5.2、生物素0.13、肌醇66.67、尼克酸5.2、对氨基苯甲酸0.53、VB6 2.67、VB1 2.67、核黄素5.2；
补糖培养基(g/L)：葡萄糖175、麦芽糊精175、糖蜜50；
无机离子营养成分培养基(g/L)：K2SO4 8、Na2SO4 0.6、MgSO4·7H2O 12、CaCl21.5、微量金属溶液12、维生素溶液12；无机离子营养成分培养基中微量金属溶液与维生素溶液同发酵培养基。
发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌体吸光度、虾青素含量、乙醇含量等检测，培养185h，菌体干重达到113.1g/L，虾青素产量达到632.8mg/L。
实施例2
固体培养、种子瓶培养、种子罐培养：同实施例1。
70L发酵罐培养：随着发酵过程的进行电导率降低，在发酵20h时手动补加无机离子营养成分培养基到12.0ms/cm，待电导率降低到5.0ms/cm时再次补加无机离子营养成分培养基到12.0ms/cm，使电导率维持在5.0～12.0ms/cm。无机离子营养成分培养基(g/L)：K2SO4 15、Na2SO4 1、MgSO4·7H2O 18、CaCl2 2、微量金属溶液20、维生素溶液20；微量金属溶液成份为(g/L)：H3BO3 0.5、CuSO4·5H2O 0.5、KI 0.05、MnCl2 0.4、Na2MoO4·2H2O 0.5、ZnSO4·7H2O 5、CoCl2 0.3、柠檬酸铁5；维生素溶液成份为(g/L)：泛酸钙2、生物素0.05、肌醇5、尼克酸0.5、对氨基苯甲酸0.1、VB6 0.1、VB1 0.1、核黄素0.2。无机离子营养成分培养基pH值为5.0～6.5。发酵培养基组份及其它控制条件同实施例1。
发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌体吸光度、虾青素含量、乙醇含量等检测，培养185h，菌体干重达到112.0g/L，虾青素产量达到637.2mg/L。
实施例3
固体培养、种子瓶培养、种子罐培养：同实施例1。
70L发酵罐培养：随着发酵过程的进行电导率降低，在发酵72h时一次性补加无机离子营养成分培养基，使电导率达到20ms/cm，继续培养直到发酵结束。无机离子营养成分培养基主要成份及含量如下(g/L)：K2SO4 5、Na2SO4 0.2、MgSO4·7H2O 6、CaCl2 1.0、微量金属溶液5、维生素溶液5。微量金属溶液成份为(g/L)：H3BO3 5、CuSO4·5H2O 10、KI 0.5、MnCl28、Na2MoO4·2H2O 5、ZnSO4·7H2O 100、CoCl2 3、柠檬酸铁100；维生素溶液成份为(g/L)：泛酸钙40、生物素1、肌醇100、尼克酸5、对氨基苯甲酸2、VB6 4、VB1 4、核黄素8。所述无机离子营养成分培养基pH值为5.0～6.5。发酵培养基组份及其它控制条件同实施例1。
发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌体吸光度、虾青素含量、乙醇含量等检测，培养185h，菌体干重达到109.3g/L，虾青素产量达到620.5mg/L。
实施例4
固体培养、种子瓶培养、种子罐培养：同实施例1。
70L发酵罐培养：随着发酵过程的进行电导率降低，在发酵10h时用活细胞传感仪控制补料泵自动流加无机离子营养成分培养基，维持电导率为2.5ms/cm，继续培养直到发酵结束。无机离子营养成分培养基同实施例3，发酵培养基组份及其它控制条件同实施例1。
发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌体吸光度、虾青素含量、乙醇含量等检测，培养185h，菌体干重达到105.8g/L，虾青素产量达到615.3mg/L。
实施例5
固体培养、种子瓶培养：同实施例1。
种子罐培养：取二级成熟种子瓶培养液，按照1.0％接种比例接同种子瓶的种子培养基(0.5m3/1m3种子罐)，于20.5±0.2℃、搅拌转速200rpm、通气比2vvm、罐压0.06MPa条件下培养16～64h；一级成熟种子罐培养液按照9.09％移种比例移二级种子罐(5m3/10m3种子罐)，于20.5±0.2℃、搅拌转速200rpm、通气比2vvm、罐压0.06MPa条件下培养16～64h。
100m3发酵罐培养：将二级种子罐按照13.5％移种比例移发酵罐(35m3/100m3发酵罐)，培养温度20.5±0.2℃、通气比为0.25～1.0vvm、罐压0.6MPa，全程用25％～28％氨水控制pH值为5.0。起始搅拌转速40rpm，当溶氧低于20％时上调搅拌转速10～30rpm，直至发酵罐最大功率，控制溶氧为20～60％范围，并在48、96h各补加8g/L乳酸(调pH值4.5～6.0)。在基础料碳源耗尽溶氧开始回升到60～80％时，开始流加补糖培养基(每1h改变补料速率)，将比生长速率设置为0.06h-1。当活细胞传感仪指示进入指数补料后期且检测到乙醇含量1～10g/L时，并设置补糖速率与溶氧联锁，关联值为45％，进行DO-STAT模式补糖。
随着发酵过程的进行电导率降低，在发酵48h开始用活细胞传感仪控制补料泵自动流加无机离子营养成分培养基，维持电导率为8.5ms/cm。发酵基础培养基、微量金属溶液、维生素溶液、补糖培养基和无机离子营养成分培养基成份同实施例1。
发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌体吸光度、虾青素含量、乙醇含量等检测，培养185h，菌体干重达到110.4g/L，虾青素产量达到630.9mg/L。
实施例6
固体培养、种子瓶培养、种子罐培养：同实施例1。
70L发酵罐培养：随着发酵过程的进行电导率降低，在发酵120h时一次性补加无机离子营养成分培养基，使电导率达到20ms/cm，继续培养直到发酵结束。无机离子营养成分培养基主要成份及含量如下(g/L)：K2SO4 5、Na2SO4 0.2、MgSO4·7H2O 6、CaCl2 1.0、微量金属溶液5、维生素溶液5。微量金属溶液成份为(g/L)：H3BO3 5、CuSO4·5H2O 10、KI 0.5、MnCl28、Na2MoO4·2H2O 5、ZnSO4·7H2O 100、CoCl2 3、柠檬酸铁100；维生素溶液成份为(g/L)：泛酸钙40、生物素1、肌醇100、尼克酸5、对氨基苯甲酸2、VB6 4、VB1 4、核黄素8。所述无机离子营养成分培养基pH值为5.0～6.5。发酵培养基组份及其它控制条件同实施例1。
发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌体吸光度、虾青素含量、乙醇含量等检测，培养185h，菌体干重达到106.7g/L，虾青素产量达到616.2mg/L。
实施例7
固体培养、种子瓶培养、种子罐培养：同实施例1。
70L发酵罐培养：随着发酵过程的进行电导率降低，在发酵72h时用活细胞传感仪控制补料泵自动流加无机离子营养成分培养基，维持电导率为23ms/cm，继续培养直到发酵结束。无机离子营养成分培养基同实施例3，发酵培养基组份及其它控制条件同实施例1。
发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌体吸光度、虾青素含量、乙醇含量等检测，培养185h，菌体干重达到95.8g/L，虾青素产量达到568.5mg/L。
实施例8
固体培养、种子瓶培养、种子罐培养：同实施例1。
70L发酵罐培养：随着发酵过程的进行电导率降低，在发酵130h时一次性补加无机离子营养成分培养基，使电导率达到20ms/cm，继续培养直到发酵结束。无机离子营养成分培养基同实施例3，发酵培养基组份及其它控制条件同实施例1。
发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌体吸光度、虾青素含量、乙醇含量等检测，培养185h，菌体干重达到102.1g/L，虾青素产量达到590.1mg/L。
实施例9
固体培养、种子瓶培养、种子罐培养：同实施例1。
70L发酵罐培养：随着发酵过程的进行电导率降低，在发酵72h时用活细胞传感仪控制补料泵自动流加无机离子营养成分培养基，维持电导率为8.5ms/cm。无机离子营养成分培养基主要成份及含量如下(g/L)：K2SO4 5、Na2SO4 0.2、MgSO4·7H2O 6、CaCl2 1.0、微量金属溶液5。微量金属溶液成份为(g/L)：H3BO3 5、CuSO4·5H2O 10、KI 0.5、MnCl2 8、Na2MoO4·2H2O 5、ZnSO4·7H2O 100、CoCl2 3、柠檬酸铁100。所述无机离子营养成分培养基pH值为5.0～6.5。发酵培养基组份及其它控制条件同实施例1。
发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌体吸光度、虾青素含量、乙醇含量等检测，培养185h，菌体干重达到103.3g/L，虾青素产量达到576.4mg/L。
对比例1
固体培养、种子瓶培养、种子罐培养：同实施例1。
70L发酵罐培养：在发酵24、60、96和132h时补加无机离子营养成分培养基，每次补加固定量的培养基0.5～1.5L。无机离子营养成分培养基同实施例3，发酵培养基组份及其它控制条件同实施例1。
发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌体吸光度、虾青素含量、乙醇含量等检测，培养185h，菌体干重达到101.5g/L，虾青素产量达到562.3g/L。
对比例2
固体培养、种子瓶培养、种子罐培养：同实施例1。
在70L发酵罐培养中，全程采用还原糖-总糖检测结果反馈调节补糖速率的传统补糖工艺，维持总糖浓度在5～15g/L。并且在发酵24、60、96和132h时补加无机离子营养成分培养基，每次补加固定量的培养基0.5～1.5L。无机离子营养成分培养基同实施例3，发酵培养基组份及其它控制条件同实施例1。
发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌体吸光度、虾青素含量、乙醇含量等检测，培养185h，菌体干重达到100.2g/L，虾青素产量达到368.4mg/L。
对比例3
固体培养、种子瓶培养、种子罐培养：同实施例1。
在70L发酵罐培养中，全程采用还原糖-总糖检测结果反馈调节补糖速率的传统补糖工艺，维持总糖浓度在5～15g/L。无机离子营养成分培养基同实施例3，发酵培养基组份及其它控制条件同实施例1。
发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌体吸光度、虾青素含量、乙醇含量等检测，培养185h，菌体干重达到85.7g/L，虾青素产量达到357.2mg/L。
从以上的描述中，可以看出，通过现有技术中的补加糖的方式来提高产量的方法，法夫酵母虾青素产量最高在250～360mg/L范围内，在其基础上按照定时定量的方式补加无机离子营养成分，产量提高并不明显。而在本申请的补碳策略基础上，按照按照定时定量的方式补加无机离子营养成分，产量提高至550mg/L左右。而进一步地，通过合理控制电导率来补加无机离子营养成分，则虾青素产量能够在550mg/L的基础上再提升10％左右，即提高50～75mg/L以上。这种产量的提升幅度相对于现有报道的最高水平250～350mg/L具有实质性突破。
本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请通过利用电导率监测和控制策略，能实时在线检测发酵体系的电导率，从而把握法夫酵母培养体系，尤其是无机离子为代表的营养物质的消耗水平，并根据电导率的变化情况指导无机离子营养成分培养基的补加，进而实现菌体浓度和虾青素产量的提高。本申请的方法，不仅可以提高发酵水平，而且具有稳定、可靠的特性，适用于商业化生产。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种提高法夫酵母虾青素产量的方法，其特征在于，所述方法包括：
利用所述法夫酵母进行补料分批发酵培养生产虾青素，其中，补料分批发酵过程中，包括补加碳源和补加无机离子营养成分培养基的步骤，其中，所述无机离子营养成分培养基的补加量通过发酵体系的电导率来调控。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无机离子营养成分培养基的补加量通过控制所述发酵体系的电导率在2.5～20.0ms/cm，优选为5.0～12.0ms/cm范围内来确定。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵体系的电导率采用活细胞传感仪进行在线采集监控。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无机离子营养成分培养基的补加方式为一次性补加、分批间歇补加或反馈连续补加。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无机离子营养成分培养基的补加时机为发酵10～120h后，优选为发酵20～72h后，进一步优选为发酵48～72h后。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，按照g/L浓度计，所述无机离子营养成分培养基包括：K2SO4 5～15、Na2SO4 0.2～1.0、MgSO4·7H2O 6.0～18.0、CaCl21.0～2.0、微量金属溶液5.0～20.0、维生素溶液5.0～20.0，其中，按照g/L浓度计，所述微量金属溶液包括：H3BO3 0.5～5.0、CuSO4·5H2O 0.5～10.0、KI 0.05～0.5、MnCl2 0.4～8.0、Na2MoO4·2H2O 0.5～5.0、ZnSO4·7H2O 5～100、CoCl2 0.3～3.0及柠檬酸铁5～100；
优选地，按照g/L浓度计，所述维生素溶液包括：泛酸钙2.0～40.0、生物素0.05～1.0、肌醇5～100、尼克酸0.5～5.0、对氨基苯甲酸0.1～2.0、VB6 0.1～4.0、VB1 0.1～4.0、核黄素0.2～8.0；
优选地，所述无机离子营养成分培养基pH值为5.0～6.5。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述补料分批发酵过程中，所述补加碳源采用指数补料与DO-STAT补料相结合的方式进行补加；
优选地，当所述发酵体系的溶氧上升到60～80％后设定比生长速率μ为0.02～0.10h-1进行指数补料；当检测到进入指数补料后期且发酵液中乙醇含量为1～10g/L时，进行DO-STAT补料，所述DO-STAT补料的溶氧关联值为20～60％，当溶氧低于所述关联值时，停止补糖，当溶氧高于所述关联值时，开始补加补糖培养基；
优选地，按照g/L浓度计，所述补糖培养基包括：葡萄糖75～300、麦芽糊精75～300、糖蜜20～100。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述补料分批发酵过程中，还包括补加乳酸，更优选在发酵36～60h和84～108h各补加3～10g/L乳酸。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述补料分批发酵过程中，所述方法还包括全程用氨水控制所述发酵体系的pH值为4.5～6.0；
优选地，在所述补料分批发酵之前，所述方法还包括：对所述法夫酵母依次进行固体培养和种子培养。
10.权利要求1～9中任一项所述的方法在法夫酵母虾青素生产中的应用。
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| CN202010865499.8A Active CN114085881B (zh) | 2020-08-25 | 2020-08-25 | 提高法夫酵母虾青素产量的方法及应用 |
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1544647A (zh) * | 2003-11-25 | 2004-11-10 | 华南理工大学 | 利用糖蜜或淀粉糖原料中间补料发酵生产虾青素的方法 |
| US20060134734A1 (en) * | 2002-09-27 | 2006-06-22 | Tatsuo Hoshino | Astaxanthin production using fed-batch fermentation process by phaffia rhodozyma |
| JP2007143491A (ja) * | 2005-11-29 | 2007-06-14 | Tosoh Corp | カロテノイド類の生産方法 |
| CN102186984A (zh) * | 2008-10-17 | 2011-09-14 | 吉坤日矿日石能源株式会社 | 类胡萝卜素的发酵法 |
| US20150118735A1 (en) * | 2012-11-09 | 2015-04-30 | Heliae Development, Llc | Methods of culturing microorganisms in non-axenic mixotrophic conditions |
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-
2020
- 2020-08-25 CN CN202010865499.8A patent/CN114085881B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (4)
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|---|
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| 王泽建;王萍;张琴;储炬;张嗣良;庄英萍;: "微生物发酵过程生理参数检测传感器技术与过程优化", 生物产业技术, no. 01 * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114085881B (zh) | 2023-12-22 |
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