CN114081895A - 一种用于治疗糖尿病性视网膜病变的miRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明通过构建糖尿病视网膜病变大鼠模型，首次公开了miR‑1261可通过抑制IRS‑1的表达，从而对糖尿病视网膜病变模型起到治疗作用，有助于人们对IRS相关通路在糖尿病及其并发症中作用机制的认识，为该病的临床诊疗提供了重要的价值。

Description

一种用于治疗糖尿病性视网膜病变的miRNA及其应用
技术领域
本发明涉及疾病治疗领域，更为具体的，本发明涉及一种用于治疗糖尿病性视网膜病变的miRNA及其应用。
背景技术
糖尿病(diabetes，DB)是当今社会影响人类健康最常见的疾病之一。据统计，每11个人中就有一人患有糖尿病。2017年的研究表明，目前全世界大约有4.15亿人患有糖尿病，到2045年，这一数字将增至6.29亿。由此可见，糖尿病已成为非常严重的世界性公共卫生问题，有相当一部分人正在受到糖尿病及其并发症的困扰。作为糖尿病最常见的微血管病变之一，糖尿病性视网膜病变(Diabeticretinopathy，DR)是一种以视网膜血管渗漏和不灌注为主要特征的眼部疾病，它可造成患者视力减退甚至失明。
IRS是调节胰岛素信号通路的关键物质，在维持细胞生长分裂和代谢中起重要作用。近年来大量研究证实，IRS在糖尿病的发生与发展中发挥重要作用。目前已经发现IRS介导的胰岛素信号通路，与其他信号通路存在交叉，导致胰岛素抵抗，从而引发糖尿病及其并发症的发生。miRNAs(microRNAs)是一组细胞内广泛表达的小分子RNA(其长度约为22个核苷酸)，他们不编码任何蛋白质，但可在转录后通过干扰mRNA的翻译和/或稳定性来抑制靶基因蛋白质的表达。近年来大量研究表明许多miRNAs与糖尿病性视网膜病变的发生与进展具有显著相关性。有研究已经证实，miRNA-126可经调控胰岛素受体底物IRS-1的表达而参与糖尿病性视网膜病变进程。而我们研究也表明miR-15b也可通过靶向沉默IRS-1，经Wnt/β-catenin通路抑制糖尿病大鼠视网膜毛细血管细胞的增殖活性。然而，有关miR-1261在糖尿病性视网膜病变中的表达及其作用至今鲜有报道。
发明内容
为填补现有技术中存在的缺陷，本发明通过构建糖尿病视网膜病变大鼠模型，筛选获得一种IRS-1抑制剂miR-1261，该miRNA可有效治疗糖尿病视网膜病变。具体的，本发明提供如下的技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种miR-1261用于制备IRS-1抑制剂中的应用。
本发明的第二个方面，提供一种IRS-1抑制剂用于制备治疗糖尿病视网膜病变的药物中的应用。
在一种实施方式中，所述IRS-1抑制剂是miR-1261。
在一种实施方式中，所述miR-1261的序列为AUGGAUAAGGCUUUGGCUU。
本发明获得了如下的显著的技术效果：
本发明通过构建糖尿病视网膜病变大鼠模型，首次公开了miR-1261可通过抑制IRS-1的表达，从而对糖尿病视网膜病变模型起到治疗作用，有助于人们对IRS相关通路在糖尿病及其并发症中作用机制的认识；为该病的临床诊疗提供了重要的价值。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为miR-1261在TargetScan系统中的评分图；
图2为HE染色观察糖尿病视网膜病变模型大鼠的视网膜形态图；
图3为IRS-1蛋白在STZ诱导的大鼠模型的糖尿病视网膜中的表达水平；
图4为HE染色观察不同分组大鼠的视网膜形态图；
图5为IRS-1蛋白在不同分组的大鼠视网膜组织中的表达水平。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1筛选靶向IRS1的miRNA
利用miRDB、miRecords、TargetScan以及RNAInter数据库对靶向IRS1的miRNA进行预测。其中取miRDB及TargetScan评分皆为80以上，然后利用韦恩图取交集，共获得2个高评分miRNAs，即miR-1200和miR-1261，其中miR-1261在TargetScan系统为评分最高(如图1所示)，将该序列作为候选治疗用miRNA，miR-1261的序列为：AUGGAUAAGGCUUUGGCUU，该序列合成交由广州锐博生物科技有限公司完成。
实施例2糖尿病视网膜病变动物模型的构建
1.糖尿病视网膜病变大鼠模型的构建
按照本领域现有技术中公开的方法，通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)来构建糖尿病性视网膜病变SD大鼠模型：
选择清洁型雄性SD大鼠30只，质量200-250g，标准饲料喂养，自由进食和饮水，室温18-22℃。随机分为对照组(CON组)及糖尿病模型组各15只。
实验组应用STZ(Sigma公司)诱发糖尿病。血糖测定使用美国强生Lifescan公司生产的OneTouch血糖仪和标准血糖试纸。用0.001mmol/L柠檬酸盐缓冲液配成10g/L的STZ。模型组大鼠按60mg/kg剂量左下腹腔内注射STZ。72h后取尾血测血糖及尿糖。凡血糖≥16.7mmol/L及尿糖阳性的大鼠定为糖尿病模型。
2.HE染色和免疫组化法鉴定
腹腔麻醉两组大鼠，摘除眼球，环行剪开角膜缘，置40g/L多聚甲醛固定24h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片。置50℃烤箱6h。二甲苯I脱蜡，梯度酒精由高到低，苏木素染色，伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明各15min，中性树胶封片。
二甲苯I、II脱蜡各15rain，梯度酒精至水；自来水浸洗后抗原修复，0.3％H：0溶液氧化15min；PBS浸洗3次；滴加适当稀释的一抗(鼠单抗IRS-1，1：50)，湿盒4℃冰箱过夜；PBS(pH＝7.4)浸洗5min×3次；滴加1：400生物素标记二抗(SABC检测盒)，湿盒中室温留置90min；PBS浸洗3次；DAB溶液显色3—5min；自来水冲洗5min；梯度酒精脱水，二甲苯I、II透明各15min；中性树胶封片。通过图象分析系统进行量化分析。
统计学方法：应用SPSS13.0统计软件分析。两组比较，行两样本均数比较的t检验(Independent-Samples T Test)；多组比较，行单因素方差分析(One-Way ANOVA)。计数资料多组比较，采用多个独立样本非参数检验(KIndependent Sample Test)检验。
3.结果：
如图2所示，对照组(正常组)视网膜各细胞层层次分明，而糖尿病模型组视网膜各层结构疏松、组织水肿，毛细血管扩张，血管壁增厚，说明糖尿病视网膜病变大鼠模型构建成功。
实施例3糖尿病视网膜病变模型组和空白对照组大鼠视网膜中IRS-1的表达
1、western blot法检测IRS-1的表达
用含20g/l蛋白酶抑制剂的冷RIPA提取对照组和模型组大鼠视网膜总蛋白，10000g离心10分钟后收集上清液。使用BCA蛋白质测定试剂盒测定上清液的蛋白质浓度。总蛋白(50μg)进行100g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移到硝酸纤维素膜上。4℃与IRS-1一抗孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗(1:2000稀释)。IRS-1特异性一抗以1:500稀释使用。通过增强型化学发光检测系统进行可视化。
结果如图3所示，IRS-1蛋白在STZ诱导的大鼠模型的糖尿病视网膜中的表达水平远高于对照组。
2、miR-1261对糖尿病视网膜病变的治疗作用
实验分为三组：
组1：建模一周的糖尿病视网膜病变模型组大鼠+眼睛玻璃体腔内注射3μg/μl的miR-1261序列1μl；
组2：建模一周的糖尿病视网膜病变模型组大鼠+眼睛玻璃体腔内注射0.9％NaCl的水溶液1μl。
组3：正常对照组(健康实验用大鼠)。
给药一周后按照实施例2中所述的方法，继续通过HE染色法观察视网膜形态学变化，并通过Western Blot检测各组大鼠视网膜组织中IRS-1的表达情况。
结果如图4-5所示，图4A显示了注射miR-1261的大鼠视网膜组织，病理改变相对于组2(图4B)病理形态明显减轻，各层排列较规则，水肿减轻，毛细血管扩张减轻，而组2视网膜各层结构输送，组织水肿严重，毛细血管扩张严重。图5显示了给药后各组大鼠视网膜组织中IRS-1的表达水平，由图可见，注射miR-1261的大鼠视网膜组织中IRS-1的表达水平明显降低，而疾病模型组(组2)中IRS-1的表达水平显著高于组1和组3。由此可知，miR-1261可通过抑制IRS-1蛋白的表达从而对糖尿病视网膜病变起到治疗作用。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.一种miR-1261在用于制备IRS-1抑制剂中的应用。
2.一种IRS-1抑制剂用于制备治疗糖尿病视网膜病变的药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述IRS-1抑制剂是miR-1261。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述miR-1261的序列为AUGGAUAAGGCUUUGGCUU。
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JOSE M. MELLADO-GIL等: "The type 2 diabetes-associated HMG20A gene is mandatory for islet beta cell functional maturity", pages 1 - 15 *

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