CN114073791B - 一种软骨组织工程支架及其制备方法与应用 - Google Patents

一种软骨组织工程支架及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种软骨组织工程支架及其制备方法与应用。它包括如下步骤制备：将生长因子荷载到纳米颗粒上，得到载生长因子的纳米颗粒；然后对其进行表面处理，使其表面具有可反应的活性基团；将带活性反应基团的聚乙二醇水溶液与如下1)和/或2)混合，得到荷载生长因子A和B的水凝胶；1)载生长因子A的纳米颗粒和载生长因子B的纳米颗粒；2)载生长因子A和生长因子B的纳米颗粒；在荷载生长因子A和B的水凝胶上荷载生长因子C，即得到软骨组织工程支架；其中，生长因子A、生长因子B和生长因子C均为促进软骨再生的生长因子，且各不相同。本发明支架模拟天然软骨组织结构与功能，荷载多种生长因子协同表达作用于软骨修复和再生。

Description

一种软骨组织工程支架及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种软骨组织工程支架及其制备方法与应用，属于组织工程支架制备领域。
背景技术
对于软骨组织工程而言，生物可降解的支架起着支持并诱导细胞生长和繁衍、规定再生组织形状和大小，并最终和机体组织结合在一起的作用，与细胞和生长因子一起成为组织工程的三大要素。目前，虽然有许多采用不同材料支架的软骨组织工程研究报道，但是由这些支架获得的软骨组织与先天软骨组织的结构和功能相比仍有差距。因此，要形成与先天软骨具有相似结构和功能的组织工程软骨，就必须要求支架能提供类似先天软骨对细胞所提供的物理和生物化学微环境，使细胞快速生长和繁衍。
PEG水凝胶具有非免疫原性、优异的亲水性能和良好的生物相容性等优点已被广泛用于生物医用应用，但由于其小尺寸三维网状结构孔隙使细胞难于进入生长，对蛋白存在抗粘附性使细胞难以在其上粘附生长，以及良好的亲水性使其载有的生长因子迅速释放，所以使PEG水凝胶作为组织工程支架并不理想。
聚乙交酯(PLA)、聚丙交酯(PGA)、聚己内酯(PCL)以及它们的共聚物等聚内酯具有良好的生物相容性、良好的机械性能和可调的降解速率已获得我国和美国等国家FDA的认证，成为可以应用于制备植入体内的医疗制品。
发明内容
本发明的目的是提供一种软骨组织工程支架及其制备方法与应用。
本发明以聚内酯为基材制备的纳米颗粒可与PEG形成孔隙尺寸和机械性能可调节的杂化水凝胶。而且聚内酯纳米粒子能有效地装载生长因子，而且释放生长因子行为可通过选择聚内酯材料的降解速率来调节。因此，如果将聚内酯类生物降解高分子纳米粒子与PEG作为组织工程软骨支架的基材不仅可以兼具安全性和有效性，而且能将多种与软骨再生相关生长因子一起荷载到具有结构可控的PEG与聚内酯纳米粒杂化水凝胶支架上，使它们按一定的时间和浓度释放以调控软骨细胞的增殖和分化，就有望成为具有先天软骨中细胞的生物化学和物理信号微环境功能的仿生软骨支架。
本发明提供的一种软骨组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：(1)将生长因子荷载到纳米颗粒上，得到载生长因子的纳米颗粒；
所述生长因子包括生长因子A和/或生长因子B；所述载生长因子的纳米颗粒包括载生长因子A的纳米颗粒、载生长因子B的纳米颗粒和/或载生长因子A和生长因子B的纳米颗粒；
(2)对所述载生长因子的纳米颗粒进行表面处理，使其表面具有可反应的活性基团；
(3)将带活性反应基团的聚乙二醇水溶液与经步骤(2)处理的如下1)和/或2)中所述载生长因子的纳米颗粒混合，得到荷载生长因子A和B的水凝胶；
1)所述载生长因子A的纳米颗粒和所述载生长因子B的纳米颗粒；
2)所述载生长因子A和生长因子B的纳米颗粒；
(4)在所述荷载生长因子A和B的水凝胶上荷载生长因子C，即得到软骨组织工程支架；
其中，所述生长因子A、所述生长因子B和所述生长因子C均为促进软骨再生的生长因子，且各不相同。
上述的制备方法中，所述纳米颗粒为生物可降解纳米颗粒；
所述生物可降解纳米颗粒具体为聚内酯；所述聚内酯选自下述任意一种单体形成的均聚物和/或至少两种单体形成的共聚物；所述单体包括乙交酯(英文简称GA)、L-乳酸(英文简称LA)和/或己内酯(英文简称CL)；
所述聚内酯的纳米颗粒的粒径为300～700纳米；
所述促进软骨再生的生长因子选自转化生长因子-β1(英文简称TGF-β1)、骨形态蛋白-2(英文简称BMP-2)、胰岛素样生长因子(英文简称IGF-1)和碱性成纤维生长因子(英文简称bFGF)中的至少一种。
上述的制备方法中，步骤(1)中将所述生长因子荷载到所述纳米颗粒上的方法包括如下步骤：将所述生长因子水溶液与所述聚内酯的二氯甲烷溶液混合形成W/O乳液；然后W/O乳液加入质量百分浓度为0.25～1％的聚乙烯醇水溶液中，得到粗双乳液；所述粗双乳液在0.5～1.5MPa压力下通过多孔玻璃膜进行挤出精制，得到均一的乳液；所述均一的乳液在水中搅拌后依次经离心、洗涤、冷冻干燥，得到所述载生长因子的纳米颗粒。
上述的制备方法中，所述生长因子水溶液的浓度具体可为50ng/ml～500μg/ml，具体可为40μg/ml、50ng/ml～40μg/ml、40μg/ml～500μg/ml、100μg/ml～250μg/ml或100μg/ml～400μg/ml；
所述聚内酯二氯甲烷溶液的浓度具体可为0.01～0.03g/ml，具体可为0.02g/ml、0.01～0.02g/ml、0.02～0.03g/ml或0.015～0.025g/ml；
所述生长因子水溶液与聚内酯二氯甲烷溶液体积比可为0.05～0.15:1，具体可为0.1:1、0.05～0.1或0.1～0.10；
所述聚乙烯醇水溶液与W/O乳液体积比可为18～25:1，具体可200:11或18～20:1；聚乙烯醇英文简称PVA；
所述多孔玻璃膜的孔径可为0.8～2.5μm，具体可为1μm、0.8～1μm、1～2.5μm或0.8～2.0μm；
所述载生长因子的纳米颗粒中所述生长因子质量含量具体为0.005～2.0％。
上述的制备方法中，步骤(2)中对所述载生长因子的纳米颗粒进行表面处理的方法是分支状聚乙烯亚胺氨解法和氧等离子体处理-阳离子化明胶锚定法；所述分支状聚乙烯亚胺氨解法为采用ZL201610274764.9中方法；所述氧等离子体处理-阳离子化明胶锚定法为如下文献中方法：Combining oxygen plasma treatment with anchorage ofcationized gelatin for enhancing cell affinity of poly(lactide-co-glycolide),Biomaterials,2007.10,28(29):4219-4230)。
上述的制备方法中，步骤(3)中所述带反应活性基团的聚乙二醇选自四星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、六星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯和八臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯中的至少一种；
所述带反应活性基团的聚乙二醇水溶液中聚乙二醇的质量百分比浓度为2.0％～5％；
步骤(3)中混合后体系中所述载生长因子纳米颗粒质量百分比浓度为5.0～12.0％。
上述的制备方法中，步骤(4)中对所述在水凝胶上荷载生长因子C的方法为聚多巴胺锚定法；
所述聚多巴胺锚定法步骤如下：在所述荷载生长因子A和B的水凝胶与多巴胺溶液混合孵育，使其表面形成聚多巴胺涂层；然后与所述生长因子C的溶液混合孵育，即得到所述软骨组织工程支架。
上述的制备方法中，所述多巴胺溶液的浓度可为1～4mg/ml，具体可为2mg/ml、1～2mg/ml、2～4mg/ml或1.5～3.5mg/ml；
与所述多巴胺溶液混合孵育的温度可为36～40℃，具体可为37℃，时间可为30～90分钟，具体可为60分钟；
所述生长因子C的溶液浓度可为0.1～1μg/ml，具体可为500ng/ml、0.1～0.5μg/ml、0.5～1μg/ml或0.25～0.75μg/ml；
与所述生长因子C的溶液混合孵的温度为室温，时间可为30～90分钟，具体可为60分钟、30～60分钟、60～90分钟或40～70分钟。
上述的制备方法中，所述软骨组织工程支架的孔径可为80～200微米；
所述软骨组织工程支架中生长因子A、生长因子B和生长因子C的质量百分含量均可为0.002～0.8％，具体可分别为0.014％、0.032％。
本发明还提供了上述的制备方法制备得到的所述软骨组织工程支架。
本发明所述软骨组织工程支架应用于制备仿先天软骨中细胞生物化学和物理信号微环境的软骨支架中。
本发明具有以下优点：
1、本发明模拟天然软骨组织结构与功能，构建具有适合软骨相关细胞生长的孔隙结构，并且能以一定时间、空间和浓度释放软骨相关生长因子，符合软骨组织工程要求的水凝胶型支架。
2、本发明在水凝胶支架上以不同的方法同时荷载多种软骨相关生长因子，使各种生长因子以一定的浓度和时间保持活性释放，以实现各生长因子协同表达作用于软骨修复和再生。
3、本发明的软骨组织工程支架由合成的可生物降解的聚内酯和聚乙二醇制备，聚内酯具有良好的生物相容性、良好的机械性能和可调的降解速率，实现了支架的生长因子释放、力学性能和降解时间的可控性。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的软骨组织工程支架(6)与对照样(1,2,3,4,5)的形貌对比SEM图，图1中1表示本发明实施例1中制备的软骨组织工程支架的形貌SEM图，图1中2、3、4、5、6分别表示对照样1、2、3、4、5的形貌SEM图。
图2为本发明实施例1中制备的软骨组织工程支架的生长因子释放实验图。
图3为本发明实施例1中制备的软骨组织工程支架(6)与对照样(1,2，3，4，5)的体外细胞培养的细胞增殖结果实验图。
图4为本发明II型胶原蛋白(Col2)的合成(亲环素为标准)。
图5为本发明聚集蛋白聚糖(Agc)的合成(亲环素为标准)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、制备结构与功能可控的软骨组织工程支架
第一步：载生长因子TGF-β1的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)颗粒(粒径为500纳米)的制备：1mL浓度为40μg/ml的TGF-β1与含200mg的PLGA(LA/GA＝70/30)的10mL二氯甲烷超声混合，形成W/O乳液。将W/O乳化液加入200mL的1％(wt/wt)PVA水溶液中，得到粗双乳化液。在压力为1.0MPa下，通过孔径为1μm多孔玻璃膜对粗双乳液进行挤出精制。将得到的均匀双乳状液快速倒入500mL改为去离子水中，500rpm磁力搅拌过夜，使粒子凝固，离心洗涤并冷冻干燥后，得到粒径约为500nm的载生长因子A的纳米颗粒(即载生长因子TGF-β1的纳米颗粒)，纳米颗粒中生长因子A的质量含量为0.014％。
第二步：载生长因子BMP-2的左旋聚乳酸(PLLA)颗粒的制备：1mL浓度为80μg/ml的BMP-2与含200mg的PLLA的10mL二氯甲烷超声混合，形成W/O乳液。将W/O乳化液加入210ml的1％PVA(W/W)的外水相，得到粗双乳化液。通过孔径为1μm多孔玻璃膜对粗双乳液进行挤出精制。将得到的均匀双乳状液快速倒入500mL去离子水中，500rpm磁力搅拌过夜，使粒子凝固，离心洗涤并冷冻干燥后，得到粒径约为500nm的载生长因子B的纳米颗粒(即载生长因子BMP-2的纳米颗粒)，纳米颗粒中生长因B的质量含量为0.032％。
第三步：对载生长因子纳米粒子进行表面处理，使其表面具有可反应的活性氨基基团：1g载生长因子TGF-β1的PLGA颗粒和载生长因子BMP-2的PLLA颗粒分别加入到浓度为20mM低分子量的支化聚乙烯亚胺的乙醇/水的溶液中(1:1，体积比)，超声均匀分散，氨基化处理30min后，离心收集纳米粒子，去离子水洗涤三次，除去表面游离的聚乙烯亚胺，冷冻干燥备用。
第四步：载生长因子TGF-β1和BMP-2纳米粒子杂化聚乙二醇水凝胶制备：氨基化处理后的载TGF-β1的PLGA颗粒和载BMP-2的PLLA颗粒分散于去离子水中，另外配制一定浓度的四臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯水溶液，然后将纳米粒子和聚合物以体积比1:1采用涡旋仪进行混合，最终的纳米粒子的浓度为7.5％，PEG的浓度为2.5％，搅拌均匀后得到荷载生长因子TGF-β1和BMP-2杂化聚乙二醇水凝胶。
第五步：结构与功能可控软骨组织工程支架制备:将载生长因子TGF-β1和BMP-2纳米粒子杂化聚乙二醇水凝胶浸泡在2mg/ml多巴胺溶液中，37℃下在摇床上孵育1小时后，用磷酸缓冲液冲洗三次，随后浸入500ng/ml的IGF-1溶液中，在室温下摇床上孵育1小时后，取出凝胶用磷酸缓冲液冲洗三次，即得到负载IGF-1、TGF-β1和BMP-2纳米粒子杂化聚乙二醇水凝胶。
对照样1的制备：氨基化处理后的PLGA和PLLA颗粒分散于去离子水中，另外配制一定浓度的四臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯水溶液，然后将纳米粒子和聚合物以体积比1:1采用涡旋仪进行混合，最终的纳米粒子的浓度为7.5％，PEG的浓度为2.5％，搅拌均匀后得到杂化聚乙二醇水凝胶，作为对照样1。
对照样2的制备：氨基化处理后的载TGF-β1的PLGA颗粒和未载生长因子的PLLA颗粒分散于去离子水中，另外配制一定浓度的四臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯水溶液，然后将纳米粒子和聚合物以体积比1:1采用涡旋仪进行混合，最终的纳米粒子的浓度为7.5％，PEG的浓度为2.5％，搅拌均匀后得到荷载生长因子TGF-β1杂化聚乙二醇水凝胶，作为对照样2。
对照样3的制备：氨基化处理后的载BMP-2的PLLA颗粒和未载生长因子的PLGA颗粒分散于去离子水中，另外配制一定浓度的四臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯水溶液，然后将纳米粒子和聚合物以体积比1:1采用涡旋仪进行混合，最终的纳米粒子的浓度为7.5％，PEG的浓度为2.5％，搅拌均匀后得到荷载生长因子BMP-2杂化聚乙二醇水凝胶，作为对照样3。
对照样4的制备：荷载生长因子TGF-β1和BMP-2杂化聚乙二醇水凝胶为对照样4，制备过程同第四步。
对照样5的制备：对照样1浸泡在2mg/ml多巴胺溶液中，37℃下在摇床上孵育1小时后，用磷酸缓冲液冲洗三次，随后浸入500ng/ml的IGF-1溶液中，在室温下摇床上孵育1小时后，取出凝胶用磷酸缓冲液冲洗三次，即得到负载IGF-1纳米粒子杂化聚乙二醇水凝胶，作为对照样5。
形貌观察：由图1可知，将结构与功能可控软骨组织工程支架冷冻干燥，喷金后使用SEM观察到支架的孔径为100～200μm。
释放实验：将本发明软骨组织工程支架浸泡在包含1％牛血清蛋白的磷酸缓冲液(pH 7.4)里，每隔一定时间后收集释放介质，采用ELISA方法测定其中的生长因子的量。由图2可知，实验结果显示：荷载在本发明支架上的三种生长因子均能持续释放，IGF-1、BMP-2和TGF-β1在30天内的累积释放量分别为58％、36％和45％。
体外细胞培养：取成年大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司提供)处死，将大鼠关节分离，取中间透明软骨，用PBS洗涤，将组织剪碎到0.5-1.0mm，0.25％胰蛋白酶37℃预消化40min，将上清液弃去，加入0.2％Ⅱ型胶原酶37℃消化4h，200目的滤网过滤，2000r/min离心8min，收集细胞。加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液，并在37℃和5％CO2培养箱中培养，当软骨细胞密度达到80％～90％时候，对细胞进行传代，用第3代细胞进行试验。将大鼠的关节软骨细胞分别种植到本发明软骨组织工程支架和对照样上。由图3可知，实验结果显示：在结构与功能可控软骨组织工程支架上的细胞增殖明显快于对照样，而且II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的合成速度明显快于对照样。此研究结果表明在本发明软骨组织工程支架上，培养关节软骨细胞，使细胞快速生长和繁衍，并且能使细胞外基质合成加快，从而促进具有生理活性软骨形成。
实施例2、制备结构与功能可控的软骨组织工程支架
第一步：载生长因子IGF-1和BMP-2的丙交酯-己内酯共聚物(PLCL)颗粒的制备：1mL浓度为40μg/ml的IGF-1和1mL浓度为80μg/ml的BMP-2与含200mg的PLCL(LA/CL＝50/50)的10mL二氯甲烷超声混合，形成W/O乳液。将W/O乳化液加入1％PVA(W/W)中，得到粗双乳化液。通过孔径为1.0μm多孔玻璃膜对粗双乳液进行挤出精制。将得到的均匀双乳状液快速倒入500mL去离子水中，500rpm磁力搅拌过夜，使粒子凝固，离心洗涤并冷冻干燥后，得到载生长因子IGF-1和BMP-2的颗粒，颗粒的粒径约为700nm,颗粒中生长因子A和B的质量含量为分别0.016％和0.035％。
第二步：对载生长因子IGF-1和BMP-2纳米粒子进行表面处理，使其表面具有可反应的活性氨基基团：1g载生长因子IGF-1和BMP-2的PLGL颗粒加入到浓度为20mM低分子量的支化聚乙烯亚胺的乙醇/水的溶液中(1:1，体积比)，超声均匀分散，氨基化处理30min后，离心收集纳米粒子，去离子水洗涤三次，除去表面游离的聚乙烯亚胺，冷冻干燥备用。
第三步：载生长因子IGF-1和BMP-2纳米粒子杂化聚乙二醇水凝胶制备：氨基化处理后的载IGF-1和BMP-2的PLGA颗粒分散于去离子水中，另外配制一定浓度的四臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯水溶液，然后将纳米粒子和聚合物以体积比1:1采用涡旋仪进行混合，最终的纳米粒子的浓度为12.5％，PEG的浓度为2.5％，搅拌均匀后得到荷载生长因子IGF-1和BMP-2杂化聚乙二醇水凝胶。
第四步：结构与功能可控软骨组织工程支架制备:将载生长因子IGF-1和BMP-2纳米粒子杂化聚乙二醇水凝胶浸泡在2mg/ml多巴胺溶液中，37℃下在摇床上孵育1小时后，
用磷酸缓冲液冲洗三次，随后浸入500ng/ml的bFGF溶液中，在室温下摇床上孵育1小时后，取出凝胶用磷酸缓冲液冲洗三次，即得到负载bFGF、IGF-1和BMP-2纳米粒子杂化聚乙二醇水凝胶。
对照样1的制备：氨基化处理后的载PLCL颗粒分散于去离子水中，另外配制一定浓度的四臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯水溶液，然后将纳米粒子和聚合物以体积比1:1采用涡旋仪进行混合，最终的纳米粒子的浓度为12.5％，PEG的浓度为2.5％，搅拌均匀后得到杂化聚乙二醇水凝胶，作为对照样1。
对照样2的制备：氨基化处理后的载IGF-1的PLCL颗粒分散于去离子水中，另外配制一定浓度的四臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯水溶液，然后将纳米粒子和聚合物以体积比1:1采用涡旋仪进行混合，最终的纳米粒子的浓度为12.5％，PEG的浓度为2.5％，搅拌均匀后得到荷载生长因子IGF-1杂化聚乙二醇水凝胶，作为对照样2。
对照样3的制备：氨基化处理后的载BMP-2的PLCL粒子分散于去离子水中，另外配制一定浓度的四臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯水溶液，然后将纳米粒子和聚合物以体积比1:1采用涡旋仪进行混合，最终的纳米粒子的浓度为12.5％，PEG的浓度为2.5％，搅拌均匀后得到荷载生长因子BMP-2杂化聚乙二醇水凝胶，作为对照样3。
对照样4的制备：荷载生长因子IGF-1和BMP-2杂化聚乙二醇水凝胶为对照样4，制备过程同第三步。
对照样5的制备：对照样1浸泡在2mg/ml多巴胺溶液中，37℃下在摇床上孵育1小时后，
用磷酸缓冲液冲洗三次，随后浸入500ng/ml的bFGF溶液中，在室温下摇床上孵育1小时后，取出凝胶用磷酸缓冲液冲洗三次，即得到负载bFGF纳米粒子杂化聚乙二醇水凝胶，作为对照样5。
形貌观察：将结构与功能可控软骨组织工程支架冷冻干燥，喷金后使用SEM观察到支架的孔径为80-200μm。
释放实验：结构与功能可控软骨组织工程支架浸泡在包含1％牛血清蛋白的磷酸缓冲液(pH 7.4)里，每隔一定时间后收集释放介质，采用ELISA方法测定其中的生长因子的量。实验结果显示：荷载在支架上的三种生长因子均能持续释放，bFGF、BMP-2和IGF-1在30天内的累积释放量分别为52％、37％和39％。
体外细胞培养：将与本发明实施例1中相同的大鼠的关节软骨细胞分别种植到结构与本实施例中制备的功能可控软骨组织工程支架和对照样上。由图4-5可知，实验结果显示：在结构与功能可控软骨组织工程支架上的细胞增殖明显快于对照样，而且II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的合成速度明显快于对照样。此研究结果表明在这种结构与功能可控的软骨组织工程支架上，培养关节软骨细胞，使细胞快速生长和繁衍，并且能使细胞外基质合成加快，从而促进具有生理活性软骨形成。
实施例3、制备结构与功能可控的软骨组织工程支架
第一步：载生长因子TGF-β1的PLGA颗粒的制备：1mL浓度为80μg/ml的TGF-β1与含200mg的PLGA(LA/GA＝70/30)的10mL二氯甲烷超声混合，形成W/O乳液。将W/O乳化液1％PVA(W/W)中，得到粗双乳化液。通过孔径为1μm多孔玻璃膜对粗双乳液进行挤出精制。将得到的均匀双乳状液快速倒入500mL去离子水中，500rpm磁力搅拌过夜，使粒子凝固，离心洗涤并冷冻干燥后，得到粒径约为500nm的载生长因子A的颗粒，颗粒中生长因子A的质量含量为0.032％。
第二步：载生长因子BMP-2的PLLA颗粒的制备：1mL浓度为40μg/ml的BMP-2与含200mg的PLLA的10mL二氯甲烷超声混合，形成W/O乳液。将W/O乳化液1％PVA(W/W)中，得到粗双乳化液。通过孔径为1μm多孔玻璃膜对粗双乳液进行挤出精制。将得到的均匀双乳状液快速倒入500mL去离子水中，500rpm磁力搅拌过夜，使粒子凝固，离心洗涤并冷冻干燥后，得到粒径约为500nm的载生长因子B的纳米颗粒，颗粒中生长因子B的质量含量为0.035％。
第三步：对载生长因子纳米粒子进行表面处理，使其表面具有可反应的活性氨基基团：1)阳离子化明胶制备:1g乙二胺和0.5g 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐加入到包含0.5g明胶的25ml 100mM磷酸缓冲液中，然后通过5M的盐酸溶液将pH值调至5.0。反应混合物在37℃下加热搅拌18小时后，在25℃下的二次水中透析(截止分子量为12000-14000)48小时。最后将透析液冷冻干燥得到阳离子化明胶。2)等子体处理：PLGA纳米粒子等离子体处理在氧气气氛下进行，腔体压力为20Pa,放电功率为50W，处理时间为10分钟。3)阳离子化明胶溶解在磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)在37℃下形成1.0g/l溶液，然后将等离子体处理载生长因子TGF-β1的PLGA颗粒和载生长因子TGF-β1的PLLA颗粒分别加入到阳离子化明胶溶液中，振荡均匀分散，处理1小时后，离心收集纳米粒子，去离子水洗涤三次，冷冻干燥备用。
第四步：载生长因子TGF-β1和BMP-2纳米粒子杂化聚乙二醇水凝胶制备：表面处理后的载TGF-β1的PLGA颗粒和载生长因子BMP-2的PLLA颗粒分散于去离子水中，另外配制一定浓度的六臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯水溶液，然后将纳米粒子和聚合物以体积比1:1采用涡旋仪进行混合，最终的纳米粒子的浓度为6.0％，PEG的浓度为3.0％，搅拌均匀后得到荷载生长因子TGF-β1和BMP-2杂化聚乙二醇水凝胶。
第五步：结构与功能可控软骨组织工程支架制备：本发明同实施例1第五步。
对照样1的制备：氨基化处理后的载PLGA颗粒和PLLA颗粒分散于去离子水中，另外配制一定浓度的六臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯水溶液，然后将纳米粒子和聚合物以体积比1:1采用涡旋仪进行混合，最终的纳米粒子的浓度为6％，PEG的浓度为3.0％，搅拌均匀后得到杂化聚乙二醇水凝胶，作为对照样1。
对照样2的制备：等离子体处理-阳离子化明胶锚定表面处理后的载TGF-β1的PLGA颗粒和未载生长因子的PLLA颗粒分散于去离子水中，另外配制一定浓度的六臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯水溶液，然后将纳米粒子和聚合物以体积比1:1采用涡旋仪进行混合，最终的纳米粒子的浓度为6％，PEG的浓度为2.5％，搅拌均匀后得到荷载生长因子TGF-β1杂化聚乙二醇水凝胶，作为对照样2。
对照样3的制备：等离子体处理-阳离子化明胶锚定表面处理后的载BMP-2的PLLA粒子和未载生长因子的PLGA粒子分散于去离子水中，另外配制一定浓度的六臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯水溶液，然后将纳米粒子和聚合物以体积比1:1采用涡旋仪进行混合，最终的纳米粒子的浓度为6％，PEG的浓度为2.5％，搅拌均匀后得到荷载生长因子BMP-2杂化聚乙二醇水凝胶，作为对照样3。
对照样4的制备：荷载生长因子TGF-β1和BMP-2杂化聚乙二醇水凝胶为对照样4，制备过程同第四步。
对照样5的制备：对照样1浸泡在2mg/ml多巴胺溶液中，37℃下在摇床上孵育1小时后，
用磷酸缓冲液冲洗三次，随后浸入500ng/ml的IGF-1溶液中，在室温下摇床上孵育1小时后，取出凝胶用磷酸缓冲液冲洗三次，即得到负载IGF-1、TGF-β1和BMP-2纳米粒子杂化聚乙二醇水凝胶，作为对照样5。
形貌观察：将结构与功能可控软骨组织工程支架冷冻干燥，喷金后使用SEM观察到支架的孔径为100-200μm。
释放实验：结构与功能可控软骨组织工程支架浸泡在包含1％牛血清蛋白的磷酸缓冲液(pH 7.4)里，每隔一定时间后收集释放介质，采用ELISA方法测定其中的生长因子的量。实验结果显示：荷载在结构与功能可控的软骨组织工程支架上的三种生长因子均能持续释放，IGF-1、BMP-2和TGF-β1在30天内的累积释放量分别为52％、36％和45％。
体外细胞培养：将与本发明实施例1中相同的大鼠的关节软骨细胞分别种植到结构与功能可控软骨组织工程支架和对照样上。实验结果显示：在结构与功能可控软骨组织工程支架上的细胞增殖明显快于对照样，而且II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的合成速度明显快于对照样。此研究结果表明在本发明结构与功能可控的软骨组织工程支架上，培养关节软骨细胞，使细胞快速生长和繁衍，并且能使细胞外基质合成加快，从而促进具有生理活性软骨形成。
实施例4、制备结构与功能可控的软骨组织工程支架
第一步：载生长因子IGF-1和BMP-2的PLCL纳米粒子制备：同本发明实施例2
第一步。
第二步：对载生长因子IGF-1和BMP-2的PLCL纳米粒子进行表面处理，使其表面具有可反应的活性氨基基团：同实施例3第三步。
第三步：载生长因子IGF-1和BMP-2纳米粒子杂化聚乙二醇水凝胶制备：氨基化处理后的载IGF-1和BMP-2的PLCL颗粒分散于去离子水中，另外配制一定浓度的六臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯水溶液，然后将纳米粒子和聚合物以体积比1:1采用涡旋仪进行混合，最终的纳米粒子的浓度为12.5％，PEG的浓度为3.0％，搅拌均匀后得到荷载生长因子IGF-1和BMP-2杂化聚乙二醇水凝胶。
第四步：结构与功能可控软骨组织工程支架制备:同实施例2的第四步。
对照样1的制备：等离子体处理-阳离子化明胶锚定表面处理后的载PLCL颗粒分散于去离子水中，另外配制一定浓度的六臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯水溶液，然后12.5％，PEG的浓度为3.0％，搅拌均匀后得到杂化聚乙二醇水凝胶，作为对照样1。
对照样2的制备：等离子体处理-阳离子化明胶锚定表面处理后的载IGF-1的PLCL颗粒分散于去离子水中，另外配制一定浓度的四臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯水溶液，然后将纳米粒子和聚合物以体积比1:1采用涡旋仪进行混合，最终的纳米粒子的浓度为12.5％，PEG的浓度为3.0％，搅拌均匀后得到荷载生长因子IGF-1杂化聚乙二醇水凝胶，作为对照样2。
对照样3的制备：等离子体处理-阳离子化明胶锚定表面处理后的载BMP-2的PLCL粒子分散于去离子水中，另外配制一定浓度的六臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯水溶液，然后将纳米粒子和聚合物以体积比1:1采用涡旋仪进行混合，最终的纳米粒子的浓度为12.5％，PEG的浓度为3.0％，搅拌均匀后得到荷载生长因子BMP-2杂化聚乙二醇水凝胶，作为对照样3。
对照样4的制备：荷载生长因子IGF-1和BMP-2杂化聚乙二醇水凝胶为对照样4，制备过程同第三步。
对照样5的制备：对照样1浸泡在2mg/ml多巴胺溶液中，37℃下在摇床上孵育1小时后，
用磷酸缓冲液冲洗三次，随后浸入500ng/ml的bFGF溶液中，在室温下摇床上孵育1小时后，取出凝胶用磷酸缓冲液冲洗三次，即得到负载bFGF纳米粒子杂化聚乙二醇水凝胶，作为对照样5。
形貌观察：将结构与功能可控软骨组织工程支架冷冻干燥，喷金后使用SEM观察到支架的孔径为100-200μm。
释放实验：凝胶支架(实验样)浸泡在包含1％牛血清蛋白的磷酸缓冲液(pH 7.4)里，每隔一定时间后收集释放介质，采用ELISA方法测定其中的生长因子的量。实验结果显示：结构与功能可控的软骨组织工程支架上的三种生长因子均能持续释放，bFGF、BMP-2和IGF-1在30天内的累积释放量分别为50％、36％和39％。
体外细胞培养：将与本发明实施例1中相同的大鼠的关节软骨细胞分别种植到结构与功能可控的软骨组织工程支架和实验样上。实验结果显示：在本发明结构与功能可控的软骨组织工程支架上的细胞增殖明显快于对照样，而且II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的合成速度明显快于对照样。此研究结果表明在这种结构与功能可控的软骨组织工程支架上，培养关节软骨细胞，使细胞快速生长和繁衍，并且能使细胞外基质合成加快，从而促进具有生理活性软骨形成。

Claims (10)

1.一种软骨组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：（1）将生长因子荷载到纳米颗粒上，得到载生长因子的纳米颗粒；
所述纳米颗粒为生物可降解纳米颗粒；所述生物可降解纳米颗粒为聚内酯；所述聚内酯以聚内酯二氯甲烷溶液的形式使用；所述聚内酯二氯甲烷溶液的浓度为0.01~0.03g/mL；
所述聚内酯选自下述任意一种单体形成的均聚物和/或至少两种单体形成的共聚物；所述单体包括乙交酯、L-乳酸和己内酯；
所述生长因子包括生长因子A和/或生长因子B；所述载生长因子的纳米颗粒包括载生长因子A的纳米颗粒、载生长因子B的纳米颗粒和/或载生长因子A和生长因子B的纳米颗粒；（2）对所述载生长因子的纳米颗粒进行表面处理，使其表面具有可反应的活性基团；
（3）将带活性反应基团的聚乙二醇水溶液与经步骤（2）处理的如下1）和/或2）中所述载生长因子的纳米颗粒混合，得到荷载生长因子A和B的水凝胶；
1）所述载生长因子A的纳米颗粒和所述载生长因子B的纳米颗粒；
2）所述载生长因子A和生长因子B的纳米颗粒；
步骤（3）中，所述带反应活性基团的聚乙二醇水溶液中聚乙二醇的质量百分比浓度为2.0%~5%；
所述载生长因子的纳米颗粒和所述带活性反应基团的聚乙二醇水溶液以体积比为1:1；
步骤（3）中混合后体系中所述载生长因子纳米颗粒质量百分比浓度为5.0~12.0%；所述带反应活性基团的聚乙二醇选自四星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、六星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯和八臂星型聚乙二醇琥珀酰亚胺酯中的至少一种；
（4）在所述荷载生长因子A和B的水凝胶上荷载生长因子C，即得到软骨组织工程支架；
其中，所述生长因子A、所述生长因子B和所述生长因子C均为促进软骨再生的生长因子。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述聚内酯的纳米颗粒的粒径为300~700纳米；
所述促进软骨再生的生长因子选自转化生长因子-β1、骨形态蛋白-2、胰岛素样生长因子和碱性成纤维生长因子中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中将所述生长因子荷载到所述纳米颗粒上的方法包括如下步骤：将所述生长因子水溶液与所述聚内酯的二氯甲烷溶液混合形成W/O乳液；然后将W/O乳液加入质量百分浓度为0.25~1%的聚乙烯醇水溶液中，得到粗双乳液；所述粗双乳液在0.15~1.5MPa压力下通过多孔玻璃膜进行挤出精制，得到均一的乳液；所述均一的乳液在水中搅拌后依次经离心、洗涤、冷冻干燥，得到所述载生长因子的纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述生长因子水溶液的浓度为50ng/mL~500μg/mL；
所述生长因子水溶液与聚内酯二氯甲烷溶液体积比为0.05~0.15:1；
所述聚乙烯醇水溶液与W/O乳液体积比为18~25：1；
所述多孔玻璃膜的孔径为0.8~2.5µm；
所述载生长因子的纳米颗粒中所述生长因子质量含量为0.005~2.0%。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中对所述载生长因子的纳米颗粒进行表面处理的方法是分支状聚乙烯亚胺氨解法和氧等离子体处理-阳离子化明胶锚定法。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（4）中对所述在水凝胶上荷载生长因子C的方法为聚多巴胺锚定法；
所述聚多巴胺锚定法步骤如下：在所述荷载生长因子A和B的水凝胶与多巴胺溶液混合孵育，使其表面形成聚多巴胺涂层；然后与所述生长因子C的溶液混合孵育，即得到所述软骨组织工程支架。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述多巴胺溶液的浓度为1~ 4mg/mL；
与所述多巴胺溶液混合孵育的温度为36~40℃，时间为30~90分钟；
所述生长因子C的溶液浓度为0.1~1μg/mL；
与所述生长因子C的溶液混合孵的温度为室温，时间为30~90分钟。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述软骨组织工程支架的孔径为80~200微米；
所述软骨组织工程支架中生长因子A、生长因子B和生长因子C的质量百分含量均为0.002~0.8%。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法制备得到的所述软骨组织工程支架。
10.权利要求9所述软骨组织工程支架在制备仿先天软骨中细胞生物化学和物理信号微环境的软骨支架的应用。
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